Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Воздействие природных факторов среды и антропогенных загрязнений на первичные процессы фотосинтеза микроводорослей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Воздействие природных факторов среды и антропогенных загрязнений на первичные процессы фотосинтеза микроводорослей"

РГ6 од

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 581.133.1

МАТОРИН Дмитрий Николаевич

ВОЗДЕЙСТВИЕ ПРИРОДНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ И АНТРОПОГЕННЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ НА ПЕРВИЧНЫЕ ПРОЦЕССЫ ФОТОСИНТЕЗА МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Специальность 03.00.02— биофизика

03.00.18 — гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва —

1 993

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н. В. КАРАПЕТЯН; доктор физико-математических наук, профессор В. В. ФАДЕЕВ;

академик РАН М. Е. ВИНОГРАДОВ.

Ведущее учреждение — Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Защита состоится » ноября 1993 г. в « ) У ^ » час.

на заседании специализированного совета Д 053.05.53 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет (ЛИК).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « ^ »_о '-1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

профессор Т. Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка__проблемы__и__ее_актуальность: первичное органическое

вещество, на базе которого строится вся пищевая пирамида водных экосистем, образуется за счет фотосинтетической деятельности фитопланктона. Центральное место в этом процессе принадлежат первичным световым стадиям фотосинтеза, в которых с высокой эффективностью происходит преобразование световой энергии солнца в энергаю химических связей. Благодаря работам ведущих отечественных и зарубежных исследовательских групп ( А.А.Красновский, А.Б.Рубин, А.. П. Борисов, в.а.Шувалов, Ф-Ф.-Читеин, Л.л.Блямэнфэльд, Н.В.Карапетян, А.К.Кукушкин, В.В.Климов, С.М.^очубей, Р.Клейтон, Л.Дейзенс, Ч.Арнтцен, Говиндаи, Дк.Барбер и др.) достигнут существенный прогресс в понимании функционирования фотосинтетического аппарата мембран хлоропластов.

В последнее время наибольшее внимание ученых привлекают" проблемы изучения структурно-молекулярной организации фотосистемы II (ФСП), поскольку тленно ее функционирование сопряжено с уникальными биологическими процессами окисления воды и Ецделепия кислорода, во многом определившимиразвитие жизни на Земле. Удалось установить, что реакционный центр (РЦ) этой фотосистема состоит из двух полипептидов, на одном из которых, Б1 белке, расположены основные переносчики электронов РЦ . Успехи в раскрытии структурной организации ФСП позволили подойти к исследованиям механизмов функционально-генетической регуляции активности ФСП в интактной клетке микроводорослей под влиянием факторов среды. Ухудшение экологической ситуации на планете сделало весьма актуальным также изучение этих процессов у водорослей в водных экосистемах. . В природных условиях антропогенные загрязнения на фоне неблагоприятных факторов среда обитания во многих водоемах могут оказывать существенное влияние на фотосинтетический аппарат водорослей, что в конечном счете долгою изменять продуктивность во всей экологической системе.

Однако, вопросы функционирования первичных процессов фотосинтеза у популяций фитопланктона в природных условиях и воздействия на них естественных факторов среды и загрязнений мало изучены, и эти исследования пока не входят в комплекс экологических исследований. Выяснение закономерностей влияния экологических

факторов на функционирование фотосинтетического аппарата состояние мембран клеток микроводорослэй . имеет важное ка .фундаментальное, так и практическое значение для разработк подходов к прогнозированию изменения продуктивности водны экосистем и методов слежения за состоянием водной среды. Цель и задачи исследования: Основная цель настоящего исследовани состояла в изучении механизмов регуляции световых реакци фотосинтеза клеток микроводорослей при действии природных факторо среда и антропогенных загрязнений, а также исследование эта процессов у популяций фитопланктона в естественных водоемах.

Так как в процессах адаптации клеток важнейшую роль играв функционирование мембранной системы, в которую входят и тилакощ хлоропласта, необходимо было изучить процессы перекисног окисления лшшдов (ПОЛ), характеризующие состояние липидов мембрг при воздействии на живую клетку неблагоприятных факторов.

Для . проведения исследований на сообществах фитопланктоне концентрация которого во многих районах Мирового океана чрезвычай мала, требовалось разработать ряд методических подходов аппаратуру, которые позволили бы получать информацию о первичш реакциях фотосинтеза и ПОЛ в природной среде.

В соответствии с этим в диссертации были поставлены следующ экспериментальные задачи:

1. Разработать новые методические подходы для изучен функционирования первичных процессов фотосинтеза и ПОЛ природное фитопланктона в естественной среде обитания на основе использован различных параметров лшинесценции хлорофилла.

2. Изучить механизмы влияние основных экологических фактор (свет, минеральное питание, температура) и вирусного заражения з функционирование процессов фотосинтеза и ПОЛ у культ микроводорослей и природного фитопланктона, а также процэ адаптации клеток к этим факторам.

3. Исследовать механизмы изменения чувствительности реакц фотосинтеза микроводорослей к низким концентрациям антропогенн загрязнений при варьировании природных факторов среды и на ба этих исследований усовершенствовать методы биотестирован природных и сточных вод.

Научная^новизна^ Разработаны методические подходы и аппаратур позволяющие изучать характеристики первичных процессов фотосинте

и ПОЛ у природного фитопланктона в естественной среде обитания. Показана корреляция активно сти ФСП глеток с продукционными характеристиками фитопланктона для разных вод и районов Мирового океана.

Показано, что устойчивость TCII микроводорослёй к неблагоприятным факторам на свету определяется соотношением констант процессов фотоповреждения и восстановления активности ФСП (репарации), обусловленной ресинтезом DI белка РЦ. При неблагоприятных температурах, недостатке минерального питания, вирусном зарзггеняи к действии содей тяжелых мэтяллов скорость репарации замедляется, что приводят к пншстпвзцгп: РЦ ICII. Обнаружены эффекты температурной и световой адаптации скорости процессов репарации РЦ ФСП.

Обнаруаена хемилшинесценция в хлорофилл содержащих клетках, возникающая при ПОЛ. Это явление было впервые использовано для. изучения ПОЛ мембран микроводорослей. Показано, что развитие фотоиндуцированного процесса ПОЛ у клеток водорослей в неблагоприятных условиях сопряжено с гибелью клеток. Впервые исследован процесс ПОЛ у природного фитопланктона и показано, что в поверхностном слое у фитопланктона развивается свзтопндуцированное ПОЛ, усиливающееся в неблагоприятных условиях.

Исследовано влияние экологических факторов на чувствительность первичных процессов фотосинтеза водорослей к -фоновым загрязнениям солями тяжелых металлов и другими веществами. Обнаружено резкое усиление чувствительности ФСП культур микроводорослей и природного фитопланктона к солям тяжелых металлоз в условиях светового и температурного стресса. Впервые показано наличие второго места действия на донорном участе ©311 для гербицидов, связывашихся с DI белком. Продемонстрировано изменение сродства гербицидсвязывавдих мест под действием факторов, влияпцих на конформацшо белков.

Полученные данные позволили сформулировать концепцию о регулирований начальных этапов фотосинтетических процессов в РЦ ФСП у микроводорослей на клеточном уровне . Результаты показали вакнуго роль активности ФСП в изменении фотосинтетической продукции водоема, что позволило обосновать необходимость применения люминесцентных методов для прогнозирования состояния и продуктивности фитопланктонных сообществ в естественных водоемах.

Научная и практическая значимость работы. Полученные в работе экспериментальные результаты и обобщения вносят существенный вклад в понимание адаптационных процессов у природного фитопланктона, приводящих к изменению общей фотосинтетической продуктивности. Они также является основой для использования методов быстрой в замедленной флуоресценции и высокотемпературной термолюминесценции (ТЛ) хлорофилла для зондирования активности фотосинтеза и жизнедеятельности клеток фитопланктона в гидробиологических в океанологических исследованиях. Разработанная на базе проведенных исследований бортовая и погружная аппаратура, выполненная не современном уровне, может быть использована в практических экологических исследованиях.

На основе методических разработок, представленных ъ диссертации, предложены и защищены авторскими свидетельствами: "Способ определения гербицидаой активности химических соединений"; "Способ определения степени повреждения растительных клеток прг действии неблагоприятных факторов среды"; "Способ определение эффективности защиты подводной поверхности от обрастания"; "Измеритель первичной продуктивности фитопланктона",

Разработанные методы внедрены в ВНИИ химических средств защита растений, ВШОбумпром, институте ботаники АзССР, Азербаджанско» университете, Российской станции защиты растений, Севанско! гидробиологической станции, в Берлинском университете, институте биологии моря г. Котор, Югославия.

Разработанные методы биотестирования прошли Государственны( испытания и рекомендованы к первоочередному внедрению (решение ВНЛ по комплексным проблемам охраны окружавдей среды и рациональном: использованию природных ресурсов при ГККГ). Метод биотестироваши удостоен серебряной медали ВДНХ и отражен в ряде методические указаний (сб.:"Метода биоиндикации и биотестирования природпы: вод" Гидрометеоиздат,1Э87; "Методы биотестирования вод" Черноголовка, 1988; "Методы биотестирования качества водной среды' МГУ,1989)

Материалы исследований используются в курсе лекций, а такж для постановки задач практикума по биофизики для студентов.

Апробация работы: Материалы работы были представлены на I'

Международном биофизическом конгрессе, Москва, 1972; Всесоюзно]

симпозиуме"Биофизические аспекты загрязнения биосферы", Москва, 1973; Х11 Международном ботаническиом конгрессе, Ленинград, 1975; XIY Международном генетическом конгрессе, Москва, 1978; II к IY Международных конференциях по люминесценции, Сегед, (ВПР), 1979 и 1982; I Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; Международной конференции по биоконверсни солнечной энергии, Пущине, 1983; Всесоюзном совешании по лимнологии горных водоемов, Севан, 1934; Всесоюзном симпозиуме "Биохемилюминесценция г. медицине и сельском хозяйстве", Ташкент, 1986; Всесоюзной

конференцип"Преобразование световой энергии в фотосинтезирущих системах к их моделях", Пушино, 1989; III Всесоюзной конференции "Проблемы экологии Прибайкалья",. Иркутск, 1988; Всесоюзной конференции по морской биологии, Севастополь, 1988,; Научно-практическом совещании "Применение биотестирования в решении экологических проблем" Иркутск, 1989; Советско-индийском симпозиуме. "Регуляция фотосинтеза", Пущино, 1990; Международном семинаре по люминесцентным методам зондирования фитопланктона, Сопот, Польша, 1990; XI Международном биофизическом конгрессе, Будапешт,1993.

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на специализированных научных семинарах в Московском и Иркутском государственных университетах, в Институте биологии моря г. Котор, Югославия и в Институте океанологии ПАН .Польша.

Публикации:по материалам диссертации опубликовало свыше 55 работ~в~отёчёственных и зарубежных изданиях, в том числе Бстатей обзорного характера. Получено и внедрено ^ авторских свидетельства.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.Методические__аспекты_^спользовзния__дамин

2.1. Объекты исследования и характеристика районов работ. Работа проводилась на культурах пресноводных (Chlorella vulgaris, Anacystis nldulas, Anabaena varlaMlia ) и морских (Phaeodactylum trlcornutum, Nephrochlorls sallna) водорослей, а также на популяциях природного фитопланктона из разных по трофности пресноводных ( Можайское водохранилище, р.Москва, оз.Байкал) и морских водоемов ( Тихий и Антлантический океаны, Средиземное, Черное и Белое моря).

Представленные данные получены в экспедициях на НИС "Башкирия" I979-1980; НИС " Ак.Несмеянов "1982 ;НИС "Ак.Виноградов"

1986; НИС "Гидробиолог"1988; НИС "Дм. Менделеев" 1990; НИС Московский Университет" 1990,1991. В работе использованы различии биофизические и биохимические метода, включавдк спектрофотометрические' и флуоресцентные методы, мете микрофлуорометрии и ЭПР. В исследованиях фитопланктона применен методы измерения концентрации хлорофилла, фотосинтетическс продукции и определения видового состава. Задачи исследованг потребовали разработки методических подходов в использован* быстрой ' (БФ) и замедленной (ЗФ) флуоресценции хлорофилла да зондирования состояния фитопланктона, а также разработки hoboi метода определения количества гидроперекисей в клеткг фитопланктона, и создание соответствующей высокочувствительнс аппаратуры.

2.2.Разработка люминесцентных методов для изучения фотосинтеза и I ' природного фитопланктона.

Методы и аппаратура для измерения__быстрой флуоресценции

хлорофилла.

Флуоресцентные метода используют в гидробиологичесга исследованиях главным образом для оценки количества фитопланктон! (borenzen.1966; Карабашев,1987; Фадеев,1Э89; Гольд,1989 и др.). последнее время начинают применять флуоресценцию для оценз фотосинтетической активности (Vincent, 1983; Bates, 198.' Falkowski,Kiefer,.1985). Фоновая флуоресценция (PQ), возникает п] слабом освещении в условиях, когда РЦ находятся в открыт« состоянии, и почти вся поглощенная энергия используется в процесс! фотосинтеза. При ингибироваяии потока электронов в присутстн даурона (закрытый РЦ) константа скорости фотохимичесю дезактивации приближается к нулю и выход флуоресценции достига! максимального значения (Рга). Разницу между интенсивностя] флуоресценциями при закрытых и открытых РЦ ( Ру=Рт-Ро) называ: переменной флуоресценцией хлорофилла и она соответствует той час анергии света, которая используется открытыми реакционными центра в процессе фотосинтеза. Показано, что отношение Fv/Pra отраха квантовый выход первичной фотохимической реакции разделения заряд в РЦ ФОН (Denmlg et al., 1989).

Для экспериментов в лабораторных условиях мы использова различные типы аппаратуры с постоянными и импульсными источника возбуждения и анализом кинетик разгорания флуоресценции

компьюторе. Для работы с природным фитопланктоном нами был разработан совместно с сотрудникам фирмы "Экомонитор"• (рук.D.Конев) погружной импульсный флуориметр с двумя импульсными латами, позволяющий проводить зондирование параметров флуоресценции с одновременной регистрацией температуры и подводкой освещенности до глубины 200 м, то есть до границы фотического слоя в олиготрофкнх водах. В зонде при освет&нш слабой зондирующей вспышкой измерялась F , тогда как использование второй мощной вспышки с энергией I Дж позволяло регистрировать í^/F^. способ регистрации эффекта усиления флуоресценции, при котором кратковременное запирание реакционных центров фотосинтеза вызывается мощной вспышкой действующего света был ранее описан в работах (Paikowski Р., 1991). Регистрация количества фитопланктона по F , фотосинтетической активности по Fv/Frn и интенсивности освещения на данном горизонте позволяет рассчитывать фотосинтетическую продукцию , которая может быть откалибрована для каждого водоема по классическим методам с использованием радпоктивного углерода С^4 ( Хромов,Семин,1975;). Погружной блок зонда работал под управлением персонального компьтера. Графики вертикальных или горизонтальных профилей параметров флуоресценцш (F0,F /Fm), температуры и освещенности отображались на экране компьютера -в реальном времени. Обработка получаемой информации с помощью специальных программ позволила быстро получать информацию о распределении флуоресцентных параметров фитопланктона по глубине и по разрезам.

Такие разрезы были построены наш для разных районов Черного,

Средиземного морей и оз. Байкал. Проведенный анализ связи параметров флуоресценции с концентрацией хлорофилла подтвердил известный из литературы факт, что Fo хорошо коррелируют с концентрацией хлорофилла. Для летнего фитопланктона Черного моря коэффициенты корреляции меэду ?0 и хлорофиллом составляли 0,95.

_иетоды_регистрации__замедленной_флуоресценции_йля__изучения

ФС11__приро^ого_фитощанктонал

Для изучения функционирования ФСП возможно использовать также метод регистрации замедленной флуоресценции (strehler,l95i) ЗФ испускается в процессе обратной рекомбинации первичных фотопродуктов в ФСП и' зависит от интактности РЦ (Bertsoh et.al.,1967; Amesz.1986), В общей форме процесс ЗФ можно представить

следующей формулой:

-Г^-Ен)

+ - ИЗ?

ь = V • ^озб [р А 1к' е

где ь-интенсивность ЗФ из единицы объема; т^ квантовый выход флуоресценции; т;воз0-доля актов рекомбинации, приводацих к возбуждению хлорофила ;к-константа скорости рекомбинации ; [Р+А~Ь концентрация РЦ ФОН с разделенными зарядами; АЕ - энергия активации для реакции рекомбинации; Ец- величина электрохимического градиента протонов на тилакоидной мембране.

Из уравнения видно, что интенсивность ЗФ пропорциональна количеству РЦ с разделенными зарядами, концентрация которых зависит от скорости последущих стадий переноса электрона. Метод регистрации ЗФ, в отличие от БФ, для изучения фотосинтегической активности природных фитопланктонных сообществ ранее не использовался. Это связано с отсутствием ясных представлений о механизме генерации ЗФ и связи ее параметров с функционированием отдельных реакций фотосинтеза. Поэтому нами была проведена работа по изучению природы ЗФ и возможности ее использования для изучения физиологического состояния растительной клетки. (Маторин и др., 1985; Маторин,Венедиктов,19Э0). В ходе проведенных экспериментов был проанализирован компонентный состав ЗФ в диапазоне от 0,5 мсек до минут, световые зависимости и зависимости параметров компонент от функционирования отдельных процессов фотосинтеза, свойств тилакоидных мембран и величины электрохимического градиента протонов. Показано, что по параметрам световой зависимости ЗФ в присутствии диурона можно оценить количество РЦ ФСП и размер светособиракщей антенны ФСН при условии, что константы скорости переноса электронов в РЦ не изменяются. Последнее можно установить по постоянству времени затухания ЗФ. Анализ световых зависимостей ЗФ в присутствии диурона выявил их двухкомпонентность, которая связана с наличием 2х типов РЦ ФСН (с высоким и низким квантовым выходом восстановления Оа).

На основании анализа литературы (Ьауоге1,1975; Ма1к1п,1977^ Атезг;,1986 ) и наших исследований, проведенных на модельных системах и мутантах водорослей с различными нарушениями е

фотосинтетическом аппарате, был выделен ряд параметров ЗФ (индукционные зависимости, кривые затухания в различном временном интервале, световые кривые, изменения ЗФ на ряд вспышек). Это позволяло получать информацию в интактннх клетках природного фитопланктона о состоянии фотосинтетического аппарата, включая процессы энергизации тилакоидных мембран. Параметры ЗФ были использованы нами при изучении фотосинтеза водорослей в разных экологических условиях.

Для измерения параметров ЗФ была разработана соответствушая бортовая аппаратура, которая позволила проводить исследования ЭФ при низкой концентрации фитопланктона. Совместно с сотрудником ТОЙ ДВО С.Захарковым разработан погружной вариант установки для регистрации миллисекундной ЗФ в естественных условиях.

Исследования, проведенные на этой аппаратуре, показали, что амплитуда индукционного максимума ЗФ хорошо отражает распределение, фитопланктона в океане. Это проявлялось в близких по форме кривых распределения амплитуда ЗФ и концентрации хлорофилла а по глубине в разных районах Мирового океана. Коэффициент корреляции между ЗФ и концентрацией хлорофилла в целом для всех водных масс в Тихом океане составил 0,723. Самый высокий коэффициент наблюдался в субарктических водах (0,814), и по мере продвижения к экватору его значение уменьшалось.

Пропорциональность интенсивности ЗФ количеству активно функционирующих РЦ ФС II позволила предложить метод ЗФ для оценки фотосинтетической продуктивности фитопланктона. Параллельное измерение амплитуды ЗФ и фотосинтетической продукции выявило хорошую корреляцию между этими параметрами при отборе проб, взятых в определенное время суток в поверхностных водах. Коэффициент корреляции составил 0,9 для проб, взятых на 70 станциях в Балтийском и Средиземном морях и на разных станциях Индийского и Тихого океанов , что согласуется с данными ( г-таИпзку, 1990).

Люминесценция хлорофилла при__перекиспом__окислении липидов

мембран_во£орослей.

Для изучения процессов ПОЛ в тканях растений применяют разные методы и подходы, которые, однако, трудно использовать при работе с микроводоросляш (Мерзляк, 1989). Поэтому число работ на культурах микроводорослей незначительно,' а для природного фитопланктона они отсутствуют. В настоящее время при исследовании ПОЛ животных тканей

используется регистрация слабой хемилшинесцэнции, сопровождающая этот процесс (Владимиров,Арчаков,1972; Иванов,1986 ). В отличие от животных и непигментированных тканей растений, хемилшинесценция, связанная с ПОЛ, для хлорофилсодержащих клеток не была описана до наших исследований.

Мы обнаружили, что длительное интенсивное освещение хлоропластов и водорослей вызывает появление медленно затухающей люминесценции хлорофилла в красной области спектра, связанной с реакциями продуктов ПОЛ. Эта хемилшинесценция появлялась после полного фотоингибирования реакций ФСП. Хемилшинесценция уменьшалась в анаэробных условиях и при добавлении к хлоропластам перед освещением ингибиторов ПОЛ -квертицина, глютатиона, тайрона, азида натрия, гидрохинона или супероксиддасмутазы. Хемилшинесценция возрастала при освещении хлоропластов в среде с Д,0 или при добавлении метилвиологена, усиливающих фотошдуцированное ПОЛ в хлоропластах (Takahama 1979, Мерзляк, Погосян,198б). Обнаруженная нами хемилшинесценция может быть инициирована в хлоропластах без освещения путем добавления к хлоропластам гидроперекиси кумила или продуктов окисления олеиновой кислоты.

При повышении температуры время затухания хемилюминесценции хлоропластов уменьшалось, а интенсивность ее существенно возрастала, достигая максимума при 120°С (высокотемпературная ТЛ). Ранее ТЛ при 120°С была зарегистрирована на сухих пленках хлоропластов (Arnold,1959). Изучение параметров хемилюминесценции хлорофилла при комнатной и высокой температуре показало, что эти процессы имеют сходный механизм, одинаковым образом зависят от интенсивности и времени освещения, концентрации 02, активаторов и ингибиторов ПОЛ. Высокотемпературная ТЛ могла быть инициирована также без освещения путем добавления органических гидроперекисей. Энергия активации свечения, рассчитанная как по интенсивности, так и по скорости затухания хемилшинесценции, составляла около 19,2 кДж/моль и была близка к таковой для процесса распада гидроперекисей липидов в модельных системах (Васильев,1983). На хлоропластах показана пропорциональная зависимость между амплитудой ТЛ и количеством добавленной в темноте гидроперекиси кумила, а также между амплитудой высокотемпературной ТЛ и накоплением продуктов ПОЛ (МДА) при интенсивном освещении хлоропластов в

присутствии активаторов или ингибиторов ПОЛ.

Данные, полученные нами в эксперимеь.тах с л*посомами, инкрустированными хлорофиллом, позволили связать обнаруженную хемплюминесценцмо с известным процессом спонтанного распада гидроперекисей лплтщов, в ходе которого образуются электронно-возбужденные карбонильные продукты, способные с высокой эффективностью передавать энергию возбуждения на хлорофилл (Кззз1,С11еп1;о, 1933;).

Проведенные эксперименты позволили предложить метод регистрации высокотемпературной ТЛ хлорофилла для исследования ПОЛ у г.ыкроЕЭдорослог к. природного фитопланктона. Высокая чувствительность метода, связанная с высокой эффективностью передачи энергии распада гидроперекисей на хлорофилл и высоким квантовым выходом высвечивания, позволила провести -исследования процесса ПОЛ у фитопланктона в природных условиях даже в олиготрофнкх водах Тихого океана (рисЛ) и оз.Байкал. Подобные исследования ранее не проводили. Поскольку высокотемпературная ТЛ испускается хлорофиллом, разработанный метод позволяет избирательно регистрировать ПОЛ з фитопланктоне, чего нельзя сделать другими методами, вследствие трудностей в отделении фитопланктона от других планктонных организмов. В настоящее время метод регистрации высокотемпературной ТЛ хлорофилла начал использоваться в работах других авторов для исследования ПОЛ у высших растений (Мегг1уаЧ ег.а1.,1992,1993).

3. ИЗМЕНЕНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА КУЛЬТУР МЖРОВОДОРОСЛЕ-ПОД ВЛИЯНИЕМ ФАКТОРОВ СРЕДУ

Для исследования процессов регуляции ФОН под действием экологических факторов были поставлены эксперименты с культурами микроводорослей, главным образом с хлореллой, выращиваемой в строго контролируемых условиях. В опытах были изучены факторы, существенно влиящие на фотосинтетическую продуктивность фитопланктона в природе: свет повышенной интенсивности, неблагоприятные температуры, недостаток минерального азота, вирусное заражение и ряд антропогенных загрязнений. В -экспериментах анализировалось изменение пигментного аппарата, функционирование ФС1 и ФОН, процессы энергизацки мембран, развитие

ПОЛ, рост и выживаемость клеток.

' Однаружено, что в согласии с уже имещимися в литературе данными (Krause,ffeiae,i99i ;Бухов, 1992 ), при действии всех исследованных нами факторов на свету на ранних стадиях повреждения, существенно изменяется функционирование ФОН, что проявляется в уменьшении Fv/Fm и интенсивности компонент ЗФ. Для таких факторов, как повышенная температура, заражение, некоторые загрязнения, на ранних стадиях также наблюдалось уменьшение стационарной величины электрохимического градиента протонов на тилакоидной мембране, что, по-видимому, связано с изменением проница&мости мембран. В тоже время, ФС1 поражалась только на поздних стадиях воздействия и обладала значительной устойчивостью к исследованным .факторам. В этот период выявлялись изменения в пигментном составе, а на самых последних стадиях развивалось ПОЛ с последующей гибелью клеток.

Проведенные эксперименты показали важную роль света в усилении повреждения ФОН при культивировании водорослей в неблагоприятных условиях, что ранее отмечалось в литературе (Powles,l984-). В темноте водоросли обладали значительной устойчивостью к факторам среды, поэтому основное внимание было направлено на изучение изменений в ФСП в различных световых условиях при воздействии неблагоприятных факторов среды.

Исследования роли__светового фактора__в_изменении_активности

ФОН и в развитии ПОЛ у микроводорослей.

Свет играет ключевую роль в осуществлении фотохимических реакций фотосинтеза у планктонных водорослей, и одновременно может являться повреждащим фактором.

При переносе микроводорослей из темноты на свет или со слабого света на более интенсивный наблюдается сложный переходной процесс изменения характеристик фотосинтетического аппарата, изученный в ряде работ (Карапетян,Бухов,1Э86; Тихонов,Кукушкин,1938). Это проявляется в сложных индукционных кривых выделения 02, состоянии переносчиков электронтранспортной цепи и изменении выходов БФ и ЗФ и др. Подробно эти процессы были нами исследованы по характеристикам индукционной кривой ЗФ (Маторин, 1978). Было показано, что индукционная кривая ЗФ водорослей после включения света или после перенесения с низкой интенсивности на более высокую в интервале от мсек до минут имеет несколько фаз, последовательно отражающих включение электронного транспорта, заполнение пула

с

переносчиков между фотосистемами, наработку электрохимического градиента и включение ферментов цикла Кальвина, увеличение потребления продуктов световой стадии в темновых реакциях и установление стационарного состояния процессов.

Процессы, рассмотренные зше, происходят в интервале до десяти минут. Однако, при действие повышенных интенсивностей света могут развиваться более длительные и глубокие перестройки фотосинтетического аппарата, которые отражают развитие процесса фотоингдбировання фотосинтеза (Kile et al.1989). Вопрос 'о ¡¿олзкул.щтах механизмах нача;гьннх стадий фотоингибирования в настоящее время остается открытым (Кгаизе,1988). Предполагает, что первичным актом повреждения ФСН при фотоингибированш является образование дважды восстановленного хинона (S tyring et

al.,1990), #который помадаэт свое место связывания в ФСЦ. В аэробных условиях в дальнейшем происходит протеолитическое расщепление 32 кДа D1 белка, входящего в состав ФС11 и кодируемого хлоропластным геном psb A(Kettunen et al., 1992). Для реактивации ФСН необходим росинтез D1- белка и его встраивание в ФС!1 (Ohad et al.,1984; Barber, Anderason, 1992; ).

Посколько процессы фотоннгибированчя и реактивации на свету протекают одновременно (G:-eer,LaiBg,l988), то общая активность ФСН может определяться соотношением констант прямой (константа фотоиЕгибирования к^) и обратной (константа репарации к^) реакций первого порядка:

А V ы*

где А и N обозначают, соответственно, концентрации активны! и инактивированных реакционных центров. Значения К1 и Кг, естественно, должны зависить от физиологического состояния клетки. Поэтому мы изучили вклад процессов инактивации и реактивации в

изменение активности ФСН на свету при действии неблагоприятных факторов и в процессе адаптации к ним.

Константы скоростей фотоингибирования К1 и восстановления Кг, рассчитывали по изменению переменной флуоресценции Ру по уравнениям:

Pv(t) = Pv(Q) EXP(-Ki*t) Pv(t) = Pv -(Pv -P (0)) EXP(-Kr^t) , где Pv(t), Pv(0) и Pv - значения Pv в моменты времени t, t=0 и

Для вычисления Ki водоросли освещали светом 280 Вт/м2, а Кг определяли, следя за восстановлением Pv у хлореллы на слабом свету (3 Вт/м2) после 20-минутного фотоингибирования ярким светом. Аппроксимация кинетики спада или восстановления Pv моноэкспоненциальными уравнениями, очевидно, является лишь условным приближением реальных процессов, не учитывающим, в частности, гетерогенности РЦ ФСП по устойчивости к фотоингибированию (Neale,Mells,l990) и многостадийного характера, процессов фотоингибирования и восстановления активности ФСП (Kettunen et al., 1991). Тем не менее, сопоставление данных, полученных на основании этого подхода, позволило нам определить вклад противоположно направленных процессов инактивации и реактивации в изменение активности ФСП в разных температурных и световых условиях роста водорослей.

Изучение изменения значения этих констант позволило показать, что уменьшение активности ФСП при резком увеличении освещения связано с увеличением константы Kit которая возрастает пропорционально увеличению интенсивности света. В тоже время, при адаптации водорослей к яркому свету происходило значительное увеличение константы скорости восстановления к^,, что сопровождалось восстановлением активности водорослей и увеличением Fv/?ra.

Поскольку, фотоингибирование приводит к уменьшению содержания в хлоропластах D1-белка, а реактивация ФСП связана с его ресинтезом ( что подтверждалось опытами с использованием ингибиторов синтеза белка), обнаруженные эффекты изменения значений Kj. говорят о осуществовании регуляторного механизма, управляющего скоростью синтеза белков РЦ ФСП в соответствии со скоростью их повреждения, и направленного на поддержание высокой эффективности использования энергии света в ФСП. В условиях, когда адаптационный потенциал клетки исчепан, при длительном интенсивном освещении, могут происходить необратимые повреждения РЦ ФСП, сопровождающиеся фотодеструктивными процессами.

Использование метода высокотемпературной ТЛ позволило нам изучить кинетику накопления продуктов ПОЛ в интактных клетках.

" Рис.! А Рис. 2 ,а

/ \ .-д.-гх ✓

/ \ /б \ X \ V у? ТЛ

/ \

/ \ \ д

¡2 \ \ ^ \л

% ) \ * / ч

' \ / я \ л.

/ * л'___ " Т - 1 1 - т— "'л

ТЛ N

7П

трмп^етупа

Т?п "с

20

40 Воемч, мин.

Р ис.1. Кривые термолюминесцешшй природного фитопланктона поверхностных слоев воды, взятых в 8 ч. утра (I), в 12 ч. в солнечный день (2).( Тихий океан) '

а- пик при 30-40 С, связанный с ФОН, б-пик при 120 0,связанный с ПОЛ.

,-2

Рис.2. Влияние интенсивного освещения (1000 Вт. к вшштуду выс0К0тешера1,ур,'30й ТЛ и выживаемость клеток хлороллы (Ы).

) на Р_/Р.

V га

1, ча

.-1

Кг, час

1

б 3

А _ 1 -

г\

>1

15 20

25

30 О/

15 20 25 30 Ос

Рис.з. Влияние температуры на константы скоростей процессов-фотоингиСирования (К^) и восстановления активности ФСд (кр после

фотоингибировагая у хлореллы, выращенной при 15° (Д.), 20°(о ) и 35 С (О), на свету 25 Вт/ьг.

культур микроводорослей и сравнить ее с кинетикой фотоингибирования реакций ФСП, фотодеструкции хлорофилла и гибелью клеток (Рис 2).

Накопление гидроперекисей в клетках водорослей на интенсивном свету, регистрируемое по интенсивности высокотемпературной ТЛ, имеет лаг-фазу, длительность которой определяется состоянием антиокислительной системы клетки. В анаэробных условиях и при добавлении антиоксидантов лаг-фаза существенно увеличивалась, тогда как в присутствии метилвиологена, который стимулирует процесс ПОЛ, происходило сокращение продолжительности лаг-фазы. Наличие лаг-фазы при развитии процессов ПОЛ в живых системах объясняют присутствием антиокислителей, расходующихся в течении индукционного периода (Владимиров,Арчаков, 1972 ), что подтверждается . и нашими результатами.

У клеток микроводорослей при интенсивном освещении в течении лаг-фазы происходило почти полное отключение реакций ФСП, регистрируемое по уменьшению 11,10 Однако,

фотоингибирование в период лаг-фазы имело обратимый характер, и клетки сохраняли свою жизнеспособность. В отличие от этого, быстрое фотоиндуцированное накопление продуктов ПОЛ после лаг-фазы коррелировало с необратимым характером фотоингиОирования фотосинтеза и сопровождалось гибелью клеток. Участие гидроперекисей липидов в необратимом ингибировании фотосинтеза и гибели клеток микроводорослей было подтверждено в опытах, где эти процессы могли быть инициировали в темноте добавлением к клеткам окисленной олеиновой кислоты. В условиях ингибирования ПОЛ удалением кислорода или при добавлении антиокислителей высокая выживаемость клеток, а также обратимость фотоингиОирования сохранялась даже после длительного освещения, что свидетельствуют о том, что в отсутствии ПОЛ, фотоингибирование не цредставляет угрозы для жизнеспособности клеток.

Проведенные эксперименты показали, что обратимая инактивация РЦ ФСП не связана с процессами ПОЛ; накопление продуктов ПОЛ происходит только после полной инактивации РЦ; их появление коррелирует с гибелью клеток, что делает невозможным реактивацию РЦ. Это подтверждает точку зрения, что ингибирование ФСП представляет собой не начальные стадии деструкции фотосинтетического аппарата, а защитную реакцию на избыточное

освещение, поскольку безизлучательное тушение возбуждения в реакционном центре ФСП уменьшает вероятность образования трштетшх состояний хлорофилла и накопление в ФС1 восстановленных продуктов, которые могут инициировать фотоокислительную деструкцию (Нрасновский, 1989).

Влияние пониженных и повышенных температур на активность ФСП, П^_и_светоч2вс?витетност^мга^воаорос^

Водоросли относятся к пойкилотермным организмам, поэтому неблагоприятная температура должна существенно влиять на протекание раз^.ичфх метаболических процессов в клетке, в том числе замедлять реакции синтеза белков.

Исследования, проведенные на термофильном штамме хлореллы, показали, что снижение температуры культивирования ниже 10°С приводит к необратимому ингибированию ФОН и возрастанию пика ТЛ при 120°С , что коррелировало со снижением выживаемости клеток. При этом эффект низких положительных температур проявлялся только при наличии освещения. В темноте при низких температурах клетки водоросли могли длительное время сохранять свою активность, что, по-видимому, имеет важное экологическое значение. Это было продемонстрировано наж при исследовании глубоководных вод оз.Байкал.

Понижение температуры культивирования водорослей в пределах толерантной зоны (до 15 С) такка приводит к уменьшению скорости роста и изменению активности первичных реакций фотосинтеза. Исследования параметров индукционной кривой ЗФ позволили еыявить изменения в скорости электронного транспорта в ФСП и в процессах образования электрохимического градиента протонов на тилакоиднкх мембранах. Однако, в этом случае изменения имели обратимый характер и приводили к адаптационным перестройкам фотосинтетического аппарата. Наблюдавшиеся нами переходные процессы при изменении температуры завершались через 1-2 суток и имели фенотипическую, .а не генотиотческую природу, так как плотность водорослей за этот период возрастала всего в 2-3 раза.

Адаптация хлореллы к новым условиям сопровождалась изменением жирнокислотного состава мембран и небольшим обратимым увеличением сигнала высокотрмпературной ТЛ. Это небольшое увеличение сигнала ТЛ доказывает, что при изменении жирнокислотного состава в процессе температурной адаптации мембран, возможно появление небольшого

Н8-

количества продуктов ПОЛ, не представлящее угрозы для жизнедеятельности клетки водоросли.

Исследование пигментного состава и . количества РЦ ФС1 и ФСП методами регистрации сигнала I ЭПР и интенсивности ЗФ в присутствии диурона, соответственно, позволило показать, что адаптация сопровождается уменьшением количества фотосинтетических единиц в клетках при лимитировании роста хлореллы температурой. Подобное изменение размеров фотосинтетического аппарата, описанное и в других работах (Verity, 1982), вероятно, является адаптационным процессом, позволяпцим уменьшить образование продуктов первичных реакций фотосинтеза в клетке в условиях, когда они не могут быть использованы в биосинтетических реакциях.

Другим адаптационным механизмом, предохраняющим клетки в условиях снижения температур на свету, является обратимое уменьшение активности ФОН, сопровожавдееся спадом Для

выяснения причин изменения активности ФОН мы сопоставили; значения констант скоростей реакций фотоингибирования. и реактивации z^ у хлореллы, выращенной в разных температурных .и световых условиях. Эксперименты показали, что уменьшение активности ФСП при резком снижении температуры на свету обусловлено значительным замедлением скорости репарации (К)г у всех культур (Рис 3). Адаптационные процессы были направлены на восстановление исходного соотношения значений констант, но уже при более низкой температуре роста водорослей (таблица). При этом адаптация к низкой температуре сопровождалась значительным увеличением Кр. Вместе с тем, у водорослей, длительное время выращиваемых при постоянных условиях роста, скорости процессов фотоингибирования и восстановления активности ФСП определялись главным образом освещенностью, а не температурой роста.

Это было потвервдено нами при исследовании этих процессов у фитопланктона, отбираемого из разных по температуре слоев воды (гл. 4 ). При этом, блокирование восстановления Pv при всех температурных режимах дудиивироаяния вадрросжй хзюраъ$ешшааи доказывает участке сввтеза хлоропяэстных белков в этом процессе.

Таким образом весь комплекс полученных результатов показывает, что в стационарных условиях роста в широком. диапазоне изменения

Таблвца

Значения констант скоростей фотоингибирования и восстановления после изменения условий шращгаания хлореллы.

Условия выращивания Оотсингибирование Восстановление

t,°c К^, час-1 t,°c Кг, час-1

Стандартные условия

7 час адаптации к 15°С 48 час адаптации к 15°С 7 час адаптации к 20°С 48 час адаптации к 20°С 7 час при 35°С, 170 Вт/М2 9 час при 20°С, 170 Вт/М2 * 7 час при 35°С, 170 ВТ/М2 **

15 7.8 15 0.05

20 6.8 20 0.10

35 5.0 35 0.40

15 3.8 15 0.12

15 5.5 15 0.37

20 5.6 20 • 0.26

20 5.5 20 0.52

35 2.9 35 1.49

20 2.8 20 1.37

35 3.5 35 0.22

Примечание ¡Стандартшэ условия разращивали^ - температура 35°С, освещенность 25 Вт/м *Перед изменением условий освещения

О Ыг

водоросли -«3 час разращивали при 20 . Одновременно с изменением условий осЕещения из среды культивирования удаляли азот.

температуры и освещенности активность ОСИ, следовательно, и эффективность преобразования энергии света у водорослей может поддерживаться на высоком уровне за счет регулирования процессов сиптзза белков, входящих в РЦ ОСП.

В природэдх водоемах эффект быстрого повышения температуры встречается редко, поэтому мы подробно не исследовали адаптационные процессы водорослей в этих условиях. Однако, как видно из рис 3, в области высоких температур значения констант репарции К^ достигали максимума при температуре примерно на 10° выше температур роста водорослей, а затем начинали быстро уменьшаться. Повышенные температуры также существенно сокращали лвг-фазу на кривой усиления ПОЛ от времени интенсивного освещения и стимулировали гибель клеток на свету.

Таким образом, активность ФСП водорослей существенно зависит от температуры окружающей среды. При этом изменение температур в

пределах толерантной области вызывает изменения функциональной активности ФОН. Вместе с тем, водоросли обладает значительным адаптационным потенциалом, позволяющим восстановить активность ФОН через сутки. В процессе адаптации к неблагоприятным температурам существенную роль, играют процессы регуляции скорости синтеза белков ФСН, наряду с другими механизмами изменения состава мембран и состояния и соотношения шгментбелковых комплексов. При этом изменение скорости их синтеза в хлоропласте согласуется со скоростью их повреждения, что позволяет поддерживать высокую эффективности использования энергии света в ФОН. Репаративная способность водорослевых клеток является одним из важнейших показателей их устойчивости к температурному воздействию. Важнейшим условием успешной репарации повреждений в клетке является приток энергии, который обеспечивается реакциями фотосинтеза. Именно этим объясняется ускорение процессов восстановления при слабом освещении клеток. При более низких температурах возможности генетического контроля перестройки метаболизма и белоксинтезирущей системы, по-видимому, оказываются исчепанными, что приводит к остановке роста суспензии клеток и необратимой инактивации реакций фотосинтеза, развитию ПОЛ и гибели клеток.

Исследование изменений активности__активности ФСН и ПОД у

водорослей в условиях культивирования при недостатке азота.

Известно, что недостаток минеральных солей в воде, существенно определяет низкую фотосинтетическую продуктивность природного фитопланктона во многих водоемах. (Ведерников, 1976). Недостаток минерального азота в среде культивирования микроводорослей не только тормозит рост, но и вызывает целый ряд адаптивных перестроек, обеспечивающих выживание в неблагоприятных условиях. Ранее отмечалось (Ко1Ьег е1 а1., 1988), что одной из реакций аппарата фотосинтеза на недостаток минерального питания в культурах микроводорослей является снижение активности ФСН. В работе (Венедиктов,Чемерис, 1967) обнаружено, что инактивация ФСН, измеренная по уменьшению связана с увеличением выхода ?о и

обусловлена ингибированием переноса электронов от Фео на хинон (За. Вместе с этим, наши исследования показали, что, наряду с этим эффектом^ у культур при недостатке азота резко усиливается светочувствительность клеток, проявляющаяся в снижении ?т.

При дефиците азота фотоинактивация .ФСН у хлореллы происходила

даке в условиях умеренного освещения (25 Вт/м2), что проявлялось в медленном снижении отношения Pv/Pin до 0.35 к исходу перЕих суток. Повышенно освэщения до 170 вт/м, приводящее, к узеличэнто фотоингибирозания, вызывало ускорение снижения Р^/Т^ у такой

культуры. В отлячке от нормальной культуры, выросшей на полной минеральной среде н при ярком освещении, у водорослей в условиях дефицита азотэ че происходило восстановления отношения Pv/Fm в процессе адаптации к повышенной интенсивности света.

Анализ констант скоростей фотоингибировавия и восстановления Ki и :kt noKS39J:» тго для культуры, несколько часов росшей в условиях недостатка азота, характерно крайне низков значение к^ (таблица), что отражает неспособность клеток увеличивать скорость синтеза Dl-балка ФСП в ответ на действие интенсивного света. В этих условиях скорость синтеза белка, по-видимому, лимитирована фондом свободных аминокислот, который значительно снижен в клетках,, растущих при дефиците азота (Zehr et al., 1988).

В культуре хлореллы в условиях недостатка азота усиление процесса догоатибирозазтот сопровоадалооь повышением

чувствительности к развит, фотэиндушфозпяного ПОЛ, коррелирующего с постэ-з^ншм угиличениэм в суспензии дояи нежизнеспособных клеток. У таких культур резко сокращалась продолжительность лаг-фззы в кккетакй увеличения ТЛ от времени освещения, tTo согласуется с денными но изменения величины лагфазы фитопланктона, взятого из различных ПО 'грозности Ь0Д09Ч0Ч( Гл.4),

Добавление ы;о3 в темноте к клеткам, выросшей при дефиците азота, приводило к восстановлению выхода максимальной флуср-зсиенгаи F-а, яри з том интенсивность постоянней флуоресценцкй Го ко •изменялась. В результате, отношение Pv/Pra увеличивалось с 0.35 до 0.60., При последующем освещении такой культуры с частично восстановленной активностью ФСП происходило дальнейшее возрастание отношения Fv/Fm до 0.80, но в этом случае реактивация была связана с уменьшением выхода флуоресценции Ро.

Ингибитор синтеза белка хлорзмфеникол полностью блокировал восстанозлэние ? , в то время, как для восстановления F синтеза

га г о

белков не требовалось. Эти данные доказывают, что снижение активности ФСП у хлореллы на умеренном свету при недостатке азота вызвано двумя различными процессами: метаболитной инактивацией ФСП( Венедиктов и др., 1989)(рост Уо) и фотоингибированием (спад

Pm) в ФСП. Эти два процесса имели разную температурную зависимость. Степень тушения флуоресценции Рт в диапазоне от 15° до 40° сравнительно мало зависела от температуры, тогда как степень возрастания ?о увеличивалась с повышением температуры. Вследствие, этого инактивация ФСП, вызванная дефицитом азота, была более выражена у водорослей при высокой температуре, чем при низкой. Таким образом низкая температура способствует сохранению активности ФСП водорослей в условиях минерального голодания. Подобная ситуация часто наблюдалась нами на оз. Байкал, где в условиях низких температур клетки сохраняли активность ФСП, несмотря на низкое содержание биогенных элементов в воде.

Приведенные в настоящем разделе результаты свидетельствуют о том, что при дефиците азотного питания, когда скорость роста водорослей и, следовательно, потребность в продуктах фотосинтеза снижены, адаптивные реакции приводят к уменьшению активности ФСП. Значительное уменьшение квантового выхода фотосинтеза и накопление неактивных РЦ ФСП является одной из наиболее ранних реакций фотосинтеза на дефицит минерального питания. В зависимости от интенсивности освещения и температуры, снижение фотосинтетической активности при недостатке взота может быть обусловлено, как фотоингибированием, так и метаболитной инактивацией ФСП, связанной с накоплением избытка продуктов фотосинтеза. В отличие от процессов адаптации к повышенным интенсивностям света или пониженным температурам, когда клетки могут восстанавливать активность ФСП, при недостатке минерального питания водоросли длительное время поддерживают активность ФСП на низком уровне.

Влияние вирусного заражения на функционирование фотосинтеза и_

ПОЛ синезеленых микроводорослей.

Вирусное заражение является причиной массового лизиса цианобактерий в природных водоемах (Saflerman,Morris, 1973). Мы изучили изменение фотосинтеза синезеленых водорослей Anabaena variabilis и Anacystls nldulans при заражении циаяофагами А-1 (L) и AS-1, соответственно. При исследовании патогенеза при вирусном заражении клеток, проведенных совместно с сотрудниками проф.М.В. Гусева, было обнаружено, что после инкубационного период* наблюдаются изменения в индукционной кривой ЗФ, свидетельствующие о разобщении фосформирования на тилакоидаой мембране. Это было

подтверздеко в опытах с разобщителем фэсфорилироваяия метил амшюм и при регистрации фотоиндуцированного изменения рН в клетке. При более длительном инфекционном процессе происходит нарушило активности реакций ФСП, сопровождающееся умекыдекис-м амплитуды ЗФ' на единичные вспышки параллельно с уменьшением скорости выделения 02. Ингибирование активности ФСП сопровождалось уменьшением содержания фикоцианина. изменениями в полосе низкотемпературной флуоресценции при 695 км. и расхождением парных мембран тклэкоидов. Изменения в функционировании ФС1, зарегистрированные по сигналу I ЭПР, происходили на поздних стадиях инфекционного процесса, когда наблюдалось усиление фотоиндуцированного ПОЛ и гибель клеток.

Инфицированные клетки обладали повышенной

светочувствительностью, что проявлялось в развитии процессов фотоингибирования и фотоиндуцированного ПОЛ. Важно подчеркнуть, что на ранних этапах заражения происходило резкое замедление скорости, восстановления после фотоингибирования. Это согласуется с данными работы (Тек1егтаг1ап е1 а1.,1990), где показаны изменения в обмене В1 белка при вирусном заражении. Вероятно, что переориентация метаболизма клетки геномом цканофага к продуцированию фаговых частиц приводит к изменению в транскрипции и трансляции белков фотосинтетических мембран, что вызывает изменение в ФСП.

4. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПЕРВИЧНЫХ РЕАКЦИИ ФОТОСИНТЕЗА И ПОЛ У ПОПУЛЯЦИЙ ФОТОПЛАНКТОНА В ЕСТЕСТВЕННОЙ СРЕДЕ ОбИТАШЯ.

Обнаруженные на лабораторных культурах механизмы регулирования активности ФСП при действии 'факторов среда были подтверждены в исследованиях природного фитопланктона. Поскольку до настоящего времени работ по изучению световых реакций фотосинтеза у природного фитопланктона крайне мало, представлялось важным провести исследования по выяснению особенностей функционирования ФСП в водоемах с разными экологическими условиями, а также связи изменений активности ФСП с продукционными характеристиками фитопланктона.

Использование разработанной погружной аппаратуры для регистрации активности ФСП по параметрам и ЗФ позволило

провести эти реботы непосредственно в среде обитания и выявить ряд важных закономерностей. Исследования обнаружили существенную пространственно-временную неоднородность распределения активности

Рис.4 Распределение по глубине параметров флуоресценции 7о и

фотосинтетической продукции и концентрации хлорофилла на

разрезе Черного моря о.Змеиный (ст.4124)-Синоп (ст.4129). Август 1989 г.

ВРВ'Л СУТОК,час.

Рис.5 Типичные суточные изменения выхода переменной флуоресценции хлорофилла фитопланктона

поверхностных слоев вода в солнечный день, а-олиготрофный, б-мезотрофный и в-сильно эвтрофицированный водоем.

ФСП У популяций фитопланктона. Во многих водоемах максимальная квантовая эффективность ФСП часто не совпадала с расположением максимума концентрации {итопланктона (рис 4). Однако, при этом прослеживалась определенная связь между активностью ФСП, определяемой по Fv/Fm, и обеспеченностью фитопланктона минеральным питанием. В олиготрофных низкопродуктивных районах Тихого океана, Средиземного моря и оз.Байкал с низким содержанием биогенных элементов в фотическом слое значения F колебались от 0,3 до 0,65. В мезотрофных водах Черного моря активность ?v/Pm возрастала до 0,5-0,В. В сильно эвтрофированных водах СеЕеро-западного района Черного моря и залива Котор Адриатического моря активность фитопланктона достигала значений, характерных для водорослей, выросших в оптимальных услоеиях.

Зависимость активности ФСП от концентрации биогенных элементов в воде наблюдалась также при измерении глубинных профилей. В олиготрофных водах активность ФСП была минимальна в поверхностных горизонтах и увеличивалась с глубиной. Максимум активности ФСП в тропических водах Тихого океана располагался на глубине 80-120 м, где существует некоторая подпитка минеральна,® солями с глубоководных вод, а количество проникающего света еще достаточно для фотосинтеза. В мезотрофных водах значительная активность наблюдалась в поверхностных горизонтах. Увеличение активности ФСП было обнаружено при зондировании в районах подъема холодных глубинных вод, обогащенных минеральными солями (Тиренское море, апвелинг вблизи Северо-западного побережья Африки).

Как было показано в гл.З, фотосинтетический аппарат водорослей достаточно быстро адаптируется к пониженным температурам. Известна способность водорослей адаптироваться к изменению температуры за счет перестройки структуры сообщества. (Галочка, 1981 ). Именно поэтому, во многих водоемах не прослеживалась зависимость активности ФСП от температура вода. Однако, на летнем фитопланктоне Белого моря нам удалось обнаружить связь между активностью ФСП и температурой. В водах фототеской зоны Белого моря было показано существенное уменьшение активности фитопланктона при низких температурах. Среднее значение F /F для проб фитопланктона с температурой от 0 до 8 С составляло 0,17, тогда как с повышением температуры Fv/Fm резко увеличивалось.

Исследования в природных водоемах связи параметров быстрой и замедленной флуоресценции, отражающих активность РЦ ФСП, с продукционными характеристиками фитопланктона показали, что, рассчитанная по этим параметрам продукция с учетом подводной освещенности, хорошо коррелирует" с продукцией, определенной классическими методами по С14 (Ведерников, 1982 ). Это доказывает, что активность ФСП, наряду с темновыми реакциями, играет существенную роль в изменении продукционных характеристик фитопланктона.

Связь активности ФСП с продукционными характеристиками была подтверждена при изучении сезонной годовой динамики Рг/Рт, проведенной на оз.Байкал совместно с сотрудниками Иркутского университета Л.Изместьевой и В.Полыновкм. В этих исследованиях было установлено, что появление в популяции клеток водорослей с высоким значением Рг/?т предшествует наступлению периода цветения, сопровождающегося резким увеличением концентрации фитопланктона. Окончание цветения характеризуемся резким уменьшением Подобная ситуация была описана нами в июле-августе в Северо-западном- районе Черного моря.

Влияние, светового фактора на активность ФСП наглядно проявляется в ингибировании активности ФСП в поверхностных водах в дневные часы (рис.5), что соответствует суточным изменениям первичной продукции с полуденной депресией, описанным в целом ряде гидробиологических работ (Ведерников, 1Э80;Финенко, 1982 ). Степень фотоингибирования ФСП была максимальна в поверхностных слоях и сильно уменьшалась с глубиной по мере снижения подводной освещенности. Величина уменьшения Р /Р в дневные часы зависила от

V С1

освещенности, скорости вертикального перемешивания воды и . физиологичвского состояния фитопланктона. В частности, уменьшение солености в Которском заливе в период доздей вызывало резкое усиление полуденной депресии активности ФСП.

Были исследованы суточные динамики изменения активности ФСП в разных по трофаости водах. Обнаружено, что при хорошей обеспеченности минеральным питанием (например в прибрежных районах) отношение в поверхностном слое сохраняется на высоком уровне

в течение суток (Рис 5). При средней обеспеченности солями в* мезотрофных водах в отсутствие перемешивания наблюдается уменьшение

отношения Р^/Рт в дневное время вследствие фотоингиОирования. В основном это было проявлялось в уменьшении р . При снижении освещенности в вечернее время достигает исходного значения. В

олиготрофных водах, обедненных биогенными элементами, наблюдается значительное возрастание интенсивности постоянной флуоресценции ?о в течение дня, а восстановление Р^ происходит только к утру, сопровождаясь снижением интенсивности Р ( рис ). Сравнение с данными опытов, проведенных с культурами водорослей при дефиците азота (гл.З), позволяет сделать вывод о том, что этот процесс обусловлен снижением к концу дня обеспеченности водорослей биогенными элементами, вследствие их потребления.

С целью уточнения механизма наблюдаемого ингибирования РЦ ФС1Г было изучены световые кривые ЗФ в присутствие диурона, по которым можно судить о гетерогенности РЦ ФСН (Маторин,Венедиктов,1990). Как было показано на культурах микроводорослей, параметры световых кривых ЗФ чувствителены к дефициту минерального питания, но остаются постоянными при фотоингибировании, так как в этом случае инактивированные центры полностью теряют способность излучать ЗФ, а характеристики остаЕшася центров не изменяются. Анализ световых кривых ЗФ фитопланктона олиготрофных вод показал появление во второй половине дня РЦ ООП с низким квантовым выходом восстановления (За , характерным для клеток, испытывавдих дефицит минерального питания. Ночью эти центры реактивируются .по-видимому, за счет продолжающегося поступления биогенных элементов при практическом отсутствии их потребления водорослями. Реактивация обусловливает, очевидно, снижение Ро в этот период. В случае отсутствия лимитирования по минеральному питанию (мезотрофные воды), параметры световых зависимостей ЗФ не изменялись в течение суток, несмотря на большие изменения Рт/Ря в процессе полуденного фотоингибирования.

Эти результаты продемонстрировали, что в природных олиготрофных водах наряду с фотоингибированием может происходит метаболитная инактивация ФСН, связанная по данным (Венедиктов и др.1989) с увеличением выхода Р . Закономерности суточной динамики изменения ФСП были подтверждены в опытах с хлореллой в лабораторных условиях при варьировании минерального питания и других условий культивирования и переменном освещении, имитирующим

о 5 га я

•Зргмя,мин

в 12 15 Время ^

Рис.6. А-Зависимости параметров быстрой флуоресценции хлорофилла I? .Р ,Р П ) и интенсивности высокотемпературной ТЛ пробы

о га V га

фитопланктона Черного моря (ст. 4133), ст продолжительности интенсивного освещения. Б-Кинетика темнового восстановления г^/Рт

этих же проб Продолжительность освещения - 3 мин (кривая 1), 10 мин (кривая 2) и 20 кош (кривая 3).

естественное изменение освещенности в течение суток.

Как указывалось в гл.З, развитие процесса фотоингибироваяия у водорослей определяется не только интенсивностью и

продолжительностью освещения, но и работой защитных механизмов и интенсивностью репарационных процессов, связанных с синтезом хлоропластных белков, входящих в состав РЦ ФСИ. Для исследования влияния факторов среда на константы фотоингибирования и восстановления ставились эксперименты в корабельной лаборатории с искуственным освещением фитопланктона интенсивным светом. Полученные на фитопланктоне закономерности по регуляции скорости репарационных процессов согласуются с таковыми для культур водорослей. Фотоингибированные клетки фитопланктона при затенении могли восстанавливать свою фотосинтетическую активность в течении нескольких часов (рис 6). Восстановление активности ФСИ у фитопланктона после фотоингибирования тормозилось при понижении температуры и при добавлении ингибитора синтеза белка -хлорамфеникола. Фитопланктон из олиготрофных вод с низким содержанием биогенов также имел низкую скорость восстановления после фотоингибирования, в то время как клетки фитопланктона„

взятые с температурно различающихся глубинных горизонтов, характеризовались близкими скоростями восстановления. Увеличение скорости восстановления после фотоингибирования происходило у клеток фитопланктона оз.Байкал перед началом цветения.

Использование разработанного и впервые примененного метода регистрации высокотемпературной ТЛ позволило показать, что в дневные часы при действии интенсивного солнечного освещения в поверхностных водах - может происходить накопление значительного' количества перекисей липидов (Рис.1). Это было характерно • для водорослей олиготрофных вод, находящихся в неблагоприятных условиях и характеризующихся низкой активностью ФСП. При сншхенш освещенности на глубине или вечерние часы количество перекисей снижалось. Накопление гидроперекисей в клетках фитопланктона, также обнаруживало лаг-фазу, длительность которой зависала от интенсивности освещения и состояния антиокислительной системы клеток (рис.5). При уменьшении трофности водоема продолжительность лаг-фазы на кривой ТЛ сокращалась. Обращает на себя внимание высокая чувствительность к свету глубоководного фитопланктона. Даже 5-минутное солнечное освещение обычно приводило к возрастанию количества перекисей и необратимому повреждению фотосинтетического аппарата. Это может указывать на то, что запас антиокислителей в клетках такого фитопланктона незначителен и при выносе в поверхностные воды они быстро погибают,вследствие фотодеструктивных процессов. Эти наблюдения позволяют предложить метод регистрации ТЛ для оценки фоточувствительности фитопланктона.

Таким образом, полученные в работе данные показывают, что под действием природных факторов существенно изменяется функционирование РЦ ФСП в клетках фитопланктона, что может приводить к изменению фотосинтетической продуктивности. При этом важнейшую роль в регулировании квантовой эффективности функционирования фотосинтеза у природных водорослей также играют процессы биосинтеза белков, входящих в состав РЦ ФСП. Во многих водоемах водоросли находятся в неблагоприятных условиях роста, что проявляется в существенном снижении квантовой эффективности ФСП. Появление благоприятных условий в водоеме сопровождается повышением эффективности функционирования ФСП, что стимулирует рост количества фитопланктона. Это позволяет обосновать использование

флуоресцентных методов, связанных с регистрацией активности РЦ, для прогнозирования состояния и продуктивности планктонных сообществ в естественных водоемах.

5.ИЗУЧЕНИЕ .ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ЗАГРЯЗНЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ НА РЕАКЦИИ ФОТОСИНТЕЗА И РАЗРАбОТКА МЕТОДОВ бГОТЕСТИРОВАНИЯ. ПРИРОДНЫХ И СТОЧНЫХ ВОД.

Особенности действия загрязнений на ФСП при варьировании

факторов среды.

В настоящее время антропогенные загрязнения становятся все более важным экологическим фактором (Чернавская,1989) и могут существенно снижать фотосинтетическую продуктивность фитопланктона. ( Патин,1979, Никаноров,Жулидов,1991;) Действительно, при исследовании р. Москвы нами было обнаружено снижение активности РЦ ФСП водорослей в районе сбросов загрязненных вод ЗИЛ и других промышленных предприятий, а также сбросов Люблинской и Курьяновской станций аэраций (рис 7).

Для экологии водных систем чрезвычайно актуальным является выяснение условий, способствующих развитию токсического эффекта и снижению фотосинтетической продуктивности водоемов при действии низких концентраций токсикантов (Филенко,1988). В наших опытах с лабораторной культурой хлореллы был изучен механизм влияния на фотосинтез и определены концентрационные зависимости токсического эффекта для большого круга современных гербицидов и ряда тяжелых металлов. Для широко используемых гербицидов из классов фенилмочевин.симмтриазинов и ряда фенольных соединений, связывающихся с Ш белком (Гольдфельд.Карапетян, 1989 ), при регистрации параметров ЗФ было обнаружено наличие второго места действия на донорном участке ФС II. При исследовании действия гербицидов на мембраны хлоропластов мы наблюдали изменения сродства гербицидсвязывающих мест под действием факторов, влияющих на конформацию белков: сродство места связывания, ответственного за ингибирование донорной стороны ФСП, увеличивалось под действием олеиновой кислоты, ослабляющей гидрофобные взаимодействия в белках, з сродство места связывания на белке понижалось под действием

ГУАШ. о.е-

0.7. 0.60.5 0.«-0.3

о.г.

0.1 О -1

Течение раки

Хневмики

Устье! Устье' ЗиЛй^й •Яузы Чуда : Т '

40

Рис.7. Изменения количества (по ? ) и фотосинтетической активности (по природного фитопланктона реки Москвы в черте города,

измеренные с помощью флуоримвтра. (июнь 1990 г)

0 ! 0 20 20 42 50 КМШШЭДа <№ЯУ»

Т--—Т-

0.2 0.4 0.6

Рис.8. Зависимость констант фотоингибирования (К1) и репарации (Кг) ФОН хлореллы от концентрации ионов меди.

Рис.9. Зависимость скорости роста хлореллы от 1у/Тт.1- культура на

среде Тамия в культиваторах; 2- культура на среде Успенского в колбах.

л

агентов, стабилизирующих структуру белков -полиэтиленгликоля и сахарозы. Изменение сродства DI белка к гербицидам отмечали также при фосформировании мембран хлоропластов или обработке их мочевиной или холатом (Vennaaa at al., 1984). 'Изменение чувствительности к гербицидам наблюдали также на клетках водорослей при недостатке минерального питания (Васильев, 1987).

Механизм изменения чувствительности ФСН микроводорослей к действию низких концентраций токсикантов при варьировании факторов среды был изучен в опытах с солямл меди (Си+2). Динамика развития токсического эффекта при действии низких концентраций солей меди на Fv/Fm характеризовалась наличием фаз первичного угнетения, стабилизации и восстановления активности фотосинтеза. При этом, основным экологическим фактором, оказывающим наиболее существенное влияние на величину токсического эффекта была интенсивность света, под влиянием которого развивалось фотоингибирование. В темновых условиях уменьшение Fу/?т наблюдали только при высоких концентрациях Си+2 выше 50 мкг/л. С увеличением освещенности до 30 Вт/м2 степень снижения Fv/Fm и присутствии меди возрастала пропорционально интенсивности освещения.

Исследование изменений констант фотоингибировашя к1 и репарации к^ позволило показать, что увеличение степени ингибирования Fv/Fm на постоянном свету с повышением концентрации меди определяется снижением Кг (рис 8). При интенсивности освещения I Вт/лг заметное замедление реактивации наблюдалось уже при концентрации меди 5 мкг/л. При полном блокировании медью процессов репарации при концентрации 50 мкг/л значение Fv/Fm на свету падало до нуля. Такие концентрации меди вызывали гибель клеток, что сопрововдалось интенсивным развитием ПОЛ в клеточных мембранах. Фаза восстановления Fv/Fm в процессе адаптации при длительном инкубировании водорослей в присутствии низких концентраций моди была обусловлена восстановлением значения Кг до исходного уровня.

Водоросли, выросшие при дефиците азота, также характеризовались повышенной чувствительностью к солям меди на свету за счет неспособности адаптироваться к токсическому стрессу в условиях низкого значения Кг. Токсическое действие меди возрастало на свету и при одновременном воздействии низкотемпературного

стресса, уменьшающего Кг и, тем самым, усиливающего степень ингибирсвания в присутствии токсиканта.

Исследованные на примере меди закономерности инактивации ФСП были также характерны и для других, изученных нами по аналогичной методике, веществ (свинец, цинк, ртуть, диурон, ТПОХ). При этом основной причиной, увеличивающей на свету долю неактивных РЦ ФСП, как н в случае с медью, являлось замедление репарационных процессов. Поскольку, синтез белка в клетке зависит от согласованного действия большого количества биохимических реакций, то очевидно, что самые разные нарушения нормального метаболизма водорослей могут в конечном итоге вызывать фэтоингибированке ФСП. Это в значительной степени объясняет неспецифичность этой реакции в ответ на воздействие многих токсикантов разной природы, ингибирующих нормальный метаболизм водорослей. Рассмотренные на примере меди особенности действия пороговых концентраций тяжелых металлов на первичные процессы фотосинтеза могут лежать в основе процессов, приводящих к снижению интенсивности первичного продуцирования в водных экосистемах, подтверхенных антропогенному загрязнению.

Это подтверждается тем фактом, что снижение активности ФСП в присутствии токсикантов на свету, коррелировало с замедлением скорости роста водорослей (р). Обнаруженная связь между Ру/Ргп и р для культуры хлореллы (рис.9) описывалась уравнениями степенного типа: м = К-(Ру/Рт)"3, где К - экспериментально устанавливаемый коэффициент, зависящий от условий культивирования водорослей. Из рис Э видно, что при величинах Бу/Ут от 0.3 и ниже рост водорослей полностью прекращался. Возможно, при низком квантовом выходе фотосинтеза вся энергия поглощенного света затрачивается на поддержание жизнедеятельности клеток водорослей или другие процессы, не связанные с ростом. Полученные данные согласуются с результатами исследования связи активности ФСП с первичной продукцией фитопланктона (гл 4) и свидетельствуют о том, что активность ФСП, измеренная по Ру/Рт, может использоваться в качестве интегрального показателя для прогнозирования ростовых характеристик водорослей при действии антропогенных загрязнений.

Рассмотренные особенности действия меди в условиях стрессов указывают на увеличение опасности загрязнений для природных

-зч-

водорослей, обычно растущих при быстрых изменениях факторов среды, прежде всего освещенности. Проведенные исследования на весеннем фитопланктоне озера Байкал подтвердили этот вывод. Так средние, полуподавлящие Рт/Рт фитопланктона, концентрации меди (6-часовые опыты) при оптимальной (3 Вт/м2) и стрессовой (8 Вт/м2) освещенности составили 20 и 6.3 мкг/л, соответственно. Следует отметить, что максимальные концентрации меда, не оказывавшие действия на водоросли в условиях светового стресса, (0.2-0.4 мкг/л) были меньше наиболее строгих 1ЩК, установленных для рыбохозяйственных водоемов. Увеличение чувствительности к токсикантам природных водорослей, возможно связанное с неоптимальными условиями роста клеток в естественных условиях, было подтверждено нами при изучении природных популяций фитопланктона Черного моря из разных районов. Воздействие солей меди и цинка было более выражено в открытых районах Черного моря, в то время как прибрежные сообщества обладали большими адаптационными возможностями.

При длительных воздействиях низких концентраций загрязнений (недели) повышение устойчивости Еопуляции может происходить также вследствие генотипической адаптации за счет отбора резистентных форм из генетически неоднородной популяции (Флеров, 1971). Процессы повышения устойчивости были исследованы в опытах при культивировании хлореллы в присутствии повышенных концентраций гербицида дпурона. При добавлении 10~-10-5М диурона наблюдали ингибирование реакций фотосинтеза и остановку роста. Однако, через 7 дней культивирования клеток в среде с диуроном высокая фотосинтетическая активность и скорость роста восстанавливалась. С помощью методов ЗФ и фотосинтетической ТЛ показано, что полученные таким образом клетки водорослей имеют повышенную устойчивость к диурону, связанную с изменениями в Ш белке. Свойства культуры сохранялись длительное время ( 2 месяца )при культивировании без ингибитора. Анализ гетерогенности популяций хлореллы по устойчивости к диурону с помощью метода микрофлуорометрии (Погосян, 1987), показвл.что культура водорослей приспосабливается к действию гербицида только цутем отбора и сохранения уже имеющихся резистентных особей и элиминации слабоустойчивой части популяции. Важным представляется также обнаруженный факт появления у этой культуры сопряженной

устойчивости к свету высокой интенсивности и повышенным температурам, что свидетельствует о повышении общих адаптационных возможностей культур водорослей при адаптации к загрязнениям. Применение__флуоресцентных__методов для__оценки__токсичности

Повышение чувствительности микроводорослей при культивировании в неблагоприятных условиях позволило усовершенствовать разработанный нами метод Сиотестирования с использованием водорослевых тест-систем и регистрации параметров быстрой или замедленной флуоресценции. Применение дополнительной физиологической нагрузки на тест-обьект (смена температуры или рехима освещения), не Еыходящей за пределы его толерантности, позволило существенно поднять чувствительность метода. Регистрация люминесценции хлорофилла была применена также для биотестирования воды путем определения пищевой активности планктонных ракообразных (дафний) по скорости уменьшения интенсивности свечения, обусловленного выеданием водорослей. Эксперименты показали, что снижение пищевой активности происходит значительно раньше и при более низких концентрациях токсикантов, чем это удается зарегистрировать принятыми в санитарной гидробиологии показателями, такими как уменьшение подвижности дафний или их гибель. Таким образом, появляется возможность в одном тесте определять токсичность воды сразу для двух важнейших компонентов водных экосистем - микроводорослей и планктонных ракообразных. Апробация комплексного метода при биотестировании сточных вод на Люблинской станции аэрации, на водах ЦБК (г.Байкальск) и на природных водах р.Москвы и Средиземного моря, показали, что метод позволяет быстро обнаруживать наличие широкого круга загрязнений в концентрациях близким к наиболее строгим экологическим ПДК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные в настоящей работе исследования фундаментальных биофизических явлений, наблюдающихся в фотосинтетических мембранах при избыточном освещении, позволили уточнить природу процессов, вызывающих фотоингибирование и деструкцию фотосинтетических мембран. Они позволили также показать, что изучение втих процеооов у водорослей в самых различных "физиологических ситуациях весьма перспективно для экологических исследований. Оказалось, что

изменения фотосинтетической продуктивности природного фитопланктона з естественной среде обитания определяются не только темновыми процессами утилизации продуктов фотосинтеза, но и активностью световых реакций. Первичные стадии фотосинтеза водорослей при действии факторов среды регулируются в соответствии с физиологическим состоянием клетки. Цель такой регуляции заключается в сопряжении световых и темновых реакций,осуществляющихся внутри хлоропласта с разными скоростями, что необходимо для поддержания определенного уровня метаболизма.

Естественно, что такая глзжноорганизованная система как фотосинтетический аппарат должна регулироваться под действием среды за счет целой серии быстрых и медленных адаптивных изменений состава и активности фотосинтетических мембран. Адаптация может происходить за счет изменения изменения состава пигментбелковых комплексов, «концентрации и активности реакционных центров фотосинтеза, регуляции световых потоков между фотосистемами, изменения липидного состава мембран и эффективности знергозапьсаицих процессов. Эти адаптивные изменения мы наблюдали в экспериментах как на культурах микроводорослей, так и на природном фитопланктоне.

Данные настоящей работы доказывают, что важнейшую роль в регулировании эффективности функционирования фотосинтеза у микроводорослей под действием экологических факторов среда играют процессы изменения активности ФСИ, которая работает в чрезвычайно жестких условиях, ( с образованием высокого окислительного потенциала и кислородных радикалов при окислении воды (Barber,Andersson, 1992) и , естественно, должна обладать системой регулирования активности. Процесс фотоингибирования представляет собой один из путей реализации такой регуляции, связанный с быстрой заменой элементов, выходящих из строя. Действительно, комплекс результатов свидетельствуют о существовании прямой регуляции работы РЦ ФСИ в соответствии с условиями окружающей среды, которая включает изменение активности, а в дальнейшем и сопряженные изменения структурной организации. Последнее осуществляется за счет скорости биосинтеза хлоропластных белков, входящих, в этот центр. Имеющиеся в литературе и полученные нами экспериментальные результаты показывают, что, по-видимому, это DI белок, характеризующейся высокой скоростью обнавления на свету. Известно,

что инактивация ФСН при фотоикгибировании сопровождается разборкой Ш бежа, а восстановление активности фотосинтеза после фотоингибирования обусловлено ресинтезом Ш белка и встраиванием нового белка на место разобранного (СШа<1 е1;.а1., 1984).

Полученные нами результаты показали, что уменьшение активности ФСН у микроводорослей под действием неблагоприятных факторов среды и низких концентраций антропогенных загрязнений определяются уменьшением скорости репарации активности фотосинтеза. Изменение' соотношения констант скоростей процессов фотоповреждения и восстановления активности РЦ ФСН, может вызывать уменьшение активности ФОН даже при физиологических освещенностях. Именно этим определяется резкое повышение светочувствительности микроводорослей, помещенных в неблагоприятные условия или в присутствии загрязнений.

От активности биосинтетических реакций существенно зависит также способность водорослей адаптироваться к неблагоприятным условиям в частности к повышенным интенсивностям света или пониженным температурам, а также к низким концентрациям токсикантов. Совокупность полученных нами результатов указывает на то, что во всех этих случаях адаптивные реакции водорослей направлены на восстановление высокой активности фотосинтбтического аппарата, в частности за счет увеличения скорости синтеза хлоропластных белков ФСН.

На свету при дефиците азотного питания, когда скорость роста водорослей и, следовательно, потребность в продуктах фотосинтеза снижены, адаптивные реакции, наоборот, приводят к уменьшению активности ФСП. Значительное обратимое уменьшение квантового выхода фотосинтеза и накопление неактивных РЦ ФСН является одной из наиболее ранних реакций фотосинтеза на дефицит минерального питания.

Процессы регуляции ФСН носят приспособительных характер и чрезвычайно важны для предохранения от появления большого количества неиспользуемых в биосинтетических реакциях восстановленных продуктов световой стадии фотосинтеза, которые могут через взаимодейстие с кислородом воздуха приводить к окислительным процессам, включая процессы ПОЛ, лежащих в основе универсального механизма поражения мембранного аппарата. Полученные нами данные показали, что появление значительного количества продуктов ПОЛ обычно свидетельствует о необратимых повреждениях клеток водорослей.

Исследования природного фитопланктона, проведенные с помощью разработанной погружной аппаратуры, показали, что процессы регулирования активности ФСП под действием факторов среды возможно регистрировать не только на культурах водорослей, но и на природных фитопланктонных сообществах. Наш данные указывают, что квантовая эффективность работы РЦ ФСП влияе-т не только на фотосинтетическую продуктивность природного фитопланктсна, но и связана со скоростью роста клеток. Появление в водоеме водорослевых клеток с активными РЦ ФСП предшествуют наступлению периода цветения. .

Проведенные исследования позволяют теоретически обосновать необходимость использования биофизических люминесцентных методов в гидробиологии при изучении состояния и продуктивности фитопланктонных сообществ. Использование этих методов позволяет не только оценивать фотосинтетическую продуктивность фитопланктона, но также определять параметры первичных процессов фотосинтеза. Разработанные методы возможно использовать также для биомониторинга загрязнений. В целом комплексный характер информации, получаемой флуоресцентными методами, позволяет дать общий портрет физиологического состояния фотосинтетического аппарата природных популяций фитопланктона и прогнозировать их будущее развитие в данном водоеме.

вывода

Исследованы процессы регуляции и адаптации световых стадий фотосинтеза у мшфоводорослей в природного фитопланктона при действии основных экологических факторов среда, включая антропогенные загрязнения и связь этих процессов с изменением продуктивности фитопланктонных сообществ.

1. Использование разработанной аппаратуры для измерения люминесценции хлорофилла позволило установить, что функционирование РЦ ФС II в клетках фитопланктона существенно изменяется под действием абиотических факторов среды. Фитопланктон олиготрофных вод характеризуется присутствием РЦ ФСП с низкой эффективностью восстановления хинонного акцептора Оа . Активность РЦ ФСП коррелирует со скоростью роста водорослей. Периоду цветения фитопланктона предшествует появление клеток с высокой эффективностью

функцконирования РЦ ФСП.

2. Обнаружена и изучена хемилшинесценция хлорофилла, возникающая при перекисном окислении липидов мембран в клетках водорослей. Показано, что данное свечение связано с спонтанным разложением гидроперекисей липидов, в ходе которого образуются электронно-возбужденные карбонильные продукты, способные с высокой скоростью передавать энергию возбуждения на хлорофилл. С использованием метода регистрации хемилзсминесценции при высоких температурах (ТЛ) обнаружено усиление ПОЛ в клетках фитопланктона поверхностных вод в дневные часы при солнечном освещении.

3. Сравнительное Изучение кинетики инактивации ФСП, накопления продуктов ПОЛ и выживаемости водорослей при действии экстремальных факторов среды (интенсивное освещение, низкие и высокие температуры и др.) показало, что обратимая инактивация РЦ ФСП не связана с процессами ПОЛ; продукты ПОЛ появляются только после полной инактивации РЦ; их появление коррелирует с гибелью клеток, что делает невозможным реактивацию РЦ.

4. С помощью регистрации восстановления активности РЦ ФСП после фотоингибированияи изучены реакции ресинтеза белка 01 РЦ в целых клетках водорослей. Обнаружено, что при действии неблагоприятных факторов среда, вирусного заражения, антропогенных загрязнений в клетках микроводорослей, замедляется ресинтез белка Ш, что приводит к снижению активности даже при физиологических освещенностях. Адаптация мккроводорослей к низкой температуре или яркому свету сопровождается увеличением скорости ресинтеза этого белка. Таким образом важнейшую роль в регулировании квантовой эффективности функционирования фотосинтеза у микроводорослей играют процессы биосинтеза хлоропластных белков, входящих в состав РЦ ФСП и характеризующихся высокой скоростью обновления на свету.

5. Антропогенные загрязнения оказывают существенное влияние на фотосинтетические мембраны природных водорослей Обнаружено, что ингибирующее действие фоновых концентраций солей тяжелых металлов на ФСП резко усиливается в условиях светового или температурного стресса, что также обусловлено резким сдаигом баланса скоростей фотоингибирования и реактивации ФС-П в сторону • ингибироввния за счет нарушения синтеза хлоропластных белков. Особенности действия токсических веществ в условиях стрессов указывают на увеличение

опасности токсикантов для природных водорослей, обычно растущих в условиях быстрых изменений факторов среда. На основе исследований разработана система для Оиотестирования природных, и сточных вод на уровне экологических ЦДК.

6.Полученные данные позволили сформулировать концепцию о регулировании начальных этапов фотосинтетических процессов в РЦ ФС II у микроводорослей на клеточном уровне. Результаты показали важную ро^ь активности ФСП в изменении фотосинтетической продукции водоема, что позволило обосновать возможность применения люминесцентных методов для прогнозирования состояния и продуктивности фитопланктонных сообществ в естественных водоемах. Предложен комплекс биофизических люминесцентных методов для прижизненного изучения особенностей фотосинтетических процессов фитопланктонных сообществ в водоеме.

Список работ па теме.

1. Венедиктов П.С. ,Маторин Д.Н..Рубин А.Б. Изучение зависимости

послесвечения оотосинтезирующих организмов от интенсивности гаозьу*дающего света. Науч.докл.высшей юкола, Биол. науки,1969, ¡«2, с. 46-51.

2. Венедиктов П.С.,Маторин Д.К.Хемипшмчнрсцентные' методы исследований. В се. "Современные методы, исследования лото^иологических процессов". М. Изд. МГУ, 1974, с.74—85.

3. Мато=ин Д.Н. Врн°пиктов П.С. , Мякевнинд М.С. Применение метода регистрации длительного послесвечения зелень-!* растений для определения загрязненности Фитотоксинескими вещестйаии оеьектоа внешней среды. Науч. докл. высшей школы. Биол. науки, 1975, N 12.с. 122-125.

д. Ьак yMöuwo Л.И., Стонов Л. Д., Маторин Д.Н. Исгюльаование замелле,ihc^; Флуоресценции хлореллы для опррдрпрнип гг?р£ицидних свойств соединений. Химия в с/х ,1977, т.15, N33, с.67—70.

5. Фадеева Л.М., Маторин Д.Н., КРенделева Т. Е. ,Влияние гербицидов на первичные процессы Фотосинтеза в изолированных хлоропласта« гороха .Физиал. растений, 1977, т.24, вып.З, С.560—565.

6. Николаев Г.М., Маторин Д.Н. Аксенов С.И. Состояние воды и Функционирование первичных реакций Фотосинтеза у лишайника Placoleconora melanophthalma иа холодных пустынь Восточного Памира Науч. докл. высшей школы, Биол. науки, 1977, N 1, c.lOl—106. .

7. Маторин Д.Н., Венедиктов П.С., Тимофеев К.Н., Руеин А.Б.

инпукмионных кривых замедленной Флуоресценции веленых растений. Науч. докл. высшей школы, Биол. науки, 1970, N2 с.35-41.

8. Маторин Д.Н., Млренкоа B.C., Добрынин С. А., Ортоидэе Т.В., Венедиктов П.С. Устаиоька для регистрации замедленной Флуонесц^нмии Фотйсинтезир ytcujuix организмов с импульсным регимом ссесш!_-ния. Науч. докл. высшей школы, Биол. науки, 3 978, N 11,

с.127-130.

9. Зайцев С.В.,Врхеш П.В.,Петухodа С.А.,Курочкин И.Н.,Маторин Д.Н. Варфоломеев С.Д. Злектронтранспоятная цепь Фотосинтеза. Механизм инактивации и стабилизации. Биохимия, 19Б0. т.45, # 5, с.934—944.

10. Гусев М.В.,Ермаков /1.Р. Дивописцева И. В., Маторин Д. Н. , Никитина К.А.,Тимофеев К.Н. D последовательности деградации Фотосинтетического аппарата Anabaena variabilis при действиии цианоФага А-1. Сизиол. растений, 1980, т.27, вып.З, с.470-476.

11. Ортоидэе Т.В., Соколов 3.Н.,Маторин Я.Н. Венедиктов П.С., Влинние повышенных тенпсратур на пориичные реакции Фотосинтеза. Сообщение АН ГР.ССР.19В0, т.ЮО, N3, с.669-671.

12. Гусев М.В., Живописцева И.В.. Маторин Д.Н. Никитина К.А.,Тимофеев К.Н. Деградация клеток Anacystis nidulus при дейстпиыи цианоФ.эга А—1.Вопросы вирусологии,19RO, т.З, с.330-333.

13. Goltsev V.M.. Ortoi dze T.V.. Socolov Z.N., Matorin D.N., Ver.ediktov P.S. Delayed luminescence yield kinetics in -flash illuminated qreen plants. Plant Sei. Lett. 1980,v.19,N4,p.339-346.

14. Кагмановский А.Я., Изанов И.К., Соколов З.Н..Маторин Д.Н.. Венедиктов П.С.Селективная окислительная деструкция пигментов мембран изолированных хлоропластом и их Функциональное состояние.Науч. докл. высшей школы, Биол. науки, 19В2, N 7,

с.38—42.

15. Гуляев Б.А.. Тетенькин В.Л..Маторим Д.Н. Поляризация быстрой и замедленной Флуоресценции Фотосистемы 11. Биофизика, 1982, т.27, N1. с.42-47.

16. Sokolov Z - N. , Matorin D.N.. Aksyonov S.I.. Bulvchev A.A., Venediktov P.S. Effects of H^Q for DO substitution on stability

and functional activity of the phatosynthetic membranes of qreen plants. Studia biophysica, 1982, v.S7. N1. p.29-39.

17. Наторин Д.Н. Замедленная Флуоресценция морских риФообразующих кораллов. Вестник МГУ, сер.биол. 1983. N 4. с.11—15.

18 Чаморовский С.К. .Маторин Д.Н. Влияние антагонистов кальмодулина на аамедленнум Флуоресценцию хларапластов и водорослей. Биохимия, 1984, т.49, «13, с.2029-2034.

19. Катарин Д.Н.,Васильев И.Р.,Рубин А.Б. Новый биофизический метод зондирования состояния и распределения микроводорослей в природных водоемах. "Биологи МГУ — рыбному хозяйству". П., изд. МГУ, 1984, с.72-77.

20. Васильев И.Р., Маторин Д.Н., Рубин А.Б. Замедленная Флуоресценция Фотосистемы I зеленых растений. Физиол. растений, 1984. т.31. выл.5, с.961-969.

21. КаФаров P.C.,Бакуменко /I.A., Маторин Д.Н. Влияние гербицидов на реакции Фотосинтеза у растетлй и водорослей. Агрохимия, 1985, N11, с.99-Ю4.

22. Маторин Д. Н. ,Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Замедленная Флуоресценция и ее использование для оценки состояния растительного организма . Изв.АН СССР, сер.биол.,1985,N 4, C.508-520.

23. Маторин Д.Н. ,Венедиктов П.С..Рубин А.Б. Использование люминесцентных методов для исследования состояния

Фотосинтетического аппарата и его реакции на воздействие Факторов внешней среды.В кн. "Проблемы экологического мониторинга и моделирование экосистем." Гидрометеоиздат,1985, т.8,с.Ю2—116.

24. Захарков С.П., Маторин Д.Н., Васильев И.Р., Стародубцев Е.Г., Венедиктов П.С. Изучение распределения Фитопланктона в океане с помощь» метода измерения интенсивности замедленной Флуоресценции. Науч. докл. высшей школы, Биол. науки, 1985, N.3, с. ЮО—Ю5.

25. Маторин Д.Н., Васильев И.Р., Венедиктов П.С.,Захарков С.П. Метод непрерывного зондирования активного Фитопланктона в водоемах путем регистрации замедленной Флуоресценции. Гидробиол. хурн, 1986, т.22, N. 2, с. 87-89.

26. Dahse J..Matorin O.N.«Liebermann В. A comparison of tentoxin action on the delayed fluorescence chloroplasts of

Spinach,Chiorella and Anasystis. Biochem. Physiol. Pflanzen 1986, v.181, p.137-146.

27. Васильев И.P., Чекуновa Е.М., Чунаеа A.C., Маторин Д.Н. Исследование замедленной Флуоресценции хлорофилла в клетках мутантов Chlamydomonas reinhardtii с пониженным содержанием каротиноидов. Вестник МГУ, сер.16, бмол, 1987, N.3, с.57-63.

28. Маторин Д.Н., Венедиктов П.С., Маренков B.C., Попов И.В., . Применение метода регистрации замедленной Флуоресценции для биотестирования загрязненности природных вод гербицидами и Фитотоксическими веществами.-В сб.: "Методы биоиндикации и биотестирования природных вод". Вып.1. П., Гидрометеоиздат, 19В7,^ с.18-25.

-к з -

29. Vasi1 *ev I.R.t Matorin D.N.. Lyadsky V.V., Venediktnv P.S. Multiple action sites -for photosystem II herbicides as revealed by delayed -fluorescence. Photosynth. Res., 1988, v.15, N 1. 33-39.

30. Васильев И.P.,Ли Дон Ир,Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. HHDiecTBiHHDCTb мест действия гербицидов, ингийирующих Фотосистему II гэленых растений. Фиаиол. растений, 19ВВ, т.35, N.4, с.694-702.

31. Васильев И.Р.,Матой1лн Д.Н.,Венедиктов П.С. Метод еиотестирован^п природных вод по замедленной Флуоресценция «икрооодороспбй. "Матоди еиотестирования вод", Черноголовка, ОИХФ АН СССР, 1988, с.23-26.

3?. КаФарпв Р.С.,Шендерова П. В., Мзторкн Д.И.,Бенедиктоа П.С. Ингийияование Фотосинтеза,накопление перекисей липидов и гибель клеток хлореллы при интенсивном освещении. Физиол. растений.,

1988, т.35, N. 3, с. 458-463.

33.Катоиин Д.Н.,Захаркой С.П..Венедиктов П.С. Исследование гисогатонпрплт^мсй'тррмопнммнпсценции хлорофилла у морских водорослей. Физиол. растений., 1988, т.35, N.6, с. 1078-1083.

34. КаФаров Р.С.,Шендерова Л. В., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Использование метода регистрации высокотемпературной термолюминесценции для неумения темнового перекисноро окисления липидов водорослей под действием экстремальных Факторов

среды.Науч. докл. высшей школы, Бмол. науки, 1988, N.9, с.29-32.

35. Маторин Д.Н., Венедиктов П.С.Новые методы аондирования океана . в кн."Биология океана" М.,иад.Наука, 1988, с.Ю1—105.

36 Маторин ß.Н.Использование метода замедленной Флуоресценции для исследования реакций Фотосинтетическаго аппарата на воздействия внешней cpg/h... С кн. "Факторы среды и организация первичного процесса оотос^нг^за" Киев, 1989, с.78—81.

37. Венедиктов П.С.,Маторин Д.Н.,КаФаров P.C. Исследование высокотемпературной термолюминесценции хлорофилла у листьев водорослей и изолированных хлоропластов Изв.АН СССР. сер. еиол.

1989, N.2, с. 245-251.

38. Маторин Д.Н., Вавилин Д.В., Попов И.В.,Венедиктов П.С. Метод еиотестирования природных вод с применением регистрации замедленной Флуоресценции микроводоросл^й. В eßs "Методы еиотестирования качества водной среды". М., изд—во МГУ, 1989,

с.10-20.

39. Маторин Д.Н.,Вавилин Д.В.,КаФаров P.C., Венедиктов П.С. Высокотемпературная термолюминесценция хлорофилла как метод

исследования перекисного окисления липидов в растениях. Докл. АН СССР, 1989, т.309, N.3, с.764-768.

40. Венедиктов П.С.,Маторин Д.Н., Вуксанович Н. сследование Флуоресценции и высокотемпературной термол»минееценции хлорофилла в Которском заливе Адриатического моря. Изв. АН СССР, сер. сиол.,1989, .N.4, с.623-627.

41. Венедиктов П.С., Маторин Д.Н.,Клфлроп P.C. Хеммлюминесиенция

хлорофилла при Фотаиндуиированиом окислении липидов в мемеранах тилакоидоэ. Биофизика, 19В9, т.34, &2, с.241—245.

42. Васильев И.Р.,Кокшарова O.A.,Маторин Д.Н. , Венедиктов П.С. Влияние диурона на реакции Фотосистемы II у мутантов Synechocystis 6803, устойчивых к диурону. Физиол. растений, 1990, т.37, N. 1,

с.39-46.

43. Vasil'ev I.R., Komarov A.I., Matorin D.N.. Verkhoturov V.N.. Vervediktov P.S. Two types of PS II centers as manifested by liqht saturation of delayed fluorescence from DCMU-treated chloroplasts. Ptiotosynth. Res.. 1990, v.26. N.2, 101-Ю7.

44. Левенко Б.А..Маторин Д.К..Венедиктов П.С. Использование переменной Флуоресценции для индикации Физиологического состояния Фитопланктона Белого моря. Науч. докл. высшей школы. Виол, науки, 1990, N. 5, с.46-52.

45. Кафаров P.C.,Маторин Д.Н.,Венедиктов П.С. Влияние высоких температур на активность Фотосистемы 2 и перекисное окисление липидов в клетках хлореллы. Физиол. растений, 1990, т.37, N3, с.569-575.

46. Маторин Д.Н. Венедиктов П.С.Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях Фитопланктона. Итоги науки и техн. ВИНИТИ, сер. ёиоФизика. 1990, т.40,с.49-100.

47. Маторин Д.Н., Вавилин Д.В.,Венедиктов П.С. □ возможности использования Флуоресцентных методов для изучения питания ракообразных. Научн. докл. высшей школы. Биологические науки, 1990, Т.1, с.146-152.

48. Вавилин Д.В., Маторин Д.Н.. КаФаров P.C.. Ьаутина

А./I.«Венедиктов П.С. Высокотемпературная термолюминесценция хлорофилла при перекисном окислении липидов. Биол. мембраны, 1991, т.8, N1, с.58-63.

49. Маторин Д.Н., Вавилин Д.В., КаФаров P.C., Венедиктов П.С. Влияние замораживания—оттаивания на перекисное окисление липидов в хлорофилл—содержащих тканях растений. Физиол. растений, 1991.

т.38, N3, с.545-551.

50. Маторин Д.Н., КаФаров P.C.. Васин Ю.И.. Венедиктов П.С. Исследование перекисного окисления липидов при действии Фотодинамических гербицидов методом высокотемпературной термолюминесценции хлорофилла. Вестник МГУ.,сер.еиол., 1991, т.16, # 2, с.17-22.

51. Венедиктов П.С.. Изместьева Л.Р.. Маторин Д.Н.. Васильев И.Р.. Вавилин Д.В. Оценка Физиологического состояния Фитопланктона Байкала люминесцентными методами. В кн. "Мониторинг Фитопланктона". Новосибирск. Наука, 1992.

52. Маторин Д.Н., Васильев И.Р.. Ведерников В.И. Исследование »агоингиеирования первичных реакций Фотосинтеза у природных популяций Фитопланктона Черного моря. Физиол. растений, 1992, т.39,в.3,С455-463.

53. Полынов В.А., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Использование дополнительного стресса для выявления токсического действия меди и цинка на Chlorella vulqaris. Водные ресурсы, 1992, N.6, с.52-55.

54. Полынов В.А., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С.,Вавилин Д.В. Действие низких концентраций меди на Фотоингиеирование Фотосистемы-2 у Chlorella vulqaris. Физиол. растений,

1993,т.40,в.5 .

55. Маторин Д.Н. Венедиктов П.С..Макевнина М.С. Бакуменко Л.И., Стонов Л.Д., Руеин А.Б. Способ определения гереицидной активности Авт.Сеид. 492В05, Опубл.БИ 1975, ft 43. с. 122

56. Марченко И.Ф. ,КаФаров P.C., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С., Успенская М.С.,Васин Ю.А. Способ определения степени повреждения растений. Авт.Свид. 14334436, ОпуБл.БИ 1988, ^.40, c.2i

-4s -

57- Здхйрков С. П., Иаторкн Д-Н.,Черное Б.Б.Спосой определения snneKTi'SHocTM защиты поверхности от обрастания. Авт.Свид. 14334436,

Олуйл.БИ 19В0, Л 40, с. 23

50. Лг?ос-мкс| Б. А. , Маторкн Д. П., Марченко И.Ф.Венедиктов П. С. Способ определения Фотосинтетической продуктивности Фитопланктона и устройство для его осуществления.

йвт.Свия, 1755724, Приор.13.03.S9 59. Вайилин Д.В., Маторпн Д.Н., Венедиктов П.С. Изменения «итасинпзгинескйга аппарата поппроспи Chlorella vutqsris при рр адаптации к пони^рикым температурам. Фиоиол. растений, 1994,т.41.в.2.

THp._i.Q0_ 3,1К._ЗМ