Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние света на изменение активности фотосистемы 2 при лимитировании роста водорослей температурой и минеральным питанием

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние света на изменение активности фотосистемы 2 при лимитировании роста водорослей температурой и минеральным питанием"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛВДЮ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

вшш

Дмитрий Васильевич

УДК 581.133.1

ВЛИЯНИЕ СВЕТА НА ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФОТОСИСТЕМЫ 2 ПРИ ЛИМИТИРОВАНИИ РОСТА ВОДОРОСЛЕЙ ТЕМПЕРАТУРОЙ И МИНЕРАЛЬНЫМ ПИТАНИЕМ

Специальность 03.00.02 - бкофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена на кафедре Оиофазики Биологического факультета МГУ

Научный руководитель кандидат биологических наук, ст. в. сотрудник Д.Н.Маторин

Официальные оппоненты доктор биологических наук, зав. лабораторией Н.В.Карадатян доктор биологических наук, вед. н. сотрудник М.Н.Мерзляк

Ведущее учреждение - Биологический институт при Санкт-Петербургском государственном университете

Защита состоится " "....... 1992 г. в " " час.

на заседании специализированного совета К 053.05.68 ш защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук по специальности "биофизика" в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет.

С ,диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " " ....... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета цоктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Свет необходим для протекания фотосянтетических реакций, вместе с тем он является инициатором фотодеструктивных процессов в хлоронластах. Так избыточное освещение вызывает фотоингибирование ФС2 [Ро»1ез, 19841, а также активирует процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран [Мерзляк, 1989], сопровождающиеся фотоокислениэм хлорофилла и гибелью клеток. Эффективное функционирование растительных организмов возможно только в том случае, если репарационные процессы успешно конкурируют с фотодеструктивными реакциями. Высшие растения и водоросли выработали также различные регуляторные механизмы, позволяющие им свести к минимуму эффекты неблагоприятного воздействия света на фотосинтетический аппарат. Например на ярком свету усиливается нефотохимическое тушение энергии возбуждения в реакционном центре и антенне ФС2, что приводит к снижению скорости нециклического электронного транспорта и предотвращает образование в ФС1 супероксид-анион-радикала, способного инициировать окислительные реакции.

Регуляторные процессы, обусловленные действием условий окружающей среда, находят свое специфическое отражение в изменении параметров люминесценции хлорофилла [Каралетян, Бухов, 1986]. В связи с этим методы, основанные на регистрации люминесценции, начинают все шире применяться в гидробиологической практике для диагностики состояния фитопланктона в водоемах [Маторин, Венедиктов, 1990].

Основными экологическими факторами, влияющими на развитие

водорослей, являются свет, температура и условия минерального

питания. Большой интерес представляет изучение их совместного

действия на фотосинтетический аппарат, поскольку его состояние и /-/776

- г -

функциональная активность у водорослей определяются аффектами комплексного влияния факторов окружающей среда.

При исследовании механизмов воздействия тех или иных, факторов на природный фитопланктон важно учитывать, что интенсивность солнечной радиации, падающей на водоросли, не остается постоянной в течение суток. Это обусловливает необходимость постоянной адаптации фотосинтетического аппарата фитопланктона к текущим условиям освещения. Вместе с тем дополнительное воздействие неблагоприятных факторов среда может накладывать определенные ограничения на адаптационные и регуляторные возможности клетки.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование процессов адаптации первичных реакций фотосинтеза в условиях совместного влияния света, температуры и обеспеченности минеральным питанием на фотосинтетический аппарат водорослей.

В соответствии с этим в работе поставлены следующие задачи:

1. Изучить механизмы адаптации фотосинтетического аппарата хлореллы к действию интенсивного света и пониженных температур.

2. Исследовать влияние пониженной температуры и периодического освещения на метаболлтную инактивацию ФС2 у хлореллы, вызванную азотным голоданием.

3. Исследовать влияние света на цроцессы ПОЛ при лимитировании роста водорослей температурой и минеральным питанием.

4. Сопоставить полученные данные с результатами исследований фитопланктона природных водоемов.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование роли светового фактора в изменении активности ФС2 и интенсивности реакций ПОЛ у водорослей при совместном лимитировании их роста температурой и минеральным питанием.

Обнаружены эффекты температурной адаптации скорости репарации поврежденных при фотоингиОированш белков ФС2 у водорослей. Показано, что после адаптации хлореллы к пониженным температурам восстанавливается высокая скорость биосинтеза этих белков. В результате, скорость репарационных процессов у адаптированной культуры хлореллы определяется главным образом условиями освещения.

Установлено, что снижение эффективности использования света в ФС2 при азотном голодании является следствием двух различных процессов. Первый связан с уменьшением фотохимического тушения возбуядения в реакционном центре, второй - с увеличением нефотохимического тушения в ФС2, что проявляется в снижении выхода максимальной флуоресценции хлорофилла. Для восстановления нормального выхода максимальной флуоресценции необходим одновременный синтез белков, кодируемых ядерным и хлоропластным геномами.

Впервые исследовано влияние температуры и минерального питания на активность ФС2 в условиях периодического освещения. Показано, что - регистрация суточной динамики переменной флуоресценции хлорофилла в природных водоемах позволяет судить о природе факторов, лимитирующих развитие фитопланктона.

Научное и практическое значение. Результаты работы расширяют и углубляют представления о механизмах регуляции эффективности первичных процессов фотосинтеза при адаптации клеток водорослей к условиям окружающей среды.

Полученные данные могут быть использованы для разработки люминесцентных методов определения физиологического состояния фитопланктона и величины его первичной продукции в

гидробиологаче ских исследованиях, а также для повышения чувствительности методов биотестирования водной среды, основанных на применении водорослей в качестве тест- объекта.

Апробация работы. Результаты настоящей работы были доложены на заседании секции биофизики Московского общества испытателей природы (22 ноября 1988 года), на VI съезде Всесоюзного гидробиологического общества (8-II октября 1991 г., г.Мурманск), и обсувдены на научном семинаре, кафедры биофизики биологического факультета МГУ.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 6 печатных работ.

Общая структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕШШЕ РАБОТЫ

Глава I. представляет собой обзор литературы.

В части I изложены современные представления о структурно-функциональной организации реакционных центров ФС2 и светособираюцего комплекса у высших растений и водорослей. В части 2 . представлены литературные данные о механизмах возникновения быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла. В части 3 рассмотрены механизмы адаптации фотосинтетического аппарата высших растений и водорослей к условиям освещения, температуры и минерального питания. Приведены данные изучения фотосинтетической активности фитопланктона в природных водоемах.

В конце главы сформулированы цель и задачи работы.

Глава 2.посвящена описанию объектов и методов исследования.

Основным объектом исследования служил термофильный штамм s-639/640688 одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgäris Beijer из коллекции Биологического института ЛГУ. Хлореллу выращивали на среде Тамия в термостатируемых культиваторах при освещении люминесцентными лампами или лампами накаливания. Перед проведением экспериментов водоросли адаптировали не менее двух суток к росту при определенной температуре. Для исследования влияния дефицита азота на водоросли клетки хлореллы отмывали средой, не содержащей нитрата и ресуспендировали в культиваторе в такой 29 среде.

Интенсивность флуоресценции при открытых (Fo) и закрытых Uta) реакционных центрах ФС2 измеряли на даухлучезом флуориметре, в котором флуоресценцию возбувдали слабыми импульсами света лампы-вспышки, а закрывания реакционных центров добивалась подсветкой образца постоянным светом в присутствии диурона. Об эффективности использования поглощенной энергии света судили по отношению Fv/Pra, где Fv=:Fra-Fo.

Интенсивность замедленной флуоресценции хлорофилла определяли на фосфороскопической установке Шаторин и др., 1985]. Измерение спектров ЭПР проводили на отражательном спектрометре РЭ-1307.

О содержании перекисей липидов в клетках водорослей судили по

амплитуде сигнала тэрмолгаинесценции (ТЛ) хлорофилла при +120°С.

При регистрации ТЛ осажденные на фильтре водоросли нагревали в

термоячейке со скоростьв 40 град/мин, температуру контролировали с

помощьв тершэпары, расположенной на поверхности фильтра. В Л// 7i

- б -

Вреия суток, час

Рис.1. Типичные изменения относительного выхода переменной флуоресценции Ру/Рш фитопланктона поверхностных слоев воды в течение суток.

методической части приведены калибрововочные зависимости интенсивности сигнала ТЛ суспензии хлоропластов и липосом из яичного лецитина со встроенным хлорофиллом а от концентрации малонового даальдегида и хлорофилла в образцах.

В главе 3 приведены результаты исследований фитопланктона разных водоемов, свидетельствующие о значительных изменениях эффективности первичных реакций фотосинтеза и содержания перекисей липидов в интактных клетках водорослей под влиянием условий окружающей среда.

Так, действие интенсивного освещения в дневные часы обычно проявлялось в снижении относительного выхода переменной флуоресценции у^/Рт хлорофилла (рис.1) вследствие фотоингибироваыия ФС2. Увеличений свещеиности приводило такие к шзсошодвд перекисей лигаугов в ир^бах фитопланктона. Кроете с том аетнь и дашамана двошаъ шдаагония активности ФС2 оирэдвлялись ш толчет ЕН-гоасившстьв света, ио и другими факторами.

Анализ полученных наш данных и сведений, имеющихся в литературе, показывает, что в природных условиях наиболее характерным является лимитирование развития фитопланктона температурой ши минеральным питанием, а состояние фотосинтетического аппарата водорослей может быть обусловлено действием этак, факторов в условиях переменного освещения.

В главе 4. изложены результаты исследования влияния света, температуры и обеспеченности азотным питанием на фотосинтетический аппарат водоросли Chlorella vulgaris.

В частях 1-2 этого раздела олисаны изменения фотосинтетического аппарата хлореллы при лимитировании роста водорослей температурой в разных условиях освещения.

В условиях, близких к оптимальным (температура 35°С, полная минеральная среда и освещенность 25 Бт/м ), культура хлореллы характеризовалась большой скорость» роста, максимальной активностью ФС2 (?v/Fm~O.B) и практически полным отсутствием сигнала ТЛ.

Уменьшение температуры культивирования водорослей до 11° являлось летальным для данного штамма хлореллы и сопровоадалось постепенным спадом отношения Fv/Pm до нуля и фотодеструкцией хлорофилла. При этом наблюдали значительное, до 10 раз увеличение интенсивности сигнала ТЛ, вызванное, очевидно, массовой табелью водорослей. Понинешга температуры до +5° в темноте не вызывало видимых изменений параметров флуоресценции и интенсивности ТЛ в течение суток. Активация темнового ПОЛ у хлореллы при оллаадении происходила только после проморашшания проб и сопровождалась необратимым падением отношения Jv/Fm.

Следовательно у водорослей нижняя температурная граница

- а -

толерантной зош определяется в значительной степени условиями освещения: температура, являвшаяся для них летальной на свету, не вызывала деструктивных изменений в фотосштетическом аппарате и гибели хлореллы в темноте. Понижение температуры культивирования водорослей в пределах толерантной зоны также вызывало временное уменьшение активности ФС2 вследствие фотоингибирования, но затем, по мере адаптации хлореллы к новым условиям, активность ФС2 постепенно восстанавливалась.

Адаптированные к холоду водоросли имели меньшую скорость роста и более низкое количество хлорофиллов а и ъ в расчете на клетку. При этом содержание активных реакционных центров ФС1, определяемое по амплитуде сигнала I ЭПР, и ФС2, определяемое по стационарной интенсивности замедленной флуоресценции в присутствии диурояа, в расчете на хлорофилл а оставалось постоянным, что свидетельствуют об уменьшении количества фотосинтатических единиц в клетках при лимитировании роста хлоре^-ш температурой.

Подобное изменение размеров фотосинтетического аппарата вероятно является адаптационным механизмом, позволяющим уменьшить образование продуктов первичных реакций фотосинтеза з условиях, когда они не могут быть использованы в биосингетичулгих реакциях.

Часть 3 посвящена изучению причин изменения активности ФС2 при адаптации водорослей к температурному и световому факторам. Как было отмечено в ряде работ, воздействие низких температур на растения резко увеличивает чувствительность фотссинтетического аппарата к фотоингибировани» [Рот?1ев et а1., 19335. Доля инактивированных реакционных центров в фотосинтетическом аппарате при фотоингибировании зависит от соотношения констант скоростей фотоингибирования (К1) и восстановления активности (К^,)

реакционных цантров ФС2 Югеег et а1., 1988].

Для выяснения причин изменения устойчивости к свету у хлореллы мы определили значения этих констант у водорослей, выращенных в разных условиях. Константы скоростей фотоингиОироввния К1 и восстановления Кр, рассчитывали по изменению переменной флуоресценции Уг, используя уравнения:

г^ = ЕХР(-К14) (I)

^ = ^.-(г.^) ЕХР(-^) (2).

1'де г^ и - значения Рт в моменты времени t=Q и t=®. Для вычисления к^ водоросли освещали светом 280 Вт/м2, а КГ определяли, следя за ьисстановлением Рт у хлореллы на слабом свету (3 Вт/м^) после 20-минутного фотоинтибирования ярким светом.

Температурные зависимости констант ^ и ^ для хлореллы,

адаптированной к разным условиям выращивания, представлены на

(рис.2). В оптимальных условиях роста у хлореллы константа

скорости восстановления Кр была много больше константы

фотоинтибирования К1, благодаря чему сохранялась высокая

активность ФС2. Резкое снижение температуры приводит к замедлению

скорости репарации и одновременно к увеличению квантового выхода

повреждения реакционных центров, что отражается соответственно в

уменьшении Кр и увеличении к^. В результате, сразу после смены

условий культивирования, возрастает доля неактивных реакционных

центров ФС2. Адаптация водорослей к низким температурам

сопровождалась восстановлением исходных (до понижения

температуры) значений констант и, сотввтсгвенно, восстановлением

активности ФС2. 3- '? 7 6

Ki, час

-1

6 -

4 -

о—hQ..

Кр,час

2 -

-1

1-

15 20 25 30 15 20 25 30 ос

Рис.2. Влияние температуры на константы скоростей процессов фото-ингибирования (К^) и восстановления активности ФС2 после фотоинги-бирования у хлореллы, выращенной при 15° (Л) 20° (О) и 35°С (О) на свету 25 Вт/м2. Стрелками показаны изменения соответствующих констант после 8-часовой адаптации водорослей к свету 170 Вт/м2.

При резком увеличении освещения константа к^ возрастала пропорционально увеличению интенсивности света, вместе 'с тем изменения константы скорости восстановления К^, по-видимому не происходило [Greer et al.t 1988]. В результате, как и в случае уменьшения температуры, наблюдали временный спад отношения Pv/?m. Впоследствии активность ФС2 постепенно восстанавливалась, адаптация к яркому свету сопровождалась уменьшением к^ и увеличением Кр. Новые значения констант у этих водорослей, также как и у выращенных на умеренном свету, были примерно одинакова у хлореллы, адаптированной к 20° и 35°С (рис.2). Таким образом, в культурах, адаптированных к постоянной температуре и световым условиям, значения констант скоростей фотоингибирования и

восстановления практически не зависят от температуры роста, а определяются интенсивностью освещения.

Известно, что фотоингибирование приводит к уменьшению содержания в хлоропластах так называемого D1-белка, а реактивация ФС2 связана с его ресинтезом в хлоропластах [ohad et al., 1984-].-Поэтому обнаруженные эффекты изменения значений Кр говорят о осуществованш регуляторного механизма, управляющего скоростью синтеза определенных фотосинтетических белков в соответствии со скоростью их повреждения, и направленного на поддержание высокой эффективности использования энергии света в ФС2.

В части 4 рассматриваются причины, вызывающие инактивацию ФС2 при лимитировании роста хлореллы азотным питанием.

У водорослей, помещенных на среду не содержащую азота, увеличение освещенности до 170 Вт/м2 вызывало резкое снижение отношения Fv/Fm. Впоследствии, в отличие от хлореллы, находившейся на полной минеральной среде на ярком свету, восстановления отношения Fv/Fm не происходило. Значения констант скоростей фотоингибирования и восстановления % и Кр у голодавшей У часов на ярком свету хлореллы были соответственно равны 3.51 и 0.22 час-1, в то время как у растущей в тех же световых условиях, но на полной минеральной среде Kj= 2.9, а Кр= 1.49 час-1.

Это означает, что при дефиците азота водоросли не способны увеличивать скорость синтеза DI-белка ФС2 в ответ на действие интенсивного света. В таких условиях скорость синтеза белка по-видимому лимитирована фондом свободных аминокислот, который значительно снижен в голодных клетках [Zehr et al., 1988].

При дефиците азота инактивация ФС2 происходила и в условиях умеренного освещения (25 Вт/м ), что проявлялось в медленном

Ро,РЙ; . отн.ед.

1 -й—

О 6 12 18 24

О б 12 18 24 Время инкубации, час

Рис.3. Восстановление параметров флуоресценции хлорофилла Ро (пунктирная линия), Рю (сплошная линия) и отношения Гу/Гш при темновой и последу щей световой инкубации хлореллы, культивируемой до этого 24 часа на среде без азота на свету 25 Вт/м2 (35°С). □ - восстановление в присутствие НГО3, момент добавления азота отмечон стрелкой; А - контроль, без добавления ЮГО3.

снижении отношения РтУРт до 0.35 к исходу первых суток и до 0.25-0.30 к концу вторых суток после удаления азота. При этом наблюдали постепенное увеличение интенсивности ТЛ, связанное с появлением в суспензии некоторого количества нежизнеспособных клеток.

Как было показано ранее [Чемерис и др. 1990], накопление неиспользуемых продуктов фотосинтеза при недостатке азотного питания вызывало ингибирование переноса электрона от Фео~ на хинон Оа, что проявлялось в возрастании выхода постоянной флуоресценции Ро у голодных водорослей. Реактивация центров ФС2, наблюдаемая на свету после добавления азота, сопровождалась снижением выхода Ро.

Вместе с тем мы обнаружили, что добавление КЮ3 в темноте к голодающим клеткам приводило к значительному увеличению выхода максимальной флуоресценции Рт, при этом интенсивность постоянной флуоресценции Ро не изменялась (рис.3). В результате, отношение Ру/Рш увеличивалось с 0.35 до 0.60. При последующем освещении такой культуры с частично восстановленной активностью ФС2 прноисходило дальнейшее возрастание отношения Ру/Рш до 0.80. но в этом случае реактивация была связана с уменьшением выхода флуоресценции Ро.

Эти данные показывают, что снижение активности ФС2 у хлореллы на умеренном свету при недостатке азота вызвано двумя рззличкыми процессами: уменьшением фотохимического тушения (рост Ро) и увеличением нефотохимичэского тушения энергии возбуждения (спад Рт) в ФС2.

Вклад увеличения выхода Ро и снижения выхода Рт в общее уменьшение флуоресценции Ру различался в зависимости от температуры при азотном голодании. При +15° выход флуоресценции Ро

Рт,

усл.ед.

0.5 -

0 ...........

О а 12 18 24 30 Вреия,час

Рис,4. Тешовоу восстановление выхода флуоресценции Рт у голодной культуры хлореллы в присутствии ингибиторов синтеза белков хлорам-феникола (9 ), циклогексимида (Д , О) или после 5-мин фотоингиби-ривания (х ), пунктиром показано изменение Рт при фотоингибирова-шш. Ингибиторы синтеза белка добавляли сразу (Д , ) или через 4 часа (□ ), а шзэ сразу (Д , V , £3 ) или через 23 часа ( X ) после выключения света.

через 24 часа азотного х'олодания нв увеличивался совсем, а с повышением температуры культивирования степень увеличения выхода 1"о возрастала. Степень тушения флуоресценции Рт в диапазоне от 15° до 40° сравнительно мало зависела от температуры. Вследствие и тот инактивация ФС2, вызванная дефицитом азота, была более выражена у водорослей при высокой температуре, чем при низкой.

Усиление тушения флуоресценции йп на свату умеренной интенсивности не было связано с фотокнгибированием, так как у помещенных е темноту голодных водорослей реактивации ФС2 без добавлении азота но происходило (рис.3). Однако, если перед

затемнением голодные водоросли подвергали воздействию интенсивного света, то это сопровождалось частичным темновым восстановлением отношения Ру/Тш и, соответственно, флуоресценции Рт (рис.4).

Эксперименты с добавлением ингибиторов белкового синтеза показали (рис.4), что для темновой реактивации ФС2 после азотного голодания необходим синтез белков, кодируемых как ядерным, так и хлоропластннм геномами. При этом блокирование восстановления Тт репрессором синтеза ядерных белков циклогексимидом скорее всего не связано с необходимостью ресинтеза фермента нитратредуктазы, который обладает малым временем жизни и инактивируется в отсутствие субстрата. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что циклогегсимид предотвращал восстановление выхода № будучи добавленным через 4 часа после добавления азота^ то есть когда активность нитратредуктазы должна была быть в значительной степени восстановлена [Weger, Тигр1п, 1989].

Таким образом, в зависимости от интенсивности освещения, снижение фотосинтетической активности при азотном голодании может бнть обусловлено как фотоингибированием, так и метаболитной инактивацией ФС2, связанной с накоплением избытка продуктов фотосинтеза. В обоих случаях для восстановления инактивированных реакционных центров ФС2 необходим,синтез белков фотосинтетического аппарата, однако, если восстановление после фотоингибироввния может происходить в отсутствие минерального азота, то для восстановления после метаболитной инактивации наличие азота в среде является обязательным.

В части 5 изложены результаты исследования изменения активности ФС2 хлореллы в условиях, имитирующих естественные суточные вариации освещения. При этом динамика изменения

Ру/Рш ■

о.б:

0.4 -0.2 -

6 12 18 о 6 12 18 0 6

Время суток, час

Рис.5. Влияние периодического освещения на отношение Рт/Тт у хлореллы, культивируемой при 35° (V,О) и 20° ( □) на полной минеральной среде ( V, □ ) и на среде без азота (6 ). Световой режим схематично показан под рисунком, освещенность в разное время составляла 0, 10, НО и 170 Вт/м2. Показаны изменения флуоресценции на вторые и третьи сутки после включения периодического освещения.

параметров флуоресценции у хореллы в течение суток (рис.5) в целом напоминала картину, наблюдаемую в природных водоемах (рис.1).

Сопоставление суточной динамики переменной флуоресценции у хлореллы, растущей в разных условиях; позволило сделать вывод о влиянии температуры на скорость адаптации водорослей к увеличению освещенности. Низкая температура замедляла адаптационные процессы, приводя тем самым к инактивации большей доли реакционных центров и более сильному фотоингибировашш ФС2 в дневные часы. Во второй половине дня фотосинтетическая активность таких водорослей полностью восстанавливалась.

Дневное подавление относительного выхода переменной флуоресценции Рт/Ут ьоледствив фотоингибировения также уоиливвлооь

цри дефиците азотного питания и^-аа неспособности голодных клеток увеличивать скорость синтеза белка на ярком свету. При этом полного восстановления отношения не происходило даже в

темновой период, что было, по-видимому, обусловлено метаболитной инактивацией части реакционных центров-

Закно отметить, что если в условиях круглосуточного постоянного освещения отношение ЗЧ/Рт спадало вследствие метаболитной инактивации до 0.20-С.25 за двое суток роста хлореллы на среде без нитрата, то при периодическом освещении величина Рт/йп уменьшалась за тот же период только до 0.65 (рис.5). В обоих случаях интегральная суточная освещенность была одинаковой, поэтому наблюдаемые различия не связаны с количеством физиологически активной радиации, падающей на водоросли.

Очевидно периодические изменения интенсивности светз приводили к тому, что большую часть времени водоросли находились в несптимальных световых условиях, когда эффективность поглощения и утилизации световой энергии, а соответственно и скорость накопления продуктов фотосинтеза снижены. Следствием невысокой скорости накопления продуктов фиксации 002 являлась более медленная инактивация реакционных центров ФС2 во время азотного голодания на периодическом свету.

В части 6 изложены результаты исследований влияния факторов внешней среди на развитие процессов ПОЛ у хлореллы.

Как было отмечено' в предыдущих частях данной главы, развитие интенсивного ПОЛ, регистрируемое гю амплитуде сигнала ТЛ, обычно коррелировало с необратимыми повреждениями клеток водорослей и снижением выживаемости культуры. Вместе с тем небольшое (в 2-3 рзза) временное увеличение ТЛ, не связанное с гибелью водорослей,

24 48 Тг Вреня,час

Рис.6.Изменение жирнокислотного состава лишдов мембран хлореллы (сплошная линия) и интенсивности высокотемиературыой ТЛ при снижении температуры культивирования с 35° до 20°.

отмечали при снижении температуры культивирования хлореллы с 35° до 15° или 20°С (рис.6).

Наблюдаемая вспышка ТЛ по- видимому отражала протекание физиологических процессов, связанных с температурной адаптацией мембран, поскольку период, в течение которого отмечали повышенную интенсивность ТЛ у анкдимируемой к 20° хлореллы (около 1.5 су т.), совпадал с продолжительностью адаптации к новым условиям кирнокислотного состава линидов мембран этих водорослей (рис.6).

Известно, что интенсивная инсоляция хлорофиллсодержащих объектов приводит к развитию окислительных процессов. Мы исследовали влияние различных условий выращивания хлореллы на ее устойчивость к ПОЛ, индуцированному ярким (2000 Вт/м2) светом.

Поскольку адаптация хлореллы к пониженной температуре ■¡•ишвдалась сильными изменениями кирнокислотного состава клеток

в сторон/ увежчеиия дож нэкасшаэниых жирных кислот (рис.6), а иошвеное содвржаий.« аарныг. кислот с двойшши связями делает йэмбраны более чувствяхэльшма к окислению, моано предполагать ваевуа роль яипадаого состава клеток в устойчивости водорослей к фотогаздуццровашюму ПОЛ. Те;,? не менее в наших экспериментах кинетика нерастзная сигнала ТЛ в ответ на действие интенсивного света пражгичэсхи совпадала у хлорллн, выращенной upa 20° и 35°, то ость книжная в анрнокзслотаом составе мембран но влияли на устойчивость водорослей к ПОЛ tn vivo.

Воэмоаао, увеличение доли ненасыщенных жирных кислот компенсировалось накоплением в мембранах повышенных концентраций аяггонсидатыов или действием других защитных механизмов, связанных, например, с уменьшением содержания хлорофиллов в кгетках. Вследствие этого водоросли, адаптированные к низкой температуре, не отличалась повышенной чувствительностью к развитию окислительных процессов в мембранах.

Вместе с тем обнаружено заметное ускорение (в несколько раз) развитая фотовдуцировенного ПОЛ, если экспонированию на интенсивном свету подвергали хлореллу после азотного голодания. При этом наблюдали сильное сокращение продолжительности индукционного периода, что очевидно свидетельствует о значительном уменьшении пула актиоксадантов в клетках, вызванном дефицитом азота.

Таким образом, ^матирование роста '«одорослей минеральным питанием, но не температурой, резко снижает .устойчивость хюролды к фотоиндуцироваштому ПОЛ. Увеличение сигнала 1'Л происходило и при умеренной иатеаснваости ссаащетш у голсцшсй хзурелли, коатому можно предполагать, что иайавдаэмое дшнюое усяж-нке ТЛ в ¡гробах

- 2С -

природного фитопланктона чаото бывает обусловлено дефицитом элементов минерального питания-

Заключение. Результата проведенной работы свидетельствует* об определяющей роли светового фактора в изменении эффективности первичных реакций фотосинтеза, а также в развитии деструктивных процессов в мембранах хлоропластов.

Продолжительное, в течение недель, затемнение водорослей сопровождалось постепенной инактивацией ФС2, связанной, вероятно, с цроцессами старения. При этом клетки длительное время сохраняли жизнеспособность, а их устойчивость к низкой температуре и дефициту минерального питания была существенно выше в темноте, чем на свету. По-видимому, вызывание популяций водорослей в водоеме в неблагоприятных условиях может также происходить за счет клеток, находящихся на большой глубине, где интенсивность освещения близка к нулю.

На свету, на полной минеральной среде, активность СС2 хлореллы могла снижаться при изменении тешературных или световых условий выращивания вследствие фотоингабирования. При этом адаптивные реакции водорослей были направлены на восстановление высокой активности фотосиптетического аппарата, в частности за счет увеличения скорости синтеза определенных белков ФС2. Скорость адаптации хлореллы к нсвым световым условиям была максимальной при оптимальной температуре роста.

При дефиците езотного питания, когда скорость роста водорослей и, следовательно, потребность в продуктах фотосинтеза снижены, адаптивные реакции наоборот приводили к уменьшению активности ФС2. Снижение эффективности первичных реакций фотосинтеза у хлореллы во время азотного голодания было

обусловлено двумя различными процессами: первый связан с уменьшением фотохимического тушения, второй - с увеличением нефотохммического тушения возбуждения в ФС2.

Полное восстановление фотосинтетической активности у голодных водорослей было возможно только после добавления азота. Поэтому в условиях периодического освещения часть реакционных центров были инактивированы у растущей без нитратов хлореллы даже в ночной период.

Низкая активность ФС2, часто регистрируемая в вечерние и ночные часы у природного фитопланктона, отбираемого с поверхности воды, также могла быть связана с недостатком элементов минерального питания. В свою очередь лимитирование роста поверхностного фитопланктона низкими температурами должно проявляться в сильном дневном фотоингибировании ФС2 при полном восстановлении ее активности к вечеру. В оптимальных условиях роста эффект фотоингибировании очевидно выражен слабо из-за высокой скорости адаптации фотосинтетического аппарата водорослей к меняющейся интенсивности света.

Таким образом, регистрация суточной динамики относительного выхода переменной флуоресценции, характеризующего активность ФС2, может быть использована для выяснения причин, сдерживающих развитие фитопланктона в природных водоемах.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано влияние светового фактора на состояние фатосинтетического аппарата хлореллы при лимитировании роста водорослей температурой и азотным питанием. Показано, что активность ФС2 хлореллы, растущей на полной минеральной среде, определяется соотношением констант скоростей процессов фотоингибирования и восстановления активности реакционных центров. Понижение температуры или увеличение освещенности при культивировании водорослей вызывает временный спад активности ФС2 из-за изменения значений этих констант.

2. Показано, что вдаптация хлореллы к низкой температуре или яркому свету сопровождается восстановлением активности ФС2 вследствие уменьшения константы скорости фотоингибирования и увеличения константы скорости восстановления. У хлореллы, адаптированной к новым условиям, значения этих констант, определенные при температуре выращивания водорослей, зависят главным образом от интесивности освещения культуры. Полученные данные указывают на существование у водорослей механизма, регулирующего скорость синтеза определенных белков 4С2 и направленного на поддержание высокой эффективности использования энергии света в реакционных центрах.

3. Обнаружено, что дефицит азотного питания вызывает обратимую инактивацию ФС2, проявляющуюся в уменьшении фотохимического и усилении нефотохимического тушения возбуждения в ФС2. Последнее проявляется в избирательном подавлении выхода максимальной флуоресценции хлорофилла и не связано с

фотоингибированием. Для реактивации комплексов ФС2 с низким выходом максимальной флуоресценции необходим синтез белков, кодируемых ядерным и хлорошшстным геномами.

4. Методом высокотемпературной ТЛ исследовано ПОЛ хлореллы и природного фитопланктона. Обнаружено усиление ПОЛ в пробах фитопланктона поверхностных вод в дневные часы. У хлореллы многократное увеличение интенсивности ТЛ при разных воздействиях коррелировало с появлением в суспензии мертвых клеток, вместе с тем некоторое обратимое увеличение сигнала ТЛ, не связанное с гибелью, водорослей, наблюдали при адаптации культуры к низкой температуре. .

5. Изучено влияние температуры и обеспеченности минеральным питанием на фотохимическую активность ФС2 у водорослей, растущих в условиях периодически меняющегося освещения. Показано, что лимитирование роста водорослей низкими температурами мокет проявляться в сильном дневном фотоингабированяи ФС2 при полном восстановлении активности реакционных центров в ночной период. При лимитировании развития водорослей. минеральным питанием полного восстановления активности ФС2 в ночной период не происходит.

ч

6. Полученные данные свидетельствуют о том, что регистрация суточной динамики относительного выхода переменной флуоресценции и интенсивности высокотемпературной ТЛ могут быть использованы для определения факторов, лимитирующих развитие фитопланктоне в природных водоемах.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СУВДУВДИЕ РАБОТЫ:

Вавшшн Д.В., Левенко Б.А. Суточная динамика переменной флуоресценции фитопланктона Белого моря и ее связь с факторами внешней среды. // Доклады МОИП. Общая биология. 1988. с. 41-45.

Маторин Д.Н., Вавилин Д.В., Кафаров P.C., Венедиктов П.С. Высокотемпературная термолюминесценция хлорофилла как метод исследования перекисного окисления липидов в растениях. // Доклады АН СССР. 1989. Т.ЗОЭ(З). с.764-768.

Маторин Д.Н., Вавилин Д.В., Попов И.В., Венедиктов П.С. Метод биотестирования природных вод с применением регистрации замедленной флуоресценции микроводорослей. // В об: Методы биотестирования качества водной среды. М., изд-во Моск. ун-та, 1989, с.10-20.

Вавилин Д.В., Маторин Д.Н., Кафаров P.C., Баутина А.Л., Венедиктов П.С. Высокотемпературная термолюминесценция хлорофилла при перекисном окислении лшшдов. // Биол. мембраны. 1991. Т.8 (I), с. 58-63.

Венедиктов П.С., Изместьева Л.Р., Маторин Д.Н., Васильев И.Р., Вавилин Д.В. Оценка физиологического состояния фитопланктона Байкала люсминесцентными методами. // В кн.: Мониторинг фитопланктона. Новосибирск. Наука, 1992. С.

Изместьева Л.Р., Венедиктов П.С., Маторин Д.Н., Васильев И.Р., Вавилин Д.В. Оценка функционального состояния байкальского фитопланктона в летний период. // В кн.: VI Съезд Всесоюзного гидробиологического общества (8-II октября 1991 г.). Мурманск, 1991.' C.I84-I85.