Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование карбоангидразной активности фотосистемы 2 гороха

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование карбоангидразной активности фотосистемы 2 гороха"

і і

005061488

На правах рукописи

Шитов Александр Васильевич

ИССЛЕДОВАНИЕ КАРБОАНГИДРАЗНОИ АКТИВНОСТИ ФОТОСИСТЕМЫ 2 ГОРОХА

03.01.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

13 ИЮН 2013

і т ^13

Пущино —2013

'') о

005061488

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Климов Вячеслав Васильевич

доктор биологических наук Аллахвердиев Сулейман Ифхан-оглы

Официальные оппоненты: Иванов Борис Николаевич

доктор биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, заведующий лабораторией фотосинтетического электронного транспорта

Пронина Наталья Александровна доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории управляемого фотобиосинтеза

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится 26 июня 2013 г. в ІЗ30 на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института фундаментальных проблем биологии Российской академій наук

Автореферат разослан « ХЦ » мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фотосинтетическое окисление воды происходит в фотосистеме 2 (ФС-2) оксигенных организмов (высших и низших растений, цианобактерий). Пигмент-белковый комплекс ФС-2, погружённый в тилакоидную мембрану, состоит из трёх структурно-функциональных блоков: свето-собирающей антенны, фотохимического реакционного центра (РЦ) (в котором происходит фоторазделение зарядов с генерацией катион-радикала первичного донора электрона, хлорофилла Пб8о+) и водоокисляющего комплекса (ВОК). В состав водоокисляющего комплекса входят: неорганическое ядро, состоящее из ионов Мп и Са, и три «внешних» водорастворимых белка. У высших растений это белки с молекулярной массой 33(PsbO), 24(PsbP) и 17 кДа (PsbQ). Последовательное четырёхкратное одноэлектронное окисление ионов Мп в ВОК реакционным центром приводит к окислению двух молекул воды до кислорода с освобождением четырёх протонов:

2Н20 - 4ё - 4Н+—>02t Скорость этой реакции определяется не только накоплением положительных окислительно-восстановительных эквивалентов, но и скоростью удаления продуктов реакции (протонов) [Haumann et al, 2005]. Известно, что ионы бикарбоната (БК), с рКа в области физиологических рН, необходимы для максимальной фотосинтетической активности на акцепторной и донорной стороне ФС-2 [Wydrzynski and Govindjee, 1975; Klimov and Baranov, 2001; van Rensen and Klimov, 2005; McConnell et al., 2012]. Ион бикарбоната на акцепторной стороне способствует протонированию Qb, а на донорной стороне участвует в сборке, стабилизации и функционировании водоокисляющего комплекса [van Rensen and Klimov, 2005]. Было высказано предположение о том, что для поддержания и регулирования содержания БК в ФС-2 необходима ассоциированная с ней карбоангидраза (КА) - фермент, катализирующий обратимую гидратацию углекислого газа [Stemler, 1997; Moskvin et al., 2004]: Н20+С02<-+Н2С0з^НС0З"+Н+'<-+С0З2"+2Н+ Ранее было показано, что ФС-2 обладает карбоангидразной активностью (КА-активностью) [Stemler, 1986; Moskvin et al., 1999, 2004; Пронина с соавт., 2002; Khristin et al., 2004; Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007; McConnell et al., 2007], но до настоящего времени не решен вопрос о носителе КА-активности в ФС-2 высших растений, и о возможной роли КА-активности в функционировании ФС-2.

В некоторых публикациях было показано, что препарат ФС-2, у которого удалены три внешних белка ВОК (PsbO, PsbP и PsbQ) обладает незначительной КА-активностью [Dai et al., 2001; McConnell et al., 2007]. С использованием другого экспериментального подхода было показано наличие двух носителей КА-активности в препаратах ФС-2, один из которых ассоциирован с «ядерным» комплексом, а другой относится к «фракции низкомолекулярных белков» (Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007]. Однако, эти работы не дают ответа на вопрос о том, какие именно белки ФС-2 проявляют КА-активность. Также высказывалось предположение о том, что сам Mn-содержащий водоокисляющий комплекс ФС-2 может обладать КА-активностью [Lu and Stemler, 2007].

Предполагается, что в ФС-2 одним из источников КА-активности мог бы быть так называемый Mn-стабилизирующий белок с молекулярной массой 33 кДа (белок PsbO) [Lu et al., 2005; Lu and Stemler, 2007]. Есть данные о том, что КА-активность белка PsbO зависит от присутствия ионов Mn2+ [Lu and Stemler, 2007]. Белок PsbO не имеет гомологии в аминокислотной последовательности ни с одной из известных карбоангидраз [Lu and Stemler, 2002] и в других работах [Пронина с соавт., 2002; McConnell et al., 2007] было показано, что PsbO не обладает КА-активностью. Таким образом, до сих пор не получено ясных данных об ассоциированной с ФС-2 высших растений карбоангидраз е.

Известен только один фотосинтезирующий организм - зелёная одноклеточная водоросль Chlamydomonas reinhardtii, в клетках которого обнаружена КА (названная СаЬЗ), входящая в состав ФС-2 и необходимая для стабилизации и функционирования ВОК ФС-2 [Karlsson et al., 1998; Villarejo et al., 2002]. Были получены данные, свидетельствующие о том, что бикарбонат и СаЬЗ участвуют в акцептировании протонов в процессе фотосинтетического окисления воды [Shutova et al., 2008]. Однако, роль КА-активности ФС-2 высших растений остаётся неясной. Ранее предпринимались попытки выяснить роль КА-активности в функционировании ФС-2 высших растений [Пронина с соавт., 2002; McConnell et al., 2007]. Однако до сих пор остаются нерешёнными вопросы о природе носителей КА-активности в ФС-2 высших растений, о месте их расположения, чувствительности к ингибиторам и необходимости для фотосинтетического окисления воды, для решения которых необходимы систематические исследования. Ранее исследовалось влияние ингибиторов либо на КА-активность ФС-2 [Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007], либо на фотосинтетическую активность [Swader and Jacobson, 1972; Stemler and Jursinic, 1983], и исследования проводились на разных препаратах. В наших

экспериментах исследуется влияние ингибиторов карбоангидраз как на карбоангидразную, так и на фотосинтетическую активность одного и того же препарата. Это - одно из основных преимуществ нашей работы по сравнению с предыдущими.

Цель работы. Исследование значимости карбоангидразной активности для функционирования фотосистемы 2 высших растеиий и выявление носителя(ей) этой активности.

В процессе исследования решались следующие задачи:

1. Сравнение действия известных ингибиторов карбоангидраз на карбоангидразную и фотосинтетическую активность ФС-2 с целью выявления возможной взаимосвязи между ними. Выявление участка ФС-2, для функционирования которого важна карбоангидразная активность.

2. Поиск эффективных ингибиторов карбоангидраз среди новых органических соединений, содержащих сульфанильные и амидные группы. Выявление, среди найденных ингибиторов, веществ, способных подавлять карбоангидразную и фотосинтетическую активность ФС-2.

3. Исследование карбоангидразной активности разных белковых компонентов, полученных из препаратов ФС-2. Сравнение свойств выявленных носителей карбоангидразной активности и известных карбоангидраз.

Научная новизна работы. Показано, что ингибитор карбоангидраз, ацетазоламид (АА), подавляет как карбоангидразную, так и кислородвыделяющую активность препаратов ФС-2 (ВВУ-частиц), выделенных из гороха. Впервые показано, что подавление АА фотосинтетической активности ФС-2 устраняется с помощью добавления бикарбоната или искусственных доноров электрона, что свидетельствует о необходимости КА-активности для функционирования донорной стороны ФС-2.

Выявлены новые ингибиторы карбоангидраз, эффективно подавляющие карбоангидразную и фотосинтетическую активность ФС-2.

Впервые показано, что белки РбЬО, РяЬР и РяЬ(2 проявляют карбоангидразоподобную активность (КП-активность), на которую не действуют классические ингибиторы карбоангидраз, тогда как пигмент-белковый комплекс ФС-2, лишенный этих белков, проявляет КА-активность, чувствительную к действию ингибиторов карбоангидраз.

Обнаружено, что КП-активность фракции белков РэЬР и РэЬС^ возрастает в присутствии Мп2+. Другие двухвалентные катионы, такие как Са2+, а

также гп2+ (основной неорганический кофактор карбоангидраз) не увеличивают, а даже подавляют КП-активность фракции белков РбЬР и РбЬС},

что свидетельствует о специфичности Мп2+ в индуцировании КП-активности этих белков. В то же время, на изолированных очищенных белках РбЬР и РбЬ(3 впервые показано, что в присутствии Мп2+ возрастает КП-активность только РвЬР. Активируемая ионами Мп2+ КП-активность белка РзЬР полностью подавляется ионами Mg5+. Это свидетельствует о специфичности действия Мп2+ на КП-активность белка РбЬР.

Показано, что белок РбЬО, очищенный от металлов, проявляет КП-активность только в присутствии экзогенного Мп2+. Выявлено, что в присутствии дитиотрейтола, разрушающего дисульфидную связь в РбЬО, белок теряет способность проявлять Мп-индуцируемую КП-активность, это свидетельствует о необходимости нативной конформации белка РбЬО для проявления КП-активности. Выявленные свойства КП-активности белков РбЬО и РбЬР (необходимость присутствия Мп2+, нечувствительность к классическим ингибиторам карбоангидраз) позволяют предположить, что РбЬО и РзЬР могут представлять собой новый класс Мп-зависимых карбоангидраз.

Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представления о механизме функционирования водоокисляющего комплекса ФС-2 и могут быть использованы при создании искусственных систем окисления воды, найдут применение в фундаментальных исследованиях в области физиологии растений, биохимии и биофизики фотосинтеза.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на X, XIV и XV международной Пущинской школе-конференции молодых учёных (Пущино, 2006, 2010, 2011); XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009); XV международном конгрессе по фотосинтезу (Пекин, 2010); Международной конференции «Исследование фотосинтеза в интересах устойчивого развития» (Баку, 2011); XX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» (Пущино, 2012); Международной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012).

Личное участие автора. Большая часть результатов получена автором самостоятельно. Автором проводились биохимические и биофизические исследования, осуществлялся анализ литературных данных, формулировались выводы. Выделения препаратов светособирающего комплекса ФС-2, реакционных центров ФС-2, субмембра1шых препаратов фотосистемы 1 (ФС-1), белков РбЬО, РбЬР и РбЬ(2, анализ содержания двухвалентных металлов в

полученных препаратах автором проводились в совместной работе с к.б.н. М.С. Христиным, к.б.н. О.В. Побегуц, Т.Н. Смоловой, В.В. Терентьевым, к.б.н. К.Г. Тихоновым и к.б.н. С.К. Жармухамедовым. Органические соединения, содержащие сульфанильные и амидные группы, были получены от коллег из Химического департамента университета Гази (Gazi University, город Анкара, Турция) в рамках совместных исследований.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них: 1 в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 в реферируемом зарубежном журнале и 8 в тезисах конференций.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на ¿MS страницах текста и включает 4 таблицы и 18 рисунков. Список литературы содержит 129 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. Исследования проводили на субхлоропластных мембранных препаратах, обогащенных ФС-2 («BBY-частицах»), выделенных по методикам [Berthold et al., 1981; Ford and Evans, 1983] с модификациями [Schiller and Dau, 2000] из двух-трёх-недельных растений гороха (Pisum sativum). Внешние водорастворимые белки водоокисляющего комплекса ФС-2 - PsbO, PsbP и PsbQ были выделены по методам, описанным ранее [Ono and Inoue, 1983; Miyao and Murata, 1983]. В процессе очистки белки обрабатывали ЭДТА с целью удаления ионов металлов. Разделение смеси белков PsbQ и PsbP проводили с помощью ионообменной хроматографии с использованием системы Acta FPLC на колонке Mono Q («Amersham Biosciences», Швеция) [Calderone et al., 2003]. Светособирающий пигмент-белковый комплекс 2 (ССК2) был получен методом, описанным ранее [Остроумов с соавт., 2007]. Изолированный пигмент-белковый комплекс Д1/Д2/цитохром Ь559 реакционного центра ФС-2 был получен методом, описанным ранее [Христин с соавт., 1997]. Для получения фотохимически активных фрагментов тилакоидных мембран, обогащенных ФС-1 (субхлоропластных мембранных препаратов ФС-1), использовали описанную ранее методику [Шувалов с соавт., 1976]. Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла а (АФ), характеризующие фотохимическую активность ФС-2 и отражающие фотовосстановление акцептора электрона - Qa (прочно связанного на акцепторной стороне ФС-2), измеряли с помощью РАМ-

7

флуориметра («WALZ», Германия). Реакцию Хилла регистрировали на фосфороскопической установке, описанной ранее [Klimov et al., 1982]. Скорость фотосинтетического выделения О2 измеряли амперометрическим методом с помощью электрода типа Кларка. КА-активность определяли электрометрическим методом [Wilbur and Anderson, 1948] по скорости изменения pH во время гидратации углекислого газа с использованием электрода Mettler Toledo InLab 413 и «рН-Метра-иономера срХ-2» (ИБП РАН, Пущино) с выводом сигнала на компьютер. С помощью специальной компьютерной программы «рХ meter» регистрировали изменения pH. Для выражения значения КА-активности белков использовали единицы Вильбур-Андерсона, рассчитанные на 1 миллиграмм белка (ед-W-A/Mr белка). Расчеты проводили по формуле:^ - t)/(t-m), где to и t - время изменения pH от 8,3 до 7,8 соответственно для спонтанной реакции (без добавок) и реакции в присутствии образца, m - количество белка в миллиграммах, внесенного в реакционную смесь. Активность КА также выражали в микромолях протонов на миллиграмм хлорофилла в минуту (мкМоль Н+/(мг Хл мин)) с учётом буферной емкости сред и образцов, определяемой титрованием с помощью 0,1 М HCl [Игнатова с соавт., 2006]. Чтобы иметь возможность сравнивать КА-активности белковых растворов и субмембранных препаратов ФС-2 и ФС-1, активности пересчитывали на 1 моль белка или на 1 моль реакционных центров ФС-2 и ФС-1, соответственно. При этом исходили из соотношения 250 молекул хлорофилла на один реакционный центр ФС-2 [Klimov et al., 1982] и 150 молекул хлорофилла на один реакционный центр ФС-1 [Шувалов с соавт., 1976]. Кроме того учитывали стехиометрию связывания водорастворимых белков с ФС-2, где на один РЦ приходится по одной молекуле белков PsbO, PsbP и PsbQ. Для анализа действия ингибиторов на КА-активность в образцы, содержавшие субхлоропластные мембранные препараты ФС-2 или растворы гидрофильных белков, добавляли ингибитор, конечная концентрация которого составляла 10 мкМ. Затем инкубировали их в измерительной ячейке в течение 1 мин до начала реакции и измеряли КА-активность. Электрофорез в денатурирующих условиях проводили в 12,5%-ном (масса/объем) ПААГ [Laemmli, 1970]. Содержание Мп в полученных препаратах измеряли с помощью пламенного атомно-абсорбционного спектрофотометра «Квант-2А» («Кортэк», Россия). Общее содержание хлорофилла в препаратах определяли с помощью его экстракции ацетоном [Агпоп, 1949]. Содержание белка определяли колориметрическим методом [Lowiy et al., 1951]. Для получения фракции растворимых белков цитоплазмы листья гороха гомогенизировали в

фарфоровой ступке с добавлением двух объемов 25 мМ Мез-МаО!1-буфера (рН 6,5), содержавшего 10 мМ МаС1 и 300 мМ сахарозу. Полученный гомогенат центрифугировали при 14 ООО § в течение 30 мин. Бесцветный супернатант содержал фракцию водорастворимых белков цитоплазмы. Частичное удаление бикарбоната из ВВУ-частиц достигалось 800-кратным разведением концентрированных (8,5 мг Хл/мл) частиц ФС-2 в среде, лишённой С02/НС03". Удаление бикарбоната из среды проводилось при помощи 60-ти минутной продувки воздухом, который был освобождён от С02 пропусканием через раствор 50% ЫаОН и 20-ти сантиметровый слой аскарита [КПтоу й а!., 1995].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение действия ингибиторов карбоангидраз на карбоангидразную и фотосинтетическую активности препаратов фотосистемы 2. Карбоангидразная активность полученных препаратов ФС-2 составляла (19±2) Ю8 ед. W-A/моль РЦ (или 119±15 мкмолей Н+/(мг Хл мин), и была сопоставима с данными, описанными ранее [Пронина с соавт., 2002; Игнатова с соавт., 2006]. Уровень КА-активности ФС-2 сопоставим с активностью некоторых р-КА (из Methanobacterium thermoautotrophicum), которая составляет 35 -108 ед. W-A/моль белка [Smith and Ferry, 1999].

8.7 8,6 8,5 8,4 8,3

аз

Q. 8,2 8,1 8,0 7,9

7.8

20 40

Рис. 1. Кинетика изменений рН, характеризующая карбоангидразную активность ВВУ-частиц гороха в отсутствие ингибиторов (кривая 1), в присутствии 10 мкМ ацетазоламида (кривая 2) или 10 мкМ

этоксизоламида (кривая 3). Кривая 4 характеризует спонтанную реакцию гидратации СОг, в отсутствие препаратов ФС-2. Стрелка 4. показывает момент добавления воды, насыщенной СО?.. Концентрация хлорофилла - 44 мкг/мл. Состав среды измерения: 25 мМ веронал (рН 8,6), 50 мМ КС1,15 мМ 1^С12.

80 100 120 140 160 180 200 t, сек

На рисунке 1 показано действие двух известных ингибиторов карбоангидраз на КА-активность препаратов ФС-2. Согласно расчётам КА-активности (см. «Объекты и методы исследования»), ацетазоламид в концентрации 10 мкМ подавляет активность частиц ФС-2 на 50% (Рис. 1, кривая 2), этоксизоламид (ЭА) в такой же концентрации - более чем на 90% (Рис.1, кривая 3), т.е. он значительно эффективнее ацетазоламида. Наши

результаты сравнимы с данными, описанными ранее [Игнатова с соавт., 2006; 11ис1епко ег а1., 2007]. Измерения КА-активности выполнялись при рН 8,3. Так как эти условия не являются оптимальными для фотосинтетического выделения 02, далее исследовалось действие ингибиторов на фотосинтетическую активность ФС-2 при рН 6,5. Одним из показателей, характеризующих перенос электрона в ФС-2, является скорость реакции Хилла. На рисунке 2 показано действие ингибиторов КА-активности (АА и ЭА) на кинетику фотовосстановления экзогенного акцептора электрона - 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) в реакции Хилла.

Ацетазоламид (1 мМ) уменьшает скорость фотовосстановления ДХФИФ на 40±3% (Рис. 2, кривая 2), тогда как этоксизоламид (0,1 мМ) подавляет скорость этой реакции только на 10±3% (Рис. 2, кривая 3) по сравнению с контролем (в отсутствие других добавок (Рис. 2, кривая 1)). Незначительное влияние этоксизоламида на скорость реакции Хилла может быть обусловлено низкой растворимостью ингибитора при рН 6,5 (его максимальная концентрация при рН 6,5, - 100 мкМ). Кроме того, при рН 6,5 количество депротонированной формы этоксизоламида (только депротонированная форма сульфаниламидов способна ингибировать карбоангидразы [Supuran, 2004]) составляет всего 2,3%, так как рКа ингибитора - 8,12 [Lewis et al., 1984]. Поэтому, детальные исследования далее проводились только с использованием АА.

Способность к фотосинтетическому выделению кислорода - один из наиболее достоверных индикаторов функциональной компетентности всех интермедиатов цепи переноса электрона ФС-2, в особенности, ВОК. Поэтому проводились исследования действия ацетазоламида на процесс фотосинтетического выделения кислорода BBY-частицами. Средняя скорость

Рис. 2. Кинетика фотоиндуцированного уменьшения поглощения ДХФИФ (ДА) при 600 нм в образце, содержащем ВВУ-частицы гороха (кривая 1), в присутствии 1 мМ ацетазоламида (кривая 2) или 100 мкМ этоксизоламида (кривая 3). Концентрация хлорофилла - 12 мкг/мл. Стрелки | и 1 соответственно показывают моменты включения и выключения действующего света (1 > 650 нм; 25 мкмолей фотонов/(м2-с)). Состав среды измерения: 25 мМ МЕЗ-ИаОН (рН 6,5), 10 мМКтаС1, 62 мкМ ДХФИФ.

выделения кислорода была равна 310±12 мкмолей 02/(мгХлчас) (принята за 100%) и использовалась далее в качестве контроля. В присутствии 0,1 мМ и 1 мМ АА скорость выделения кислорода частицами ФС-2 подавляется соответственно на 17±2% и 45±5%. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что одновременно с подавлением КА-активности ацетазоламид подавляет и фотосинтетическую активность ФС-2. Однако из этих данных неясно, на каком участке ФС-2 происходит подавление фотосинтетической активности ингибитором ЬСА. Для выяснения этого вопроса использовали метод измерения фотоиндуцированных АФ, а также проводились эксперименты с известными экзогенными донорами электрона ФС-2.

Рис. 3. Кинетика фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла а (ДФ) препаратов ФС-2 без добавок (кривая 1), в присутствии: 1 мМ ферроцианида калия (кривая 2); 150 мкМ ТМФД (кривая 3); 1 мМ ацетазоламида в отсутствие других добавок (кривая 4) и в присутствии: 1 мМ ферроцианида калия (кривая 5); 150 мкМ ТМФД (кривая 6). Д показывает момент включения измерительного света (X = 490 нм, 0,01 мкмолей фотонов/(м2-с)), который возбуждает флуоресценцию хлорофилла ФС-2 Ф0 (/. > 650 нм); стрелки Ї и| соответственно показывают момент включения и выключения действующего света (X > 600 нм, 0,75 мкмолей фотонов/(м2-с)). Концентрация хлорофилла -12 мкг/мл. Состав среды измерения: 25 мМ МЕЗ-ЫаОН (рН 6,5), 10 мМЖСІ.

Рисунок 3 показывает результаты сравнения эффектов ацетазоламида и экзогенных доноров электрона ФС-2 — ферроцианида и Т^НМ'ДЧ'-тетраметил-«-фенилендиамина (ТМФД) на фотоиндуцированные ДФ. В присутствии экзогенных доноров электрона и АА, уровень Ф0 практически не изменяется (Рис. 3). Это свидетельствует о том, что данные агенты не влияют на перенос электрона на акцепторной стороне ФС-2 [Кіітоу й а1., 1995].

В отсутствие других добавок, ферроцианид (гидрофильный донор электрона (Рис. 3, кинетика 2)) и ТМФД (липофильный донор электрона (Рис. 3, кинетика 3)) увеличивают скорость нарастания фотоиндуцированных

і

6 1

ГЛ І

ДФ соответственно в 1,6 и 2,8 раза (Рис. 3, соответственно кинетика 2 и 3), по сравнению с контролем (Рис. 3, кинетика 1).

В присутствии АА скорость нарастания фотоиндуцированных ДФ в отсутствие других добавок значительно (на 70%) уменьшается (Рис. 3, кривая 4). В присутствии АА, доноры электрона ферроцианид и ТМФД увеличивают скорость нарастания фотоиндуцированных ДФ соответственно в 2 и 4,3 раза (Рис. 3, соответственно кинетика 5 и 6). При этом скорость нарастания флуоресценции приближается к таковой, измеренной на препарате, не обработанном АА.

Таким образом, индуцированное ацетазоламидом уменьшение скорости фотовосстановления ДХФИФ (Рис. 2), скорости фотосинтетического выделения 02, скорости нарастания фотоиндуцированных ДФ (Рис. 3), связано с ингибированием переноса электрона. Уменьшение ингибирующего действия АА в присутствии доноров электрона свидетельствует о том, что этот ингибитор подавляет активность донорной стороны ФС-2 (возможно на уровне МгцСаОз-кластера).

Обратимость действия ацетазоламида при добавлении ионов бикарбоната. Необходимо отметить, что эффект восстановления параметров фотоиндуцированных ДФ после обработки АА наблюдается, не только в присутствии доноров электрона, но и при добавлении бикарбоната (Рис. 4).

В данном эксперименте использовали среду, обеднённую по С02/НС03\ При рН 5,5 количество растворённого НСОэ" существенно ниже, чем при рН 6,5 [БЬиЮуа Й а1., 2008]. Поэтому, во всех дальнейших исследованиях мы использовали среду с рН 5,5.

При удалении из среды НС037С02 происходит 20%-ное подавление фотосинтетической активности ФС-2, даже в отсутствие АА (Рис. 4, кривая 2; Таблица 1). В присутствии ЮОмкМАА фотосинтетическая активность снижается ещё больше (Рис. 4, кривая 4; Таблица 1). Добавление бикарбоната (5 мМ) практически полностью восстанавливает скорость нарастания фотоиндуцированных ДФ как в отсутствие АА (Рис. 4, кривая 3), так и в его присутствии (Рис. 4, кривая 5). Похожее действие, а именно, уменьшение при добавлении АА и восстановление при последующем добавлении бикарбоната наблюдалось и при сравнении максимальных уровней флуоресценции (Фм), тогда как уровень Ф0 во всех этих случаях оставался неизменным. Концентрация бикарбоната равная 5 мМ, по-видимому, является насыщающей для указанных эффектов, поскольку при добавлении 3 мМ бикарбоната наблюдались аналогичные результаты. Таким образом, полученные нами

результаты свидетельствуют о том, что АА ингибирует перенос электрона на донорной стороне ФС-2 и это связано с его специфичным подавлением именно КА-активности, поскольку фотосинтетическая активность значительно

Рис. 4. Кинетики фотоиндуцированньгх ДФ, измеренные на ВВУ-частицах гороха до (кинетика 1) и после удаления бикарбоната (кинетики 2-5) в отсутствие добавок (кинетики 1 и 2) и в присутствии: 5 мМ бикарбоната (кинетика 3); 100 мкМ ацетазоламида (кинетика 4); 100 мкМ ацетазоламида и 5 мМ бикарбоната (кинетика 5). А показывает момент включения измерительного света (Х=490нм, 0,01 мкмолей фотонов/(м2-с)) который возбуждает флуоресценцию хлорофилла ФС-2 Фо (X > 650 нм). Стрелки Т и| соответственно показывают момент включения и выключения действующего света (). > 600 нм, 2 мкмолей фотонов/(м2-с)). Концентрация хлорофилла - 12 мкг/мл. Состав среды измерения: 50 мМ МЕЯ-МаОН (рН 5,5), 10 мМ КаС1.

Таким же образом бикарбонат снимает ингибирующее действие АА при измерении фотосинтетического выделения кислорода (таблица 1).

Таблица 1. Скорость фотосинтетического выделения О 2 препаратами ФС-2 в присутствии различных добавок.

Состав среды % активности

Среда с не удалённым НСОз'/ССЬ 120+1

Среда с удаленным НСОз'/СОг 100+4

Среда с удаленным НСОз'/СОг + 0,1 мМ АА 92±4

Среда с удаленным НС03'/С02 + 0,1 мМ АА+5 мМ БК 113±1

Среда с удалённым НСОз'/СОг + 5 мМ БК 132+7

Состав среды измерения: 50 мМ МЕЗ-ИаОН (рН 5,5), 10 мМ ЫаС1, 300 мМ сахароза. В качестве акцепторов электрона - 1 мМ Кз[Г;е(СКк1 и 0,3 мМ 2,6-дихлоробензохинон.

В присутствии АА скорость выделения кислорода уменьшается, а при добавлении бикарбоната - возрастает. Эти результаты показывают значимость

бикарбоната и КА-активности для функционирования водоокисляющего комплекса ФС-2.

Степень подавления скорости нарастания фотоиндуцированных АФ в присутствии ацетазоламида, зависит от его концентрации (Рис. 5, кривая 1). Кривая 1 характеризует действие АА на ФС-2, в среде истощенной по НС03"

Рис. 5. Зависимость фотосинтетической активности препаратов ФС-2, от концентрации ацетазоламида в среде, обеднённой по бикарбонату (кривая 1) и в той же среде, но в присутствии 5 мМ бикарбоната (кривая 2). Фотосинтетическая активность оценивалась по скорости нарастания фото-индуцированных АФ на линейном участке кривой (см. Рис. 3, прерывистые линии). Состав среды измерения: 50 мМ MES-NaOH (рН 5,5), 10 мМ NaCl.

Результаты представленные на рисунке 5 показывают, что при низких концентрациях ацетазоламида, в области 50 мкМ - 100 мкМ, бикарбонат в концентрации 5 мМ, добавленный в среду истощенную по НС03УС02, практически полностью снимает ингибирующее действие ацетазоламида на скорость нарастания фотоиндуцированных ДФ (Рисунок 5, кривая 2). При концентрации 200 мкМ и выше, ингибирующий эффект АА на фотоиндуцированные АФ уже не уменьшается с помощью бикарбоната, что может свидетельствовать о наличии неспецифического действия АА, вызывающего потерю активности ФС-2, не связанную с подавлением КА-активности.

Действие АА на ФС-2, наблюдаемое в нашей работе на высших растениях, близко к действию ЭА на препараты ФС-2 из клеток Chl. reinhardtii [Shutova et al., 2008]. Представляется возможным, что некоторые белки ФС-2 из высших растений могли бы проявлять функции, подобные тем, которые проявляет СаЬЗ в Chl. reinhardtii. Было выдвинуто предположение, что СаЬЗ способствует удалению протонов из Мп-комплекса, локально «снабжая» его НС03", который может функционировать в качестве акцептора протонов [Shutova et al., 2008]. Согласно этой гипотезе, карбоангидраза СаЬЗ необходима для ускорения преобразований НС0з~<-»СО2 на донорной стороне ФС-2,

14

/С02 в отсутствие других добавок.

120 110 100 90 80 70 60 S0 40

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 |АА|, IIIМ

обеспечивая незамедлительное удаление протонов в процессе окисления воды. Возможно, компоненты ФС-2 высших растений, обладающие карбоангидразной активностью, играют подобную роль.

Поиск ингибиторов карбоаигидраз, подавляющих

карбоангидразную и фотосшггетическую активности фотосистемы 2. Ранее на хлоропластах было показано, что фотосинтетическую активность ФС-2 может подавлять не только АА, но и другие ингибиторы КА, например имидазол, азид или цианид [Stemler and Jursinic, 1983; Пронина с соавт., 2002]. Необходимо выяснить, является ли действие АА на ФС-2 уникальным, или это присуще всем ингибиторам КА. Кроме того, одной из актуальных задач исследования механизма функционирования ФС-2 является поиск новых ингибиторов фотосинтетической активности этого комплекса. Был осуществлён скрининг 30 недавно синтезированных органических соединений, содержащих сульфанильные и амидные группы (как у сульфаниламидных ингибиторов АА и ЭА), на их способность эффективно подавлять КА-активность а-карбоангидраз. Выявлено 7 эффективных ингибиторов КА. Для двух из них (TKKBAPP-Cu, SALMSMH-Cu) показана способность эффективно подавлять как фотоиндуцированные ДФ, так и КА-активность ФС-2 (в особенности это относится к Cu-содержащему ингибитору под названием SALMSMH-Cu, подавляющему фотоиидуцированные ДФ на 60% и КА-активность полностью). Эти ингибиторы обладают более сильным, чем у ацетазоламида, ингибирующим действием на карбоангидразную и фотосинтетическую активности ФС-2 и являются перспективными инструментами исследования фотосинтетичсского окисления воды и, в частности, роли карбоангидразной активности в функционировании ФС-2. Ингибирование карбоангидразной активности и фотоиндуцированных ДФ при добавлении TKKBAPP-Cu и SALMSMH-Cu могут свидетельствовать об общности механизма действия известных ингибиторов карбоангидраз и выявленных нами агентов на ФС-2, и могут являться дополнительным доказательством значимости КА-активности для функционирования ФС-2.

Носители карбоангидразной активности в фотосистеме 2. Показано, что при последовательном удалении трех гидрофильных белков (PsbO, PsbP и PsbQ), с помощью высоких концентраций NaCl и СаС12, КА-активность препаратов ФС-2 снижается в три раза (до 30% от активности исходных.

Рис. 6. Гидратазная КА-акгивность исходных препаратов ФС-2 (1) и фракций, полученных в результате удаления внешних водорастворимых белков ВОК с помощью солевых обработок (2-6): 2 и 3 -соответственно, осадок и супернатант после обработки с помощью 1 М NaCl (супернатант содержит белки PsbP и PsbQ); 4 и 5 - соответственно, осадок и супернатант после обработки осадка «2» с помощью 1 М СаСЬ (супернатант при этом содержит белок PsbO) и 6 - осадок после однократной обработки исходных препаратов с помощью 1 М СаСЬ, приводящей к удалению трех внешних водорастворимых белков. При

концентрации хлорофилла в реакционной среде, равной 44,4 мкг/мл, концентрация РЦ составляла 2,5 ■ 10"7 М.

Этот результат согласуется с данными одних авторов [Lu and Stemier, 2002], однако другие исследователи описывали большее падение КА-активности [McConnell et al., 2007]. КА-активность также наблюдалась в супернатанте, содержащем смесь белков PsbP и PsbQ (Рис. 6, колонка 3). Путем разделения и очистки с помощью ионообменной хроматографии смеси белков PsbP и PsbQ показано, что каждый из них проявляет КА-активность (PsbP -(5±1)- ю8, a PsbQ - (3±0,6)-108 ед. W-A/моль белка. Супернатант, содержащий белок PsbO, не проявлял КА-активности (Рис. 6, колонка 5). Возможно, это было связано с тем, что в растворе, при измерении КА-активности, находилось 93 мМ СаС12 (вследствие разбавления исходного супернатанта, содержавшего 1 М СаС12),

Влияние сульфаниламидных ингибиторов на карбоангидразную активность белковых компонентов фотосистемы 2. Показано, что КА-активность мембранных фрагментов ФС-2, не содержащих трех гидрофильных белков, полностью подавляется с помощью как АА, так и ЭА (концентрация ингибиторов - 10 мкМ). КА-активность очищенных изолированных препаратов белков PsbQ и PsbP не подавляется ни одним из указанных ингибиторов карбоангидраз. Таким образом, КА-активность препарата ФС-2, лишенного

препаратов (Рис. 6, колонка 4).

S30

х

Я"

К*

л

ч

о

30

ч о

.Я <

£ 0

20

10

гидрофильных белков ВОК, проявляет свойства, характерные для обычных карбоангидраз. С другой стороны, активность белков PsbP и PsbQ можно назвать карбоангидразо-подобной (КП-активность), так как их КА-активность не подавляется классическими ингибиторами карбоангидраз.

Действие ионов двухвалентных металлов на карбоангидразо-

нодобную активность фракции белков PsbP и PsbQ. Известно, что белок

PsbP способен прочно связывать ионы Mn2+ ¡Bondarava et al., 2007]. В ВОК ФС-

2, ионы Са2+ и Мп2+ играют важную роль в процессе окисления воды [Ferreira et

al., 2004]. У многих известных карбоангидраз ионы Zn2+ служат кофактором

°° PsbP, PsbQ реакционного центра фермента

+ Мп

[Moroney et al., 2001; Иванов с соавт.,

2007]. В связи с этим исследовалось

влияние Са2+, Мп2+ и Zn2+ на КП-

активность фракции белков PsbP и

PsbQ (Рис. 7). Показано, что только

ионы Мп2+ значительно (более чем в 5

раз) увеличивают КП-активность

PsbP, PsbP, PsbP, фракции этих белков, тогда как ионы

PsbQ PsbQ PsbQ Са2+ и Zn2+, наоборот, ингибировали её +Mg + Ca +Zn _ч тт 9+

(Рис. 7). Ионы Mg , имеющие близкии

к Мп2+ ионный радиус, так же как ионы Рис. 7. Влияние ионов двухвалентных Са2+ и Zn2+, полностью подавляли КП-металлов на гидратазную КП-акгивность активность фракции смеси белков PsbP фракции смеси белков PsbQ и PsbP , ^ ,_ _ __ , , 2+

(колонка 3 на Рис. 6). Концентрация белков и PsbQ (Рис- 7>- Добавление Мп на в реакционной среде составляла 0,25 мкМ. фоне избытка ЭДТА - агента, Концентрация MnS04, MgSO, и СаС12 СВЯЗЬ1Вающего ионы Мп2+ также составляла 200, а ZnCl2 - 50 мкМ.

приводит к подавлению КП-активности (Рис. 8, кривая 2). Эти данные свидетельствуют о том, что фракция смеси гидрофильных белков PsbP и PsbQ обладает КП-активностыо специфично активируемой ионами Мп2+. Максимальное значение КП-активности фракции белков PsbP и PsbQ наблюдается при концентрации Мп2+ равной 200 мкМ и выше (Рис. 8, кривая 1), при этом 50%-ная стимуляция КП-активности происходит при концентрации Мп2+ равной 45 мкМ.

Исследование влияния ионов Мп2+ на КП-активность изолированных высокоочищенных белков PsbP и PsbQ показало, что только активность белка PsbP зависит от ионов Мп2+ (в присутствии 200 мкМ Мп2+ КП-активность увеличивалась в 2 раза - от (5±1)-108 до (10±1)-108 ед. W-A/моль белка).

Добавление 200 мкМ М^24', на фоне 200 мкМ Мп2+, приводит к полному подавлению КП-активности белка РяЬР. Возможно, это связано с тем, что вытесняет Мп2+ из «активного центра» или с поверхности белковой глобулы. Эти результаты подтверждаются данными о том, что Мп2+ прочно связывается с белком РяЬР [Воп(1ага\'а # а1., 2007], что может определять способность Мп2т выступать в качестве кофактора, необходимого для КП-активности. По-видимому, активацией КП-активности именно белка РвЬР ионами Мп2+, описанной выше, можно объяснить специфичное стимулирующее действие Мп2+ на КП-активность фракции смеси белков РбЬР и РвЬО (Рис. 7; Рис. 8, кривая 1).

а

3

о л

4

0

5

1

Я

£ 10

20

н и

U1

т 3 /Xй^

f J

4

Рис. 8. Зависимость гидратазной КП-активности фракции белков РэЬР и РвМЗ, и очищенного белка РзЬО от концентрации Мп2+ 1 - фракция белков Р$ЬР и РвЬС), 2 - фракция белков РэЬР и РвЬО в присутствии 1 мМ ЭДТА, 3 - белок РбЬО. Кривая 4 - результаты измерений, проведенных при различных концентрациях Мп2+ в буфере в отсутствие белков. Конечная концентрация белков РяЬР и РбЫЗ, а также белка РвЬО в образце составляла 5,96 мкг/мл (2,510"7М) и 4,67 мкг/мл (2,5-Ю"7 М), соответственно.

0.00 0.25

0.50 0.75 1.00 (Мп], мМ

48

Действие ионов Мп, ингибиторов карбоангидраз и дитиотрейтола на КА-активность белка PsbO. Ранее было показано [Lu and Stemler, 2007], что белок PsbO проявляет КА-активность и она увеличивается при добавлении 5 мМ Мп2+, а также стимулируется ионами Са2+ и небольшими концентрациями СГ (до 30 мМ). С другой стороны, есть данные [McConnell et al., 2007], что белок PsbO не обладает КА-активностью (в присутствии 50 мМ Мп2+). Полученный нами препарат белка PsbO не содержал Мп и не проявлял КА-активность до тех пор, пока Мп2+ не добавляли в реакционную среду. Ни АА, ни ЭА не подавляли КА-активность белка PsbO, которая появляется в присутствии Mnz+. Это является существенным свойством КА-активности белка PsbO отличающим ее от КА-активности классических карбоангидраз, поэтому гидратазную КА-активность этого белка (как и белка PsbP) можно назвать «карбоангидразоподобной». В результате исследования зависимости КП-активности PsbO от концентрации Мп2+ установлено, что оптимальная для

проявления КП-активности концентрация Мп2+ составляет ~1 мМ, 50%-ное увеличение КП-активности наблюдается при 670 мкМ. Эта величина в 15 раз выше концентрации Мп2+, которая необходима для 50%-ной активации КП-активности у фракции белков PsbP и PsbQ (способность белка PsbO связывать Мп2+ с относительно высокой степенью аффинности (Кс-Ю^4 М~") была продемонстрирована ранее [Shutova et al., 2005]). Выявлено, что ионы Са2+ ингибируют КП-активность белка PsbO, индуцируемую добавлением Мп2+. Эти данные не согласуются с результатами предыдущего исследования [Lu and Stemler, 2007]. Возможно, это противоречие объясняется использованием разных реакций при определении КА-активности: в работе [Lu and Stemler, 2007] измерялась дегидратазная КА-активность, тогда как в нашей работе -гидратазная.

Известно, что для белка PsbO характерно наличие дисульфидной связи в третичной структуре [Oh-oka et al., 1986]. Разрушение этой связи (с помощью дитиотреитола (ДТТ), 2-меркаптоэтанола или 2,3-дигидроксибутан-1,4-дитиола) приводит к нарушению третичной структуры белка [Tanaka and Wada, 1988; Shutova et al., 1997; Shutova et al., 2000]. В наших исследованиях показано, что при нарушении третичной структуры в результате действия ДТТ белок PsbO теряет способность к проявлению КП-активности в присутствии Мп2+. Эти данные свидетельствуют о том, что для проявления выявленной нами Мп2+-индуцируемой КП-активности белка PsbO необходимо сохранение его нативной конформации.

Показано, что изолированный комплекс Д1/Д2/цитохром Ь-559 реакционного центра ФС-2, как и белки светособирающего комплекса ФС-2, не проявляют КА-активности как в отсутствие, так и в присутствии Мп2+. Следовательно, ионы Мп2+ являются специфичным активирующим фактором только для обнаруженных нами источников КП-активности, связанных с ФС-2, а именно, белков PsbO и PsbP. Это утверждение основано также на данных о том, что добавление Мп2+ к фракции цитоплазматических белков, содержащей высокоактивную КА, к субхлоропластным мембранным фрагментам, обогащенным ФС-1, не приводило к увеличению КА-активности. Кроме того, добавление Мп2+ к таким известным белкам, не обладающим КА-активностью, как бычий сывороточный альбумин и цитохром с, не приводит к индуцированию в этих белках КА-активности. Таким образом, способность ионов Мп2+ вызывать появление КП-активности является уникальным свойством гидрофильных белков фотосистемы 2 - PsbO и PsbP.

Заключение

Данные о том, что, наряду с подавлением КА-активности, ингибитор карбоангидраз ацетазоламид вызывает снижение скорости фотосинтетического переноса электрона и что этот ингибирующий эффект снимается добавлением бикарбоната или искусственных доноров электрона, свидетельствуют о важности КА-активности для функционирования донорной стороны ФС-2 высших растений. Уменьшение скорости фотосинтетического выделения кислорода в присутствии ацетазоламида и её увеличение при последующем добавлении ионов бикарбоната является подтверждением значимости карбоангидразной активности для функционирования водоокисляющего комплекса.

В ФС-2 обнаружены четыре носителя КА-активности: субхлоропластные мембранные фрагменты ФС-2, лишенные трех гидрофильных белков, а также каждый га гидрофильных белков РбЬО, РэЬР и РбЬ(3 водоокисляющего комплекса. На основе полученных данных о чувствительности КА-активности к действию классических ингибиторов КА-активности, АА и ЭА, сделано заключение о том, что комплекс ФС-2, лишённый внешних белков, проявляет КА-активность, характерную для классических карбоангидраз. Нечувствительность карбоангидразной активности водорастворимых белков водоокисляющего комплекса к действию АА и ЭА позволяет выделить ее в особый новый тип карбоангидразо-подобной активности. Зависимость карбоангидразоподобной активности белков РбЬО и РбЬР от присутствия ионов Мп2+, является уникальным свойством белков ВОК ФС-2, не характерным для известных карбоангидраз, в активном центре которых содержится Хп2+. Учитывая эти факты, можно предполагать, что мы имеем дело с новым классом Мп-зависимых карбоангидраз, ассоциированных с ФС-2.

Роль обнаруженных нами источников КА-активности, находящихся в люменальной части ФС-2, в непосредственной близости к ВОК, может быть важна для фотосинтетического окисления воды, подобно функциональной активности карбоангидразы саЬЗ, обнаруженной ранее в составе ядерного комплекса ФС-2 клеток СМ. шпИагАи и, возможно, необходимой (наряду с анионом бикарбоната) для акцептирования протонов в процессе фотосинтетического окисления воды.

выводы

1. На мембранных фрагментах фотосистемы 2 гороха, показано, что ингибитор карбоангидраз, ацетазоламид, вызывает (наряду с подавлением карбоангидразной активности фотосистемы 2) снижение скорости фотосинтетического переноса электрона в фотосистеме 2, которое частично снимается добавлением бикарбоната или искусственных доноров электрона. Эти данные свидетельствуют о важности карбоангидразной активности для функционирования донорной стороны фотосистемы 2 высших растений.

2. Выявлены новые ингибиторы а-карбоангидраз (содержащие сульфанильные и амидные группы). Среди них найдены вещества, способные подавлять как карбоангидразную, так и фотосинтетическую активность фотосистемы 2. Сходство эффектов ингибиторов карбоангидраз разной молекулярной структуры служит дополнительным доказательством значимости карбоангидразной активности для функционирования фотосистемы 2.

3. Карбоангидразная активность препаратов фотосистемы 2 слагается из карбоангидразной активности комплексов фотосистемы 2, лишённых гидрофильных белков, чувствительной к действию специфичных ингибиторов карбоангидраз, и карбоангидразоподобной активности белков РэЬО, РвЬР и РбЫЗ, не чувствительной к действию этих ингибиторов.

4. Выявлено, что изолированный и очищенный от металлов белок РбЬР обладает карбоангидразоподобной активностью, которая значительно активируется в присутствии Мп2+ и полностью подавляется ионами М§2+, что свидетельствует о специфичности действия Мп2+ на карбоангидразоподобную активность белка РбЬР.

5. Белок РбЬО, очищенный от металлов, проявляет карбоангидразоподобную активность только в присутствии экзогенного Мп2+. Разрушение дисульфидной связи дитиотрейтолом приводит к потере Мп-индуцируемой карбоангидразоподобной активности белка РвЬО, что свидетельствует о необходимости нативной конформации белка для проявления этой активности.

6. Обнаруженная Мп-зависимая карбоангидразоподобная активность, характерная для белков РзЬО и РбЬР фотосистемы 2, не выявляется у других белков растений (белка РэЬр, фракции белков цитоплазмы, фотосистемы 1, светособирающего комплекса фотосистемы 2) и белков животных (цитохрома с, бычьего сывороточного альбумина) и проявляет свойства, не характерные для типичных карбоангидраз (необходимость присутствия Мп2+, нечувствительность к классическим ингибиторам карбоангидраз), что позволяет сделать предположение о том, что Р$ЬО и РбЪР могут представлять собой новый класс Мп-зависимых карбоангидраз.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. А.В. Шитов. О.В. Побегуц, Т.Н. Смолова, С.И. Аллахвердиев, В.В. Климов. (2009) Марганецзависимая карбоангидразная активность белков фотосистемы 2. Биохимия, 74, вып. 5, 629 - 639.

2. А.У. Shitov. S.K. Zharmukhamedov, T.V. Shutova, S.I. Allakhverdiev, G. Samuelsson, V.V. Klimov. (2011) A carbonic anhydrase inhibitor induces bicarbonate-reversible suppression of electron transfer in pea photosystem 2 membrane fragments. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 104, 366-371.

Материалы конференций п тезисы докладов:

1. Щитгт А.В.. Жармухамедов С.К., Аллахвердиев С.И., Климов В.В. Значимость бикарбоната и карбоангидразной активности для функционирования фотосистемы 2 высших растений // Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии», Саранск, 3-5 октября 2012 г. Материалы конференции, с. 150.

2. А.В. Шитов. Т.В. Шутова, С.И. Аллахвердиев, G. Samuelsson, В.В. Климов Карбоангидразная активность фотосистемы-2 высших растений // 10-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология — наука XXI века», Пущино, 17-21 апреля 2006 г. Сборник тезисов, т. 2, с. 102.

3. А.В. Шитов. О.В. Побегуц, Т.Н. Смолова, С.И. Аллахвердиев, В.В. Климов Марганец-зависимая карбоангидразная активность белков фотосистемы 2 // XIX Путинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах», Пущино, 15-19 июня 2009 г. Тезисы докладов, с. 67.

4. А.В. Шитов. О.В. Побегуц, Т.Н. Смолова, С.И. Аллахвердиев, В.В. Климов Марганецзависимая карбоангидразная активность белков фотосистемы 2 // 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 19-23 апреля 2010 г. Сборник тезисов, т. 2, с. 345 - 346.

5. А.У. Shitov. O.V. Pobcguts, T.N. Smolova, S.I. Allakhverdiev, V.V. Klimov Manganese-dependent carboanhydrase activity of photosystem 2 proteins // The 15th international congress of photosynthesis, Beijing, 22 - 27 August, 2010. Abstracts, c. 86.

6. А.В. Шитов. О.В. Побегуц, Т.Н. Смолова, В.В. Климов, С.И. Аллахвердиев Действие ингибиторов карбоангидраз на карбоангидразнуто активность белков фотосистемы 2 высших растений // 15-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология — наука XXI века», Пущино, 18—22 апреля

2011 г. Сборник тезисов, с. 420 - 421.

7. A. Shitov. S. Zharmukhamedov, Т. Shutova, S. Allakhverdiev, G.Samuelsson, V. Klimov A carbonic anhydrase inhibitor induces bicarbonate-reversible suppression of electron transfer in pea photosystem 2 membrane fragments // The International Meeting «Photosynthesis Research for Sustainability - 2011», Baku, 24-30 July, 2011. Abstracts, c. 71.

8. Шитов A.B.. Жармухамедов C.K., Шутова T.B., Аллахвердиев С.И., Samuelsson G., Климов В.В. Значимость карбоангидразной активности для функционирования фотосистемы 2 высших растений // XX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе», Пущино, 17—22 июня

2012 г. Тезисы докладов, с. 64.

Подписано в печать:

20.05.2013

Заказ № 8518 Тираж - 140 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шитов, Александр Васильевич, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201360026

ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ КАРБОАНГИДРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ФОТОСИСТЕМЫ 2 ГОРОХА

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.В. Климов; доктор биологических наук С.И. Аллахвердиев

ПУЩИНО -2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................6

ГЛАВА1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................9

1.1. Строение фотосистемы 2.....................................................................................................9

1.1.1. Реакционный центр.........................................................................................................9

1.1.2. «Ядерный» комплекс....................................................................................................10

1.1.3. Светособирающий комплекс.......................................................................................11

1.1.4. Водоокисляющий комплекс.........................................................................................12

Структурно функциональная организация водоокисляющего комплекса...............12

Предполагаемые функции внешних белков водоокисляющего комплекса................14

1.2. Роль бикарбоната в функционировании фотосистемы 2 высших растений..........16

1.2.1. Бикарбонатный эффект на препаратах фотосистемы 2............................................17

1.2.2. Стимулирующий эффект бикарбоната во время реконструкции водоокисляющего комплекса.......................................................................................18

1.2.3. Стабилизирующий эффект бикарбоната во время фото- и термоинактивации фотосистемы 2..............................................................................19

1.3. Карбоангидразная активность фотосистемы 2............................................................21

1.3.1. Карбоангидразная активность фотосистемы 2 высших растений и

её свойства.....................................................................................................................21

1.3.2. Карбоангидраза СаЬЗ одноклеточной водоросли

СЫатуйотопах гетИаг&И............................................................................................22

1.3.3. Возможная взаимосвязь карбоангидразной активности и кислородвыделяющей активности в фотосистеме 2 высших растений...................23

1.3.4. Носители карбоангидразной активности в фотосистеме 2

высших растений..........................................................................................................25

Карбоангидразная активность «ядерного» комплекса.............................................26

Отмывки солями и «внешняя» карбоангидразная активность...............................28

«Внутренняя» карбоангидразная активность фотосистемы 2.............................29

Предполагаемая карбоангидразная активность белка РзЬО...................................30

1.3.5. Возможные функции карбоангидразы (карбоангидраз) в фотосистеме 2..............32

1.4. Карбоангидразы, их классификация, механизм функционирования, ингибирование....................................................................................................................34

1.4.1. Многообразие и классификация карбоангидраз........................................................34

1.4.2. Механизм катализа карбоангидраз.............................................................................36

1.4.3. Краткие характеристики карбоангидраз разных классов.........................................38

1.4.3.1. а-карбоангидразы.............................................................................................38

1.4.3.2. ¡}-карбоангидразы.............................................................................................38

/3-карбоангидразы первого типа.........................................................................39

р-карбоангидразы второго типа.......................................................................39

1.4.3.3. у-карбоангидразы.............................................................................................39

1.4.3.4. д-карбоангидразы.............................................................................................40

1.4.3.5. е-карбоангидразы.............................................................................................41

1.4.3.6. С-карбоангидразы.............................................................................................41

1.4.4. Основные физиологические роли карбоангидраз......................................................42

1.4.5. Замена металлов в активном центре карбоангидраз.................................................43

1.4.6. Ингибиторы карбоангидраз, их классификация и механизм действия...................45

1.4.7. Влияние сульфаниламидных ингибиторов на карбоангидразы

разных классов...............................................................................................................46

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................................47

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................................................47

2.1. Объекты исследования.........................................................................................................47

2.2. Получение фракции растворимых белков цитоплазмы из листьев гороха.....................47

2.3. Выделение фрагментов тилакоидных мембран, обогащенных фотосистемой 2...........47

2.4. Выделение фрагментов тилакоидных мембран, обогащенных фотосистемой 1...........48

2.5. Выделение комплекса светособирающих белков фотосистемы 2...................................48

2.6. Получение безмарганцевых препаратов фотосистемы 2..................................................49

2.7. Выделение реакционных центров фотосистемы 2............................................................49

2.8. Получение и очистка белков РвЬО, РвЬР и РвЫ^...............................................................49

2.9. Приготовление растворов сульфаниламидных ингибиторов...........................................50

2.10. Измерение концентрации белка........................................................................................50

2.11. Измерение карбоангидразной активности.......................................................................50

2.12. Измерение реакции Хилла.................................................................................................51

2.13. Удаление бикарбоната из препаратов..............................................................................51

2.14. Измерение концентрации хлорофилла.............................................................................51

2.15. Измерение скорости фотосинтетического выделения кислорода.................................52

2.16. Измерение фотоиндуцированных изменений выхода

флуоресценции хлорофилла..............................................................................................52

2.17. Электрофорез......................................................................................................................52

2.18. Измерение концентрации ионов металлов (Мп, Ъп).......................................................53

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................54

3.1. Значимость карбоангидразной активности для фотосистемы 2...............................54

3.1.1. Выбор метода измерения карбоангидразной активности.........................................54

3.1.2. Карбоангидразная активность фотосистемы 2..........................................................56

3.1.3. Ингибирование сульфаниламидными ингибиторами карбоангидразной активности фотосистемы 2...........................................................................................59

3.1.4. Влияние сульфаниламидных ингибиторов на фотосинтетическую

активность фотосистемы 2...........................................................................................61

3.1.4.1. Измерение реакции Хилла в присутствии сульфаниламидов.......................61

3.1.4.2. Измерение скорости выделения кислорода

в присутствии сульфаниламидов.....................................................................64

3.1.4.3. Измерение фотоиндуцированных АФ в присутствии ацетазоламида и искусственных доноров электрона...................................65

3.1.5. Выяснение значения карбоангидразной активности для функционирования фотосистемы 2.............................................................................68

3.2. Поиск ингибиторов карбоангидраз, подавляющих карбоангидразную

и фотосинтетическую активности фотосистемы 2......................................................76

3.3. Карбоангидразная активность фотосистемы 2 и ее отдельных компонентов.......79

3.3.1. Источники карбоангидразной активности в фотосистеме 2

и их характеристика......................................................................................................79

3.3.2. Влияние ингибиторов карбоангидраз на карбоангидразную активность различных препаратов, выделенных из фотосистемы 2............................................85

3.3.3. Влияние ионов двухвалентных металлов на карбоангидразоподобную активность внешних белков РэЬР и РэЬО...................................................................88

3.3.4. Карбоангидразная активность белка РвЬО.................................................................93

3.3.4.1. Влияние ионов марганца на карбоангидразную активность белка РяЬО... 93

3.3.4.2. Влияние ингибиторов карбоангидраз и дитиотрейтола на карбоангидразную активность белка РзЬО...................................................94

3.3.5. Содержание Мп и2пв полученных из фотосистемы 2 препаратах........................98

3.4. Заключение: важная роль карбоангидразной активности для функционирования донорной стороны фотосистемы 2 высших растений..........101

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................105

БЛАГОДАРНОСТИ..................................................................................................................116

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА ацетазоламид

АТФ аденозинтрифосфат

ВОК водоокисляющий комплекс

ДТ-20 фрагменты тилакоидных мембран, обогащенные фотосистемой 2 (выделенные с помощью детергентов дигитонина и Triton Х-100, согласно [Пронина с соавт., 2002])

ДХФИФ 2,6-дихлорфенолиндофенол

КА карбоангидраза(ы)

а(р, у, 5, б, Q-KA а(Р, у, 5, е, ^)-карбоангидраза(ы)

KA II (III, IV и т.д.) карбоангидраза изоформы II (III, IV и т.д.)

КА-активность карбоангидразная активность

КП-активность карбоангидразоподобная активность

Kd константа диссоциации

Ккат константа скорости ферментативной реакции

Ксв константа связывания

НАДФ никотинамидадениндинуклеотидфосфат

Пб80 первичный донор электрона в фотосистеме 2

ПААГ полиакриламидный гель

РЦ реакционный центр

ССК2 светособирающий комплекс 2 (относящийся к фотосистеме 2)

ТМФД N,N,N' ,N' -тетраметил-р-фенилендиамин

Фо начальный («темновой») уровень флуоресценции хлорофилла о

ДФ изменения выхода флуоресценции хлорофилла а

Фм сумма Фо плюс ДФ

Фео феофитин

ФС-1 фотосистема 1

ФС-2 фотосистема 2

Хл хлорофилл

ЭА этоксизоламид

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

BBY фрагменты тилакоидных мембран, обогащенные фотосистемой 2

(выделенные согласно [Berthold et al., 1981])

ЕС50 концентрация вещества, необходимая для достижения 50%-ного эффекта

150 концентрация ингибитора, при которой активность фермента

подавляется наполовину

MES 2-(Ы-морфолино)этансульфоновая кислота

Tris 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол

Qa и Qb первичный и вторичный хиноновые акцепторы электрона в фотосистеме 2

Yz аминокислотный остаток тирозина 161 белка D1 в фотосистеме 2

ВВЕДЕНИЕ

Фотосинтез (От греч. Photos - свет + Synthesis - соединение) - это один из величайших по значимости процессов на Земле, изменивший до неузнаваемости облик нашей планеты.

За счёт энергии Солнца, энергетически бедные вещества СО2 и НгО превращаются в богатые энергией продукты - углеводы, это важнейший путь химических реакций при фотосинтезе [Холл и Pao, 1983].

Для синтеза углеводов необходимы СО2, электроны и энергия. Углекислый газ поступает в клетку из окружающей среды, а приток электронов (в виде НАДФН) и энергия (в виде АТФ) обеспечивается работой цепи переноса электрона в тилакоидной мембране. В её состав входят три трансмембранных белковых комплекса (фотосистема 2, фотосистема 1 и цитохромный böf комплекс) и подвижные переносчики электрона (пластоцианин, ферредоксин и пул пластохинонов). Перенос электрона сопряжён с образованием градиента протонов и синтезом АТФ. У большинства фотосинтезирующих организмов источником электронов, поступающих в электрон-транспортную цепь, являются молекулы воды. При разложении воды в процессе фотосинтеза выделяется молекулярный кислород. В связи с этим данный процесс назван оксигенным фотосинтезом [Whitmarsh and Govindjee, 2002].

Оксигенный фотосинтез осуществляют как эукариоты (высшие и низшие растения, одноклеточные водоросли, некоторые простейшие), так и прокариоты (цианобактерии) [Холл и Pao, 1983]. У всех вышеназванных организмов фотосинтетическое окисление воды происходит в специализированном пигмент-белково-липидном комплексе, пронизывающем тилакоидные мембраны, - фотосистеме 2. Фотосистема 2 (ФС-2) - это единственный белковый комплекс, способный окислять воду и выделять молекулярный кислород.

Состав и структура белков фотосистемы 2 лучше изучены у цианобактерий (к настоящему времени получена рентгено-структурная модель этого комплекса с разрешением 1,9 Á [Umena et al., 2011]) и хуже для эукариотических организмов (проекционная модель меньшего разрешения - 5,5 Ä, на основе двумерных электронных фотографий [Büchel and Kühlbrandt, 2005]), что затрудняет идентификацию и точное определение положения отдельных аминокислот в белках и кофакторов фотосинтеза. Тем не менее, для ФС-2 эукариот определён состав основных кофакторов, участвующих в фотосинтетическом разложении воды и переносе электрона через ФС-2 [Nelson and Yocum, 2006; Croce and van Amerongen, 2011]. В ряде работ было убедительно показано,

что для функционирования как акцепторной, так и донорной стороны ФС-2 высших растений и одноклеточных водорослей важен ион бикарбоната [Wydrzynski and Govindjee, 1975; van Rensen et al., 1988; Klimov et al., 1995a, 1995b; Villarejo et al., 2002; Shutova et al., 2008].

Если бикарбонат так важен для функционирования ФС-2, то в этом белковом комплексе должен присутствовать катализатор, ускоряющий обратимую реакцию преобразования СО2 + Н2О <-»• НСОз" + ЬТ^ [Stemler and Jursinic, 1983]. В природе широко распространены ферменты - карбоангидразы, выполняющие роль такого катализатора. В одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii была обнаружена карбоангидраза (КА), Cah3, ассоциированная с ФС-2 [Karlsson et al., 1998]. Предполагается, что Cah3 ускоряет отвод протонов от водоокисляющего комплекса (ВОК), препятствуя закислению пространства внутри него и обеспечивая высокую скорость окисления воды в процессе фотосинтеза [Shutova et al., 2008]. Структура ФС-2 Chi, reinhardtii имеет ряд отличий от структуры ФС-2 высших растений (в особенности это касается структуры белков ВОК) [Enami et al., 2008]. Кроме того, Chi reinhardtii - это единственный организм, для которого показана значимость карбоангидразной активности (КА-активности) для функционирования ФС-2. Поэтому исследование КА-активности ФС-2 высших растений представляет значительный научный интерес. Эти исследования значительно расширят представление о функционировании ФС-2 и будут являться шагом к выяснению механизма окисления воды.

Многими исследователями было показано наличие КА-активности, ассоциированной с ФС-2 высших растений, таких как: арабидопсис, шпинат, горох, пшеница, кукуруза [Stemler, 1986; Lu and Stemler, 2002, 2007; Dai et al., 2002; Пронина с соавт., 2002; Moskvin et al, 1999, 2004; Lu et al., 2005; Руденко с соавт., 2006; Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007; McConnell et al., 2007; Ignatova et al., 2011]. Также были сделаны попытки определить, связаны ли КА- и фотосинтетическая активности ФС-2. Некоторые исследователи полагали, что КА-активность не связана с фотосинтетической активностью ФС-2 [Dai et al. 2002; McConnell 2007]. Однако в других работах были выдвинуты предположения о важности КА-активности для функционирования ФС-2 [Пронина с соавт., 2002; Lu et al., 2005; Lu and Stemler, 2007; Lazova et al., 2009]. К настоящему времени накоплено ещё недостаточно сведений, чтобы подтвердить или опровергнуть наличие взаимосвязи между карбоангидразной и функциональной активностью ФС-2 высших растений. Исследование данного вопроса и было целью нашей работы.

Одним из подходов к исследованию функции фермента является использование его ингибиторов [Swader and Jacobson, 1972]. На данный момент остаётся много неясных

вопросов, касающихся механизма функционирования ФС-2 и функций отдельных белков этого комплекса. Некоторые из этих вопросов могли бы быть решены с помощью ингибиторов, способных подавлять перенос электрона на определённых участках цепи переносчиков в ФС-2 и/или карбоангидразную активность. Таким образом, поиск новых ингибиторов фотосинтетической (карбоангидразной) активности представляет значительный научный интерес. Это также являлось целью нашей работы.

Важной проблемой в исследовании КА-активности ФС-2 является выявление белка (или группы белков), обладающего этой активностью. Ни один из известных белков ФС-2 высших растений не имеет гомологии с карбоангидразой Cah3 Chi. reinhardtii. КА-активностью в ФС-2 может обладать либо неизвестный до настоящего времени белок, либо известный белок, выполняющий другую функцию. Не исключено, что КА-активностью в ФС-2, может обладать комплекс состоящий из двух и более белковых субъединиц [Rudenko et al., 2007], как это показано для и у-КА. По результатам последних работ в этой области было выдвинуто предположение, что в ФС-2 существует два источника КА-активности: один из них ассоциирован с «ядерным» комплексом ФС-2; а другой связан с одним из внешних водорастворимых белков ВОК - белком PsbO [Lu and Stemler, 2007; Dai et al., 2002; Moskvin et al, 1999, 2004; Rudenko et al., 2007; McConnell et al., 2007; Ignatova et al., 2011]. Однако в ряде работ было показано, что белок PsbO не обладает КА-активностью [Пронина с соавт., 2002; McConnell et al., 2007;]. Таким образом, выявление источников КА-активности в ФС-2 является актуальной задачей, что и было предметом наших исследований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. СТРОЕНИЕ ФОТОСИСТЕМЫ 2

Фотосистема 2 (Рис. 1) состоит из более чем 20 различных белков и пигмент-белковых комплексов различного состава, зависящего от условий окружающей среды. Эти полипептиды являются продуктами хлоропластных и ядерных генов Часть из них непосредственно связана с поглощением энергии света и передачей энергии возбуждения, р