Гетерогенность карбоангидразной активности тилакоидов гороха

Руденко, Наталья Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гетерогенность карбоангидразной активности тилакоидов гороха
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность карбоангидразной активности тилакоидов гороха"

Не правах рукописи

Руде и ко Наталья Николаевна

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ КЛРБОАНГИДГАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ТИЛАКОИДОВГОРОХА

03.00.12 физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущине-2006

Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии Российской Академии Наук, г. Пущино.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Иванов Борис Николаевич.

доктор биологических наук Пронина Наталья Александровна,

доктор биологических наук Любимов Валерий Юрьевич.

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского государственного университета

им. М.В. Ломоносова, г. Москва.

Защита состоится Г июня 2006 г. в на заседании

диссертационного совета Д 002.066.01 при Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН.

Автореферат разослан ^ мая 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Карбоангидраза (КА, карбонатгидролиаза КФ 4,2.1.1.) - фермент, катализирующий реакцию С02 + Н20 «-► HCOj" + Н+ встречается практически во всех живых организмах. Биологические системы, требующие для обмена веществ больших потоков неорганического углерода, обладают цитоплазматическими, митохондри-апьными, периплазматическими, хлоропластными карбоангидразами (Smith, 1988) В геноме Arabidopsis thaliana известно 14 генов, кодирующих карбоангидразы, принадлежащие трбм известным семействам (Moroney et al., 2001), но только две карбоангидразы высших растений, стромальная и цитоплазматическая, были выделены и хорошо изучены (Graham, 1984; Badger & Price, 1994).

Функционирование карбоангидраз, участвующих в фотосинтезе, процессе преобразования энергии света в энергию химических связей органических соединений в растении, остается невыясненным в некоторых важных аспектах. Взаимопревращение форм неорганического углерода - необходимая стадия как на его пути к центрам карбоксили-рования, так и в строме хлоропласта, где происходит реакция присоединения молекулы СОг к рибулозо-1,5-бисфосфату с участием рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Рубиско). При щелочных pH в строме на свету неорганический углерод, в основном, находится в форме бикарбоната, и для обеспечения эффективного функционирования Рубиско нужен быстрый перевод НСОз" в СО2. Считается, что для эффективного протекания этой реакции необходима карбоангидраза, ускоряющая реакцию взаимопревращения форм неорганического углерода, и предполагается, что эту функцию выполняет растворимая стромальная карбоангидраза. Было высказано предположение об участии в дегидратации бикарбоната карбоангидразы, связанной с тилакоидной мембраной (Пронина, Семененко, 1984).

Перенос электронов в тилакоидах по фотосинтетической электрон-транспортной цепи как на акцепторной, так и на донорной сторонах фотосистемы 2 (van Rensen, 1988; Allakhverdiev, 1997; Klimov & Baranov, 2001) также зависит от присутствия неорганического углерода. Не ясно, какая форма углерода взаимодействует с переносчиками электронов, но очевидно, что для эффективного функционирования электрон-транспортной цепи необходимо присутствие карбоангидразы, поскольку специфические ингибиторы карбоангидраз подавляют фотосинтетический электронный транспорт в тилакоидах (Stemler & Jursinic, 1982).

Данные о присутствии карбоангидразы в тилакоидах высших растений были получены еще в 1982 г. (Vaklinova et al.). Комарова и др. (1982) обнаружили присутствие в хлоропластах бобов двух белков, обладающих карбоангидразной активностью, разли-

РОС. НАЦИОНАЛЬНА БИБлШО.Ч-К ^ С.-Петербург

чающихся по электрофоретической подвижности Однако вопросы о природе, расположении в тилакоидах, функциях и свойствах тилакоидной карбоангидразы остаются мало изученными. С каждым годом обнаруживаются новые карбоангидразы в клетках, казалось бы, хорошо изученных организмов и накапливаются свидетельства присутствия нескольких карбоангидраз в тилакоидах высших растений (Пронина и др , 2002; 1.и & $1ет-1ег, 2002).

Цель работы Поиск и изучение носителей КА активности тилакоидов высших растений' определение их количества, свойств, характера связи с тилакоидной мембраной и возможного расположения в тилакоидах.

В процессе работы решались следующие задачи:

1 Подбор условий выделения тилакоидных мембран, обогащенных или фотосистемой 1 или фотосистемой 2, свободных от люменальных и слабо связанных с тилакоидной мембраной белков и сохраняющих КА активность.

2 Проведение электрофореза, обеспечивающего разделение пигмент-белковых комплексов тилакоидов и выявление в них КА активности.

3. Выявление различий в характеристиках активности растворимых карбоангидраз и тилакоидных фракций. 4 Изучение КА активности тилакоидных фракций.

Научная новизна Изучение характеристик карбоангидразной активности тилакоидов и растворимых белков листьев гороха (влияние тритона Х-100, сульфамидных ингибиторов и дитиотреитола) показало отличие носителей карбоангидразной активности тилакоидов от растворимых карбоангидраз стромы и цитоплазмы. По крайней мере два носителя карбоангидразной активности тилакоидов расположены вблизи ФС2, один из которых связан с кор-комплексом этой фотосистемы. Эффект стимуляции карбоангидразной активности тилакоидов при субмикромолярных концентрациях плохо проникающего в мембраны сульфамидного ингибитора карбоангидраз ацетазоламида (АА) обусловлен его действием на низкомолекулярный белок, обладающий карбоангидразной активностью, расположенный вблизи ФС2.

Фрагменты тилакоидных мембран, обогащенные ФС1, обладают карбоангидразной активностью, в несколько раз превышающей активность фрагментов мембран, обогащенных ФС2. Обнаружен растворимый носитель карбоангидразной активности, расположенный, вероятно, в люмене тилакоидов, названный нами «Ь» (люменный). Показано, что свойства «I.»: электрофоретическая подвижность, действие на него ингибиторов и дитиотреитола, отличаются от свойств растворимых (стромальной и цитоплазматиче-ской) карбоангидраз листьев гороха.

Апробация работы. Основные положения работы изложены на Городской научной конференции молодых ученых (Пущино, 2002), Международной конференции «Первичные процессы в фотосинтезе бактерий и растительной фотосистемы II» (Пущино, 2002), Международной конференции «Фотосинтез и продуктивность урожая» (Киев, 2002), V съезде Общества Физиологов растений России (Пенза, 2003), XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004). Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 127 страниц, содержит 34 рисунка и 11 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы содержит сведения об особенностях строения активных центров, осуществления каталитической реакции, механизме ингибирования карбоангидраз, принадлежащих известным семействам, а также данные о распределении КА в клетках различных организмов и функциях КА. Рассмотрены имеющиеся сведения о тилакоидной КА водорослей и КА активности тилакоидов высших растений.

Объекты и методы исследования. Основным объектом исследования служили тилакоиды и выделенные из них фрагменты мембран, обогащенные ФС1 или ФС2 (ФС1-мембраны и ФС2-мембраны), мезофилла листьев гороха (Pisum sativum /..), отмытые от растворимых КА. Среда выделения тилакоидов содержала 1мМ фенилметилсульфонилфлуорид, ингибитор протеаз. Все операции выделения тилакоидов и их фрагментов проводили при 4°С.

Выделение мембран, обогащенных ФС1 или ФС2 осуществляли с помощью неионного детергента тритона Х-100 (рис. 1). Тилакоиды инкубировали с тритоном при отношении тритон/хл, мг/мг, равном 1.0 в течение 20 мин при 0° С, затем центрифугировали при 12000g, 30 мин Супернатант, полученный таким образом (супернатант «12»), содержал белки люмена и белки, слабо связанные с тилакоидной мембраной. Его также исследовали на присутствие КА активности. Осадок инкубировали при тех же условиях в той же среде при отношении тритон/хл., равном 20.0. После центрифугирования при 32000g в течение 30 мин получали осадок, содержавший ФС2-мембраны. Для получения ФС1-мембран супернатант центрифугировали при 144000g в течение 1 часа. ФС1- и ФС2-

мембраны замораживали в жидком азоте с добавлением 10% глицерина и хранили при 80°С.

Выделение тилакоидов *

Инкубация тилакоидов с тритоном Х-100 (при отношении тритон/хл, равном 1 0) при 0°С, в

течение 20 мин ♦

Центрифугирование при 12000 в течение 30 мин

Супернатант «12» Инкубация осадка тилакоидов с тритоном при отношении

КА4 («Ь»), КА2, КАЗ . ,п. „.„ ,п

' тритон/хл, равном 20.0 при 0 С, в течение 30 мин

Центрифугирование при 32000 g, в течение 30 мин .

К \

Центрифуг ирование супернатанта при Ресуспендирование осадка в том же количестве 144000 g, среды и осаждение в том же режиме.

т Осадок содержал ФС2-мембраны

Ресуспендирование осадка в той же среде и осаждение КА1, КА2

при тех же условиях. Осадок содержал ФС1-мембраны КАЗ

Рис. 1. Схема фракционирования тилакоидов Показано распределение носителей КА активности во фракциях.

Анализ состава фракций проводили с помощью измерения спектров низкотемпературной флуоресценции (Се(1ег51гап(1 & Ооутс1§ее, 1966), возбуждаемой светом с длиной волны 435 им Степень взаимозагрязнения препаратов фотосистем контролировали путем измерения фотоиндуцированного изменения поглощения (ДА) на двухлучевой фос-фороскопической установке (Карапетян и Климов, 1971). Функциональную активность фотосистем определяли по скорости поглощения или выделения кислорода с помощью рСЬ-элсктрода Кларка Экстракт растворимых белков листьев гороха, содержащий растворимые карбоангидразы, получали из листьев верхних двух ярусов 10-14-ти дневных растений гороха, замораживали в жидком азоте с добавлением 10% глицерина и хранили при -80°С.

Измерение КА активности проводили с помощью стеклянного электрода при 2°С в 14 мМ вероналовом буфере (рН 8.4), начиная реакцию добавлением воды, насыщенной С02 и измеряя время изменения рН от 8 3 до 7.8 Контролем служило время спонтанной гидратации в тех же условиях с добавлением соответствующей среды вместо образца. Активность КА выражали в мкмолях Н+ на мг хлорофилла или мг белка за минуту с учетом буферной емкости сред и образцов, определяемой титрованием 0.1 М НС1.

Электрофорез проводили по методу (Peter & Thornber, 1991) Препараты перед нанесением на гель обрабатывали детергентом додецилмальтозидом (ДМ) Условия обработки препаратов детергентом подбирали экспериментально Выявление КА активности в ПААГ проводили добавлением насыщенного раствора СОг к гелям, предварительно окрашенным бромтимоловым синим. В местах проявления КА активности происходил переход синей окраски индикатора в желтую. Анализ гелей на присутствие белка проводили с помощью кумасси G-250. Для определения молекулярной массы пигмент-белковых комплексов в качестве стандарта использовали уреазу - смесь тримера и гекса-мера с молекулярной массой 272 кД и 545 кД, соответственно.

гая

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Распределение КА активности в тилакоидах.

Распределение КА активности в тилакоидах было исследовано с помощью электрофореза в 7% ПААГ додецилмальтозидных экстрактов тилакоидов, обладавших КА активностью (рис. 2А). В принятых условиях электрофореза мы обнаружили шесть полос пигмент-белковых комплексов. Из спектров низкотемпературной флуоресценции (рис.1Б) видно, что стартовая часть геля (полоса 1) содержала крупные фрагменты тилакоидов, полоса 2 соответствовала фрагментам мембран, обогащенным ФС1 Об этом свидетельствовал выраженный максимум флуоресценции Р700 при 735 нм.

Рис. 2.

A. Электрофорез в 7% ПААГ ДМ-эксгракта тилакоидов. Линии справа от элек-трофореграмм показывают положение белков-метчиков, а цифры - их молекулярная масса (кД). Показаны линии разреза геля. Ь. Спектры низкотемпературной флуоресценции зеленых полос.

B. Карбоангидраз-ная активность элюатов этих полос.

Б Ятш, CiHIM В КА активность элютгав ШХЛ.ШШЯ

— 4M 1 ЯШ**** 2.54+0.96 5560t2100

..— эм 2 з***** 3.62+0.66 45901840

— m 3 0.77+ 0.31 1290±530

— m 4 |л— жттвпгяг» 0.41+0.3 444+316

— я 5 1А- Шштымя 0.65±0.03 643+30

б 2.36+0.49 11250+2360

nvn- проявление КА активности /////-распределение пигмент-белковых комплексов

Полосы 3-6 содержали, в основном, светособирающий комплекс (максимум при 682 нм), ФС2 (максимум Р680 - при 695 нм) и незначительную примесь ФС1 (рис. 2Б) На рис 2А показано проявление КА активности в геле Наиболее явно разните окраски наблюдалась в полосах, обогащенных Р700 (полоса 2), Р680 (полосе 3) и в полосе низкомолекулярных белков с кажущейся молекулярной массой около 50 кД (полоса 6)

Для того, чтобы оценить КА активность пигмент-белковых комплексов гель разрезали так, как показано на рис 2А, элюировали содержимое полос в вероналовый буфер с последующим измерением КА активности элюатов КА активность присутствовала практически во всех полосах, причем наиболее высокая суммарная КА активность наблюдалась в полосе 2, содержащей ФС1-мембраны (рис 2В, левая колонка) В расчете на хлорофилл КА активность полос 1 и 6 оказывалась наиболее высокой (рис. 2В, правая колонка), поскольку содержание хлорофилла в этих полосах было незначительно.

Для изучения свойств носителей КА активности тилакоидов их инкубировали с тритоном Х-100 При действии тритона на тилакоиды наблюдали два пика активности, при отношениях тритон/хл, равных 0 3 и 1.0 (рис. 3, кривая 1) Наличие двух пиков КА активности тилакоидов свидетельствовало о гетерогенности этой активности. Мы предположили, что при отношении тритон/хл, равном 0 3 повышалась активность одного из носителей, которая уменьшалась при более высокой концентрации тритона..

Рис. 3. КА активность тилакоидов, ФС1-мембран и ФС2-мембран, инкубированных с тритоном при различных отношениях тритон/хл. 100% - КА активность в отсутствие тритона: для тилакоидов - 61.2 мкмоль Н+(мг хл)"'мин"', для ФС1 -мембран - 1060 мкмоль Н+(мг хл)'1мин'1, для ФС2-мембран - 78 мкмоль Н+(мг хлу'мин"1. На врезке - КА активность экстракта растворимых белков листьев гороха, %. 100% - К А активность в отсутствие тритона, 1380 мкмоль Н+(мг белка)''мин''.

При повышении отношения тритон/хл до 1 0 происходило увеличение КА активности, которое может быть связано как с активацией мембраносвязанного(ых) носителя(ей), так и с выходом при этом отношении тритон/хл носителя(ей) КА активности в раствор (см.

200< 180160-

# 140. 120

5 100 X

Ё 80. (О

§ во.

40. 20. 0

—О—тилакоиды - 1 - -о- - ФС1 - мембраны - 2 А ФС2-мембраны - 3

00 0.2 04 0« 08 1Д и <.4 1.» 1« 20 2.2 2.4 ЗЛ Тритон Х-100/Хлсрофилл, ыгЫг

далее). При ещё более высоких концентрациях детергента КА активность этого(их) носи-теля(ей) снижалась

4.2. КА активность ФС1-мембран и ФС2-мембран.

Следующим шагом в исследовании носителей КА активности тилакоидов было изучение КА активности тилакоидных мембран, обогащенных ФС1 или ФС2 Для получения препаратов ФС1- и ФС2-мембран использовали тилакоиды, предварительно обработанные тритоном при отношении тритон/хл, равном 1 0 и осажденные при 12000§ (см. Методы), поэтому носители КА активности, которые могли находиться в люмене или были слабо связаны с мембраной, переходили в супернатант Таким образом, препараты ФС1- и ФС2-мембран содержали только носители КА активности, прочно связанные с тилакоидной мембраной КА активность была обнаружена как в препаратах ФС2-мембран, так и в препаратах ФС1-мембран.

Влияние тритона Х-100 на КА активность ФС1-и ФС2-мембран.

При действии тритона на ФС1-мембраны наибольшая КА активность наблюдалась при отношении тритон/хл, равном 0 3 (рис. 3, кривая 2), тогда как активность ФС2-мембран была максимальна при отношении тритон/хл, равном 1 0 (рис 3, кривая 3), то есть при тех же отношениях тритон/хл, при которых наблюдалось повышение КА активности целых тилакоидов (рис 3, кривая 1) КА активность экстракта растворимых белков тритон не повышал (рис 3, врезка). Таким образом, проявление двух максимумов КА активности тилакоидов, очевидно, являлось результатом увеличения КА активности носителей, которые расположены вблизи ФС1 и вблизи ФС2.

КА активность пигмент-белковых комплексов Фотосистем в ПААГ.

После электрофореза в 7% ПААГ ДМ-экстракгов ФС2-мембран наблюдали несколько пигмент-белковых комплексов (рис. 4А, гель II). Известно, что в верхней части геля располагаются димеры и мономеры кор-комплекса ФС2, ассоциированные с триме-рами и мономерами светособирающих комплексов; в нижней части геля - более низкомолекулярные ассоциации светособирающих комплексов (уап Иооп, 2000) Мы наблюдали КА активность в области расположения белков с кажущейся молекулярной массой около 50 кД (рис. 4А, гель II, полоса в нижней части геля), а также в полосах, содержащих высокомолекулярные пигмент-белковые комплексы, обогащенные кор-комплексами ФС2 (рис. 4А, гель II, полосы в верхней части геля).

После электрофореза в 7% ПААГ ФС1-мембран, предварительно обработанных ДМ, наблюдалось пять пигмент-белковых комплексов (рис. 4А, гель I) КА активность была видна в зоне расположения белков с кажущейся молекулярной массой около 50 кД.

т ™ лет И!

'НИ -454 -364 -272 ¿а их* Щ - 454 -364 -272 «ОС* оси

чт -182 -91 4111 -182 -91

Ш чш «X*

,273 Е-182 91

I II

ч\\- проявление к*Л активности

/////-распределение пиг мент-белкоеых комплексов

Рис. 4 Злектрофореграммы ФС1-мембран (I) и ФС2-мембран (II), обработанных ДМ. А. 7% ПААГ, Б. 15% ПААГ. Серым цветом показано распределение пигмент-белковых комплексов в геле, штриховкой обозначено проявление КА активности. Линии справа от электрофореграмм показывают положение белков-метчиков, а цифры - их молекулярная масса (кД).

Влияние ингибиторов на КА активность ФС1- и ФС2-мембран. Нами было исследовано действие на КА активность фрагментов мембран, обогащенных ФС1 или ФС2, двух наиболее часто используемых сульфамидных ингибиторов карбоангидраз' способного легко проникать в мембраны этоксизоламида (ЭА) и плохо проникающего в мембрану ацетазоламида (АА).

Рис. 5. Карбоангидразная активность ФС1-мембран (А) и ФС2-мембран (Б) в присутствии ацетазоламида (АА) и этоксизоламида (ЭА). В экспериментах с ацетазоламидом 100% - активность ФС1 -мембран, равная 540 мкмоль Н+/мг хлхмин, ФС2-мембран - равная 45 мкмоль Н+/мг

хлхмин, в экспериментах с этоксизо-ламидом КА активность ФС1 -мембран - 256 мкмоль Н+/мг хл*мин, ФС2-

мембран - 60 мкмоль Н+/мг

хлхмин

Концентрация ингибитора, М

Оба ингибитора действовали практически одинаково на КА активность ФС1-мембран (рис. 5А), Ьо для обоих составляла около 10"6 М Это свидетельствовало о том, что этот носитель КА активности ФС1 -мембран расположен на внешней стороне тилако-идной мембраны, и полость его активного центра открыта в среду. АА на КА активность ФС2-мембран действовал необычно - в низких концентрациях (10'*-10"5 М) он не снижал, а стимулировал КА активность и подавлял ев лишь в концентрациях выше 10*' М (рис 5Б).

В отличие от КА активности ФС2-мембран, АА не стимулировал активность ФС1-мембран ни при каких концентрациях (рис 5А). Обращает на себя внимание высокая чувствительность КА активности ФС2-мембран к липорастворимому ЭЛ. Этот ингибитор полностью подавлял их активность уже при концентрации ~ 10'* М (рис. 5Б), а Ьо составляла около 10"9 М.

Свидетельства присутствия в препаратах мембран, обогащенных ФС1 и обогашённых ФС2. разных носителей КА активности.

Как отмечено выше, при обработке ДМ как ФС1-мембран, так и ФС2-мембран, наблюдали присутствие КА активности в области расположения белков с кажущейся молекулярной массой около 50 кД. Можно было бы предположить, что некая низкомолекулярная КА равномерно распределена в мембране тилакоидов и поэтому ее можно было видеть в препаратах обеих фотосистем Применяемые нами условия электрофореза (7% ПААГ, присутствие детергента дерифата в верхнем электродном буфере) не обеспечивали достаточного разрешения белков с низкой молекулярной массой Чтобы установить идентичность или различие низкомолекулярных носителей КА активности ФС1- и ФС2-мембран, было исследовано влияние ингибиторов на КА активность элюатов соответствующих полос гелей (табл. 1).

Таблица 1. Действие ингибиторов на КА активность низкомолекулярных белков ФС1-мембран и ФС2-мембран. Полосы низкомолекулярных белков, обладавшие КА активностью, были вырезаны и их содержимое элюировано в вероналовый буфер. Концентрация ингибиторов составляла 1.5x10"7 М.

Вариант Карбоангидразная активность, мкмоль Н+/мг хл*мии

Без ингибитора + этоксизоламид + ацетазоламид

Элюат ФС1-мембран 8 833 ± 1 239 4 570 ± 1 453 5 125 ± 685

Элюат ФС2-мембран 5 296 ±1 631 0 14 444 ± 605

Различия в действии ингибиторов, обнаруживаемые при исследовании крупных мембранных структур, сохранялись при солюбилизации додецилмальтозидом, последующем электрофоретическом разделении и элюции из геля носителей КА активности АА в концентрации 1 5*10'7 М стимулировал КА активность элюата низкомолекулярных белков ФС2-мембран, а ЭА в той же концентрации полностью подавлял ее, тогда как оба ингибитора одинаково подавляли КА активность низкомолекулярных белков, элюируе-мых из ФС1 -мембран (табл. 1).

Результаты электрофоретического разделения в 15% геле подтвердили различия низкомолекулярных носителей КА активности ФС1- и ФС2-мембран На рис. 4Б видна разница их подвижности В этих условиях кажущаяся молекулярная масса носителя КА активности ФС2-мембран близка к 50 кД, а ФС1 -мембран - приблизительно 20 кД

Таким образом, влияние ингибиторов на низкомолекулярные белки ФС1- и ФС2-мембран, сходное с их действием на необработанные додецилмальтозидом ФС1- и ФС2-мембраны (рис 5, табл 1), а также различие кажущихся молекулярных масс этих носителей (рис 4Б) свидетельствуют о наличии в ФС1- и ФС2-мембранах двух разных низкомолекулярных носителей, проявляющих КА активность.

4 3 Свидетельства присутствия в тилакоидах растворимого носителя КА активности.

КА активность супернатантов, полученных после центрифугирования при 12000§ тилакоидов, инкубированных с тритоном, возрастала по мере увеличения концентрации тритона до отношения тритон/хл, равного 1.0 (рис 6). Такое возрастание свидетельствует о том, что носители КА активности, которые могли находиться в люмене тилакоидов или были слабо связаны с тилакоидной мембраной под действием повышающейся концентрации тритона постепенно переходили в раствор. При более высокой концентрации тритона КА активность супернатантов снижалась.

100-.

Рис. 6. Влияние концентрации тритона на КА активность супернатантов, полученных после центрифугирования при 12000$ тилакоидов, инкубированных с тритоном. 100% -КА активность тилакоидов в отсутствие тритона, равная 108.8 мкмоль Н+(мин"').

о.

05 10 1.5 20

Тритон Х-100/хлорофилл, мг/мг

После электрофореза в 7% ПААГ супернатанта тилакоидов, инкубированных без добавок тритона, присутствовала только одна полоса КА активности - в нижней части геля (рис. 7Б) На электрофореграмме супернатанта тилакоидов, инкубированных с тритоном при отношении тритон/хл, равном 1.0 (супернатант «12»), в верхней части геля был виден ещ8 один носитель КА активности (рис 7В) Он был назван нами «L». Подвижность его не зависела от добавок додецилмапьтозида, что указывает на то, что это растворимый белок. Без обработки супернатанта «12» додецилмапьтозидом «L» - единственная КА, присутствующая в геле (рис 7Г) Этот носитель, как мы предполагаем, выходил из люмена при действии на тилакоиды тритона Известно, что клетки высших растений содержат высокомолекулярные стромальную и хлоропластную ß-карбоангидразы (Reed, Graham, 1981) Электрофоретическое разделение экстракта белков листьев гороха показало, что кажущаяся молекулярная масса растворимых КА в наших условиях проведения нативного электрофореза составляла 234 и 312 кД (рис. 7А), а кажущаяся молекулярная масса «L» (рис. 7В) - приблизительно 262 кД Этот носитель оставался растворе после 1 ч осаждения при 144000g супернатанта «12» «L» присутствовал в геле после электрофоретического разделения супернатанта, полученного при таком осаждении (рис. 7Е) и отсутствовал на электрофореграмме осадка (рис. 7Д).

А Б В ГДЕ Рис. 7. Нативный электрофорез в 7%

ПААГ экстракта растворимых белков листьев гороха (А); супернатанта, полученного после инкубации тилакоидов без добавок (Б); супернатанта, полученного после инкубации тилакоидов при отношении тритон/хл, равном 1.0 (супернатанта «12») (В, Г); осадка, полученного после центрифугирования супернатанта «12» при 144000xg (Д); супернатанта, полученного после центрифугирования супернатанта «12» при 144000xg (Е). На рисунках 7Б, Г, Д, Е - электрофорез препаратов, обработанных 0.1% додецилмаль-тозидом, на рисунках 7А, Г -электрофореграммы препаратов, необработанных ДМ. Линии справа от электрофореграмм показывают положение белков-метчиков, а цифры - их молекулярная масса

(кД).

— 455

/// — 364

L ч\\ L VW L VW — 273

VW — 182

tu — 91

№ № Ш

\VC- проявление КА активности

/////— распределение пигмент-белковых комплексов

На рис. 7В также видна КА активность в нижней части геля, в которой, вероятно, содержались оба низкомолекулярные носители КА активности, расположенные в участках тилакоидов, обогащенных ФС1 или ФС2. Эти носители частично отделились от мембран тилакоидов при обработке их тритоном. В 7% геле они видны как одна полоса.

ОБСУЖДЕНИЕ

В работе получены свидетельства присутствия в тилакоидах гороха, по крайней мере, четырёх носителей КА активности. Каждый из этих носителей КА активности, очевидно, вносит вклад в сложный характер зависимости КА активности тилакоидов от концентрации тритона (рис. 2).

Один из носителей КА активности расположен, вероятно, в кор-комплексе ФС2, глубоко в липид-белковой структуре и не выходит в раствор при действии детергентов и солей Его присутствие обнаруживается после электрофореза ФС2-мембран в 7% ПААГ как КА активность в полосах высокомолекулярных пигмент-белковых комплексов, обогащенных кор-комплексами ФС2 (рис. 4А, гель П). Ранее было показано, что компоненты) ФС2-мембран пшеницы при электрофоретическом разделении связывались с ингибитором КА, мафенидом, пришитым к нейтральной матрице (агарозе), причем ассоциация бычьей КА со слоем агарозы/мафенида уменьшала связывание компонента(ов) кор-комплекса с мафенидом (КЬшИп е1 а1., 2004) Не исключено, что реакционный центр этого носителя КА активности образуется при взаимодействии нескольких субъединиц белков, входящих в состав кор-комплекса ФС2. Тот факт, что ингибиторы КА подавляют активность ФС2 -мембран (рис. 5Б) свидетельствует о том, что в реакционном центре этого носителя КА активности должен присутствовать металл, хотя структура его реакционного центра может быть нетипичной для известных КА, и металл в активном центре тилакоидных карбоангидраз не обязательно должен быть Ъп. Известно, что бикарбонат необходим на акцепторной стороне ФС2 для переноса электрона между Од и Он, и было установлено, что участок присоединения его находится на негемовом железе белка ПИ (уап Яепзеп, 1988). Функцию обеспечения бикарбонатом этого участка может осуществлять КА, расположенная в кор-комплексе ФС2 («КА1» на рис. 8).

Другой носитель КА активности обнаруживается на электрофореграмме ФС2-мембран в области белков с кажущейся молекулярной массой около 50 кД (рис 4Б, гель II). Вероятно, он принадлежит а-семейству КА, т.к. ЭА в низкой концентрации (Ю-8 М) полностью ингибирует КА активность ФС2-мембран (рис. 5Б), что характерно для а-КА (КагЬвоп й а1., 1995). Ьо ЭА при действии на СаЬЗ, а-КА СЫату^топах гетИагЛп, ассоциированную с ФС2, также составляет 10"9 М (Мкга е1 а1., 2005) Кроме того, белки

ФС2-мембран из тилакоидов мезофилла кукурузы и гороха реагировали с антителами против а-КА СЫатус/отопая гетИагЛп (Ьи е1 а1,2002; Пронина и др, 2002).

АА в концентрации 1 510"7 М повышал КА активность элюата низкомолекулярных белков ФС2-мембран (тал 1) Ранее такое действие этого ингибитора было обнаружено как в экспериментах с целыми тилакоидами (Москвин, 1995), так и с выделенными несколько иначе, чем в нашей работе ФС2-мембранами при измерении КА активности в дегидратазном направлении (Мовкут е1 а1., 2004). В последнее время было обнаружено, что бикарбонат стабилизирует Мп кластер на донорной стороне ФС2, и этот эффект особенно явно выражен в экспериментах по восстановлению активности Мп-истощвнных препаратов ФС2 гороха (АИакИуегсКеу, 1997; КНтоу & Вагапоу, 2001). Возможно, что низкомолекулярная КА, расположенная вблизи ФС2 на люменальной стороне тилакоид-ной мембраны («КА2» на рис. 8) ответственна за обеспечение бикарбонатом водоокис-ляющего комплекса, либо требуется для катализа дегидратации бикарбоната на донорной стороне ФС2, удаляя протоны, освобождающиеся в результате окисления воды при освещении, и предотвращая таким образом повреждение водоокисляющего комплекса при повышении интенсивности света (УШалдо е1 а)., 2002).

Таким образом, в препаратах ФС2-мембран нам удалось обнаружить присутствие двух носителей КА активности, один из которых расположен в кор-комплексе ФС2, другой, как мы предполагаем, на люменальной стороне тилакоидной мембраны, вблизи ФС2. Ранее было опубликовано указание о присутствии двух носителей КА активности в препаратах ФС2-мембран (Ьи & 81еш1ег, 2002). Недавно теми же авторами была обнаружена КА активность 33-кД белка ОЕСЗЗ гороха, ассоциированного с кислород-выделяющим комплексом ФС2, расположенным на люменальной стороне ФС2 Причем активность его подавлялась антителами против ОЕСЗЗ. Для проявления максимальной КА активности ОЕСЗЗ необходим марганец в качестве кофактора (Ьи е1 а1., 2005). Вероятно ОЕСЗЗ и обнаруженная нами «КА2» - один и тот же фермент.

Третий обнаруженный нами носитель КА активности тилакоидов расположен, как мы предполагаем, вблизи ФС1 После электрофореза ФС1-мембран в 7% ПААГ он виден в области низкомолекулярных белков, где проявляется КА активность (рис. 4А, гель I). Кажущаяся молекулярная масса этого носителя при разделении ФС2-мембран в 15% ПААГ равна приблизительно 20 кД (рис. 4А, гель I). КА активность ФС1-мембран в наших экспериментах была в несколько раз выше, чем КА активность ФС2-мембран, за исключением ФС1-мембран, выделенных из зимних растений, в них активность была сравнима с КА активностью ФС2-мембран. Свойства этого носителя свидетельствуют о том, что его активный центр расположен на стромапьной стороне тилакоидной мембраны: а) одинаковый эффект липофильного и плохо проникающего в мембрану ингибиторов (рис

5А), б) стимуляция КА активности ФС1-мембран тритоном, взятым в очень низкой концентрации - при отношении тритон/хл, равном 0.3 (рис. 2, кривая 2); в) освобождение этого носителя из ФС1-мембран при обработке их додецилмальтозидом, поскольку на электрофореграмме ФС1-мембран КА активность видна в белковой полосе, обладающей самой высокой подвижностью, а основные пигмент-белковые комплексы ФС1 находятся в более верхних частях геля (рис. 4А, гель I).

Ранее присутствие КА активности в препаратах ФС1 -мембран было показано только в одной работе, причСм белки ФС1-мембран из тилакоидов гороха не реагировали с антителами против а-КА ФС2 Chlamydomonas reinhardtii (Пронина и др , 2002) Одинаковое подавление как плохо проникающим в мембрану АА, так и хорошо растворимым в липиде ЭА характерно для a-KAIV животных, активный центр которой расположен на внешней поверхности мембраны, и полость активного центра открыта в среду, причем эта мембраносвязанная а-КА слабее подавляется сульфамидами, чем другие а-КА, а Ьо составляет ~ 10"6-10"5 (Maffia et al., 1996), приблизительно столько же, сколько и для КА активности ФС1-мембран (рис 5А) Таким образом не исключено, что носитель КА активности расположенный вблизи ФС1, может принадлежать к а-семейству КА. Карбоан-гидразы - чрезвычайно разнообразный класс ферментов, и последовательность аминокислот в структуре карбоангидразы, расположенной вблизи ФС1 может существенно отличаться от последовательности а-КА С. remhardtn и других а-КАз. Функция носителя КА активности ФС1-мембран может состоять в обеспечении углекислым газом центра карбоксилирования в мультиферментном комплексе, содержащем Рубиско (Jebanathirajah & Coleman, 1998), который находится в контакте со стромальным мембранами (Anderson et al., 1996; Süss et al., 1995), где расположена ФС1 («КАЗ» на рис. 8). Эта КА, как мы предполагаем, образует протонный канал и использует внутритилакоидные протоны для катализа дегидратации бикарбоната на внешней поверхности тилакоидной мембраны (рис 8).

Четвертый носитель КА активности расположен, по-видимому, в люмене тилакоидов Он наблюдается как полоса в верхней части геля на электрофореграммах супер-натанта «12» (полученного после инкубации тилакоидов при отношении тритон/хл, равном 1.0), (рис. 7В, «L») При обработке тритоном при отношении тритон/хл, равном 1.0, в мембране тилакоида образуются каналы, через которые этот носитель выходит из люмена. «L» обладает свойствами растворимого носителя КА активности: а) присутствует на электрофорезе супернатанта «12», как обработанного, так и необработанного ДМ (рис. 7В, 7Г); б) не осаждается после центрифугирования при 144000 g, в течение 1 ч - отсутствует на электрофореграмме осадка, полученного после такого центрифугирования (рис. 7Д) и хорошо виден на электрофореграмме супернатанта «144» (рис. 7Е); в) электрофо-

ретическая подвижность «Ь» не зависит от добавок ДМ (рис 7В, 7Г, 7Е) Кажущаяся молекулярная масса этого носителя КА активности в 7% ПААГ приблизительно равна 262 кД («Ь», рис. 7В) Электрофорез экстракта растворимых белков, проведённый в тех же условиях, показал, что молекулярные массы растворимых КА равны приблизительно 234 кД и 312 кД (рис 7А). Эти три значения можно считать довольно близкими в наших условиях проведения электрофореза, однако присутствие высокомолекулярной КА в три-тоновом экстракте тилакоидов не является загрязнением стромапьной формой фермента, поскольку полоса «I.» отсутствует в супернатанте тилакоидов, полученном после инкубации без добавок (рис 7Б) и даже после инкубации с тритоном, взятом при отношении тритон/хл, равном 0 3 При этом мы не исключаем возможность того, что этот высокомолекулярный носитель КА активности по структуре может отличаться от стромапьной КА только какими-то постгрансляционными модификациями. Среди генов АгаЬШорт ЛаНапа обнаружено 5, кодирующих Р-КА, и не исключено, что люменальная КА, обнаруживаемая нами, стромальная и цитоплазматическая карбоангидразы являются продуктами разных генов Можно отметить, что Комарова и др (1982) обнаружили на электро-фореграмме мембранной фракции хлоропластов бобов присутствие высокомолекулярной КА с ЯЕ равной 0 22, несколько отличающейся от подвижности КА стромальной фракции (ЯГ = 0.28). Причем, КА с равной 0 22, появлялась при обработке мембран тритоном Х-100.

Рис. 8. Схема предполагаемого расположения в тилакоиде обнаруженных нами носителей карбоангидразной активности (KAI, КА2, КАЗ, КА4). КА1 - вблизи D1 белка кор-комплекса ФС2, где находится область взаимодействия с бикарбонатом. КА2 -на внутренней стороне тилакоидной мембраны вблизи водоокисляющего комплекса ФС2; КАЗ - в стромальных тилакоидных мембранах вблизи ФС1, КА4 - в тилако-идном люмене.

ысо»

^ л со,

> i RA2 г

!__________!

Ol'l»'

люмен

Люменальная КА («КА4» на рис. 8), возможно, регулирует рН люмена и предохраняет белки люмена от закисления при быстрых изменениях световой интенсивности

Основные характеристики четырех обнаруженных нами носителей КА активности представлены в табл. 2. На рис. 1 показано, каким образом эти носители распределяются во фракциях, выделенных из тилакоидов.

Табл. 2. Характеристики носителей КА активности тилакоидов гороха.

Характеристики Носители

КА1 КА2 КАЗ КА4 («Ь»)

Предполагаемое расположение в тилакоиде Кор-комплекс ФС2 Вблизи ФС2, на люменальной стороне тилако-идной мембраны Вблизи ФС1, на стромальной стороне тила-коидной мембраны Тилакоидный люмен

Влияние тритона Повышение активности при отношении три-тон/хл, равном 1.0 Вероятно, отсутствие эффекта Повышение активности при отношении тритон/хл, равном 0.3 Вероятно, отсутствие эффекта

Особенности взаимодействия с ингибиторами Сильное подавление активности этоксизоламидом Стимуляция активности ацета-золамидом, (при концентрации 10"-10'5М), сильное подавление этоксизоламидом Одинаковый эффект хорошо растворимого в липиде этокси-золамида и плохо проникающего в мембрану аце-тазол амида (Ьо-Ю-*) Сильное подавление активности этоксизоламидом

Кажущаяся молекулярная масса, кД. ? 50 кД 20 кД 262 кД

ВЫВОДЫ

1. Исследование влияния тритона Х-100, сульфамидных ингибиторов и дитиотреи-тола на карбоаш идразную активность тилакоидов и растворимых карбоангидраз показало, что носители карбоангидразной активности тилакоидов отличаются по свойствам от растворимых карбоангидраз стромы и цитоплазмы растительной клетки.

2. Сложная зависимость карбоангидразной активности тилакоидов от концентрации тритона Х-100 (наличие двух пиков активности), стимуляция активности фрагментов ти-лакоидных мембран, обогащенных или ФС2 (ФС2-мембран) или ФС1 (ФС1-мембран), при разных отношениях тритон/хлорофилл, соответствующих двум пикам активности тилакоидов, а также присутствие карбоангидразной активности как во фракциях пиг-

мент-белковых комплексов ФС1 и ФС2, так и низкомолекулярных белков свидетельствуют о гетерогенности карбоангидразной активности тилакоидов.

3. Обнаружено, что ФС1-мембраны обладают карбоангидразной активностью, существенно превышающей, как в расчете на содержание хлорофилла, так и в расчете на содержание белка, активность ФС2-мембран. Стимуляция карбоангидразной активности ФС1-мембран тритоном Х-100 в низких концентрациях и характер влияния на нее сульфамидных ингибиторов карбоангидраз предполагают расположение реакционного центра носителя карбоангидразной активности в ФС1-мембранах ближе к стромальной стороне тилакоидной мембраны.

4. В додецилмальтозидных экстрактах ФС2-мембран и ФС1-мембран выявлены низкомолекулярные носители карбоангидразной активности с разными кажущимися молекулярными массами, 50 кД и 20 кД соответственно. Данное различие наряду с разной чувствительностью КА активности ФС2-мембран и ФС1-мембран к сульфамидным ингибиторам карбоангидраз, слабо проникающему в мембраны ацетазоламиду и хорошо проникающему в мембраны этоксизоламиду, свидетельствуют о разной природе этих носителей.

5. В тилакоидных мембранах, обогащенных ФС2, обнаружено по крайней мере два носителя карбоангидразной активности, один из которых связан с кор-комплексом этой фотосистемы.

6. Найдено, что карбоангидразная активность низкомолекулярного носителя, обнаруженного в ФС2-мембранах, увеличивается при низких концентрациях ацетазоламида (10'"-10'5 М). Вероятно, именно этот носитель ответственен за возрастание карбоангидразной активности тилакоидов и ФС2-мембран в присутствии ацетазоламида

7. Обнаружен растворимый носитель КА активности тилакоидов, который выходит из них после инкубации с тритоном Х-100 Свойства этого носителя отличаются от свойств растворимых карбоангидраз листьев гороха' концентрация этокоизоламида, вызывающая полное ингибирование КА активности экстракта тилакоидов, содержащего этот носитель, на три порядка меньше, чем концентрация этоксизоламида, необходимая для полного подавления активности растворимых карбоангидраз; дитиотреитол, известный протектор растительных Р-КАз, не оказывал влияния на активность этого носителя; электрофоретическая подвижность его отличалась от подвижности растворимых стромальной и цитоплазматической карбоангидраз при электрофоретическом разделении в ПААГ.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Руденко Н.Н., Игнатова Л.К., Христин М.С., Иванов Б.Н. Влияние тритона Х-100 на активность карбоангидраз различного происхождения. Тезисы докл. Биология - наука XXI века, 6-я Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 20-24 мая 2002 г.), т.З, с. 3.

2. Khristin M.S., Ignatova L.K., Rudenko N.N., Ivanov B.N., Klimov V.V. Localization of carbonic anhydrase activity in BBY-particles isolated from pea leaves. Abstracts XVII Push-chino Readings in Photosynthesis and International Conference Primary Processes of Photosynthesis m Bacteria and Plant Photosystem II, (Pushchino, 8-12 July, 2002),

p. 17.

3. Rudenko N.N., Ignatova L.K., Ivanov B.N. The carbonic anhydrase activity of thylakoid membranes from pea leaf thylakoids: Programme and Abstracts of International Conference Photosynthesis and Crop Production (Kiev, 7-11 October, 2002), p. 94.

4. Ignatova L.K., Khristin M.S., Rudenko N.N., Klimov V.V .The carbonic anhydrase activity of BBY-particles from pea leaf thylakoids: Programme and Abstracts of International Conference Photosynthesis and Crop Production, (Kiev, 7-11 October, 2002), p. 12

5. Игнатова Л.К., Руденко H.H., Романова A.K , Никонова С.И, Иванов Б Н. Растворимые и мембраносвязанные карбоангидразы листьев гороха и влияние на их активность содержания СОг в воздухе' V Съезд Общества Физиологов Растений России и Международная конференция "Физиология растений - основа фитобиотехнологии" (Пенза, 1521 сентября 2003 г.), стр. 45.

6. Руденко Н.Н., Игнатова Л.К., Христин M С., Иванов Б.Н. Гетерогенность карбоангид-разной активности тилакоидных мембран листьев гороха: V Съезд Общества Физиологов Растений России и Международная конференция "Физиология растений - основа фитобиотехнологии" (Пенза, 15-21 сентября 2003 г.), стр. 71.

7. Н.Н. Руденко, Л.К. Игнатова. Ингибиторный анализ карбоангидразной активности хлоропластов: Учебно-научный центр Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, XVI зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 912 февраля 2004 г.) стр. 75.

8 Игнатова Л К , Н Н. Руденко, Б Н Иванов Карбоангидразы тилакоидных мембран высших растений' III съезд биофизиков растений (Воронеж, 24-29 июня 2004 г), стр 421422.

9 Khristin М S., Ignatova L.K., Rudenko N N, Ivanov B.N., Klimov V.V. Photosystem II associated carbonic anhydrase activity in higher plants is situated in core-complex, FEBS Letters, 2004, 577,305-308.

10 Игнатова Л К, Руденко Н Н , Христин М С., Иванов Б Н. Гетерогенная природа Кар-боангидразной активности тилакоидных мембран. Биохимия, 2006, т 71, вып 5, 651659.

11 Руденко Н.Н., Игнатова Л.К , Каморницкая В.Б., Иванов Б.Н. Присутствие нескольких карбоангидраз в тилакоидах листьев гороха, ДАН, 2006, т 408, № 4

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0уч.-изд.-л. Заказ № 929. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

0.006 А

»1 0823

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Руденко, Наталья Николаевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УГЛЕКИСЛОТЫ.

2.2. СЕМЕЙСТВА КАРБОАНГИДРАЗ.

2.2.1. а-семейство карбоангидраз.

2.2.2. ^-семейство карбоангидраз.

2.2.3. у-семейство карбоангидраз.

2.2.4. 5- и е- семейства карбоангидраз.

2.3. ОСОБЕШОСТИ МЕХАНИЗМА КАТАЛИЗА ОБРАТИМОЙ РЕАКЦИИ ГИДРАТАЦИИ С02 КАРБОАНГИДРАЗАМИ РАЗНЫХ СЕМЕЙСТВ.

2.3.1. Механизм действия а-КА.

2.3.2. Р~КА. Предположительная модель катализа.

2.3.3. у-карбоангидраза. Особенности каталитической реакции.

2.4. МЕХАНИЗМ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КАРБОАНГИДРАЗ.

2.5. ЗАМЕЩЕНИЕ ЦИНКА НА ДРУГИЕ МЕТАЛЛЫ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ КАРБОАНГИДРАЗ.

2.6. РАСПРОСТРАНЕНИЕ И РОЛЬ КАРБОАНГИДРАЗ.

2.6.1. Прокариоты.

2.6.2. Эукариоты. Животные.

2.6.3. Водоросли.

2.6.4. Высшие СЗ растения.

2.6.5. С4 растения.

2.7. ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ В ТИЛАКОИДНОЙ МЕМБРАНЕ.

2.7.1. Организация фотосинтетического аппарата высших растений.

2.7.2. Роль протонов и неорганического углерода в регуляции энергопреобразования.

2.8. КАРБОАНГИДРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ

ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН.

2.8.1. Тилакоидная карбоангидраза водорослей.

2.8.2. Карбоангидразная активность тилакоидов высших растений.АО

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ТИЛАКОИДОВ.

3.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН, ОБОГАЩЕННЫХ ФОТОСИСТЕМОЙ 1 ИЛИ 2 (ФС1-МЕМБРАН И ФС2-МЕМБРАН).

3.3. ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТА РАСТВОРИМЫХ БЕЖОВ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА.

3.4. ИЗМЕРЕНИЕ КА АКТИВНОСТИ.

3.5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПРЕПАРАТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ

ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА.

3.5.1. Условия проведения электрофореза.

3.5.2. Определение КА активности в ПААГ.

3.5.3. Анализ гелей на присутствие белка.

3.5.4. Подбор условий разрешения пигмент-белковых комплексов в ПААГ.

3.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА В ПИГМЕНТ-БЕЛКОВЫХ ПОЛОСАХ В ГЕЛЕ.

3.7. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЗЕЛЁНЫХ ПОЛОС.

3.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА.

3.9. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ, ПЕРЕХОДЯЩИХ В РАСТВОР ПРИ ИНКУБАЦИИ ТИЛАКОИДОВ С ТРИТОНОМ ПРИ ОТНОШЕНИИ ТРИТОН/ХЛОРОФИЛЛ, РАВНОМ 1.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КА АКТИВНОСТИ В ТИЛАКОИДАХ.

4.2. ХАРАКТЕРИСТИКИ ФС1-МЕМБРАН И ФС2-МЕМБРАН.

4.3. КА АКТИВНОСТЬ ФС1-МЕМБРАН.

4.3.1. Характеристики КА активности ФС1-мембран.

4.3.2. Карбоангидразная активность ФС1-мембран в ПААГ.

4.3.3. Влияние ингибиторов на КА активность ФС1-мембран.

4.4. КАРБОАНГИДРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ФС2-МЕМБРАН.

4.4.1. Характеристики карбоангидразной активности

ФС2-мембран.

4.4.2. Карбоангидразная активность ФС2-мембран в ПААГ.

4.4.3. Влияние ингибиторов на карбоангидразную активность ФС2-мембран.

4.5. СВИДЕТЕЛЬСТВА ПРИСУТСТВИЯ В ПРЕПАРАТАХ МЕМБРАН, ОБОГАЩЁННЫХ ФС1 И ОБОГАЩЁННЫХ ФС2, РАЗНЫХ НОСИТЕЛЕЙ КА АКТИВНОСТИ.

4.6. СВИДЕТЕЛЬСТВА ПРИСУТСТВИЯ В ТИЛАКОИДАХ РАСТВОРИМОГО НОСИТЕЛЯ КАРБОАНГИДРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ.

4.6.1. Карбоангидразная активность тритоновых экстрактов тилакоидов.

4.6.2. Карбоангидразная активность белков супернатанта 12.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гетерогенность карбоангидразной активности тилакоидов гороха"

Карбоангидраза - фермент, присутствующий во всех живых организмах, ' осуществляет катализ реакции: со2 + н2о <-> НСОз" + IT".

Неорганический углерод (С„еорг.Х субстрат этой реакции, вовлечён во многие биологические процессы: Р-карбоксилирующий глюкогенез, образование мочевины и синтез жирных кислот, цикл трикарбоновых кислот, регулирование рН и ионного обмена.

Ни один метаболический путь не происходит без участия ионов водорода, другого субстрата карбоангидразной реакции. В процессе фотосинтеза они освобождаются при окислении воды, участвуют в образовании трансмембранного протонного градиента. В контексте данной работы особенно важна роль реакции дегидратации бикарбоната в хлоропластах как путь образования СОг - субстрата ключевой реакции цикла Кальвина, карбоксилирования рибулозо-1,5-бисфосфата, основного процесса т.н. «темновой» стадии фотосинтеза, в которой происходит синтез углеводородов.

Фотосинтез, помимо темновой стадии, включает также "световую стадию", процесс * поглощения и преобразования энергии света в тилакоидной мембране. Неорганический углерод вовлечён не только в реакции "темнового метаболизма", но и взаимодействует с участниками "световой стадии", обусловливая, так называемый, "бикарбонатный эффект" -влияние НСОз" (или СОг) на перенос электронов как на донорной, так и на акцепторной сторонах Фотосистемы 2 (Allakhverdiev, 1997; Klimov & Baranov, 2001; van Rensen, 1988). По-видимому, бикарбонатный эффект может рассматриваться как механизм непосредственного взаимодействия двух стадий фотосинтеза, помимо их взаиморегуляции через энергетические и восстановительные эквиваленты, АТФ/АДФ и НАДФН/НАДФ+.

Биологические системы, требующие для метаболизма больших потоков неорганического углерода, обладают цитоплазматическими, митохондриальными, периплазматическими, хлоропластными карбоангидразами. Активность и количество карбоангидраз коррелируют со скоростью потока неорганического углерода (Smith R.G., 1988). Считается, что в строме хлоропласта реакция превращения бикарбоната в СОг осуществляется каталитически, при участии растворимой карбоангидразы, однако эта реакция может осуществляться при участии карбоангидразы, связанной с тилакоидной мембраной при условии, что активный центр этого фермента направлен в сторону стромы.

Данные о присутствии карбоангидразы в тилакоидах высших растений были получены ещё в 1982 г. (Vaklinova et al.), однако существование карбоангидразы в тилакоидах высших растений долгое время не признавалось. С каждым годом открывается всё большее количество карбоангидраз при анализе геномов различных организмов и всё больше накапливается свидетельств присутствия карбоангидраз в тилакоидах высших растений (Пронина с гр., 2002; Ьи & 81еш1ег, 2002). Недавно были получены убедительные доказательства того, что Мп-стабилизирующий 33 кД белок ФС2 высших растений, ОЕСЗЗ, обладает карбоангидразной активностью (Ьи е1 а1., 2005) и, вероятнее всего, это - не единственная карбоангидраза, присутствующая в тилакоидах.

Целью работы было изучение носителей КА активности тилакоидов высших растений: определение их количества, свойств, характера связи с тилакоидной мембраной и возможного расположения в тилакоидах.

2. Обзор литературы

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Руденко, Наталья Николаевна, Пущино

1. Алиев Д.А., Гулиев Н.М. (1990). Карбоангидраза растений. М.: Наука, 174 с.

2. Джонс О.Т., Эрнест Ю.П., Мак-Номи М.Дж. Солюбилизация и реконструкция мембранных белков, стр. 197-211 в кн. Биологические мембраны. Под ред. J.B.C. Findley, W.H. Evans, M.: Мир, 1990.

3. Комарова Ю.М., Доман Н.Г., Шапошникова Г.Л. (1982) Две формы карбоангидразы в хлоропластах бобов. Биохимия. Т. 47, вып. 6,1027-1034.

4. Карапетян Н.В., Климов В.В. (1971). Установка для измерения кинетики индуцированных светом изменений выхода флуоресценции у фотосинтезирующих организмов. Физиол. раст. 18,223-228.

5. Куприянова Е.В., Дудоладова М.В., Лебедева Н.В., Маркелова А.Г., Герасименко Л.М., Алексеева С.Г., Пронина H.A., Заварзин Г.А. (2003). Активность карбоангидраз у алкалофильных цианобактерий содовых водоёмов. Физиология растений. 50, 598-606.

6. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. (1993) Биохимия человека. М.: Мир. т. 1, стр. 48.

7. Москвин О.В., Игнатова Л.К., Овчинникова В.И., Иванов Б.Н. (1995). Мембраносвязанная карбоангидраза тилакоидов гороха. Биохимия. 60, 1130-1137.

8. Москвин О.В. (1999). Мембраносвязанная карбоангидраза тилакоидов. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Пущино.

9. Орт Д.Р., Меландри Б.А. (1987). Механизм синтеза АТФ. В книге: Фотосинтез (в 2-х тт.) Пер. с англ./ Под ред. Говинджи. М. Мир, 5-64.

10. Остерман Л.А. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука.

11. Пронина Н.А., Рамазанов З.М., Семененко В.Е. (1981) Зависимость карбоангидразной активности клеток Chlorella от концентрации СОг. Физиология растений. Т. 28.494502.

12. Пронина Н.А., Семененко В.Е. (1984) Локализация мембраносвязанной и растворимой форм карбоангидразы в клетке хлореллы. Физиология растений. 31, вып. 2, с. 241-251.

13. Пронина Н.А., Аллахвердиев С.И., Куприянова Е.В., Клячко-Гурвич Г.Л., Климов В.В. (2002). Локализация карбоангидразы в субхлоропластных частицах гороха. Физиология растений. 49,431-439.

14. Семененко В.Е., Аврамова С., Георгиев Д., Пронина Н.А. (1977). Сравнительное изучение активности и локализации карбоангидразы в клетках Chlorella и Scenedesmus. Физиология растений. 31, вып. 2,241-251.

15. Alber В.Е., Ferry J.G. (1994). A carbonic anhydrase from the archaeon Methanosarcina thermophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 6909-6913.

16. Allakhverdiev SI; Yruela I.; Picorel R; Klimov W (1997). Bicarbonate is an essential constituent of the water-oxidizing complex of photosystem II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 94, No. 10, 5050-5054.

17. Anderson, L.E., Gibbons, J.T., and Wang, X. (1996). Distribution often enzymes of carbon metabolism in pea (Pisum Sativum) chloroplasts. Int. J. Plant Sci., 157, 525-538.

18. Arancibia-Avila, P., Coleman, J.R., Russin, W.A., Graham, J.M., and Graham, L.E. (2001). Carbonic anhydrase localization in charophycean green algae: ecological and evolutionary significance. Int. J. Plant Sci. 162,127-135.

19. Atkins C.A., Patterson B.D., Graham D. (1972). Plant carbonic anhydrases. II. Preparation and some properties of monocotiledon and dicotiledon enzyme types. Plant Physiol. 50,218223.

20. Badger M.R. and Price G.D. (1994). The role of carbonic anhydrase in photosynthesis. Ann.Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol. 45, 369-392.

21. Baird T.T., Waheed A., Okuyama T., Sly W.S., Fierke C.A. (1997). Catalysis and inhibition of human carbonic anhydrase IV. Biochemistry. 36, No 9,2669-2678.

22. Berliner, R. W. (1957). Some aspects of ion exchange in electrolyte transport by the renal tubules. In Metabolic Aspects of Transport Across Cell Membranes. The University of Wisconsin Press. Madison, WI. 203-220.

23. Bertini I., Canti G., Luchinat C., Mani F. (1981) H NMR spectra of the coordination sphere of cobalt-substituted carbonic anhydrase. J. Am. Chem. Soc. 103, 7784-7788.

24. Bjorkbaska H., Johansson I.M., Forsman C. (1999) Possible rowles for His 208 in the active-site region of chliroplast carbonic anhydrase from Pisum sativum. Arch. Biochem. Biophys. 361,17-24.

25. Borowitzka M. A., Larkum A W. D. (1976) Calcification in the green algae Halimeda. IV. The action of metabolic inhibitors on photosynthesis and calcification. J. exp. Bot. 11, 894907.

26. Bracey M.H., Christiansen J., Tovar P., Cramer S.P. & Bartlett S.G. (1994) Spinach carbonic anhydrase: Investigation of the zinc-binding ligands by site-directed mutagenesis, elemental analysis and EXAFS. Biochemistry. 33, 13126-13131.

27. Bradfield J.R.G. (1947). Plant carbonic anhydrase. Nature. Vol. 159,467-468.

28. Bundy H.F. (1986). Comparative kinetics and inhibition of a carbonic anhydrase from Chlamydomonas reinhardtii. Ibid. Vol. 84, 63-69.

29. Burnell J.N. & Hatch M.D. (1988). Low bundle sheath carbonic anhydrase is apparently essential for effective C4 pathway operation. Plant Physiology. 86,1252-1256.

30. Campbell I.D., Lindskog S., White A.I. (1975). A stidy of the histidine residues of human carbonic anhydrase B using 270 MHz proton magnetic resonance. J. Mol. Biol. 90,469-489.

31. Campbell I.D., Lindskog S., White A.I. (1977) Proton magnetic resonance studies of histidines in human, rhesus monkey and bovine carbonic anhydrases. Biochim. Biophys. Acta. 484,443-452.

32. Carter M.J. (1972). Carbonic anhydrase: isoenzymes, properties, distribution and functional significance // Biol. Rev. Cambridge Phil. Soc. Vol. 47,465-513.

33. Cederstrand C., Govindjee Xu C. (1966) Some Properties of Spinach Chloroplast Fractions Obtained by Digitonin Solubilization. Biochim.Biophys.Acta. 120, 177-180.

34. Chen R.F., Kernohan J.C. (1967). Combination of bovine carbonic anhydrase with a fluorescent sulfonamide. J. Biol. Chem. Vol. 242,5813-5823.

35. Coleman I.E. (1967) Mechanism of action of carbonic anhydrase. J. Biol. Chem. Vol. 242. 5212-5219.

36. Cowan I.R. (1986). Economics of carbon fixation in higher plants. In: On the economy of plant form and function, Ed. by Givnish T.J., Cambridge University Press, Cambridge, 133170.

37. Christianson D.W., Fierke C.A. (1996). Carbonic anhydrase: evolution of the zinc binding site by nature and by design. Ace. Chem. Res. 29,331-339.

38. Christianson D.W. & Cox J.D. (1999). Catalysis by metal-activated hydroxide in zinc andmanganese metalloenzymes. Annual Review of Biochemistry. 68, 33-57.

39. Davenport H.W. (1939). Gastric carbonic anhydrase. J. Physiol. Vol. 97,32-43.

40. Davies D.D. (1973). Control of and by pH. Symp. Soc. Exp. Biol. Vol. 27, 513-529.

41. Edwards L.J., Patton R.L. (1966). Visualization of carbonic anhydrase activity in polyacrilamide gel. Stain Technology. 41, n.6, 333-334.

42. Edwards G.E., Mohamed A.K. (1973). Reduction of carbonic anhydrase activity in zinc deficient leaves of Phaseolus vulgaris L. Crop Sci. 13, 351-354.

43. Eriksson A.E., Jones T.A., Liljas. A. (1988). Refined structure of human carbonic anhydrase II at 2.0 angstrom resolution. Protein Struct. Fund. Genet. 4, 274-282.

44. Faurholt C. (1924). Efudes sur les solutions aquenses d'anhydride carbonique et d'acide carbonique. Chim. Physiol. V. 21, № 4,400-453.

45. Fawcett T.W., Browse J.A., Volokita M. & Bartlett S.G. (1990). Spinach carbonic-anhydrase primary structure deduced from the sequence of a cDNA clone. Journal of Biological Chemistry. 265, 5414-5417.

46. Fridborg K. Kannan K.K., Liljas A. (1967). Crystal structure of human erythrocyte carbonic anhydrase C. III. Molecular structure of the enzyme and on one enzyme-inhibitor complex at 5.5 A resolution. J. Mol. Biol Vol. 25, 505-516.

47. Fujita I., Davis M.S., Fajer J J. (1978). Anion radicals of pheophytin and chlorophyll a: Their role in the primary charge separations of plants photosythesis. J. Amer. Chem. Soc. 100,62806282.

48. Findenegg G.R. (1974.) Relations between carbonic anhydrase activity and uptake of HCO3" and Cl~ in photosynthesis by Scenedesmus obliquus. Planta. Vol. 116,123-131.

49. Forster R.E., Steen J.B. (1968). Rate limiting processes in the Borh shift in human red cells. J. Physiol. (London). 196, 541-562.

50. Friedland B.R., Maren T.H. (1981). The relation between carbonic anhydrase activity and ion transport in elasmobranch and rabbit lens. Exp. Eye Res. 33, 545-561.

51. Frilyand L.E. (1995). Photosynthesis from light to Biosphere. Proceedings of theXth International Photosynthesis Congress, Vol. 5, 559-562.

52. Fujiwara S., Fukuzawa H. Tachiki A. & Miyachi S. (1990). Structure and differential expression of two genes encoding carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 87, 9779-9783.

53. Gill S.R., Fedorka-Gray P.J., Tweten R.K., Sleeper B.P. (1984). Purification and properties of carbonic anhydrase of Rhodospirillum rubrum. Arch. Microbiol. Vol. 138, 113-118.

54. Giordano M., Norici A., Forssen M., Eriksson M., Raven J. (2003). An anaplerotic role for mitochondrial carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 132,21262134.

55. Gotz R., Gnann A. & Zimmermann F.K. (1999). Deletion of the carbonic anhydrase-like gene NCE103 of the yeast Saccharomyces cerevisiae causes an oxygen-sensitive growth defect. Yeast. 15, 855-864.

56. Govindjee Xu C., van Rensen J.J.S. (1997). On the requirement of bound bicarbonate for photosystem II activity Zeitschriftfur Naturforschung C-A Journal of Biosciences. 52. No. 12, 24-32.

57. Graham D., Perry G.L., Atkins C.A. In search of a role for carbonic anhydrase in photosynthesis Mechanisms of regulation of plant growth / Ed. R. L. Bieleski, A.R. Ferguson, M.M. Cresswell. Wellington, 1974. 251-258. (Roy. Soc. N.Z. Bull.; Vol. 12).

58. Graham D., Reed M.L., Patterson B.D., Hockley D.G. (1984). Chemical properties, distribution, and physiology of plant and algal carbonic anhydrases. In: Ann. N.Y. Acad Sci. 429,222-237.

59. Guilloton M.B., Lamblin A.F., Kozliak E.I., Gerami-Nejad M., Tu C., Silverman D., Anderson P.M., Fuchs J. A. (1993). A physiological role for cyanate-induced carbonic anhydrase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175,1443-1451.

60. Gutknecht J., Bisson M.A. and Tosteson F.C. (1977). Diffusion of carbon dioxide through lipid bilayer membranes. Effects of carbonic anhydrase, bicarbonate, and unstirred layers. J. gen. Physiol. 69, 779-794.

61. Hatch M.D. & Burnell J.N. (1990). Carbonic anhydrase activity in leaves and its role in the first step of C4 photosynthesis. Plant Physiology. 93, 825-828.

62. Henkart P., Guidotti G.6 Edsall J.T. (1968). Catalysis of the hydrolysis of l-fluro-2,4-dinitrobenzene by carbonic anhydrase. J. Biol. Chem. 243,2447-2449.

63. Hiyama Т., Ke B. (1972). Difference spectra and extinction coefficient of P700. Biochim. Biophys. Acta. 267,160-171.74 http://www.lcsc.edu/nsl72/lectures/biology/Photosynthesis.pdf

64. Hulsebosch R.J., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V., Picorel R, Hoff A.J. (1998). Effect of bicarbonate on the S2 multiline EPR signal of the oxygen-evolving complex in photosystem II membrane fragments. FEBS Letters. 424 (3), 146-148.

65. Ignatova L.K., Moskvin O.V., Ivanov B.N. and Romanova A.K. (1993). The effect of C02 uptake by pea protoplasts on 02 evolution rate and parameters of chlorophyll fluorescence quenching. Plant Physiol. Biochem. 31,295-301.

66. Ignatova L.K., Moskvin O.V., Romanova A.K., Ivanov B.N. (1998). Carbonic anhydrases in the C3-plant leaf cell. Aust. J. Plant Physiol. 25, 673-677.

67. Isaev A., Scheiner S. (2001). Proton Conduction by a Chain of Water Molecules in Carbonic Anhydrase, J. Phys. Chem. В., 105,6420-6426.

68. Jakobson B.S., Fong F., Heath R.L. (1975). Carbonic anhydrase of spinach. Studies of its localizations, inhibition and physiological fuction. Plant Physiol. V. 55, №3, 9-13.

69. Jebanathirajah, J. A., and Coleman, J.R. (1998). Associaton of carbonic anhydrase with a calvin cycle enzyme complex in Nicotiana tabacum. Planta. 203, 177-182.

70. Jenkins C.L.D., Furbank R.T. & Hatch M.D. (1989). Mechanism of C4 photosynthesis. A model describing the inorganic carbon pool in bundle sheath cells. Plant Physiology. 91, 1372-1381.

71. Jiang W.P. & Gupta D. (1999). Structure of the carbonic anhydrase VI (CA6) gene: evidence for two distinct groups within the alpha-CA gene family. Biochemical Journal. 344,385-390.

72. Johansson I.M, Forsman C (1993). Kinetic studies of pea carbonic anhydrase. Eur J Biochem. 218(2), 439-46.

73. Kachru R.B., Anderson L.E. (1974). Chloroplast and cytoplasmic enzymes. Planta (Berl.).118,235-240.

74. Kaiser E.T., Lo K.W. (1969) The carbonic anhydrase catalyzed hydrolysis of 2-hydroxy-5-. nitro-o-toluenesulfonic acid sultone. J. Am. Chem. Soc. 91,4912-4918.

75. Kamo T., Shimogawara K., Fukuzawa H., Muto S., Miyachi. S. (1990). Subunit constitution of carbonic anhydrase from Chlamydomonas reinhardtii. Eur. J. Biochem. 192, 557-562.

76. Kandel M., Gornall A.G., Cybulsky D.L., Kandel S.I. (1978). Carbonic anhydrase from spinach leaves. J. Biol. Chem. Vol. 252, 679-685.

77. Kaplan. A., Reinhold. L. (1999). CC>2-concentrating mechanism in photosynthetic microorganisms. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50, 539-570.

78. Karlsson, J., Hiltonen, T., Husic, H.D., Ramazanov, Z., and Samuelsson, G. (1995) Plant Physiol., 109, 533-539.

79. Keilin D., Mann T. (1940). Carbonic anhydrase. Purification and nature of the enzyme. Biochem J. Vol. 34, 1163-1176.

80. Kimber M.S. & Pai E.F. (2000). The active site architecture of Pisum sativum ß-carbonic anhydrase is a mirror image of that of a-carbonic anhydrases. EMBO Journal. 19,1407-1418.

81. Kingsley R. J., Watabe N. (1985). The role of carbonic anhydrase in calcification in the Gorgonian Leptogorgia virgulata (Octocorallina, Gorgonac). Am. Zool. 25,144A.

82. Kisiel W., Graf G. (1972). Purification and characterization of carbonic anhydrase from Pisum sativum. Phytochemistry. Vol. 11,113-117.

83. Kisker C, Schindelin H., Alber B.E., Ferry J.G. & Rees D.C. (1996). A left-handed beta-helix revealed by the crystal structure of a carbonic anhydrase from the archaeon Methanosarcina thermophila. EMBO Journal. 15, 2323-2330.

84. Klimov V.V., Shuvalov V.A., Heber V. (1985). Photoreduction of pheophytin as a result of electron donation from water-splitting system to PSII reacton centre. Biochim et. Biophys. Acta. 809,345-350.

85. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Feyziev Ya.M., Baranov S.V. (1995). Bicarbonate requirement for the donor side of Photosystem II. FEBS Letters. 363,251-255.

86. Klimov V.V., Baranov S.V. (2001) Bicarbonate requirement for the water-oxidizing complex of photosystem II. Biochim. Biophys. Acta. 1503, 187-196.

87. Knoche W. (1980). Chemical reactions CO2 in water. In Biophysics and Physiology of Carbon Dioxide (Edited by Bauer C, Gros G. and Bartels H.), 3-11. Springer, New York.

88. Kobayashi Y., Inouc Y., Shibata K., Heber U. (1979). Control of electron flow in intact chloroplasts by the intrathylakoid pH, not by the phosphate potential. Planta. 146,481-486.

89. Krahn T.A., Weinstein (1996). Acic^ase transport in a model of the proximal tubule brush border: impact of carbonic anhydrase. TheAmer. Phys. Soc. 344-355.

90. Kramer D.M. Sacksteder C.A, Cruz J.A. (1999). How acidic is the lumen? Photosynth. Res. 60, 151-163.

91. Ku MS B., Kano-Murakami Y., Matsouka M. (1996). Evolution and expression of C sub(4) photosynthesis genes. Plant Physiology. Ill, 949-957.

92. Kuchitsu K., Tsuzuki M., Miachi S. (1991). Polypeptide composition end enzyme activities of the pyrenoid and its regulation by CCVconcentration in unicellular green algae. Can. J. Bot. 69, 1062-1069.

93. Lane T.W., Morel F.M.M. (2000). A biological function for cadmium in marine diatoms. Proceedings of the National Academy ofSciences USA. 97,4627-4631.

94. Liljas A., Kannan K.K., Bergsten P. (1972). Crystal structure of human carbonic anhydrase C. Nature. New Biol. Vol. 235,131-137.

95. Liljas A., H&kansson K., Jonsson, B.H., Xue Y. (1994). Inhibition and catalysis of carbonic anhydrase. Recent crystallographic analyses. Eur. J. Biochem. 219, 1-10.

96. Liljas A., Laurberg M. (2000). A wheel invented three times. The molecular structures of the three carbonic anhydrases. EMBO Reports. Vol. 1, no. 1,16-17.

97. Lindskog S., Malmstrome B.G. (1962). Metal binding and catalytic activity in bovine carbonic anhydrase. J. Biol. Chem. Vol. 237, 1129-1137.

98. Lindskog S. (1963). Effects of pH and inhibitors on some properties related to metal binding in bovine carbonic anhydrase. J. Biol. Chem. Vol. 238. 945-951.

99. Lindskog S., Nyman P.O. (1964). Metal-binding properties of human erythrocyte carbonic anhydrases. Biochim. Biophys. Acta. 85,462-474.

100. Lindskog S. (1966). Interaction of cobalt (2)-carbonic anhydrase with anions. Biochemistry. Vol. 5,2641-2646.

101. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Fan A.L., Randall R.L. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. Vol. 193,256-266.

102. Lu Y.K., Stemler A.J. (2002). Extrinsic Photosystem II Carbonic Anhydrase in Maize Mesophyll Chloroplasts. Plant Physiol. 266,16746-16754.

103. Lu Y.K., Theg S.M., Stemler A.J. (2005). Carbonic Anhydrase activity of the Photosystem II OEC33 protein from pea. Plant Cell Physiol. 46(12), 1-10.

104. Lucas W.J., Berry J.A. (1985). Inorganic carbon transport in aquatic photosynthetic organisms. Phvsiol. Plant. 65, 539-543.

105. Manahan S.E. (1984). Environmental Chemistry, 1-612. Willard Grant Press, Boston.

106. Maren T.H. (1984). The General Physiology of Reactions Catalyzed by Carbonic Anhydrase and Their Inhibition by Sulfonamides, 568-579. In: Biology and chemistry of the carbonic anhydrases. Ann. Of the York Acadamy of Sci. V. 429.

107. Maren. T.H. (1988). The kinetics of HCO3" synthesis related to fluid secretion, pH control, and CO2 elimination. Annu. Rev. Physiol. 50, 695-717.

108. Martin R.B. (1974). Pyrole hydrogen ionization of imidazole derivates in metal ion complexes and carbonic anhydrase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71,4346-4347.

109. Majeau N., Arnoldo M. & Coleman J.R. (1994). Modification of carbonic anhydrase activity by antisense and over-expression constructs in transgenic tobacco. Plant Molecular Biology. 25, 377-385.

110. McCauley S.W., Melis A. (1986). Quantitation of plastoquinone in spinach chloroplasts. Photosynthesis Research. 8, 3-16.

111. Meldrum N.N., Roughton F.J.W. (1933). Carbonic anhydrase: its preparation and propeties. Nature. 80,113-142.

112. Mitz M.A. (1979). C02Biodinamics: A new concept of cellular control. J. Theor. Biol. V. 80, №4,537-551.

113. Mitra M., Lato S.M., Ynalvez R.A., Xiao Y., Moroney J.V. (2004). Identification of a new chloroplast carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology, Vol. 135, 173-182.

114. Mitra M., Mason C.B., Xiao Y., Ynalvez R.A., Lato S.M., Moroney J.V. (2005). The carbonic anhydrase gene families of Chlamydomonas reinhardtii. Can. J. Bot. 83, 1-15.

115. Miyachi S., Tsuzuki K., Avramova S.T. (1983). Utilization modes of inorganic carbon for photosynthesis in various species of Chlorella. Plant Cell Physiol. 24,441 -451.

116. Miziorko H. M. and Lorimer G. H. (1983). Ribulose-l,5-biphosphate carboxylase-oxygenase. A. Rev. Biochem. 52, 507-535.

117. Moroney J. V., Husic H.D., Tolbert N.E. (1985). Effect of carbonic anhyderase inhubitors on inioganic carbon assimilation by Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 79,177-183.

118. Moroney J.V., Tolbert N.E., Sears B.B. (1986). Complementation analysis of the inorganic carbon concentrating mechanism Chlamydomonas reinhardtii Mol. Gen. Genet. 204,199-203.

119. Moroney J.V., Mason C.B. (1991). The role of chloroplast in inorganic carbon acquisition by Chlamydomonas reinhardtii. Can. J. Bot. 69,1017-1024.

120. Moroney J.V., Somanchi A. (1999). How do algae concentrate CO2 to increase the efficiency of photo synthetic carbon fixation? Plant Physiol. 119, 9-16.

121. Moroney J.V., Bartlett S.G., Samuelsson G. (2001). Carbonic anhydeases in plants and algae. Plant Cell Environ. 24, 141-153.

122. Moubarak-Milad M. and Stemler A. (1994). Oxidation-reduction potential dependence of photosystem II carbonic anhydrase in maize thylakoids. Biochemistry. 33,4432-4438.

123. Muscatine L. (1973). Nutrition of corals. Biology and geology of Coral Reefs. N.Y.; L.: Acad, press. Vol 2. 77-115.

124. Newman T., deBruijn F.J., Green P. (1994). Genes galore: a summary of methods for accessing results from large-scale partial sequencing of anonymous Arabidopsis cDNA clones. Plant Physiology. 106, 1241-1255.

125. Parisi G., Perales M., Fomasari M.S., Gonztalez-Schain A.C.N., Gomez-Casati D., Zimmermann S., Brennicke A., Araya A., Ferry J.G., Echave J., Zabaleta E. (2004). Gamma carbonic anhydrases in plant mitochondria. Plant Molecular Biology. 55, 193-207.

126. Parkkila A.-K., Scarim A.L., Parkkila S., Waheed A., Corbett, J.A., Sly W.S. (1998). Expression of carbonic anhydrase V in pancreatic beta cells suggests role for mitochondrial carbonic anhydrase in insulin secretion. J. Biol. Chem. 273,24620-24623.

127. Peter G.F., Thornber J.P. (1991). Biochemical Composition and organization of higher plant Photosystem II light-harvesting pigment-proteins. J. Biol. Chem. 266,16746-16754.

128. Pitts, R. F., R. S. Alexander. (1945). The nature of the renal tubular mechanism for acidifying the urine. Am. J. Physiol 144,239-254.

129. Pocker Y., Meany J.E. (1965). The catalytic versatility of carbonic anhydrase from erythrocytes: the enzyme-catalyzed hydration of acetaldehyde. J. Am. Chem. Soc. 87,18091811.

130. Pocker Y., Stone J.T. (1965). The catalytic versatility of eryth-rocyte carbonic anhydrase: the enzyme-catalyzed hydrolysis of p-ni-trophenyl acetate. J. Am. Chem. Soc. 87, 5497-5498.

131. Pocker Y., Ng J.S.Y. (1974). Plant carbonic anhydrase: Hydrase activity and its reversible Inhibition. Ibid. Vol. 13, 5116-5120.

132. Price G.D., Badger M.R., Bassett M.E., Canberra A.C. (1985). Involvement of plasrnolemmasomes and carbonic anhydrase in photosynthetic utilization of bicarbonate in Chora corrallina. Austral. J. Plant Physiol. Vol. 12,241-256.

133. Price, G.D. and Badger, M.R. (1989). Ethoxyzolamide inhibition of C02-dependent photosynthesis in the cyanobacterium Synechococcus PCC7942. Plant Physiol. 89,44-50.

134. Pronina N.A., Borodin V.V. (1993). CO2 stress and C02 concentration mechanism: investigation by means of photosystem-deficient and carbonic anhydrase-deficient mutants of Chlamydomonas reinhardtii. Photosynthetica. 28 (4), 515-522.

135. Protoschill-Krebs G. and Kesselmeier J. (1992). Enzymatic pathways for the consumption of carbonil sulfide (CO2) by higher plants. Botanica Acta. 105, 206-212.

136. Provart N.J., Majeau N., Coleman J.R. (1993). Characterization of pea chloroplastic carbonic anhydrase. Expression in Escherichia coli and site-directed mutagenesis. Plant. Mol. Biol. 22, 937-943.

137. Pullan L.M., Noltmann E.A. (1985). Specific arginine modification at the phosphatase site of muscle carbonic anhydrase. Biochemistry. 24, 635-640.

138. Raven J.A (1997). C02-concentrating mechanisms: A direct role for thylakoid lumen acidification? Plant Cell And Environment. 20, 147-154.

139. Raven J.A. (2001). A role for mitochondrial carbonic anhydrase in limiting CO2 leakage from low C02-grown cells of Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell Environ. 24,261-265.

140. Rawat M., Moroney J.V. (1991). Partial characterization of a new isoenzyme of carbonic-anhydrase isolated from Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry. 266, 9719-9723.

141. Reed M.L., Graham D. (1981). Carbonic anhydrase in plants: Distribution, properties and possible physiological roles. Progr. Phytochem. Vol. 7. 47-94.

142. Reising H., Shreiber U. (1994). Inhibition by ethoxyzolamide of a photoacoustic uptake signal in leaves: Evidence for carbonic anhydrase catalyzed CCVsolubilisation. Photosynthesis Research. 42(1), 65-73.

143. Van Rensen J.J., Tonk W.J.M., Bruijn S.M. (1988). Involvement of bicarbonate in the protonation of the secondary quinone electron acceptor of Photosystem II via the non-haem iron of the quinone-iron acceptor complex. FEBS Letters. 226,347-351.

144. Rowlett R.S., Chance M.R., Wirt M.D., Sidelinger D.E., Royal J.R., Woodroffe M., Wang Y.F.A., Saha R.P. & Lam M.G. (1994). Kinetic and structural characterization of spinach carbonic-anhydrase. Biochemistry. 33, 13967-13976.

145. Rumeau D„ Cuine S., Fina L., Gault N., Nicole M., Peltier G. (1996). Subcellular distribution of carbonic anhydrase in Solanum tuberosum L. leaves. Characterization of two compartment-specific isoforms. Planta. 199,79-88.

146. Schlieper P., de Robertis E. (1977). Triton X-100 as a channel-forming substance in artificial lipid bilayer membranes. Arch. Biochem. Biophys. 184, 204-208.

147. Silverman D.N. (1991). The catalytic mechanism of carbonic anhydrase. Can. J. Botany. 69, 1070-1078.

148. Sly W.S., Hu P.Y. (1995). Human carbonic anhydrases and carbonic anhydrase deficiencies. Annu. Rev. Biochem. 64, 375-401.

149. Smith R.G. (1988). Inorganic carbon transport in biological systems. Comp. Biochem. Physiol. Vol. 90B, No 4,639-654.

150. Smith K.S., Jakubzick C., Whittam T.S., Ferry J.G. (1999). Carbonic anhydrase is an ancient enzyme widespread in prokaryotes. PNAS. V. 96, no. 26

151. Smith K.S., Ferry J.G. (1999). A plant-type (beta-class) carbonic anhydrase in the thermophilic metanoarchaeon Methanobacterium thermoautotrophicum. Journal of Bacteriology. 181,6247-6253.

152. Smith K.S., Ferry J.G. (2000). Prokaryotic carbonic anhydrases. FEMS Microbiology Reviews. 24,335-366.

153. So A.K.C., Espie G.S., Williams E.B., Shively J.M., Heinhorst S., Cannon G.C. (2004). A novel evolutionary nige of carbonic anhydrase (e class) is a component of the carboxysome shell. J. Bacteriol. 186. 623-630.

154. So A.K.C., Espie G.S. (2005). Cyanobacterial carbonic anhydrases. Can. J.Bot. 83, 721-734.

155. Soltes-Rak, E., Mulligan, M.E. and Coleman, J.R. (1997). Identification and characterization of a gene encoding a vertebrate-type carbonic anhydrase in cyanobacteria. J. Bacteriol. 179, 769-774.

156. Spalding Martin H., Ogren William L. (1982). Photosynthesis is required for induction of the C02-concentrating system in Chlamydomonas reinhardtii. FEBSLett. Vol. 145,41-42.

157. Stams T., Nair S.K., Okuyama T., Waheed A., Sly W.S., Christianson D.W. (1996). Crystal structure of the secretory form of membrane-associated human carbonic anhydrase IV at 2.8-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93,13589-13594.

158. Stemler A. (1979). A dynamic interaction between the bicarbonate legand and photosystem II reaction center complexes in chloroplasts. 'Ibid. Vol. 545. 36-45

159. Stemler A., Jursinic P. (1983). The Effects of Carbonic Anhydrase Inhibitors Formate, Bicarbonate, Acetazolamide, and Imidazole on Phosystem II in Maize Chloroplasts. Arch. Biochem. Biophys. 221,227-237.

160. Stemler A. (1985). Carbonic Anhydrase: molecular insights applied to Photosystem II research in thylakoid membranes In Inorganic carbon uptake by aquatic photosynthetic organisms. The American Soc. of Plant Physiologists. 377-387.

161. Stemler A. (1986). Carbonic anhydrase associated with thylakoids and photosystem II particles from maize. Biochim. et biophys. acta. Vol. 850, 97-107.

162. Stemler A. J. (1997). The case for chloroplast thylakoid carbonic anhydrase. Physiologia Plantarum. 99, No. 2, 348-353.

163. Stemler A.J. (1998). Proceedings of the Xl-th International Congress on Photosynthesis. Budapest, Aug. 17-22,1998.

164. Swader J.A., Jacobson B.S. (1972). Acetazolamide inhibition of photosystem II in isolated spinach chloroplasts. Phytochemistry. 11,65-70.

165. Thorslund A., Lindskog S. (1967) Studies of the Esterase Activity and the Anion Inhibition of Bovine Zinc and Cobalt Carbonic Anhydrases. Eur. J. Biochem. 3,117-123.

166. Tripp B.C., Smith K., Ferry J.G. (2001). Carbonic Anhydrase: New Insights for an Ancient Enzyme, J. Biol. Chem. Vol. 276, Issue 52,48615-48618.

167. Tripp B.C., Bell C.B., Cruz F., Krebs C., Ferry J.G. (2004). A Role for Iron in an Ancient Carbonic Anhydrase. J. Biol. Chem. Vol. 279, No 8, 6683-6687.

168. Tsuzuki M., Miyachi S., Edwards G.E. (1985). Localization of carbonic anhydrase in mesophyll of terrestrial C3 plants in relation to CO2 assimilation. Plant and Cell Physiol. Vol. 26(5), 81-891.

169. Tu C.K., Thomas H.G., Wynns G.C., Silverman D.N. (1986). Hydrolysis of 4-nitrophenyl acetate catalyzed by carbonic anhydrase 111 from bovine skeletal muscle. J. Biol. Chem. 261, 10100-10103.

170. Utsunomiya E., Muto S. (1993). Carbonic anhydrase in the plasma membranes from Cs and C4 plants. Physiol. Plant. 88,413-419.

171. Vaklinova S.G., Goushina L.M., Lazova G.N. (1982). Carboanhydrase activity in chloroplasts and chloroplast fragments C.r. Acad. bulg. sci. Vol. 35. 172-1724.

172. Villarejo A, Orus M.I; Martinez F (1997). Regulation of the C02-concentrating mechanism in Chlorella vulgaris UAM 101 by glucose. Physiologia Plantarum. 99, No. 2,293-301.

173. Villarejo A., Shutova T., Moskvin O., Forssen M., Klimov V.V., Samuelsson G. (2002). A photosystem II-associated carbonic anhydrase regulates the efficiency of photosynthetic oxygen evolution. The EMBO Journal Vol. 21, No 8,1930-1938.

174. Virgin I., Styring S., Andersson B. (1988). Photosystem II desorganization and manganese release after photoinhibition of isolated spinach thylakoid membranes. FEBS. Lett. 233,408412.

175. Webb E. C. van Heyingen R. (1946). The action of British antilewisite (BAL) on enzyme systems. Biochem. J. Vol. 41, 74-82.

176. Wessing A.; Zierold K.; Bertram G. (1997). Carbonic anhydrase supports electrolyte transport in Drosophila Malpighian tubules. Evidence by X-ray microanalysis of cryosections. Journal of insect physiology. 43. No. 1,17-28.

177. Whitney P.L., Folsch G., Nyman P.O., Malmstrom B.G. (1967). Inhibition of human erythrocyte carbonic anhydrase B by chloroacetyl sulfonamides with labeling of the active site. J. Biol. Chem. 242,4206-4211.

178. Wincencjusz H., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V., Gorkom H.J. (1996). Bicarbonate -reversible formate inhibition at the donor side of Photosystem II. Biochem. Biophys. Acta. 1273, 1-3.

179. Wistrand P.J. Properties of membrane-bound carbonic anhydrase, 195-206. In: Biology and chemistry of the carbonic anhydrases. Ann. Of the YorkAcadamy ofSci. V.429,1984.

180. Yagawa Y., Shiraiwa Y., Miyachi S. (1984). Carbonic anhydrase from the blue-green algae (Cyanobacterium) Anabaena variabilis. Plant and Cell Physiol. Vol. 25, 775-783.

181. Yruela I, Allakhverdiev S.I., Ibarra J.V., Klimov V.V. (1998). Bicarbonate binding to the water-oxidazing complex in the photosystem II. A Fourier transform infrared spectroscopy study. FEES Letters. 425 (3), 396-400.

Информация о работе

Руденко, Наталья Николаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Гетерогенность карбоангидразной активности тилакоидов гороха - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы