Светозависимое образование АТФ и энергетика фотосинтезирующих клеток

Демидов, Эдуард Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Светозависимое образование АТФ и энергетика фотосинтезирующих клеток
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Светозависимое образование АТФ и энергетика фотосинтезирующих клеток"

РГб од

российская академия наук

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи УДК 581.(132;133.12;Г74.4)

ДЕМИДОВ Эдуард Дмитриевич

СВЕТОЗАШСИМОБ ОБРАЗОВАНИЕ АТФ И ЭНЕРГЕТИКА «ОТОСИНТЕЗИРУШЩ КЛЕТОК

03.00.12 - фонология растений

Диссертация на соискание ученое степени доктора биологически наук в форме научного доклада

Москва - 1993

Работа выполнена в группе энергетики фотосинтеза Института фотосинтеза АН СССР и лаборатории метаболизма углерода и азота Института почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук

Официальные оппоненты:

действительный член РАН, доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

И.А. Тарчевский В.Е. Семененко П.С. Венедиктов

Ведущая организация: Ботанический Институт им. В.Л. Комарова Российской Академии Наук

Специализированного' Совета Д.002.45.01 по защите' диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН (127276, Москва, Ботаническая ул., 35)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева' РАН

Защита состоится

час. на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оценки превращения энергии в фотосинтезирую-щих клетках обычно основываются на данных по газообмену, т.е. по скорости видимого поглощения углекислого газа или выделения кислорода. Согласно классическому уравнению фотосинтеза:

С02 + НдО —> 1/6 (С6Н1206) + 02; 4 а0=+П4 ккал

на каздый моль поглощенного С02 или выделенного кислорода свободная энергия фотосинтезирующей системы увеличивается на II4 ккал. В этом случае связь между скоростями энерго №э)-и газообменом (Яр) выражается с помощью формулы:

нэ= кг. V

где Кг= 114 ккал/моль, если Ер измеряется в молях газа в единицу времени.

Однако прямые' фотокалориметрические измерения скорости запасания энергии при фотосинтезе у клеток зеленой водоросли хлореллы в сочетании с измерениями скорости выделения кислорода показали, что при низких интенсивностях синего света количество запасаемой энергии почти в два раза больше того количества, которое следовало бы ожидать на основании газометрических измерений (Белл и др., 1968; Белл, Шувалова, 1970). Превышение фактически запасенной клеткой энергии над величиной, рассчитанной по результирующему 02-газообме-ну, было обнаружено затем при насыщающих интенсивностях красного и белого света (Шувалова и др., 1973; Петров, 1975). Эти данные указывают, во-первых, на возможность запасания энергии света в фото-синтезирунадей клетке в результате какого-то процесса, не солро-воздагацэгося эквивалентным выделением кислорода, и, во-вторых, на зависимость этого процесса от длины волны света. Существование такого расхождения между энерго-и газообменом имеет большое значение для всей фотоэнергетики растений, так как оно означает, что энергетические расчеты, основанные на газометрических данных занижены.

• Теоретической основой для постановки подобных исследований, а также правомочности энергетических расчетов, проводимых на основании балансового уравнения фэтосинтвза, послужили экспериментальные данные, показавшие, что углевода не являются единственными продуктами фотосинтеза (Ничипорович, 1955). Гипотеза о разнокачественное™

продуктов фотосинтеза подучила широкое экспериментальное обоснование (Воскресенская, 1965; 'Тарчввский, I9G4; Андреева, 1968; Bassha-n et.ai.1981) и пользуется всеобщим признанием.

Несоответствие между энэрго-и газообменом показывает, что на баланс энергии фотосинтезирующей клетки, кроме фотосинтеза влияет еще какой-то или какие-то энергетические процессы, стимулируемые светом. Установление природы этих процессов имеет значение для выяснения факторов, влияющих на эффективность запасания энергии света в растениях.

Было предложено три объяснения наблюдаемому превышению энергообмена над газообменом при фотосинтезе: свет, и, в частности, качество света влияет: I )на первичные энергозапас ащие процессы фотосинтеза; 2)на вторичные энергетические процессы, протекающие одновременно с фотосинтезом (например, фотоокислительные реакции) или 3)на фотобиосинтезы и на фотоэндоэргонические реакции, не связанные с ассимиляцией С02, такие как фоторедукция нитрата или нитрита, активный транспорт ионов и в том числе углекислоты (Demi-dov, Bell, 1978).

Под первичными энергозапасащими процессами фотосинтеза мы будем понимать все те процессы, которые связаны с образованием первых химически устойчивых (или "термически релаксированных" ), по выражению Кальвина (Calvin, Jündress, 1963), соединений фотосинтеза, т.е. процессы, связанные с образованием АТФ и восстановителя. Основное внимание в настоящей работе будет уделено первичным эндоэргоническим реакциям фотосинтеза, приводящим к синтезу ЛТФ. Такой выбор связан с тем, что в результате функционирования циклического (или псевдоциклического) фотофосфорилирования можно ожидать расхождения между энерго-и газообменом при фотосинтезе. Известно, например, что при циклическом транспорте электронов энергия света может запасаться без выделения 02 и поглощения С02 (Tagawa et.al., 1963). Имеется достаточно много данных, об использовании энергии АТФ циклического фотофосфорилирования на некоторые метабодатические процессы, связанные с запасанием энергии и отличные от ассимиляции углекислоты. Так в интактных клетках за-счет циклического фотофосфорилирования осуществляются реакции биосинтеза крахмала и полисахаридов (Заленский и др., 1966), анаэробная фотоассимиляция глюкозы (Tanner et.al., 1965) или включение Р^во внутриклеточные соединения (Urbach, Gimnler, 1970). Были получены доказательства участия циклического фотофосфорилиро-

вания в синтезе белка (Ramirez et.al., 1968) и в поглощении ионов

(Jeschke, 1967).

Монет быть и другое объяснение: под действием света усиливается поглощение кислорода ("фотоокислительный процесс"), и часть энергии окисления не деградирует в тепло, а сохраняется в клетке, подобно тому, как при обычной дыхании до 60% энергии окисления может не деградировать в тепло (Белл, 1980). В самом деле, хорошо известно, что у фотосинтезирущих организмов, в том числе и у хлореллы свет активирует поглощение кислорода, т.е. активирует окислительные процессы (Ried, 1969). Имеется немало данных, где было показано также, что синий свет вызывает более активное поглощение кислорода, чем красный (Воскресенская, Гришина, 1966; Kowailik, Gafiron, 1966). При этом не исключено,что эти светоактивнрозензав окислительные процессы могут быть сопряжены с запасанием части энергии окисления. На возможность сопряжения фосфорилирования с активированным светом поглощением кислорода указывали ряд исследователей (Arnon, 1967; Jackson, Volk, 1969). Имеющиеся экспериментальные данные позволяют представить конкретный механизм сохранения энергии окисления, например, при фото дыхании по г дико латному пути. Было показано, что при превращении глицина в серии в клетках наблюдается образование АТФ (Bird et.al. ,1972). Также было показано, что эта АТФ может образовываться в изолированных митохондриях за счет окисления НАДН, образующегося в реакции глицин-серин в гликолатном пути (Tiaidyantha et.al.,1975).

Наблюдаемое превышение энергообмена над газообменом в принципе мокет объясняться и имеющимися в литературе оценката энергетических затрат на фотобиосингезы, не связанные с ассимиляцией углекислоты. Расчеты показывают, что для синтеза клеточного материала необходимо тратить больше энергии, чем на синтез углеводов из С02 и HgO по схеме Кальвина. Так, на включение одного атома углерода в клеточный материал сверх затрат АТФ и ШЩФН , используемых на включение атома углерода в углеводы в цикле Кальвина (3 и 2 молекулы соответственно) требуется дополнительно от 0.4 до 2 молекул АТФ (Белл, 1980; Кок, 1972; Raven 1976). Даже если не увеличивается количество органического вещества клетки, дополнительная энергия необходима для поддержания жизнедеятельности клетки. Эта энергия поддержания используется на восполнение потерь клеточных соединений, непрерывно распадающихся в результате гидролиза, денатурации и т.д. Кроме того, значительная часть энергии может использоваться клеткой на процессы

активного транспорта ионов против концентрационных градиентов, на восстановление минеральных источников азота и в других реакциях.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилось исследование роли различных фотоэндоэргонических процессов, происходящих в фотосинтезирующей клетке, в эффекте расхождения между энерго-и газообменом; выявление вклада АТФ, образуемого при фосфо-ршшровании в эндоэргонические процессы, отличные от фотоассимиляции С02- Достижение цели исследования потребовало решения следующих основных, задач:

1. Изучить действие качества света (длины волны) на относительный квантовый выход и максимальную скорость фотофосфорилирования на изолированных хлоропластах и целых клетках водорослей.

2. Исследовать возможную роль гликолатного пути превращения углерода в энергетике фотосинтезирующих клеток хлореллы.

3. Выявить участие реакций фотофосфорилирования в механизме концентрирования углекислоты в клетках микроводорослей.

4. Количественно оценить возможность использования восстановителя, образующегося в фотосинтетической электрон-транспортной цени на поддержание процесса нитратредукции в клетке.

Научная новизна. Проведено комплексное изучение действия качества света на первичные энергозапасающие реакции в целых фотосин-тезирущих организмах и на изолированных хлоропластах. На линейных участках световых кривых как синего, так и красного света наблюдалось совпадение относительных квантовых выходов всех типов фотофосфорилирования, а при насыщающих интенсивностях света совпадение абсолютных скоростей нециклического и псевдоциклическога фотофосфорилирования. Ее было обнаружено влияния качества света на максимальную скорость циклического фотофосфорилирования и циклического переноса электронов в целых фотоскнтезирушцих клетках хлореллы.

Впервые достаточно полно изучено влияние интенсивности и качества света на выделение гликолата клетками хлореллы при различных концентрациях 02. Показано, что существует связь мевду выделением в среду гликолевой кислоты, вызываемым светом, и аффектом расхождения между знерго- и газообменом. Установлено, что факторы, благоприятствующие эффекту расхождения, т.е. видимому избыточному запасанию энергии света, являются одновременно и факторами пониженного или полностью подавленного выделения гликолата в среду. С позиции энер-

гетини впервые исследован метаболизм экзогенно добавленных субстратов гликолатного метаболизма. Сделано заключение, что вклад этого пути в энергетический баланс освеженной зеленой клетки может Сыть значителен. Выявлено, что одним из основных факторов, заметно меняющих интенсивность гликолатного пути в клетках хлореллы, является концентрация СС>2, при которой выращиваются клетки. Был сделан вывод, что фотодыхание по гликолатному пути играет энергетически полезную роль и не является полностью бесполезным, как считалось раньше.

Впервые показано, что процесс адаптации микроводорослей к низкой концентрации С02 не ограничивается только биосинтезом карбоан-гидразы, но и сопровождается адаптивными изменениями в фотосинтетической цепи переноса электронов и фэтофэсфорилирования, что выражается, в частности, в обратимой инактивации ФСП и увеличении активности циклического фотофосфорилирования.

На примере клеток хлореллы было показано, что до 20% энергии генерируемой при фотосинтезе в виде восстановительной силы, расходуется на поддержание процесса ниграгредукции. Получены новые факты, доказывающие, что восстановление нитрата до аммония в клетках может осуществляться без участия цепи реакций, связанных с ассимиляцией С02 в цикле Кальвина, и что этот процесс в энергетическом отношении является вторым по важности фотоэндоэргоническим процессом после ассимиляции СС^, осуществляемым клеткой. Сопряжение нециклического переноса электронов с синтезом АТФ, когда конечным акцептором электронов является N0^, может существенно сказываться на потребности энергии при синтезе клеточного материала и таким образом влиять на общий энергетический баланс клетки.

В результате проведенного исследования экспериментально доказано, что энергетические возможности фотосинтеза не ограничиваются совокупностью лишь тех процессов, внешним выражением которых служит фогосинтетический газообмен.

Научная и практическая значимость работы. Проделанная работа дает сведения, представляющие основу для понимания энергетических аспектов, определяющих баланс энергии освещаемой растительной клетки. Полученные экспериментальные результаты и обобщения, касающиеся действия света разного спектрального.состава, дефицита СО^, минерального азота на фотосинтез, являются важной составной частью физико-химических механизмов, обеспечивающих устойчивость и надежность функционирования фотосинтетического аппарата клетки. Сформулирован-

ная в работе концепция участия АТФ в реакциях, отличных от ассимиляции С02, расширяет наши представления об участии циклического фото-фосфорилирования и окислительного фосфорилирования в энергетическом балансе фогосинтезирувдих клеток. Выявленные в работе закономерности могут быть использованы для разработки представлений о регуляции эффективности поставки энергии не только на реакции, связанные с ассимиляцией СС>2, но и на другие биосинтетические процессы в клетке. Они вносят существенный вклад в выяснение механизмов регуляции первичных процессов фотосинтеза при изменении физиологического состояния клеток и их адаптации к условиям среда.

В работе содержатся оригинальные методические разработки, которые создают основу для дальнейшего прогресса в области изучения участия первичных процессов фотосинтеза в метаболизме углерода, азота, транспорте углекислоты и т.д.

Полученные результаты могут быть использованы для развития исследований в области изучения механизмов эндогенной регуляции фотосинтеза; внутриклеточных механизмов адаптации фотосинтезирующих клеток к условиям углекислотного и азотного обеспечения; при разработке новых регламентов для массового культивирования микроводорослей как продуцентов ценных метаболитов.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на Всес. симпозиуме "Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений" (Москва, 1974); 3-м Всес. биохимическом съезде (Рига, 1974); Расширенном семинаре ИФР АН СССР (1978, 1980); XI Всес. рабочем совещании по вопросам круговорота веществ в замкнутых системах на основе жизнедеятельности низших организмов (Канев, 1981); Всес. совещании "Энергетика, метаболитические пути и их регуляция" (Пущино, 1981); Международной конференции "Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С3 растениях (Таллин, 1983); 13-х Пущинских чтениях по фотосинтезу-лекция (Пущино, 1986); Всес. конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирундих системах и их моделях" (Пущино, 1989); Расширенном семинаре КФ АН СССР (Казань, 1989); заседании ВОМ> (Пущино, 1989); Всес. конференции "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде" (Пущино,1989); 2-м съезде ВОФР (Минск, 1990); "Круглом столе", посвященном исследованию механизмов концентрирования С02 в раститель-хых клетках (Минск, 1990); Международном симпозиуме по фотосистемам (Зап.Берлин, 1990); Международном совещании "Метаболизм углерода и

азота при фотосинтезе" (Пущино, 1991); Международном симпозиуме "Фотосинтез и стресс" (Чешские Будеевицы, 1991); Шведском симпозиуме "Дыхание растений" (Умеа, 1992); Российско-Американском рабочем совещании по фотосинтезу (Пущино, 1992); Совещание по продуктивности растений (Екатеринбург, 1992); Научной конференции по проблемам теоретической и прикладной альгологии (Москва, 1992).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано в отечественных и зарубежных научных изданиях 50 работ..

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали одноклеточные водоросли, принадлежащие к родам Chlorella И Chlamydomonas, циалобактерии Anacystis niclulans, Anabaena variabilis, а также растения гороха (Pisum sativum).

Культивирование водорослей проводили в накопительном режиме в стерильных условиях при постоянном освещении, оптимальной для каждой культуры температуре и непрерывном барботировании суспензии газовоздушной смесью с 1,8-2% СО^.

1лоропласты извлекали из листьев с использованием О,4M сахарозы И 0,5% бычьего альбумина (West, Wiskich, 1968).

Нзлерение скорости, газооблена по 02 проводили амперометрическим методом в термостатированной ячейке с электродом Кларка, а в некоторых случаях манометрическим методом в аппарате Варбурга.

Константу полутсьвцения Kq gfHCOg + СО2) определяли по (^-зависимому выделению 02- Перед добавлением соответствующих количеств ЫаНСО^ клетки освещали до полного прекращения выделения кислорода.

Активность фотосистем 1 определяли по поглощению 02 в присутствии пары мэтилвиологен + аскорбат.

Активность фотосистем 2 определяли по выделению 02 с использованием феррицианида в качестве акцептора электронов.

Фотофосфорилирование регистрировали потенциометрическим методом (Nishimura et.al., 1962).

О скорости циклического потока электронов in vivo судили по изменению оптической плотности в области поглощения пигмента Р700 в присутствии диурона (Белл, Демидов, 1974).

Относительные квантовые выходы определяли из полученных спектральных кривых распределения излучения для синего и красного света. Синий свет, используемый в настоящих опытах выделяли в спектральном

интервале от 380 до 550 нм с максимумом излучения при 490 нм. Красный свет был в интервале от 560 до 740 им с максимумом при 620 нм. Затем вычислялось отношение числа квантов падающего красного света к числу падающих квантов синего при одинаковой их энергетической интен

сивности (измеряемой в эрг/см сек). Это отношение оказалось равным 1,33, и с его помощью можно было определить относительное число поглощенных квантов того и другого света при условии их полного поглощения.

Скорости поглощения ^COg. измеряли по включению меченого углерода.

Излерение относительных скоростей фотосинтеза и выделения меченых продуктов фотосинтеза в среду проводили в замкнутой системе при постоянной концентрации С02 по ранее описанному методу (Демидов и др., 1978)

Состав внеклеточных соединений анализировали с помощью метода восходящей двумерной хроматографии (Тарчевский, Карпилов, 1963).

Содержать ионов N0^, NH^, H0g определяли спектрофотометрически в надосадочной жидкости после осаждения клеток: нитрат по поглощению при 210 нм (Cawse, 1967); аммоний - фенолгипохлоритным методом при 640 нм (Soiorsano, 1969); нитрит- НЭДА-сульфаниламидным методом при 540 НМ (Guerrero, 1982).

Дез интеграция клеток проводили в гомогенизаторе со стеклянными бусами (Семененко, Касаткина, 1972).

Активность карбоангиврат определяли электрометрическим способом по скорости изменения рН при 3-4 С в фосфатном буфере.

Активность нитрат- и нитршлредуюпаз in vi-tro определяли по изменению количества нитрита в реакционной среде (Guerrero, 1982).

Низкатехпературкые (77К) спектры флуоресценции регистрировали с помощью ФЭУ-84 через монохроматор ВДР-4 при облучении образца линией аргонового лазера 488 нм, W= Ю(тЛ см-2).

КАЧЕСТВО СВЕТА И ПЕРВИЧНЫЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ПРОШССЫ ФОТОСИНТЕЗА

Одним 'из возможных объяснений завышенного энергетического выхода на синем свету является повышенная эффективность циклического или псевдоциклического фотофэсфорилирования на этом свету, по сравнению с красным. Литературные данные, относящиеся к вопросу о действии качества света на фотофэсфорилирование к моменту начала данных исследований были не только малочисленны, но и противоречивы см. (Деми-

дов, Белл, 1973). Расхождения в интерпретации результатов частично объяснялись тем, что в некоторых из работ не строго контролировались световые измерения, а именно, не рассчитывались отношения числа квантов, лежащих в красной области спектра, к числу квантов, лежащих в синей области спектра; кроме того, не во всех работах учитывались коэффициенты поглощения для двух сравниваемых участков спектра. По этим причинам на основании литературных данных было трудно сделать надежные выводы об эффективности использования света разного спектрального состава в реакциях фотофосфорилирования. Б связи с этим мы исследовали действие качества света (длины волны) на относительный квантовый выход и максимальную скорость различных типов фотофосфорилирования, а такке переноса электронов как in vitro, так и in vivo.

Сравнительные измерения значений эффективности или квантовых выходов при различных длинах волн возбуждаемого света проводились следующим образом. Для изучаемых реакций строились световые кривые на синем ж красном свету и определялись области их линейных участков. Затем по углу наклона судили об эффективности процесса. На рис.1 в качестве примера показаны линейные участки световых кривых фотофосфорилирования с.ФМС на синем и красном свету. Из представленного рисунка видно, что при низких уровнях освещения скорость образования АТФ нэ увеличивается линейно. Задержку в образовании АТФ мы постоянно наблюдали при малых уровнях поглощенного света для фотофосфорилирования с ®С и нециклического фотофосфорилирования с феррицианидом. По этой причине относительные квантовые выходы определяли только по наклонам линейных участков световых кривых. Скорости ке образования АТФ при очень низких интенсивностях в расчет не принимались. Все оп-

Pua.í. Линейные участки, световых кривых фотофосфорилирования а ФПС на синел и красно л свету.

1- на синел свету;

2- на краснол свету;

3- на синел после квантова-тя

ределения скоростей реакций выполнялись на хлоропластах, изолированных из растений гороха (Pisum sativum), в значительной степени сохранивших свою первоначальную активность.

Результаты измерений относительных квантовых выходов различных типов фотофосфорилирования сведены в таблице I. Здесь показаны отно-

Таблица I

Отношение наклонов линейных участков квантованных световых кривых фотофосфорилирования, ивлеренных на синел и краснол свету.

Условия опыта число измерений Средние значения тангенсов углов наклона Ореднее отношение тангенсов углов наклона на синем

синий красный и красном свету

ФМС 9 0,60 0,59 1,01±0,П

ФМН _7 5 1,43 1,49 0,96±0,07

ФМН 4 DCMU IQ М 4 0,81 0,83 0,98±0,1

витамин К3 3 1,07 1,08 0,99

Феррицианид 4 2,0 1,93 I,03±0,12

Пиоцианин 3 0,69 0,70 0,99

Пиоцианинл-+DCMU Ю 3 0,54 0,60 0,90

шения значений для двух сравниваемых участков спектра. Данные эксперименты показывают, что не наблюдается существенного влияния качества света на квантовый выход циклического фотофосфорилирования с ШС и пиоцианином, псевдоциклического, катализируемого ФМН и витамином К3, а также нециклического, связанного с восстановлением феррицианида.

Можно было думать, что в изолированных хлоропластах нарушены некоторые условия, которые имеются в целых клетках, и именно по этой причине искомое влияние синего света не наблюдается. Для проверки этой возможности была исследована зависимость циклического фотофосфорилирования (ЦФФ) в интактных клетках зеленой водоросли хлореллы от качества света.

Все методы определения скорости ЦФФ в клетках являются косвенными и основаны на определении скорости процессов, требующих для своего осуществления энергии АТФ. При этом опыты проводятся в условиях, когда единственным процессом, поставлякщим АТФ является ЦФФ, т.е. когда ингибируется нециклическое и псевдоциклическое фото-фосфорилирование. В данной работе относительная скорость ЦФФ

ю "

оценивалась по величине биосинтеза крахмала из эндогенных меченых соединений, образовавшихся после предшествующего кратковременного (I минута) фотосинтеза в атмосфере, содержащей I4C0g. В опытах использовалась культура Chlorella pyrenoidosa штамм 82, у которой слабо была выражена разветвленная цепь превращений на пути биосинтеза крахмала, т.к. сахароза почти не метилась. Это обстоятельство давало возможность сопоставлять суммарное изменение радиоактивности водно-спиртовой фракции (фосфорных эфиров Сахаров и других промежуточных соединений цикла Кальвина) и фракции крахмала. При дальнейшем экспонировании клеток хлореллы на синем или красном свету регистрировали перераспределение метки: количество 4С в веществах водно-спиртовой фракции уменьшалось и соответственно возрастало в крахмале. Изменение в активности происходило именно в двух исследуемых фракциях, поскольку сумма активностей обеих фракций была близка к исходной радиоактивности клеток. По разнице радиоактивности крахмала д К сразу после I-минутного фотосинтеза в атмосфере *4COg и после дополнительной I0-минутной экспозиции на свету, можно было судить о скорости биосинтеза крахмала и, следовательно, об относительной скорости ЦФФ.

Результаты четырех опытов представлены в таблице 2. В трех

Таблица 2

Радиоактивность крахмала до и после 10 лип. экспозиции на крас-нол и синел свету в различных газовых средах и в присутствии диурона ( ь К, % от общей радиоактивности).

Условия освещения Интенсивность света в эрг/см2 сек Разность радиоактивностей в % (аК)

гелий ВОЗДУХ+ DCMU с 5 I0"öM 1% со2

I 2 3

Красный 3200 20 36 21 25 34

свет 19000 20 25 20 27 32

Синий 3100 20 29 23 28 35

свет 16500 25 29 21 25 29

Темнота - - в 5 3 -

опытах ЦФФ отделялось от нециклического путем экспозиции клеток в атмосфере гелия, а в одном с помощью диурона. Для сравнения

представлены величины перераспределения метки в атмосфере COg, т.е. в условиях , благоприятных для функционирования всех типов фэтофос-форилирования, а также после 10-минутного выдерживания в темноте без продувания газа. Небольшая величина биосинтеза крахмала, наблюдаемая в темноте и составляющая 15-20% от общего его биосинтеза на свету, обусловлена, по-видимому, участием окислительного фосфоршшрования в биосинтезе крахмала, так как при прокачивании гелия в темноте перераспределение метки не было заметным. Что касается вклада нециклического фотофосфорилирования в величину биосинтеза крахмала, то оно во всех наших экспериментах в атмосфере \% COg было невелико. Основной вклад в поддержание этого процесса приходился на долю ЦФФ. На основании сопоставления экспериментальных данных таблицы 2 можно говорить о независимости ЦФФ от качества света.

Поскольку метод определения ЦФФ in vivo по скорости биосинтеза крахмала является косвенным, желательно было исследовать вопрос о влиянии длины волны света на ЦФФ другим способом. Были проведены опыты по измерении скорости циклического потока электронов на синем и красном свету у зеленой водоросли Chlorella pyrenoidosa и сине-зеленой Anacystis niduians. О циклическом потоке электронов in vivo мы судили по обратимому изменению коэффициента поглощения света в области поглощения пигмента Р7СЮ. На рис.2 показаны квантованные световые кривые сигнала для хлореллы. Кривые, измеренные в присутствии Ю-5М диурона, т.е. в условиях подавления выделения кислорода и нециклического потока электронов, совпадают на синем и красном свету, как это наблюдалось и в опытах с анацистис.

Рис.2. Квантованные световые криВье фжоиндуциро-ванныг излечений коэффициента пропускания при 702нл у клеток хлореллы.

1- красный свет;

2- синий свет.. (6-ти крсвтая повторностъ)

Поток поглощенных квантов (отн.ед.)

Таким образом, совокупность опытов, проведенных как с изолированными хлоропластами, так и с целыми фотосинтезирующими клетками, дала отрицательный ответ на вопрос о влиянии длины волны света на такие первичные энергетические процессы, как реакции фотофосфорили-рования, циклический и нециклический перенос электрона.

Хотя эти данные и говорят oö отсутствии влияния качества света на ход первичных энергозапасакщих процессов фотосинтеза, их нельзя рассматривать как окончательное доказательство этого положения. Возможно, что при других условиях и, в частности, при особом физиологическом состоянии клеток водорослей такое влияние будет наблюдаться. Тем не менее, отсутствие эффекта в стольких опытах, проведенных как in vitro, так и in vivo все же делает вероятность подобного эффекта достаточно малой и дает основание для заключения, что наблюдаемое на клетках хлореллы повышенное запасание энергии на синем свету скорее всего обусловлено действием этого света на вторичные энергетические процессы.

ГЛШХЛАГНЫИ МЕТАБОЛИЗМ 1/1 ЭНЕРГЕТИКА 40ТОСИНТЕЗЯРШ1Щ КЛЕТОК

ХЛОРЕЛЛЫ

I. Связь нежду выделением гликолевой кислота на свету и эффектом расхождения

В настоящей главе приводятся данные, указывающие на существование связи мевду выделением гликолевой кислоты и энергетикой освещенных клеток хлореллы. Исходным для данной работы послужило наблюдение, что на синем свету выделение гликолевой кислоты клетками хлореллы значительно слабее, чей на красном (Becker et.al, I968). Этот факт можно было сопоставить с действием синего света на энергетический выход. Возникает вопрос, существует ли корреляция, т.е. повышенное запасание энергии - низкое выделение, и в других условиях, для которых известны особенности энергетики фотосинтезиру-щих клеток? Исходя из этого исследовалась зависимость скорости выделения гликолевой кислоты от интенсивности света разного спектрального состава и от концентрации кислорода.

На рис.3 показаны кривые зависимости скорости выделения гликолевой кислоты от интенсивности синего и красного света при продувании суспензии клеток Chlorella sp.K газовой смесью 0.03% С 0Z и 21$ Og. Видно, что при низких уровнях освещения интенсивность выделения метки из клеток на синем свету существенно ниже, чем на красном, и до 30 Вт/м2- практически равна нулю. Этот

результат вполне соответствует энергетическим измерениям, согласно которым при низких интенсивностях синего света энергетическая обеспеченность клеток выше, чем на красном (Белл и др.,1968). По мере приближения к насыщающим интенсивностям света происходит, как это видно из рисунка, сближение скоростей выделения метки на синем и красном свету. Именно такого результата можно было ожидать, исходя из прежних энергетических измерений, согласно которым при насыщающих интенсивностях света избыток запасания энергии наблюдался не только на синем свету, но и на красном (Шувалова и др.,1972). В этих условиях 8-12% углерода, ассимилированного клетками, выделялось в виде гликолевой кислоты.

Световые кривые, полученные при барбогаже суспензии клеток газовой смесью со 100%-ным 02 показали, что в этих условиях различие на линейном участке световых кривых выхода гликолевой кислоты на синем и красном свету меньше, чем при 21% 02. На плато световых

<=с

О) &

Е<

О О И

СИ

Интенсивность света,Вт/и2

О 20 40 во 80 100 Концентрация кислорода,%

Рис.3

Рис.4

Рис.3. Световые кривые поглощения 14С02 и выделения летки в среду на синел и краснол свету при 21%-но.л содержании кислорода. 1- поглощение 14С02 на краснол свету; 2- на синел; 3- виделение летки на краснол свету; 4- на синел.

Рис.4. Выделение летки в среду на краснол и синел свету при различных концентрациях кислорода. 1- краснол свету; 2- синел.

кривых экскреция гликолата значительно возросла и составила 40-46% от общего ассимилированного углерода. При этом общая интенсивность фотосинтеза по сравнению со значением при 21% 02 уменьшилась в 3 раза. Отметим, что выделения гликолата на всех участках световых кривых мы не обнаружили при концентрации кислорода 1-2Ж. Фотосинтез в этих условиях был выше, чем при 21% кислорода в 1.3-1.4 раза.

Результаты измерений выделения метки на линейном участке световых кривых на синем и красном свету при продувании суспензии клеток газовой смесью с различным содержанием кислорода приведены на рис.4. По мере увеличения концентрации кислорода от 21 до 38% наблюдалось более резкое увеличение скорости выделения метки, чем при изменении концентрации от 2 до 21%, что коррелирует с обнаруженным ранее падением энергетического выхода при повышенных ( >21% ) концентрациях 02 (Крупенко и др.,1978). Таким образом, и в этом случае наличие эффекта расхождения коррелирует с эффектом выделения гликолата.

Отсутствие выделения гликолевой кислоты на синем свету низкой интенсивности могло быть обусловлено тем, что на синем свету она не синтезируется. Определения выделения гликолевой кислоты на синем и красном свету в присутствии и отсутствие а-гидрооксипиридинметан-сульфоната, ингибитора оксидазы гликолевой кислоты показали, что на синем свету низкой интенсивности образование гликолевой кислоты имеет место (табл.3). Отсутствие ее выделения, таким образом, вероятно, связано с лучшей ее метаболизацией на синем свету, чем на красном.

Таблица 3

Выделение гликолевой кислоты на синел и нраснол свету в присутствии и в отсутствие а-ГИПС

Варианты Выделение 14С-гликолата,% Б/А

Контроль(А) а-ГЕМС 10 у(Б)

Красный свет 27.500 эрг/см2сек Сниний свет 32.000 эрг/см2сек 16,7 ± 0,5 2,7 ± 0.06 17,5 ± 0,8 12,0 ± 0,46 1,06 4,4

Сопоставление всех этих результатов с данными по энергетике фотосинтезирующих клеток хлореллы показывает, что существует тесная связь между выделением гликолевой кислоты клетками хлореллы и особенностями их энергетики. Конкретно, условия, приводящие к повышению скорости запасания энергии над скоростью выделения кислорода, являются одновременно и условиями заниженного выделения гликолата.

2.Фотодыхавде и превращение гликолата и глицина в клетках хлореллы.

Анализ данных, полученных при изучении взаимосвязи между выделением гликолевой кислоты на свету и эффектом расхождения, позволил предположить,.что в условиях, когда образуется гликолевая кислота и по тем или иным причинам нет ее выделения в среду, происходит дальнейшее ее окисление, сопряженное с сохранением части энергии окисления, что и приводит к расхождению между энерго- и газообменом. Такое объяснение хорошо согласуется с данными по гликолатному пути, полученными на высших растениях, где при метаболизации гликолата из двух молекул глицина образуется молекула серина, С02 и молекула восстановленного НАД. Этот процесс происходит в митохондриях и поэтому в результате окисления НАШ может образоваться АТФ (Bird. et.al., 1972 Кузьмин, Маслов, 1980). Таким образом часть энергии окисления может сохраняться в виде НАДН или АТФ.

Перенесение этой схемы на клетки зеленых водорослей наталкивалось на некоторые трудности. В некоторых работах приводились экспериментальные данные, свидетельствующие об образовании и метаболизации гликолевой кислоты в этих организмах (Merrett,Lord, 1973), в других работах ставилось под сомнение вообще наличие фэто-дыхания по гликолатному пути в водорослях, в том числе и у хлореллы (Iloyd et.al.,1977; Bidwell, 1977). Несомненно, что гликолат может образовываться на свету в хлорелле; это следует из факта его выделения в среду. Однако, возможно, что его дальнейший метаболизм не происходит,и, в частности, могла не происходить именно та реакция (глицин -> серии), в которой выделяется С02 и которая могла бы быть ответственна за сохранение части энергии окисления. В связи с этим, перед нами встала задача выяснить, происходят ли следующие процессы в клетках хлореллы: I) фотодыхание; 2) метаболизация гликолата с образованием С02; 3) окисление глицина, сопряженное с функционированием электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий.

Фотодахание. Фотодыхание,т.е. стимулированное светом выделение С02, первоначально было установлено на листьях высших растений (Jackson, Volk, 1970). Условиями, благоприятными для усиления фотодыхания являются высокие интенсивности света, низкие концентрации С02 и высокие концентрации 02. Считается, что при достаточно низком отношении в газово® Фазв происходит

активирование оксигеназной реакции РДФ-карбоксилазы/оксигеназы в результате чего на свету увеличивается скорость окисления РДФ и образования гликолевой кислоты- субстрата фотодыхания. В ходе дальнейшей метаболизации гликолевой кислоты происходит поглощение кислорода и выделение С02. Это в свою очередь приводит к уменьшению видимого газообмена на свету, определяемого по скорости выделения 02 и также скорости поглощения С02. Нами было высказано предположение, что соотношение между карбоксилазной и оксигеназной функциями фермента могло существенным образом зависеть от способа предварительной подготовки культуры клеток. Такая возможность представлялась вполне реальной, если учесть, что клетки водорослей, адаптированные к низким концентрациям С02, более эффективно фотосинтезируит в условиях пониженной концентрации С02, чем неадаптированные, благодаря повышенной активности карбоангидразы (Веггу et.al.,1976). Известно, что карбоангидраза является адаптивным ферментом. Ее активность у клеток, выращенных при низких концентрациях С09 больше, чем у клеток, выращенных при высоких (Reed,Graham, 1977; Пронина и др.,1981).

Исходя из этих фактов, можно было ожидать, что в условиях низкой концентрации С02(0.(Ш) скорость фотосинтеза будет относительно выше у клеток, предварительно адаптированных к низкой концентрации С02. В этом случае большая активность карбоангидразы будет благоприятствовать проявлению карбоксилазной функции РДФ-карбо-ксилазы. Адаптация же к высокой концентрации С02 приведет к снижению активности карбоангидразы и вследствии этого к повышению оксигеназной функции РДФ-карбоксилазц и, следовательно, к усилению фотодыхания.

В предварительых опытах было установлено, что для полной адаптации клеток Chlorella sp.K, выращенных при 1.8Ж302 к .низкой концентрации С02 (0.03%) достаточно 1-2 часов. В таблице 4 представлены данные, которые показывают распределение КА-активности во фракциях клеток, выросших при 1.8% С02 и адаптированных к 0,03%. Можно отметить общий характер реакции клеток в ответ на снижение

концентрации С02 в среде, который заключается в увеличении суммарной КА-активности. Для обоих типов клеток присуще то, что наибольшая активность фермента была зарегистрирована на поверхности клеток , в то время как при адаптации клеток к низким концентрациям С02 возрастала активость КА во фракции растворимых белков.

Таблица 4

Распределение активности карОоангидразы во фракциях клеток хлореллы, адаштрованных к высокой и низкой концентрации СОо

Фракция Активность КА, ед/мг Хл

адаптированные к 1,8% С02 адаптированные к 0,03% со2

Клетки 116 ± 9 177 ± 17

Гомогенат 123 ± 4 214 ± 21

Супернатанг 0 48 ± 9

Осадок 105 ± 1.1 127 - 12

Рис.5 показывает изменение скорости выделения 02 в зависимости от концентрации общего растворимого неорганического углерода в среде у клеток, выросших при 1,8% С02, и клеток, адаптированных в течение 2 ч к воздуху. Обращает на себя внимание тот факт, что у клеток, адаптированных к воздуху, насыщение фотосинтеза происходит при более низких концентрациях бикарбоната, чем у клеток, адаптированных к 1,8% С02, хотя максимальные скорости фотосинтеза были примерно одинаковы у обоих типов клеток. Концентрации общего растворимого углерода, необходимые для полунасшцения скорости выделения 02, рассчитанные с помощью метода двойных обратных величин, также показаны на рис.5. Как видно, оба типа клеток существенным образом отличались между собой по их сродству к С02-Так, клетки, адаптированные к воздуху, имели К0 Б(НС03+С02)= 18мкМ и соответственно К0 5(С02)= 2,ЗмкМ, а клетки, выросшие при 1,8% С02 •К0 Б(НС03+С02)= 455мкМ и К0 5(С02)= 57,5мкМ.

Представление результаты находятся в полном согласии с имеющимися в литературе данными о связи мевду активностью КА и изменением сродства клеток к С02. Так, наблюдаемое в этих опытах снижение величины К0 Б коррелировало с увеличением активности КА.

0.5 1 1.5

[НСС>з+С02]

Рис.5. Выделение 02 клетками хлореллы в зависимости ок концентрации растворенного неорганического углерода (.4 1. (Б)- обратные величины скорости и концентрации су Острота 1- клети, адаптированные к 1,8% С0о; 2- клетки, адапти-

рованте к 0,03% СОг.

Изучали также влияние разных концентраций кислорода на относительные скорости поглощения 14С02 и выделения меченой гликолевой кислоты клетками, адаптированными к высокой и низкой концентрации С02. Результаты этой серии экспериментов приведены на рис 6 из которого можно видеть, что более сильное ингибирование поглощения С02 наблюдается в клетках, адаптированных к высокой концентрации С02. У клеток же с высоким сродством к С0? эффект ВарОурга (ингибирование фотосинтеза кислородом) был значительно меньше Примечательно, что скорости фотосинтеза клеток, адаптированных к 0,03% С02. значительно превышали таковые у клеток, адаптированных к высокой концентрации С02. Отметим также, что аналогичные результаты были получены и по измерению скорости выделения кислорода. Из рис 6 видно, что стимулирующее действие кислорода на выделение гликолевой кислоты наблюдалось только у клеток, адаптированных к высокой концентрации С02.

Таким образом, проявление фотодыхания в клетках хлореллы зависит не только от условий, в которых проводятся измерения ( концентрации С02, 02, и интенсивности света), но и существенным образом зависит от условий предварительной подготовки культуры клеток к последующим измерениям юс газообмена. По этой причине может сильно изменяться и вклад фотодахания в энергетический баланс меток

Рис.6. Действие различных концентрация кислорода на поглощение С02 и. выделение гликолевой кислоты клеткали хлореллы, адатированкыли к низкой и высокой концентрации С02.

А- поглощение1-4СО2 клеттли, адаптировакныли к 1,8% С02; Б- выделение ^-гликолат клетками, адагтированкыли к 1,8% СО2; В- поглощение 14С02 клеттли, адалтированшли к 0,03% С02; Г- выделение 14С-гли-кожвю. клетжиы, адаптированным, к 0,03% СО

Метаболизация гликолата. О споооОносги клеток метаболизировать гликолат судили по его окислению до С02. Для этого использовали эк-зогенно добавленный меченый 1-14С-гликолат и регистрировали выделяющийся 14С02- Одновременно анализировали состав продуктов, образующихся при его окислении.

На рис.7 представлены кинетические кривые выделения 14С02 из клеток хлореллы, в которые предварительно была введена меченая гликолевая кислота. Как видно в темноте происходило непрерывное выделение С02, в то время, как на свету оно полностью отсутствовало Наблюдаемое выделение метки в темноте доказывает способность клеток

хлореллы образовывать С02 из гликолата, т последний без участия света. Отсутствие выделения С09

метаболизировать на свету могло

быть обусловлено тем, что свет каким-чо образом ингибирует поглощение экзогенного гликолата или же тем, что на свету полностью

Рис.7. Выделение 14С0о клетка■

ли, глареллы 14,

окислении

при

I-1 чС-гликолта.

1.3- темнота; 2,4- свет;

3.4-6 присутствии БСШ

15 30 45 Врекя, кин

реассимилируется углекислый газ, выделяемый при окислении гликолата. Опыты показали, что последняя возможность (реассимиляция) более

вероятна. Так, при добавлении к суспензии клеток диурона (10' 14,

-5,

Ю,

интенсивность выделения С02 на свету была почти такая же, как и в темноте (рис.7). Подтвервдением отсутствия выделения С02 на свету в результате реассимиляции выделяющегося углекислого газа послужили и результаты опытов по влиянию света на скорости поглощения экзогенного гликолата. Скорости поглощения гликолата были не только не ниже, но даже несколько выше на свету, чем в темноте. Таким образом

полученные результаты позволяют заключить, что клетки хлореллы способны метаболизировать гликолат с образованием С02 как на свету, так и в темноте. Это в свою очередь дает основание полагать,что в клетках хлореллы может осуществляться реакция глицин -> серин. Хроматографический анализ продуктов превращения экзогенной гликоле вой кислоты также подтвердил вывод о способности клеток хлореллы метаболизировать гликолевую кислоту. Оказалось, что при ее мета-болизавди образуются типичные продукты гликолагного метаболизма. Кроме того, свет существенным образом влиял на состав продуктов, образующихся при метаболизме гликолата (таблица 5). В темноте метка

Таблица 5

Метаболизация 1-14С-глшолапи клешам, хлореллы на свету и в телнсте

Радиоактивность соединений, % от суммы

Варианты глицин, серин глицерат, ма-лат, аланин, аспартат пигменты старт+фос-форн.эфиры Сахаров

15 мин темн. 64,3 - - 35,7

*-„- свет 19,9 6,0 25,7 48,4

-„-свет+БСии 55,8 - - 44,2

30 мин теш. 68,3 - - 31,7

свет 16,4 10,5 35,6 37,5

-„-свет+БОШ 54,7 - 6,8 38,5

60 мин теш. 61,4 - - 38,6

свет 9,6 18,0 32,4 40,0

-„-свет+юсии 54,2 - 3,8 42,0

в основном (на 60-65&) обнаруживалась в серине и глицине. На свету процент метки в серине и глицине снижался до 8-16% и соответственно увеличивался в продуктах восстановительной части гликолатного обмена: глицериновой кислоте, аланине, малате, аспартате и особенно в пигментах. Для биосинтеза этих соединений необходимы восстановительные эквиваленты и АТФ, которые могут генерироваться в световых реакциях фотосинтеза.

Окисление глицина. Рассмотрим теперь вопрос о связи окисления глицина с электрон-транспортной цепью (ЭТЦ) митохондрий. Для этого мы изучали действие ингибиторов ЭТЦ на окислительное декарбок-

оптирование глицина. Ранее было показано, что ингибиторы ЭТЦ подавляют окислительное декарбоксилирование глицина в изолированных митохондриях (Moore et.al.,1977) и в изолированных клетках высших растений на свету (Карпилов и др., 1978). Однако эти данные нельзя было рассматривать как доказательства того, что подобное явление происходит и в клетках хлореллы. Поэтому была поставлена задача исследовать сопряжение окисления глицина с образованием восстановленного НАД, окисляемого в ЭТЦ митохондрий.

Как видно из таблицы G, клетки хлореллы способны осуществлять

Таблица G

Действие ингибиторов элентронтранспорпной цепи и ЩК на окислительное декарОоксшироваше I-4 С-глицина клетшт хлореллы

Вариант Выделение в имп/мин 14с02 Относительная скорость выделения 14С02 (%)

Темнота 21.300 - 600 100

KCN 1(Г3М 12.200 ± 500 57,0

Na3N Ю"3М 6.340 - 130 30,0

Ант.А Ю_4М 2.000 ± 90 9,4

ЩУК 4 10~4М 79.400 - 2200 366

Время экспозиции 45 мин

окислительное декарбоксилирование экзогенного меченого глицина с образованием '4С02. Это декарбоксилирование глицина тормозилось ингибиторами дыхательной ЭТЦ - цианидом калия, азидом натрия и анти-мицином А. Результаты этих опытов показывают, что окисление глицина может осуществляться через ЭТЦ митохондрий. Это предположение подтверждается также опытами с добавлением щавелевоуксусной кислоты (ЩУК). Добавление ЩУК к клеткам стимулировало скорость выделения 14СС>2 более чем в три раза. Подобный эффект был обнаружен ранее на интактных митохондриях (Иооге et.al-.i977). Возможное объяснение его состоит в том, что восстановленный НАД, образующийся в результате декарбоксилирования глицина,, расходуется на восстановление ЩУК до яблочной кислоты. Это в свою очередь должно увеличить скорость реакции окислительного декарбоксилирования.

Если окисление восстановленного НАД, образуемого в реакции

декарбоксилирования глицина, действительно связано с образованием АТФ и ответственно за эффект расхождения, то можно было ожидать, что высокие концентрации кислорода уменьшат эффективность фосфорилиро-вания при образовании глицина в серин. Дело в том, что при изучении влияния 02 на соотношение между энерго-и газообменом, как отмечалось выше, было найдено, что при высоких его концентрациях ( >40£ ) эффект расхождения уменьшается по сравнению с тем же при 21% (Круленко и др.,1978). В связи с этим мы измеряли степень сопряжения фосфорилирования с транспортом электрона при различных концентрациях 02- Так как получить митохондрии из клеток хлореллы трудно, опыты проводили на препаратах митохондрий, выделенных из этиолированных эпикотелей гороха и зеленых листьев гороха. Результаты этих опытов показали, что повышение концентрации 02 с 21% до 50% приводит к снижения отношения АДФ/0 на 20-25% при окислении глицина в сукцинат т.е. понижается степень сопряжения фосфорилирования с транспортом электронов.

Таким образом, приведенные результаты, а также сходное действие высокой концентрации кислорода на эффективность образования АТФ в митохондриях в процессе окисления глицина и на эффект расхождения между энерго- и газообменом, является убедительным доводом в пользу того, что гликолатный метаболизм, если не полностью, то частично, ответственен за указанное расхождение. Отметим, что предположение о том, что окислительное фосфорилирование, сопряженное с окислением глицина, приводит к повышению отношения АТФ/АДФ в цитоплазме высших растений, также получило экспериментальное подтверждение (СагаеБ^от, яи^е.,1988). Если, например, предположить, что 60% энергии окисления НАДН, образуемого на этапе глицин -> серин в митохондриях, запасается в виде АТФ, то можно подсчитать, что для того, чтобы скорость запасания энергии превысила скорость, рассчитанную по выделению 02, на 40%, скорость поглощения 02 (фотодыхание) должна составить 40% от скорости выделения 02 (истинного фотосинтеза). Подобные скорости фотодыхания встречаются в опыте, во всяком случав с листьями высших растений (геШ;о11,1971). Рис.8 поясняет возможность объяснения эф1)екта расхождения между энерго- и газообменом существованием фотоокислительных процессов. Стрелки Фэ и Фг обозначают скорости запасания энергии, где Ф0- скорость запасания энергии света на свету, Фр- скорость выделения 02 при фотосинтезе, выраженная в единицах энергии (умножением на коэффициент 114 ккал/моль 02). Стрелки Дэ и Др скорости выделения энер-

Рис.8. Схема, иллюстрирующая возможность обыюнения эффекта расхождения между энерго- и газообменом за счет частичного сохранения энергия стиулировакных свешал окислительных процессов.

гии на свету, где Дэ- истинная скорость выделения энергии, ^-скорость поглощения 02, выраженная в единицах энергии, в результате фотоокисления и в предположении полной деградации энергии окисления. Стрелка Дэ меньше вычисленной по газообмену (стрелка Др) за счет сопряжения окисления с энергозапасающим процессом. Заштрихованные стрелки- непосредственно измеряемая (например, на фотокалориметре), скорость запасания энергии (Э) и непосредственно измеренная на опыте скорость выделения 02, выраженная в единицах энергия. Наблюдаемое на опыте превышение скорости запасания энергии света над скоростью, вычисляемой по газообмену характеризуется величинойД .

ФОТОФОСФОРИЛИРОБАНИЕ И МЕХАНИЗМ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ С02 У КЛЕТОК МИКРОВОДОРОСЛЕИ

Концепция о существовании С02-концентрирующего механизма (СКМ) в клетках микроводорослей получила в настоящее время широкое экспериментальное подтверждение как в физиологических, так и в биохимических и молекулярно-генетичэских исследованиях (Spalding et.al., 1989; Moroney et.al.,1989; Пронина, 1992). Важнейшей характеристикой существования индукции СИЛ у водорослей является увеличение сродства клеток к С02,-т.е. уменьшения полунасыщающей фотосинтез концентрации С02 (К0_5) при адаптации клеток к недостатку С02 в среде. Благодаря наличию СОз-концентрирующего механизма концентрация неорганического углерода внутри клеток может во много раз превышать его концентрацию в окружающей среде (Badger et.al.,1980). Было высказано предположение, что транспорт углерода против концентрационного градиента может поддерживаться клеткой на свету энергией АТФ циклического переноса электронов (Spalding et.al.,1984; Sunbland et.al.,1986). Отсюда неизбежно следует, что ассимиляция С02 в клетках с СКМ должна сопровождаться увеличением вклада АТФ относительно НАДФН за счет увеличения активности фотосистемы I

(ФС1). Однако прямых доказательств участия циклического фотофосфо-ршшрования в функционировании СКМ не было. В связи со сказанным, мы исследовали изменения в спектрах низкотемпературной флуоресценции в процессе адаптации клеток хлореллы к низким концентрациям COg с целью выяснения участия ФС1 в механизме концентрирования С02.

На рис.9 представлены спектры флуоресценции, измеренные при температуре жидкого азота, клеток Chlorella vulgaris sp.K, выросших при 1,8$ С02, и клеток, адаптированных в течении 2 ч к воздуху. 06-

Рис.9. Нормализованные спектры низкотеллературной флуоресценции клеток хлореллы.

1- клетки, выросшие при 1,8% С02

2- клетки, адаптированные в течении 2 ч к воздуху.

600 650 700 Длина волны,ни

наружено, что полокение максимумов флуоресценции практически совпадает в спектрах обоих типов клеток, однако при этом имели место изменения в относительной интенсивности максимумов. Отношение флуоресценции Ф686^720 и ф697^®720 П0СЛ6 адаптации клеток уменьшалось от 2,0 до 1,4 и от 1,5 до 1,1 соответственно. Таким образом, обработка клеток воздухом приводила к снижению интенсивности флуоресценции при 686 и 697 нм, приписываемых фотосистеме 2, и увеличению интенсивности длинноволновой полосы 720нм (ФС1). Особенно это четко было видно при разложении спектров на гауссовые компоненты На рис ЛО показаны данные, которые характеризуют динамику изменения отношения коротковолновых полос флуоресценции к длинноволновым в процессе адаптации клеток к воздуху. Одновременно представлены результаты опыта по изменению сродства клеток к общему растворимому неорганическому углероду во время адаптации. Видно, что отношение флуоресценции фе8б/ф720 и ф697/ф720 сшжал°сь в обоих случаях и достигало стационарного уровня по прошествии 90 мин адаптации. Концентрация общего растворимого углерода, необходимая

250

200,

150

100

Pua.10. Действие продолжительности. адаптации к воздуху на сродство клеток к неорганичес-колу углероду и на отношение флуоресценции ФС2 к ФС1.

1- K0t5(Hco-3+coz); 2- Фев^го з- ф697/я?20

Вреия адаптации,шш

для полунаоыщения скорости выделения 02, KQ 5(НС03+С02), также снижалась от 313 до 26 мкМ и достигала стационарного значения за такое же время. Таким образом, увеличение сродства клеток к С02 во время адаптации соответствовало изменениям в спектрах низкотемпературной флуоресценции.

Перечисленные выше характеристики явились хорошими свидетельствами того, что в процессе адаптации клеток к низким концентрациям C0g изменяется не только сродство к С02, но и наблюдаются адаптивные изменения в пигментном аппарате. Изменения пигментного аппарата, направленные на регуляцию эффективности функционирования электрон-транспортной цепи за счет перераспределения энергии возбуждения между двумя фотосистемами, называют переходом состояния I в состояние 2 (Williams,Allen, 1987). Состояние I соответствует избыточному возбуждению ФС1, а состояние 2 - избыточному возбуждению Œ>C2. Считается, что при "перевозбуждении" ФС2 избыточный восстановленный пул пластохинонов стимулирует протеинкиназу, которая фосфорилирует белки светособирающего комплекса (СОК), принадлежащего преимущественно ФС2 При этом ССК2 отделяется от ФС2 и переносится к ФС1. Встраивание ССК в пигментный аппарат ФС1 должно приводить к снижению активности ФС2 и увеличению активности ФС1 (состояние 2) (Кочубей и др.,1988). В связи с этим логично предположить, что адаптация клеток хлореллы к низкой концентрации С02 вызывает переход из состояния I в состояние

2, б результате чего должно происходить перераспределение энергии возбуждения меащу двумя фотосистемами в пользу ФС1 и, возможно, повышению скорости циклического переноса электронов. Тем самым должны создаваться условия,необходимые для обеспечения СО^-концентрирующего механизма энергией циклического фотофосфорилирования.

Наиболее весомые свидетельства участия ЦФФ в механизме концентрирования СО2 были получены наш при изучении фотофосфорилирующей активности препаратов, приготовленных из клеток СЫаМйотопаз ге1п-Иагали (мутант, си-дг, лишенный клеточной стенки). С помощью метода быстрого пропускания клеток через тонкую иглу (0.4х20т/т) нам удалось получить препараты, обладающие высокой и достаточно устойчивой активностью. Рис.II демонстрирует как в процессе пропускания клеток сквозь иглу меняется фотохимическая активность препаратов. Небезин-тересно, что клетки без всяких процедур, связанных с приготовлением и выделением частиц, были фотохимически активны. Так, если клетки

1 2 3 4 6

Число пропусканий

Puo.ll. Фотосинтез и перенос электронов в первой и второй фотосистеле после пропускания клеток через иглу.

теряли способность к фотосинтезу после 5-6 разового пропускания через иглу, то,напротив, активность ФС1, измеренная в системе аскор-бат+метилвиологен по поглощению С^.и феррицианид-зависимое выделение С>2 (ФС2), начинали проявляться только после пропускания через иглу.

На рис.12 приведены данные, которые характеризуют динамику изменений в активности циклического и нециклического фотофосфорилиро-

Рас. 12. Изменение активности, циклического и нециклического фотофосфорилирования в процессе адаптации клеток к воздуху.

Продолжительность адаптации«часы

РИС .13 Рис.14

Рис.13. Изленение мжсижиъной скорости фотосинтеза и сродства клеток к неорганическолу углероду в процессе адаптации к воздуху.

1- ¡((^ 6(НС0-3+С02); 2- лаксилалъная скорость (Утах). Рис.14. Изленение скорости переноса электронов во второй фото-систеле в процессе адаптации клеток к воздуху. (ферр1щианид-зависилое выделение Ор)

вания в ответ на снижение концентрации С02. Как видно из рисунка, в ответ на снижение содержания CCU в газовоздушной фазе с I,8 до 0,03% отмечается существенное (2-3 раза) увеличение активности циклического фотофосфорилирования. Повышение активности ЦФ$ происходило достаточно быстро и за 2-3 часа адаптации активность приближалась к постоянному стационарному уровню. Нециклическое фотофосфэрилирование, сопряженное с восстановлением феррицианида, практически оставалось без изменений.

Исследование адаптации клеток к низкой концентрации С02 позволило нам выявить факты, не отмеченные ранее. Так, при адаптации к снижению концентрации С02 мы наблюдали не только увеличение сродства клеток к растворимому неорганическому углероду, но и снижете максимально насыщающей скорости фотосинтеза (рис.13). Оказалось, что одновременно с подавлением V max в первые два часа адаптации происходило и снижение скорости переноса электронов в фотосистеме 2 (рис.13 , рис.14). После двух часов адаптации наблюдалось заметное увеличение скоростей обеих реакций. Этот результат подтверждает представление о том, что существует прямая связь между активностью ФС2 и интенсивностью фотосинтеза (Samueisson et.ai., 1983). Кроме того, он соответствует данным о подавлении активности ФС2 в первые часы адаптации, полученным при измерении спектров низкотемпературной флуоресценции (рис.9).

Таким образом, исходя из этих данных, мы пришли к заключению, что циклическое фотофосфорижровашв является необходимым звеном утилизации низких концентраций С02 атмосферы и участвует в механизме концентрирования С02- Становится ясно, что для проявления механизма концентрирования С02 необходимы не только свет, низкие концентрации С02, синтез карбоангидразы, но и способность к активному транспорту углерода за счет энергии АТФ циклического фотофосфорилирования. Это в свою очередь позволило нам высказать предположение,■что эффект несоответствия мэЖду энерго- и газообменом может быть частично приписан и активному транспорту углерода внутрь клеток. Основанием для данного предположения явились условия калориметрических и газометрических измерений. Эксперименты проводились с клетками хлореллы, ре-суспендированными в карбонатном буфере Варбурга J69, где равновесная концентрация С02 в газовой фазе составляет 0,23%, а клетки перед этим выращивались при высоких концентрациях С02 от 0,6 до 1,8% (Белл и др., 1968, Крупенко и др., 1976). Поэтому не исключено, что клетки могли адаптироваться к низкой концентрации С02 непосредственно в

процессе достаточно длительных калориметрических измерений. Еще одним аргументом в пользу такого предположения можно привести работу, в которой было показано, что индукция механизма концентрирования С02 осуществляется значительно быстрее при низких интенсивностях синего, чем красного света (Borodin et.ai., 1993). Отметим также, что имеются прямые энергетические измерения, установившие, что при воздействии неблагоприятных факторов на фотосинтез хлореллы до 40% энергии может запасаться за счет циклического фотофосфорилирования (Петров, 1981). Отсюда имеются основания полагать, что не учитываемая газометрическими методами доля запасенной энергии может возрастать за счет расходования АТФ циклического фотофосфорилирования на поддержание процесса концентрирования углерода внутри клеток.

ПРЯМОЕ ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ НИТРАТА

Эффект усиления светом процесса ассимиляции неорганического азота, известный для фотосинтезируюцих организмов, несмотря на давность его открытия, до сих пор является предметом многих научных исследований (Canvin, Atkins, 1974; Turpin 1991). Несомненным является факт сопряжения процессов фотосинтеза и нитратредукции (Larsson et.al., 1985, Демидов, 1987). Из разнообразия мест взаимодействия этих процессов для нас наиболее существенной и интересной является возможность непосредственного использования энергии фотовосстановителя, образующегося в электрон-транспортной цепи при фоторазложении воды.

Возможность прямого фотохимического восстановления нитрата, сопряженного с выделением 02, в интактных клетках водорослей можно показать с использованием двух экспериментальных подходов. Первый заключается в определении в отсутствие С02 стехиометрии, с одной стороны, выделения 0, и поглощения N0^ (02/ш^) и с другой поглощения N0^ и выброса nh^ (NO^/HH^). Уравнение, описывающее эту реакцию, можно представить в следующем виде:

HN03 + 4Н20*-^-> NH3 + 20* + ЗН20

Из этого уравнения следует, что на одну молекулу восстановленного нитрата при фотосинтезе должно выделиться 2 молекулы 02. Второй подход заключается в измерении скоростей выделения 02 при насыщающих

фотосинтез концентрациях С02- Если в клетках одновременно с ассимиляцией С02 происходит и восстановление нитрата за счет фоторазложения вода, то очевидно, что в присутствии нитрата должно наблюдаться дополнительное выделение 02-

Оказалось, что при исключении С02 из газовой фазы клетки Chlorella sp.K способны использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов. На рис.15 показана кинетика газообмена по 02 на свету и в темноте в присутствии и в отсутствие нитрата. Можно видеть, что на свету при добавлении нитрата наблюдается заметное усиление выделения 02. Стационарная скорость выделения 02 достигалась после I часа эксперимента и была равна 24,7 мкмолей/мг Хл ч. В темноте клетки поглощали 02 с низкими скоростями независимо от присутствия в среде нитрата. Одновременно с изучением газообмена измеряли поглощение нитрата и выделение аммиака (рис 16). Так, на свету

8 И i

0.7»

(LS»

«О вО 120

Вреыя.шн Рис Л 6

Рис.15. Газообмен клеток хлореллы в присутствии и в отсутствие нтраш на свету и в темноте в атмосфере без СО 1- свет+ИОд; 2- свет-по^; 3- темнота+Юд; 4- темнота-т^ Рис.16. Поглощение N0^ и выделение 6 отсутствие С02 на свету и в темноте.

1- поглощение N0^ в темноте; 2- поглощение ыо^ т свету; 3- выделение мн^ на свету; 4- выделение нн£ б темноте

скорость поглощения нитрата была равна 12,6 мкмолей/мг Хл ч, тогда как в темноте лишь 1,5. Отношение скорости выделения 02 к скорости поглощения N0^ на свету составило 1,96, т.е. близко к теоретическому, равному двум. Количество выделяющегося в среду аммиака, после некоторого индукционного периода, практически соответствовало количеству поглощенного нитрата.

Бри восстановлении нитрата в присутствии С02, т.е когда в клетках синтезируются акцепторы для связывания ин£, помимо 8 электронов, необходимых для превращения N0^ в nh^, еще 2 электрона должны израсходоваться на восстановление до готовых азотсодержащих соединений. Следовательно, теоретически в присутствии С02 при насыщающих интенсивностях света на одну молекулу восстановленного нитрата должны выделиться (2+0,5) 2,5 молекулы 02. Основываясь на таких расчетах нам удалось получить еще одно подтверждение светозависимости восстановления нитрата при фотосинтезе. Для этого измеряли скорости фотосинтеза по выделению 02 в отсутствие и присутствии нитрата в зависимости от интенсивности света с одновременной регистрацией скорости поглощения N0^. Из рис.17 видно, что на плато световой кривой (при насыщающей интенсивности света) нитрат усиливал скорость выделения 02- Если в отсутствие нитрата максимальная скорость выделения 02 была 75 мкмолей/мг Хл ч, то в его присутствии 108 мкмоль/мг Хл ч. На плато световой кривой скорость поглощения нитрата составила 12 мкмолей/мг Хл ч. По расчетам, прибавка к скорости выделения 02 должна составить 12 2,5= 30 мкмолей/мг Хл ч, т.е. суммарная скорость должна быть равна: 75+30= 105 мкмолей/мг Хл ч. Экспериментально же измеренная скорость составила- 108. Таким образом, в присутствии С02 увеличение скорости выделения 02 практически соответствовало скорости поглощения нитрата, т.е. эффект повышенного выделения 02 "экстра 02" вызван присутствием альтернативного акцептора электронов- нитрата. На линейном участке световой кривой скорости выделения 02 в отсутствие и присутствии нитрата были одинаковы.

Обратную картину наблюдали при измерении световых кривых по поглощению 14С02 (рис.18). На линейном участке нитрат подавлял скорость ассимиляции С02- На плато световой кривой скорости поглощения С02 были примерно одинаковы при добавлении то^ и в его отсутствие. Результаты этих опытов можно интерпретировать следующим образом. Во-первых, то, что в присутствии С02 нитрат увеличивает скорость фотосинтеза, измеряемую по выделению 02, является еще одним веским аргу-

^ 0 50 100

Интенсивность света,Вт/и2

о" и

Рис.17

о-----■---(,—I

О 20 40 во 300

Интенсивность света,Вт/ы^ Рис.18;

Рис.17. Световие кривые фотосинтеза в присутствии и в отсутствие нитрата.

1- (+) КОч; 2- (-) да;

'3. Концентрация ЯаНСОд- 7 ли

Рис 18. Световие кривые фотосинтеза, излеренные по поглощению в присутствии и в отсутствие нитрата. 1- 2- (-) да;

14,

С0о

ментом светозависимого восстановления нитрата при фотосинтезе. Во-вторых, они показывают, что на плато световой кривой энергии фотосинтетического восстановителя достаточно не только для ассимиляции " и для фотоассимиляции N0". Другими словами, конкуренции за '2 и коз на плато световой кривой не существу-

СО.

но

восстановитель между СО.

В настоящее время не имеется однозначных доказательств, которые объясняли бы причину светового насыщения фотосинтеза (Белл, 1980). С одной стороны, считается, что при высоких интенсивностях 'света замедление фотосинтеза может быть связано с ограничением со стороны энзиматических реакций, ответственных за восстановление СО-. С другой стороны, имеется ряд данных, которые показывают, что и перенос электронов по электрон-транспортной цепи может быть узким местом и ограничивать скорость фотосинтеза. Однако увеличение скорости выде-

ления 02 в присутствии нитрата на плато световой кривой свидетельствует, что первичные фотохимические реакции, скорее всего, не могут лимитировать скорость фотосинтеза при насыщающих интенсивностях света.

Возникает вопрос- сколько восстановителя используется на восстановление нитрата в результате прямого фотохимического разложения 1^0? Для определения доли фотовосстановителя, расходуемого на редукцию нитрата были проведены измерения скоростей ассимиляции С02 и нитрата. Исходя из того факта, что фотосинтетический коэффициент в отсутствие нитрата должен быть близок к I, учитывая, что в присутствии С02 нитрат вызывает дополнительное выделение 02на плато световой кривой в соответствии со стехиометрическим коэффициентом 02/гю^= 2,5, и, зная скорость поглощения нитрата, можно рассчитать и теоретически возможную скорость ассимиляции С02 но скорости выделения 02. В таблице 7 приведены результаты 9 опытов, в которых проведено

Таблица 7

Ассшаияция С02 и Н0д клешюлхл хлореллы.

Скорость, мкмоль/мг Хл ч

Номер опыта **гоглощени9 Юд ***выделение 02

У2 Y3.V2.5v,

I 8,0 142,2 122,2 15,2

2 14,1 136,9 101,7 7,2

3 10,8 113,0 86,0

4 11,2 137,7 109,7 9,8

5 11,2 117,4 89,0 7,9

*6 3 в 51 .0 42,1 11,8

*7 5,1 51 ,2. 7,5

8 10,8 106,0 79,0 7,3

9 5,3 73,0 59,8 11,2 среднее 9,5

Примечание. Содержание хлорофилла 25-40 мкг/мл; *- содержание хлорофилла 100 мкг/мл; **- время измерения от 20 до 60 мин; ***- скорости измеряли за первые 10 мин после освещения.

одновременное измерение скоростей выделения 02 и поглощения нитрата

яри насыщающих фотосинтез интенсивности! света и концентрациях С02-Можно видеть, что отношение скоростей поглощения С02 и нитрата колеблется в пределах от 15,2 до 7,2. Однако в подавляющем числе экспериментов это отношение было близким к 10. Отсюда представляется возможным сделать вывод. Восстановление нитрата до готовых азотсодержащих соединений при фотосинтезе должно расходовать 20% энергии, генерируемой в виде восстановительной силы, поскольку на восстановление 10 молекул С02 должно расходоваться 40 электронов, а на восстановление I молекулы КО^ - 10 электронов. Восстановление нитрата на свету, таким образом, в энергетическом отношении является вторым но важности после ассимиляции С02 фотоэндоэргоничес-ким процессом, осуществляемым автотрофной клеткой.

Анализ данных по светозависимому восстановлению нитрата при фотосинтезе позволяет высказать предположение о физиологической роли такого способа восстановления в растительной клетке. Выше уже отмечалось, что потребность растущих фотосинтезирующих клеток в АТФ больше, чем это следует ожидать из стехиометрии восстановительного пентозофосфатного пути превращения углерода. Есть основания полагать, что недостающее количество молекул АТФ вырабатывается клеткой при нециклическом фэтофосфорилировашш, сопряженном с восстановлением нитрата. В литературе имеются данные, которые показывают, что восстановление нитрата в интактных клетках водорослей сопряжено с синтезом АТФ (иНгасЬ, 1973).

Приведем следующий расчет. Допустим, что скорость фотосинтеза составляет 100 мкмолей/мг Хл ч, тогда скорость образования восстановителя при нециклическом переносе электронов будет 200 мкмолей НАДФН /мг.Хл ч, а скорость образования АТФ- 400 мкмолей/мг Хл ч (при Р/2е= 2). Таким образом, при восстановлении одной молекулы С02 образуется

4 молекулы АТФ, а требуется минимум 5. Учитывая, что одновременно с ассимиляцией С02 происходит и восстановление нитрата, то 20Ж дополнительного количества восстановителя должны повысить скорость нециклического фотофосфорилирования еще на 100 мкмолей АТФ/мг Хл ч, то есть общая потребность клеток в АТФ в присутствии нитрата, а именно

5 молекул АТФ на молекулу С02, в принципе может быть обеспечена. Привлекательность этого объяснения заключается в том, что оно указывает на возможность покрытия расхода АТФ клетками при росте на среде с нитратом, за счет одного нециклического фотофосфорилирования. Вклад циклического фотофосфорилирования, видимо, в этих усло-

виях незначителен. Напротив, когда клетки во время роста используют аммоний, доля циклического фотофосфорилирования должна возрастать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Энергетический баланс фотосинтезирующей клетки определяется многими процессами, происходящими как на свету, так и в темноте. До сравнительно недавнего времени считалось, что в растениях основная часть энергии солнечного излучения запасается в результате обычного фотосинтеза, т.е. при восстановлении С02. Однако применение прямых методов измерения запасания энергии дало основание предполагать, что истинное энергообеспечение автогрофной клетки монет существенно отличаться от рассчитываемого по результирующему 02 газообмену. Исследование природа обнаруженного ранее несоответствия между энерго-и газообменом явилось основной целью работы.

Выяснение механизма этого явления важно по двум причинам: I) если это явление наблюдается и в высших растениях, то это означает, что оценки солнечного излучения, запасаемого автотрофами, могут быть сильно занижены и нуждаются в пересмотре; 2) в запасании энергии света наряду с обычным фотосинтетическим механизмом, участвуют какие-то другие процессы, знание которых необходимо для раскрытия механизмов запасания энергии в фотосинтезируюцей клетке.

Исследовалось влияние качества света на относительный квантовый выход (при низких интенсивностях света) и на максимальную скорость фотофосфорилирования (при насыщающих интенсивностях света) с различными кофакторами и окислителями в изолированных хлоропластах. Были проведены опыты с целыми фотосинтезирующими клетками хлореллы, в которых сравнивалось действие синего и красного света на циклическое фотофосфорклирование in vivo. Наконец, исследовалась зависимость циклического штока электронов от качества света у клеток Chlorella pyrenoidosa и Anaoystis nidulans. Не было обнаружено различий в действии синего и красного света на различные типы реакций фотофосфорилирования. При низких интенсивностях света наблюдалось совпадение квантовых выходов всех изучаемых реакций, а при насыщающих интенсивностях света совпадение абсолютных скоростей нециклического и псевдоциклического фотофосфорилирования. Не было обнаружено влияния ка-

чества света и на максимальную скорость циклического фотофосфорили-рования в целых фотосинтезирующих клетках хлореллы. С представлением о независимости циклического фотофосфорилирования от качества света согласуются и опыты по исследованию скорости циклического потока электронов. Именно поэтому представляется, что наблюдаемое повышенное запасание на синем свету скорее всего обусловлено действием этого света на вторичные энергетические процессы.

В исследованиях по изучению влияния интенсивности и качества света на выделение гликолевой кислоты клетками хлореллы при различных концентрациях кислорода показано, что существует прямая связь между выделением клетками в среду гликолевой кислоты и особенностями их энергетики. А именно, те условия, которые в большей степени повышают скорость запасания энергии, являются одновременно и условиями заниженного выделения гликолевой кислоты. На основании этих результатов было сделано заключение о сохранении в клетке части энергии стимулируемого светом окисления гликолата.

Результаты опытов с меченым гликолатом и глицином показали, что реакция глицин -> серин в гликолатном метаболизме сопряжена с образованием восстановленного НАД, при окислении последнего образуется АТФ, ответственная за наблюдаемый в клетках эффект расхождения .между энерго-и газообменом. Таким образом, в энергетическом отношении гликолатный путь может выполнять такую же роль на свету, какую выполняет обычный дыхательный метаболизм, где часть энергии окисления сохраняется путем образования АТФ и используется на метаболити-ческие нукды. Возможность замены обычного дыхательного метаболизма гликолатным путем на свету с энергетической точки зрения имеет, по-видимому, определенное физиологическое значение, а в некоторых случаях, реакция глицин -> серии может являться источником электронов для дыхательной цепи и тем самым компенсировать недостаток НАДН или АТФ.

Энергетический вклад гликолатного пути в общую энергетику клетки может сильно меняться в зависимости от условий, при которых выращиваются клетки. Как показали проведенные в настоящей работе эксперименты, одним из основных факторов, существенно меняющих скорость прохояздения углерода через гликолатный путь, является концентрация С02, при которой выращиваются клетки. Так, при адаптации клеток к низким концентрациям углекислого газа ингибируидее действие кислорода на фотосинтез, измеряемый при 0,03% С02 менее выражено, чем на

клетках, адаптированных к высоким концентрациям С02- Наблюдаемое в этих опытах сильное ингибирование фотосинтеза кислородом у клеток, адаптированных к высоким концентрациям С02, коррелировало со способностью этих клеток синтезировать значительные количества гликолевой кислоты в этих условиях. Наоборот, клетки, адаптированные к низким концентрациям С02, синтезировали значительно меньшие количества гликолевой кислоты, и эффект Варбурга у них был меньше. Отсюда следует, что энергетический вклад гликолатного пути превращения углерода в значительной степени зависит от условий выращивания клеток и от условий проведения измерения ( концентрации С02 и Оо). Что касается высших растений Сд-типа, то у них энергетический вклад гликолатного пути в общую энергетику при естественных концентрациях С02 и 02 всегда будет значителен, т.к. в этих организмах всегда наблюдаются достаточно большие скорости фотодыхания.

Изучение адаптации клеток микроводорослей к низкой концентрации С02 показало, что процесс индукции С02-концентрирующего механизма сопровождается обратимой инактивацией фотосистемы 2 и увеличением активности циклического фэтофосфорилирования. Инактивация ФСП в начале адаптации сникает максимальную скорость фотосинтеза и является сигналом для перераспределения энергии возбуждения между двумя фотосистемами в пользу ФС1. Тем самым создаются благоприятные условия для обеспечения С02-концентрирующего механизма энергией циклического фотофосфорилирозания. Поскольку истинного восстановления С02 в результате активного транспорта не происходит, а наблюдается лишь видимое ее поглощение, представляется, что исследуемый эффект несоответствия между энерго- и газообменом может также быть энергетическим проявлением индукции механизма концентрирования неорганического углерода внутри клеток. Повышение активности циклического фотофосфорилирования при дефиците С02 можно рассматривать как защитно- приспособительную реакцию ассимилирующих клеток, позволяющую им на определенное время стабилизировать энергетический баланс и противостоять повреждающему действию фактора.

Процесс восстановления нитрата в фотосинтезирующей клетке осуществляется последовательно на нескольких этапах с затратами энергии. Относительный вклад энергии в виде АТФ в ассимиляцию нитрата невелик. Основная доля энергетических затрат приходится на восстановитель. Факт ускорения ассимиляции нитрата на свету свидетельствует о непосредственном участии фотосинтеза в этом процессе.

Действительно, существующая стехяометрическая связь между восстановлением N0^ и выделением 02, а также образованием КН^ на свету в отсутствие СО,, свидетельствует об использовании восстановителя, образующегося при фоторазложении воды, на восстановление нитрата. Б процессе восстановления нитрата расходуется 20% энергии, генерируемой в виде восстановительной силы при фотосинтезе. При насыщающих фотосинтез интенсивностях света энергии фэтовосстановителя достаточно и для ассимиляции С02, и для фотоассишлядии нитрата. При низких интенсивностях света наблюдается конкуренция между двумя этими акцепторами за фотоЕосстановитель. Расчеты показывают, что дополнительные молекулы АТФ, образующиеся при нециклическом фотофосфори-лирсвании, сопрякенном с восстановлением нитрата, могут расходоваться на поддержание самого процесса ассимиляции нитрата, а также сверх того на ассимиляцию С02 и другие потребности клетки.

Таким образом, совокупность представленных результатов дает основание заключить, что энергетический баланс фогосинтезирунцей клетки обусловлен не только результирующим газообменом,при котором энергия света запасается в продуктах ассимиляции С02, но и'другими фото-эндоэргоническими и фотоокислительными процессами. Энергия света может использоваться на образование соединений различной степени восстановленности, некоторые из которых, как, например, гликолат могут выделяться из клеток и,следовательно, не учитываться в энергообмене; на восстановление такого физиологически важного соединения как нитрат; на активный транспорт неорганического углерода против градиента его концентрации. Индукция С02-концентрирующего механизма в клетках микроводорослей, сопровождающаяся активацией циклического фотофосфорилирования, как показано в работе, может являться внешним выражением эффекта несоответствия. Факты показывают, что завышенное (по сравнению с газообменом) запасание энергии света может быть также обусловлено протеканием фотоокислительных процессов, несвязаннш с фотосинтетическим транспортом электрона, в которых не вся энергш окисления деградирует в тепло, а сопряжена с образованием АТФ. Иг всего этого следует, что превышение истинной скорости запасанш энергии над скоростью, вычисляемой по выделению кислорода, можнс объяснить наличием фотоэндоэргонических (помимо ассимиляции С02) I фотоокислительных процессов.

выводы

Из результатов исследования, изложенных в настоящей работе следует, что потенциальные возможности фотосинтеза в отношении запасания энергии света не ограничиваются лишь совокупностью тех процессов, внешним выражением которых служит газообмен.

1. Эффект расхождения между энерго-и газообменом не может быть объяснен особенностями протекания первичных энергетических процессов фотосинтеза на синем и красном свету. Совокупность опытов, проведенных как с изолированными хлоропластами, так и с целыми фотосинтези-рующими клетками указывает, что квантовые выходы и максимальные (насыщающие) скорости различных типов фотофосфорилирования и переноса электронов не зависят от длины волны возбувдающего света.

2. Обнаружено, что существует тесная связь между выделением в среду гликолевой кислоты клетками хлореллы и особенностями их энергетики. Факторы, благоприятствующие эффекту расхождения, т.е. видимому избыточному запасанию энергии, являются одновременно и факторами пониженного или полностью подавленного выделения гликолата в среду.

3. В отличие от существовавшего мнения, впервые показано наличие фотодыхания у клеток микроводорослей. Фотодыхание проявляется только в процессе адаптации клеток к низким концентрациям углекислоты, т.е. во время индукции механизма концентрирования неорганического углерода. Установлено, что клетки хлореллы способны не только образовывать и выделять гликолевую кислоту, но также способны метаболизировать гликолат с образованием С02 как на свету, гак и в темноте.

4. Эксперименты по действию ингибиторов дыхательной электрон-транспортной цепи на окислительное декарбоксилирование глицина в целых фотосинтезирующих клетках показали, что реакция глицин -> серин в гликолатном метаболизме связана с митохондриальной цепью переноса электронов. В этой реакции часть энергии окисления сохраняется в виде восстановленного Н4Д или АТФ, образуемого при окислении НДДН в ЭТЦ. Таким образом эта реакция может быть ответственна за наблюдаемый в клетках хлореллы эффект расхождения между энерго-и газообменом

5Сформулирована концепция, которая позволяет заключить, что завышенное (по сравнению с газообменом) запасание энергии света может быть, если не полностью, то частично обусловлено сохранением в клетках энергии окисления продуктов гликолатного метаболизма. В энергетическом отношении гликолатный путь может играть такую же роль на свету, которую играет обычный дыхательный метаболизм в темноте, в котором часть энергии окисления сохраняется путем образования НАДН или АТФ и используется клетками на свои мэтабологические нужды.

6. Показано, что индукция С02-концентрирумдего механизма в клетках микроводорослей сопровождается увеличением активности циклического фотофосформирования за счет перераспределения энергии возбуждения между фотосистемами в пользу ФС1, благодаря чему обеспечивается высокая эффективность фотосинтеза в условиях низких концентраций С02.

7. Предложена гипотеза участия механизма концентрирования С02 в эффекте расхождения между энерго- и газообменом. Приводятся результаты ряда экспериментальных данных об участии циклического фотофосфорили-рования в активном транспорте углекислоты внутрь клеток, которые могут служить доказательствами, подтверждающими эту гипотезу.

8. Получены количественные доказательства в пользу прямого использования восстановителя, образующегося при фотсразложении воды, на восстановление нитрата. Показано, что до 20% фотовосстановителя расходуется на процесс редукции нитрата. На плато световой кривой энергии фотовосстановителя достаточно не только для ассимиляции С02, но и для фотоассимиляции нитрата. Конкуренцию за фотовосстановитель можно наблюдать только на линейном участке световой кривой. Обоснована возможность использования АТФ, образующегося при нециклическом фото-фосфорилировании, сопряженном с восстановлением нитрата, на метабо-литические потребности клетки.

9. Сравнительный анализ представленных данных позволяет сделать вывод о том, что наблюдаемое несоответствие между энерго-и газообменом при фотосинтезе обьясняется преобразованием энергии света в энергию АТФ, функция которой не ограничивается лишь участием ее в ассимиляции С02, но и распространяется на разнообразные фотометаболизмы растительной клетки.

Список

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Демидов Э.Д, Крупенко А.Н., Кулаков А.А. (1972) Особенности фото-фосфорилирования и реакции Хилла в присутствии феназинметасульфата. В сб." Биология и научно-технический прогресс", Пущино, 80-83.

2. Demidov E.D., Krupenko A.N., Kulakov A. A. and Bell L.N. (1972) Stimulation of the ferricyanide Hill réaction and coupled photophos-phorylation by phenazine methasulphate. PEBS I/ETTERS, v.21 , N3, 307310.

3. Демидов Э.Д., Белл JI.H. (1973) Влияние синего и красного света на фогофосформирование в изолированных хлоропластах гороха. Физиология растений. 20 (2), 292-299.

4. Демидов Э.Д., Глаголева Т.А. (1973) Сравнение интенсивности циклического фотофосфорилирования у зеленой водоросли хлореллы на синем и красном свету. В сб."Фотосинтез. Проблемы и методы", деп. в ВИНИТИ, 7176-73.

5. Белл Л.Н., Демидов Э.Д. (1974) Качество света и первичные энергетические процессы фотосинтеза. В сб."Итоги исследования механизма фотосинтеза", Пущино, 197-208.

6. Белл Л.Н., Демидов Э.Д. (1974) Применение метода разностной спек-трофотометрии для изучения циклического переноса электронов in vivo. В сб."Методы исследования фотосинтегического переноса электронов", Пущино, 133-138.

7. Devidov E.D., Karapetian N.V. and Bell I.M. (1974) Wavelength independence of light-induced cyolic eleotron transport in Chlorella and Anaoyotis oells. Plant Soienoe Letters, v.3, 87-91.

8. Демидов Э.Д. (1974). Качество света и первичные энергетические процессы фотосинтеза. Автореферат кандидатской диссертации, Москва.

9. Демидов Э.Д., Белл Л.Н. (1977) 0 световом пороге в изолированных хлоропластах. Физиология растений. 24 (2), 424-426.

10. Демидов Э.Д., Керимов С.Х., Карташова Р.Н. (1978) 0 максимальной величине внеклеточного выделения гликолевой кислоты клетками хлореллы. В сб."Биологические основы рационального животного и растительного мира". Зинатне, Рига, 75-78.

11. Demidov E.D., Bell Ь.Н. (1973) bight guality and the primary energy storing prooesses of photosynthesis. Photosynthetica, v.12, N2, 158-165.

12. Демидов Э.Д., Керимов С.Х., Белл Л.Н. (1978) 0 связи между выделением гликолевой кислоты и энергетической обеспеченностью клеток хлореллы на свету. Физиология растений. 25 (5), 1089-1095.

13. Керимов С.Х., Демидов Э.Д., Маслов А.И., Белл Л.Н. (1980). Превращение гликолата и глицина в клетках хлореллы. Физиология растений. 27 (I), 52-57.

14. Демидов Э.Д., Керимов G.X., Бородин В.Б., Белл Л.Н. (I98Q). Фотосинтез и фотодыхание клеток хлореллы, адаптированных к низким и высоким концентрациям углекислоты. Физиология растений. 27 (5), IQI8 -1023.

15. Бородин В.Б., Керимов С.Х., Атаханов Б.О., Демидов Э.Д. (1981). Функциональные и структурные изменения клеток хлореллы, адаптированных к высокой и низкой концентрации С02- В сб."Биологические аспекты изучения и рационального использования животного и растительного мира". Тезисы. Зинатне, Рига, 239.

IG. Демидов Э.Д. (1981) Действие диурона на окисление гликолевой кислоты клетками хлореллы. В сб."Энергетика, метаболитические пути и их регуляция в фотосинтезе". Тезисы, Пущино,

17. Керимов С.Х., Бородин В.Б., Демидов Э.Д. (1981). Фотодыхание,эффект Варбурга и гликолатный путь превращения углерода в клетках хлореллы. Препринт. АН СССР, НЦБИ, Пущино, 1-9.

18. Kerimov S., Demidov E.D.(19S1).Glycolate and glycine oxidation in Chlorella cells. Plant metabolism regulation. Sofia, 74-80.

19. Демидов Э.Д., Керимов С.Х., Бородин В.Б. (1983). Выделение гликолевой кислоты клетками хлореллы, адаптированными к низким и высоким концентрациям С02- В сб."XI Всесоюзное рабочее совещание по вопросам круговорота веществ в замкнутых системах на основе жизнедея тельности низших организмов. Наукова Думка, Киев, 40-43.

20. Бородин В.Б., Демидов Э.Д., Белл Л.Н. (1983). Действие ингибитора карбоангидразы ацэтазоламида на эффект Варбурга и выделение гликолевой кислоты клетками хлореллы. Физиология растений. 30 (5), 931-937.

21. Borodin V.B., Demidov E.D. (1983). Effect of oxygen and aceta-zolamide on photosynthesis and glycolie acid exoretion in Chlorella. Abst. of the III Symp. on Plant Metabolism Regulation. Yarna, Bulgaria, 21-22

22. Borodin V.B., Demidov E.D. (1984). Effeot of oxygen and aoeta-zolamide on photosynthesis and glycolic acid exoretion in Chlorella.

Proc. of the III Sym. on Plant Metabolism Regulation. Sofia, 111-114

23. Бородин В.Б., Демидов Э.Д. (1984). О связи между образованием гликолевой кислоты и фотосинтетическим коэффициентом. В сб."Труды II конференции молодых ученых и специалистов ИПФС". Деп. в ВИНИТИ, 5301

24. Павлова Е.А., Демидов Э.Д. (1985). Фотосинтез и поглощение нит-трата клетками хлореллы. Тезисы Всес. симпозиума "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе". Пущино, 24

25. Демидов Э.Д., Кисилев Г.Г. (1985). Применение методов ионометрии для исследования ассимиляции нитрата клетками микроводорослей. Тезисы Всес. симпозиума "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе. Пущино, 25

26. Бородин В.Б., Демидов Э.Д. (1985). Действие ингибитора карбоан-гидразы ацетазоламида на эффект Варбурга и выделение гликолевой кислоты клетками хлореллы. Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С3-растениях. Валгус, Таллин, 99-103.

27. Демидов Э.Д., Павлова Е.А., Смолов А.П. (1986). Светозависимое восстановление нитрата в клетках хлореллы. Физиология растений. 33 (5), 913-921.

28. Демидов Э.Д. Фотосинтез и • ассимиляция нитрата. (1987). В сб."Азотное и углеродное питание и связь при фотосинтезе" Пущино, 3-19.

29. Pavlova Е.А., Eemidov E.D. (1988). Photosynthetio produotion of ammonium from air nitrogen by oyanobaoterium Anabaena variabilis. Abstraot Int. conierence on biorganic chemistry. Pushchino, 13330. Павлова E.A., Демидов Э.Д. (1989). Фотообразование аммиака клетками цианобактерии Anabaena variabilis. Прикладная биохимия и микробиология. 25 (2), 192-197.

31. Бородин В.Б., Демидов Э.Д. (1989). Фотосинтез и фотодыхание клеток хлореллы, адаптированных к низкой и высокой концентрации С02. В сб."Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях". Тезисы докл. Всес. конф. Пущино, 149-150.

32. Демидов Э.Д., Павлова E.A. (1989). Фотосинтез и ассимиляция нитрата и аммония. Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях. Тезисы докл. Всес. конф. Пущино, 154.

33. Demidov E.D., Pavlova E.A. (1989) Effect oi nitrogen-starvation on oarbonio angydrass (CA) induotion and affinity for inorganio oarbon in. photosynthesis of Chlorella sp.K. Physiologia Plantarum. v.76, Paso.3,part 2 A-204.

34. Демидов Э.Д., Павлова Е.А. (1989). Ассимиляция нитрата и аммония нормальными и азотдефицитными клетками хлореллы. Экологические проблемы накопления нитрата в окружающей среде. Тезисы докл. Всес. конф. Пущино, 106.

35. Демидов Э.Д., Павлова Е.А., Романова А.К. (1989). Участие С02 в восстановлении нитрата и ассимиляции аммония хлореллой. Физиология растений. 36 (5), II64-1170.

36. Демидов Э.Д., Павлова Е.А. (1990) Активность карбоангидразы и сродство клеток Chlorella vulgaris sp.K к С02 в процессе азотного голодания. Докл. АН СССР. 313 (5), 1270-1273.

37. Demidov E.D., Pavlova Е.А. (1990) A study of NOj assimilation by Chlorella cells in the absence of C02- Abst. 7th Congress of PESPP, Umea, Sweden. Physiologia Plantarum. v.79, F.2., 457

38. Демидов Э.Д., Павлова Е.А. (1990). Сродство клеток хлореллы к С02 и активность поверхностно-связанной карбоангидразы. Тезисы 2 съезда Всес. общества физиологов растений (Минск). Москва, 29.

39. Demidov E.D., Pavlova Е.А. (1990). Assimilation of N03 and NH^ by Chlorella cells in the absence of COg. Abst. Soviet-Indian sym. on regulation of photosynthesis. Pushchino.

40. Бородин В.В., Демидов Э.Д. (1991). Экскреция гликолата и фотосинтетический коэффициент у клеток хлореллы. Биологические науки 4 (328), 94-103.

41. Демидов Э.Д., Елфимов Е.И. (1991) Перераспределение энергии возбуждения между фотосистемами в процессе адаптации клеток хлореллы к низким концентрациям С02- Тезисы докл. мекд. конф. Фотосинтез и фото биотехнология. Пущино, 35-36

42. Demidov E.D. (1992). Photosynthetic characteristics of endosym-biotic Chlorella from freshwater sponge Lubomirskia Baicalensis. Abst. 8th"Congress of FESPP, Amsterdam, Belgium. Physiologia Plantarum. v.84. N4 , 703

43. Demidov E.D., Pavlova E.A. (1992) Photosynthesis, respiration and N-assimilation in H-sufficient and H-starved cells of Chlorella. Abst. IX Int. Congress on Photosynthesis. Photosynthesis Research v.34. К 1., 600.

44. Демидов Э.Д., Елфимов Е.И. (1992). Перераспределение энергии возбуждения между фотосистемами в процессе адаптации клеток хлореллы к низкой концентрации С02- Физиология растений. 39 (4), 718-722.

45. Demidov Е. (1992). Photosynthesis, respiration and inorganic

nitrogen assimilation in Chlorella. Abst. Russian-USA workshop on photosynthsis. Pushchino, 42

46. Демидов Э.Д., Павлова E.A., Романова А.К. (1992). Участие фотосинтеза и дыхания в ассимиляции минерального азота клетками хлореллы в норме и при азотном голодании. Физиология растений. 39 (4), 79S-806.

47. Demidov E.D., Eifimov K.I.(1993). Distribution of exitation energy between PSII and PS1 during adaptation of high-CO,, grown cells Chlorella vulgaris sp.K to low COg conditions. Photosynthetica v.27. N 3, 483-487.

48. Демидов Э.Д., Бородин В.Б., Стом Д.И. (1993). Фотосинтез клеток зоохлореллы, изолированных из пресноводной байкальской губки Lubo-mirskia baicalensis. Физиология растений. 40 (5), 810-815.

49. Павлова Е.А., Романова А.К., Демидов Э.Д. (1993). Ассимиляция неорганического азота клетками хлореллы при фотосинтезе. Физиология растений, (в печати)

50. Демидов Э.Д. (1993). Изменение активности циклического фотофос-форилирования в процессе индукции СО^-концентрирующего механизма в клетках зеленой водоросли Chlamidomonas reinhardtii. Физиология растений. (в печати).

Сокращения: ЦФФ- циклическое фотофосфорилирование; СКМ-СО^-коггцентрирующий механизм; ССК- светособираюпий комплекс; ФС-фотосистема; Реси- феррицианид калия; ФМС- феназинметосульфат; БСШ-диурон- 3-(3,4-дихлорфэнил)-1,1-дюлетилмочевина; Хл-хлорофилл; аск-аскорбаТ' Иа; К0 5(С02+НСОд)-константа полунасыщения для общего растворимого неорганического углерода; ЭТЦ- электрон транспортная цепь.

Информация о работе

Демидов, Эдуард Дмитриевич
доктора биологических наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы