Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембраносвязанная карбоангидраза тилакоидов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Москвин, Олег Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. РОЛЬ НЕОРГАНИЧЕСКОГО УГЛЕРОДА В ПРЕОБРАЗОВАНИИ ЭНЕРГИИ В ТИЛАКОИДНОЙ МЕМБРАНЕ.

2.1.1. Общая схема преобразования энергии в тилакоидной мембране. Ключевая роль протонов в регуляции энергопреобразования.

2.1.2. "Бикарбонатный эффект".

2.1.2.1. Общие представления.

2.1.2.2. Проблема локализации действия неорганического углерода на электронный транспорт.

2.1.2.3. Вопрос об активной форме неорганического углерода, участвующей в развитии бикарбонатного эффекта. Статическая и динамическая концепции.

2.1.3. Карбоангидразнаяреакция и фотосинтетический электронный транспорт.

2.2. Карбоангидразы в фотосинтезирующей клетке.

2.2.1. Общие представления о карбоангидразах (КА). Роль КА в различных организмах.

2.2.2. Особенности механизма катализа. Ингибирование карбоангидраз.

2.2.3. Карбоангидразы растительной клетки и транспорт неорганического углерода.

2.2.4. Карбоангидраза тилакоидов.

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Получение препаратов.

3.1.1. Выделение тилакоидов.

3.1.2. Выделение частиц ФС2.

3.2. Измерение параметров энергопреобразования в тилакоиде.

3.3. Тестирование объекта исследования.

3.4. Измерение активности карбоангидразы.

3.4.1. Описание метода.

3.4.2. Тестирование экспериментальной установки.

3.5. Электрофорез белковых экстрактов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ. »

4.1. Условия проявления КА-активности тилакоидов.

4.1.1. Проблема загрязнения тилакоидов растворимой КА.

4.1.2. Критические условия выращивания растений.

4.1.3. Критические условия выделения препарата.

4.2. Сравнительное исследование карбоангидразных активностей тилакоидов и растворимой фракции клеток мезофилла гороха.

4.2.1. Титрование активностей растворимой КА и тКА ингибиторами карбоангидраз.

4.2.2. Сравнение рН-зависимостей активности рКА и тКА.

4.2.3. Сравнение Км (НСОЗ-) для рКА и тКА, зависимость от рН.

4.3. электрофоретическое выявление специфического белка, ответственного за феномен К А-активности тилакоидов.

4.4. МОДЕЛИРОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ТКА ТРАНСМЕМБРАННЫМИ ПРОТОННЫМИ ПОТОКАМИ В ТЕМНОВЫХ УСЛОВИЯХ.

4.5. Функционирование процессов энергопреобразования в шлакоиде и КА

АКТИВНОСТЬ ШЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН.:.

4.5.1. Опосредованные данные (измерение флуоресценции хлорофилла и 9-аминоакридина).

4.5.2. Влияние интенсивного освещения тилакоидов на их КА-активностъ.

4.5.3. Влияние освещения низкой интенсивности на активность тКА.

4.5.4. КА-активностъ субхлоропластных препаратов Фотосистемы 2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мембраносвязанная карбоангидраза тилакоидов"

Органическое вещество биосферы Земли синтезируется в конечном счете благодаря процессу фотосинтеза. Фотосинтетический процесс, протекающий в хлоропласте растительной клетки, состоит из процессов поглощения и преобразования энергии света в тилакоид-ной мембране (т.н. "световой стадии фотосинтеза") и собственно синтеза углеводородов в результате карбоксилирования СОг и протекания реакций цикла Кребса (т.н. "темновой стадии фотосинтеза"). Общепринятый взгляд на взаимодействие "световой" и "темновой" стадий подразумевает взаимную регуляцию этих процессов посредством систем АТФ/АДФ и НАДФН/НАДФ+, служащих для переноса энергии и восстановительных эквивалентов от энергопреобразующей системы тилакоида к комплексам ферментов цикла восстановительного карбоксилирования. Однако, открытие Варбургом стимуляции фотосинтетического электронного транспорта бикарбонатом послужило началом поиска механизмов более непосредственной, не обусловленной названными молекулами-интермедиатами, взаиморегуляции "светового" преобразования энергии в тилакоиде и "темновош" метаболизма неорганического углерода.

Какой же процесс может претендовать на роль связующего звена, опосредующего подобную взаиморегуляцию? A priori этот процесс должен вовлекать с одной стороны, неорганический углерод в той или иной форме и, с другой стороны, химический компонент, как активно вовлеченный в реакции энергопреобразования в тилакоиде, так и вступающий в физиологически значимую реакцию с неорганическим углеродом. Последним условиям вполне удовлетворяет ион водорода, который, с одной стороны, образуется в реакции фотосинтетического разложения воды, участвует в регуляции эффективности переноса энергии возбуждения в пигмент-белковых комплексах, служит посредником в преобразовании энергии из световой формы в химическую через промежуточную стадию энергии трансмембранного протонного градиента, а с другой стороны - участвует в качестве субстрата в реакции дегидратации бикарбоната, активно происходящей при фотосинтезе в строме хлоропласта в условиях потребления молекулярного СО2 РБФ-карбоксилазой:

НСОз+Н+ = С02 + Н20 Известно, что эта реакция катализируется ферментом карбоангидразой, широко представленным в клетках как животного, так и растительного происхождения. Однако, несмотря на общепринятое наличие растворимой карбоангидразы в строме хлоропласта, существование мембраносвязанной формы фермента, локализованной в мембране тилакоида и приближенной таким образом к компартменту, концентрирующему протоны - люмену - долгое время не было показано, по причине как объективно малого количества этого фермента в тилакоиде и связанных с этим технических сложностей достоверного измерения ферментной активности, так и по причине легкой дезактивации этой формы КА в процессе выделения тилакоидов. В 1982 г. появилось первое сообщение об обнаружении карбоангидразной активности тилакоидов высших растений (УакНпоуа е1 а1., 1982) и вслед за этим - открытие стимулирующего влияния экзогенной карбоангидразы на электронный транспорт (УакНпоуа е1 а1, 1984). Обнаружение фермента углеродного метаболизма в системе электронного транспорта могло бы считаться революционным, но крайне нестабильный характер этой активности, вопрос о возможной причине ее проявления как результата простого загрязнения растворимой формой фермента и отсутствие весомых данных о сопряженности ее функционирования с энергопреобразованием в тилакоиде не способствовали признанию феномена тилакоидной карбоангидразы - тКА - как установленного факта, и вопрос о возможной роли этого фермента в фотосинтезе так и остался открытым.

Цель работы. Целью работы было выяснение реальности существования тКА и выявление возможного сопряжения ее функционирования с процессами переноса электронов и протонов в тилакоиде. В качестве рабочей гипотезы была выдвинута возможность потребления протонов, аккумулированных тилакоидом на свету в результате протекания фотосинтетического электронного транспорта, в реакции дегидратации бикарбоната, с образованием СОг, используемого РБФ-карбоксилазой в качестве непосредственного субстрата карбокси-лирования. На вероятность данного процесса указывают как низкое равновесное содержание СОг в щелочной строме освещенного хлоропласта, так и относительный "избыток" протонов, аккумулируемых на свету в тилакоиде, по отношению к потребностям реакции синтеза АТФ

1уапоу В.К, 1993). В этом смысле катализируемая тКА дегидратация бикарбоната могла бы рассматриваться в качестве второго процесса, после синтеза АТФ, потребляющего аккумулированные на свету внутритилакоидные протоны.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Подбор условий выделения тилакоидов гороха, сохраняющих КА-активность тилакоидов и свободных от загрязнения растворимым ферментом.

2. Создание установки для измерения активности КА по скорости дегидратации бикарбоната в условиях, приемлемых для протекания электронного транспорта.

3. Сравнение характеристик КА-активности тилакоидов и растворимой КА.

4. Выявление возможного сопряжения реакции дегидратации бикарбоната, катализируемой тКА, со светозависимыми процессами преобразования энергии в тилакоиде.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Москвин, Олег Владимирович

6. Выводы

1. Качественные отличия в зависимостях карбоангидразной активности растворимой и ти-лакоидной фракций от рН, концентрации ингибиторов КА и от концентрации СОг при выращивании, а также в зависимости Км(НСОз") от рН, вместе с наличием отдельной полосы КА-активности тилакоидов, выявляемой при нативном электрофорезе, свидетельствуют о существовании специфического фермента - тилакоидной КА (тКА).

2. Обнаружена стимуляция КА-активности тилакоидов светом, как при насыщающем освещении, так и при слабом освещении в присутствии диурона. Оба эффекта устранялись разобщителями, что указывает на ключевую роль внутритилакоидных протонов в механизме эффекта стимуляции КА-активности тилакоидов светом.

3. Показано, что светозависимая активация дегидратации бикарбоната в суспензии тилакоидов не является следствием неферментативной реакции в люмене тилакоида, имеющем низкий рН, а опосредована работой карбоангидразы (тКА), о чем говорит полное устранение светозависимой КА-активности этоксизоламидом. При этом, отсутствие влияния гидрофильного ингибитора КА указывает на существование липидного барьера между активным центром тКА и стромальной поверхностью тилакоида.

4. Сравнение влияния ингибитора КА на скорость электронного транспорта в разобщенных и базальных условиях, а также в случае фрагментов ФС2 показывает, что участие К А в поддержании электронного транспорта в тилакоидах обусловлено потреблением ею внутритилакоидных протонов, приводящим к частичному снятию фото синтетического контроля. Следовательно, функционирование КА тилакоидов т шуо поддерживает фотосинтез посредством как активации поставки СОг к РБФК/О, так и ускорения электронного транспорта.

5. Реакция потребления внутритилакоидных протонов тилакоидной КА в ходе катализа дегидратации бикарбоната при насыщающем освещении представляет из себя ранее неизвестный механизм конструктивного потребления энергии трансмембранного протонного градиента

5. Заключение и

В настоящей работе впервые экспериментально показано, что а) в результате концентрирования протонов внутри тилакоидов, происходящего при светоиндуцированном переносе электронов по фотосинтетической ЭТЦ, ускоряется реакция дегидратации бикарбоната, и б) эта реакция катализируется специфической формой карбоангидразы (КА), тилакоидной КА. Первое доказано тем, что ускорение дегидратации подавляется ингибитором электронного транспорта диуроном и соединениями, предотвращающими концентрирование протонов внутри тилакоидов. Второе - тем, что а) указанное ускорение не происходит в присутствии ингибитора КА этоксизоламида, б) характеристики темновой КА активности тилакоидов (величины Km, рН-зависимость, чувствительность к ингибиторам) резко отличаются от характеристик растворимой КА.

Загадочный" эффект активации электронного транспорта при добавлении внешней КА, описанный ранее (Vaklinova et al., 1984) получает объяснение в свете нашего заключения об использовании внутритилакоидных протонов как механизме ускорения электронного транспорта, полученного при изучении влияния ингибиторов КА на электронный транспорт! Работающая внутри тилакоида тКА может вызывать существенное устранение фотосинтетЦ ческого контроля при условии удаления продукта реакции - СОг. В отсутствие РБФК/Од внешняя КА, непроникающая в тилакоид, гидратировала продукт активности тКА - СОг - в бикарбонат, устраняя торможение катализируемого тКА потребелния протонов внутри тилакоида и, соответственно, вызывая более выраженное устранение фотосинтетического контроля, видимое как ускорение электронного транспорта.

In vivo, в условиях интенсивного освещения хлоропласта, роль тКА, по-видимому, сводится к ускорению двух фотосинтетических процессов: карбоксилирования РБФК, за счет активации поставки С02 к РБФК/О, и электронного транспорта, за счет частичного снятия фотосинтетического контроля. Пространственная близость тКА к ФС2 позволяет предполагать роль тКА в ускорении электронного транспорта также за счет облегчения разложения воды вследствие удаления выделяющихся в этом процессе протонов. Доказательство реальности последнего процесса, однако, требует детального исследования.

Таким образом, тилакоидная КА использует протоны внутри тилакоидов на свету для ускорения трансформации бикарбоната в углекислый газ - субстрат ключевой темновой реакции фотосинтеза. Это является третьим (после реакции синтеза АТФ и транспорта некоторых белков - (Mould and Robinson, 1991)) процессом, конструктивно использующим энергию светозависимого трансмембранного градиента протонов на тилакоидной мембране и может рассматриваться как неизвестный ранее механизм сопряжения процессов преобразования энергии света в тилакоиде и метаболизма неорганического углерода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Москвин, Олег Владимирович, Пущино

1. Алиев Д.А., Гулиев Н.М. (1990) Карбоангидраза растений. М.: Наука, 174 с.

2. Диксон М., Уэбб Э. (1961) Ферменты. Изд-во иностранной литературы, М., с. 728.

3. Дубинский А.Ю., Тихронов А.Н. (1995) Математическое моделирование фотоиндуци-рованного поглощения протонов хлоропластами для различных механизмов утечки протонов через тилакоидную мембрану. Биофизика 40 (2), 365-371.

4. Дубинский А.Ю., Тихронов А.Н. (1997) Математическая модель тилакоида как распределенной гетерогенной системы электронного и протонного транспорта. Биофизика 42 (3), 644-661.

5. Иванов Б.Н., Овчинникова В.И. (1988) Сохранение в темноте путей электронного переноса, возникающих в фотосинтетической цепи при интенсивном освещении. Биохимия 53, 541-549.

6. Комарова Ю.М., Доман Н.Г., Шапошников Г.Л. (1982) Две формы карбоангидразы в хлоропластах бобов. Биохимия 47: 1027-1034.

7. Магомедов И.М., Тищенко H.H. (1978) Подготовка экстрактов для определения активности ферментов. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции 61, вып. 3, 105-106.

8. Молотковский Ю.Г., Яковлева Г. А. (1980) Проницаемость тилакоидных мембран для анионов. Физиология растений 27, с. 453-469

9. Орт, Д.Р., Меландри Б. А. (1987) Механизм синтеза АТФ В книге: Фотосинтез (в 2-х тт.) Пер. с англ./ Под ред. Говинджи. М.: Мир, 5-64

10. Остерман Л. А. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука.

11. Пронина H.A. и Семененко ВЕ.(1984) Локализация мембраносвязанной и растворимой форм карбоангидразы в клетке хлореллы; Физиология растений 31, вып. 2, с. 241-251.

12. Семененко В.Е., Аврамова С., Георгиев Д., Пронина H.A. (1977) Сравнительное изучение активности и локализации карбоангидразы в клетках Chlorella и Scenedesmus. Физиология растений 24, вып. 5, с. 1055.

13. Семененко В.Е., Аврамова С., Георгиев Д. и Пронина Н.А. (1979) О световой зависимости карбоанщцразной активности клеток Chlorella и Scenedesmus. Физиол. растений 26,1069-1071.

14. Фирус O.K., Кострикина Н.А., Бирюзова В.И. и Романова А.К. (1985) Локализация карбоангидразы в клетках цианобактерии Synechococcus cedrorum. Физиол. растений 32, 777-785.

15. Шмелева В.Л., Иванов Б.Н., Акулова Е.А. (1976) Фотофосфорилирование и электронный транспорт в хлоропластах гороха, выращенного при разной интенсивности света. ФизиологияpacfaemmiS, с. 80-876. и:

16. Aizawa К. and Miyachi S. (1986) Carbonic anhydrase and C02 concentrating mechanisms in microalgae and cyanobacteria. FEMSMicrobiol. Rev. 39,215-233.

17. Allakhverdiev, SI; Yraela, I; Picorel, R; Klimov, W (1997) Bicarbonate is an essential constituent of the water-oxidizing complex of photosystem П. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 94 No. 10, 5050-5054.

18. Andersson, B; Aro, EM (1997) Proteolytic activities and proteases of plant chloroplasts. Physiologia Plantarum 100 No. 4, p. 780-793.

19. Arnon D.I. and Tang G. M.-S. (1988) Cytochrome b559 and proton conductance in oxygenic photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9524-9528.

20. Atkins C. A., Patterson B.D., Graham D. (1972) Plant carbonic anhydrases. П. Preparation and some properties of monocotiledon and dicotiledon enzyme types. Plant Physiol. 50,218-223.

21. Badger M.R. and Price G.D. (1994) The role of carbonic anhydrase in photosynthesis. Ann. Rev. Plant Physiol PlantMol. Biol. 45,369-392.

22. Baird, TT; Waheed, A; Okuyama, T; Sly, WS; Fierke, CA (1997) Catalysis and inhibition of human carbonic anhydrase IV. Biochemistry 36 No. 9, 2669-2678.

23. Batra P.P. and Jagendorf A.T. (1965) Bicarbonate effects on the Hill reaction and Photophos-phorylation. Plant Physiol. 40,1074-1079.

24. Beer S,,nRehnberg J. (1997) The acquisition of inorganic carbon by the seagrass Zostera marina Aquatic Botany 56 No. 3-4,277-283.

25. Bertold D. A., Babcock G.T., Yocum C.F. (1981) A highly resolved, oxygen-evolving photosystem It preparation from spinach thylakoid membranes: EPR and electron transport properties. FEB S Lett. 134, 231-234.

26. Bjork M., Weil A., Semesi S., Beer S. (1997) Photosynthetic utilisation of inorganic carbon by seagrasses from Zanzibar, East Africa. Marine Biology 129 No. 2,363-366.

27. Bjorkbacka H., Johansson I.M., Skarfstad E., Foreman C. (1997) The sulfhydryl groups of Cys 269 and Cys 272 are critical for the oligomeric state of chloroplast carbonic anhydrase from Piston sativum. Biochemistry 36 No. 14,4287-4294

28. Bruce, D; Samson, G; Carpenter, C (1997) The origins of nonphotochemical quenching of chlorophyll fluorescence in photosynthesis. Direct quenching by P680(+) in photosystem II enriched membranes at low pH. Biochemistry 36 No. 4, 749-755.

29. Butler W.L. (1978) On the role of cytochrome b559 in oxygen evolution in photosynthesis. FEBSLett. 95, 19-25.

30. Chirica, LC; Elleby, B; Jonsson, BH; Lindskog, S (1997) The complete sequence, expression in Escherichia coli, purification and some properties of carbonic anhydrase from Neisseria gonorrhoeae. Eur. J. Biochem 244 No. 3,755-760.

31. Cowan I.R. (1986) Economics of carbon fixation in higher plants. In: On the economy of plant form andfunction, Ed. by Givnish T.J., Cambridge University Press, Cambridge, 133-170.

32. Davies D.D. (1973) Control of and by pH. Symp. Soc. Exp. Biol 27, 513-529.

33. Davis B.J. (1964) Disc electrophoresis EL Method and application to human serum proteins. Annals New York Academy ofScience 121, 404.

34. Demir, N; Demir, Y; Yildirim, A (1997) Carbonic anhydrases from leaves and roots of Dau-cus carota. Phytochemistry. 44 No. 7, 1247-1250

35. Demmig-Adams B. (1990) Carotenoids and photoprotection in plants: a role for the xantho-phyll zeaxanthin. Biochim. etBiophysActa 1020, 1-24.

36. Diaz E., Sandblom J.P. and Wistrand P J. (1982) Selectivity properties of channels induced by a reconstituted membtane-bound carbonic anhydrase. Acta Physiol Scand. 116,461- 463.

37. DUley Theg S.M., Beard W. A (1987) Membrane-proton interactions in chloroplasts bioenergetics: localized proton domains. Ann, Rev. Plant Physiol. 38, 347-389

38. Edwards G.E. and Mohamed A.K. (1973) Reduction of carbonic anhydrase activity in zinc deficient leavesofPhaseolus vulgaris L. Crop Sci. 13,351-354

39. Edwards L.J., Patton R.L. (1966) Visualization of carbonic anhydrase activity in polyacrila-mide gel. Stain Technology 41, n.6.

40. Eigen M. and Hammes G.G. (1964) Elementary steps in enzyme reaction. Adv. Enzymol. 25, 1-38.

41. Eskling M., Arvidsson P.O., Akerlund H.E. (1997) The xanthophyll cycle, its regulation and components. Physiologia Plantarum 100 No. 4, 806-816.

42. Fernley R.T. (1988) Non-cytoplasmic carbonic anhydrases. Trends in Biochemical Sciences 13, 356-359.

43. Finazzi G., Bianchi R, Vianelli A., Ehrenheim A M., Forti G. (1995) Inhibition of photosystem 2 primary photochemistry by photogenerated protons. Photosynthesis Research 46(3), 379-392.

44. Foyer C., Furbank R., Harbinson J., Horton jfy (1990) The mechanisms contributing to photo-synthetic control of electron transport by carbon assimilation in leaves. Photosynth. Res. 25, 83-100.

45. Fridlyand L; Kaplan A; Reinhold L (1996) Quantitative evaluation of the role of a putative C02-scavenging entity in the cyanobacterial C02-concentrating mechanism. Biosystems 37(3), 229-238

46. Good N.E. (1963) Carbon dioxide and the Hill reaction. Plant Physiol. 38, 298-304.

47. Govindjee, Xu C., vanRensen J.J.S. (1997) On the requirement of bound bicarbonate for photosystem II activity Zeitschriftfur Naturforschung C-A Journal of Biosciences 52 No. 1-2, 24-32

48. Graham D., Reed M.L., Patterson B.D., and Hockley D.G. (1984) Chemical properties, distribution, and physiology of plant and algal carbonic anhydrases. In: Ann. N.Y. Acad Sci. 429, 222-237.

49. Hager-A; Holocher-K (1994) Localization of the xanthophyll-cycle enzyme violaxanthin de-epoxidase within the thylakoid lumen and abolition of its mobility by a (light-dependent) pH decrease. Planta 192(4), 581-589 j

50. Haraux F., de Kouchkovsky Y. (1980) Measurement of chloroplast internal protons with 9-aminoacridine. probe binding, dark proton gradient and salt effects. Biochim. Biophys. Acta 592: 153-168.99

51. Horikawa S., Ogawara H. (1979) A simple and rapid procedure for removal of Triton X-100 from protein solution. Analytical Biochemistry 97, 116-119.

52. Horton P. and Black M.T. (1981) Light-dependent quenching of chlorophyll fluorescence in pea chloroplasts induced by ATP. Biochim. et Biophys Acta 635,53-62.

53. Hulsebosch R.J., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V., Picorel R., HofF AJ. (1998) Effect of bicarbonate on the S2 multiline EPR signal of the oxygen-evolving complex in photosystem II membrane fragments. FEBSLetters 424 (3), 146-148.

54. Hurt, JD; Tu, CK; Laipis, PJ; Silverman, DN (1997) Catalytic properties of murine carbonic anhydrase IV. Journal of Biological Chemistry 111 No. 21, 13512-13518

55. Husic H.D. (1991) Extracellular carbonic anhydrase of Chlamydomonas reinhardtii: localization, structural properties, and catalytic properties. Can. J. Bot. 69,1079-1087.

56. Ignatova L.K., Moskvin O.V., Ivanov B.N. and Romanova A.K. (1993) The effect of C02 uptake by pea protoplasts on O2 evolution rate and parameters of chlorophyll fluorescence quenching. Plant Physiol. Biochem. 31,295-301

57. Ignatova L.K., Moskvin O.V., Romanova A.K., Ivanov B.N. (1998) Carbonic anhydrases in the C3-plant leaf cell. Aust. J. Plant Physiol. 25,673-677.

58. Johansson IM, Forsman C (1993) Kinetic studies of pea carbonic anhydrase. Eur J Biochem. 218(2), 439-46

59. Johnson J. J., Pfister V.R. and Homann P.H. (1983) Metastable proton pools in thylakoids and their importance for the stability of photosystem n. Biochim. et Biophys. Acta 723,256-265.

60. Kachru R.B. and Anderson L.E. (1974). Chloroplast and Cytoplasmic Enzymes. V. Pea-leaf Carbonic Anhydrases. Planta 118, 235-240.

61. Karlsson J., Hiltonen T., Husic D., Ramazanov Z., Samuelsson G. (1995) Intracellular carbonic anhydrase of Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 109, 533-539.

62. Khalifah RJ. (1971) The carbon dioxide hydration activity of carbonic anhydrase. J. Biol. Chem. 246,2561-2573.

63. Kisel W., Graf G. (1972) Purification and characterization of carbonic anhydrase from Pisum sativum. Phytochemistry 11, 113-117.

64. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Feyziev Ya.M., Baranov S.V. (1995) Bicarbonate requirement for the donor side of Photosystem n. FEBS Letters 363, 251 -255.

65. Klimov V.V., Baranov S.V., Allakhverdiev S.I. (1997a) Bicarbonate protects the donor side of photosystem II against photoinhibition and thermoinactivation. FEBS Letters 418 (3), 243246

66. Klimov V.V., Hulsebosch R.J., Allakhverdiev S.I., Wincencjusz H., van Gorkom HJ., Hoff A. J. (1997b) Bicarbonate may be required for ligation of manganese in the oxygen-evolving complex of photosystem n. Biochemistry 36 (51), 16277-16281.

67. Kobayashi Y., Inouc Y., Shibata K., Heber U (1979) Control of electron flow in intact chloro-plasts by the intrathylakoid pH, not by the phosphate potential. Planta 146,481-486.

68. Kozlov Yu.N., Kazakova A.A., Klimov V.V. (1997) Changes of the redox potential and cata-lase activity of Mn2+ ions during formation of Mn-bicarbonate complexes. Membr. Cell Biol. 11, 115-120.

69. Krause G.H. and Behrend U. (1983) Characterization of chlorophyll fluorescence quenching in chloroplasts by fluorescence spectroscopy at 77K. I. ATP-dependent quenching. Biochim. et Biophys Acta 723: 176-181.

70. Krause G.H., Laasch H., Weis E. (1988) Regulation of thermal dissipation of absorbed light energy in chloroplasts indicated by energy-dependent fluorescence quenching. Plant physiol. Biochem. 26,445-452.

71. Laasch H., Schumann J., Guenter G. (1991) Inhibition of the transthylakoid gradient of electrochemical proton potential by the local anesthetic dibucaine. Plcmta 183(4), 567-574.

72. Lazova G.N., Popova L.P. (1993) Effect of abscisic acid and jasmonic acid on carbonic anhy-drase activity of etiolated pea seedlings trteated with cycloheximide and chloramphenicol. Comptes rendus de VAcademie bulgare des Sciences 46, pp. 101 -104.

73. Lazova G. (1993) Influence of electron transport inhibitors (DCMU and hydroxylamine) on the carbonic anhydrase activity in green pea plants. Comptes rendus de VAcademie bulgare des Sciences 46, N.3,99-102.

74. Lazova G. (1994) Electrophoretic characterization of the membrane-bound carboanhydrase form in pea chloroplasts. Comptes rendus de VAcademie bulgare des Sciences 47, N.2, 93-96.

75. Lindscog S. and Coleman J.E. (1973) The catalytic mechanism of carbonic anhydrase. Proc. Natl Acad Sci. USA 70, 2502-2508.

76. Lograsso P.V., Tu C., Jewell D.A., Wynns G.C., Laipis P.J. (1991). Catalytic enhancment of human carbonic anhydrase m by replacement of phenylalanine-198 with leucine. Biochemistry 30(34), 8463-8470

77. Lowry O.H., Rosebrough N. J., Farr A.L., Randall R. J. (1951) Protein measurement with the folin phenol reagent. Biological Chemistry 1, 265-275.

78. Lucas J.M., Knapp L.W. (1996) Biochemical characterization of purified carbonic anhydrase from the octocoral Leptogorgia virgulata. Marine Biology 126,471-477.

79. Maren T.H. (1984) The general physiology of reactions catalyzed by carbonic anhydrase and their inhibition by sulfonamides. In: Ann. N.Y. Acad. Sci. 429, 568-579.

80. Martinez, I; Orus, MI; Marco, E (1997) Carboxysome structure and function in a mutant of Synechococcus that requires high levels of C02 for growth. Plant Physiology and Biochemistry 35 No. 2, 137-146.

81. Mercado, JM; Niell, FX; Figueroa, FL (1997) Regulation of the mechanism for HC03" use by the inorganic carbon level in Porphyra leucosticta Thur in Le Jolis (Rhodophyta) Planta 201 No. 3,319-325.

82. Metzner H (1978) Oxygen evolution as an energetic problem. In: Metzner H (ed.J "Photo-synthetic Oxygen Evolution" Academic Press, London, 59-76

83. Mohanty N; Yamamoto HY (1996) Induction of two types of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching in carbon-assimilating intact spinach chloroplasts: The effects of ascorbate, de-epoxidation, and dibucaine. Plant Science 115(2), 267-275.

84. Moser, CC; Page, CC; Chen, X; Dutton, PL (1997) Biological electron tunneling through native protein media Journal of Biological Inorganic Chemistry 2 No. 3, 393-398.

85. Moubarak-Milad M. and Stemler A. (1994) Oxidation-reduction potential dependence of photosystem n carbonic anhydrase in maize thylakoids. Biochemistry 33, 4432-4438.

86. Mould R. M., Robinson C. (1991) A proton gradient is required for the transport of two lume-nal oxygen-evolving proteins across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry 266(19): 12189-12193.

87. Nimer, NA; IglesiasRodriguez, MD; Merrett, MJ (1997) Bicarbonate utilization by marine phytoplankton species. Journal ofPhycology 33 No. 4, 625-631.

88. Nishio J. N., Whitmarch J. (1993) Dissipation of the proton electrochemical potential in intact chloroplasts: H The pH gradient monitored by cytochrome f reduction kinetics. Plant Physiology 101(1), 89-96.

89. Palmqvist K, Badger M. (1996) Carbonic anhydrase(s) associated with lichens: in vivo activities, possible locations and putative roles. New Phytologist 132, 627-639.

90. Paranwithana S.R., Tu C., Laipis P J., Silverman D.N. (1990). Enhancement of the catalytic activity of carbonic anhydrase HI by phosphates. Journal of Biological Chemistry 265(36), 22270-22274.

91. Park Y.H, Karlsson J, Rojdestvenski I., Pronina N., Klimov V., Oquist G., Samuelsson G. (1999) Role of a novel photosystem n-associated carbonic anhydrase in photosynthetic carbon assimilation in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett. 444,102-105.

92. Pfundel E. E., Renganathan M., Gilmore A M., Yamamoto H. Y., Dilley R. A. (1994) In-trathylakoid pH in Isolated Pea Chloroplasts as Probed by Violaxanthin Deepoxidation. Plant Physiology 106(4), 1647-1658

93. Pocker Y., Ng J.S.Y. (1973) Plant carbonic anhydrase: properties and carbon dioxide hydration kinetics. Biochemistry 12, 5121-5134.

94. Price G.D., Badger M.R., Bassett M.E. and Whitecross M.I. (1985) Involvement of plasma-lemmasomes and carbonic anhydrase in photosynthetic utilization of bicarbonate in Chara corallina. Aust. J. Plant Physiol. 12, 241-256.

95. Protoschill-Krebs G. and Kesselmeier J. (1992) Enzymatic pathways for the consumption of carbonil sulfide (COS) by higher plants. Botanica Acta 105, 206-212.

96. ProninaN.A., Borodin V.V. (1993) CO2 stress and CO2 concentration mechanism: investigation by means of photosystem-deficient and carbonic anhydrase-deficient mutants of Chlamy-domonas reinhardtii. Photosynihetica 28 (4), 515-522.

97. Punnett T. and Iyer R.V. (1964) The enhancement of photophosphorylation and the Hill reac-tionby carbon dioxide. J. Biol. Chem. 239, 2335-2339.

98. Raven, JA (1997) C02-concentrating mechanisms: A direct role for thylakoid lumen acidification? Plant Cell And Environment 20,147-154.

99. Rawat M., Moroney J.V. (1995) The regulation of carbonic anhydrase and ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activase by light and CO2 in Chlamydomonas reihardtii. Plant Physiology 109, 937-944.

100. Reising H., Shreiber U. (1994) Inhibition by ethoxyzolamide of a photoacoustic uptake signal in leaves: Evidence for carbonic anhydrase catalyzed C02-solubilisation. Photosynthesis Research 42(1), 65-73.

101. Ren X., Tu C., Laipis P.J, Silverman D.N. (1995) Proton transfer by histidine 67 in site-directed mutants of human carbonic anhydrase HI. Biochemistry 34(26), 8492-8498.

102. Robinson H.H., Eaton-Rye J.J., van Rensen J.J.S., Govindjee (1984) The effects of bicarbonate depletion and formate incubation on the kinetics of oxidation-reduction reactions of the photosystem II quinone acceptor complex. Z Naturforsch 39c, 382-385.

103. Rossi C., Chersi A., Cortivo M. (1969) Carbonic anhydrase from spinach leaves: isolation and properties. In: CO2: Chemical, biochemical and physiological aspects. Wash. (DC.), NASA, SP-188, 131-138.

104. Sarojini G. and Govindjee (1981) On the active species in bicarbonate stimulation of Hill reaction in thylakoid membranes. Biochim. et Biophys Acta 634, 340-343.

105. Schansker G; Van Rensen J J S (1996) Mechanism of photoinhibition in pea thylakoids: Effects of irradiance level and pH. Biochimica etBiophysica Acta 1276(3), 239-245.

106. Schuldiner S., Rottenberg H. and Avron M. '(1972) Determination of ApH in chloroplasts. 2. Fluorescent amines as a probe for the determination of ApH in chloroplasts. Eur. J. Bio-chem. 25: 64-70.

107. Silverman D.N. (1991) The catalytic mechanism of carbonic anhydrase. Can. J. Botany 69, 1070-1078.

108. Snel J.F.H., van Rensen J.J.S. (1984) Réévaluation of the role of bicarbonate and formate in the regulation of photosynthetic electron flow in broken chloroplasts. Plant Physiol. 75,146150.

109. Stemler A and Govindjee (1973) Bicarbonate ion as a critical factor in photosynthetic oxygen evolution. Plant Physiol. 52,119-123.

110. Stemler A. (1980) Forms of dissolved carbon dioxide required for Photosystem n activity in chloroplast membranes. Plant Physiol. 65,1160-1165.

111. Stemler A. (1986) Carbonic anhydrase associated with thylakoids and Photosystem n particles from maize. Biochim. Biophys. Acta 850, 97-107.

112. Stemler A. J. (1997) The case for chloroplast thylakoid carbonic anhydrase. Physiologia Plantarum 99 No. 2, 348-353.

113. Stemler A. J. (1998) Chloride and calcium dependence of the CA activity of maize PSII particles. Proceedings of the Xl-th International Congress on Photosynthesis. Budapest, Aug. 1722, 1998.

114. Stemler A. and Jursinic P. (1983) The effects of carbonic anhydrase inhibitors formate, bicarbonate, acetazolamide, and imidazole on photosystem n in maize chloroplasts. Arch. Bio-chem. Biophys., 221,227-237.

115. Stemler A. and Jursinic P.A. (1994) Oxidation-reduction potential dependence of formate binding to Photosystem II in maize thylakoids. Biochim. et Biophys. Acta, 1183:269.

116. Stemler A. and Murphy J. (1983) Determination of the binding constant of HC03- to the photosystem II complex in maize chloroplasts: effects of inhibitors and light. Photochemistry and Photobiology 38,701-707.

117. Stemler A., Murphy J. and Jursinic P. (1984) Effects of flashing light and hydroxylamine on the binding affinity of H CO to photosystem II in chloroplast thylakoids. Photobiochemistry andPhotobiophysics 8, 289-304.

118. Suess K. H., Arkona C, Manteuffel R, Adler K. (1993) Calvin cycle multienzyme complexes are bound to chloroplast thylakoid membranes of higher plants in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 90(12), 5514-5518.

119. Sultemeyer, D (1997) Changes in the C02 concentrating mechanism during the cell cycle in Dunaliella tertiolecta. BotanicaActa 110 No. 1,55-61.

120. Sultemeyer D., Schmidt C., Fock H.P. (1993) carbonic anhydrases in higher plants and

121. Sundby C, Mattsson M, Schiott T (1992) Effects of bicarbonate and oxygen concentration on photoinhibition on thylakoid membranes. Photosynthesis Res. 263-270.

122. Swader J. A. and Jacobson B.S. (1972) Acetazolamide inhibition of Photosystem II in isolated spinach chloroplasts. Phytochemistry 11,65-70.

123. Tashian RE. (1989) The carbonic anhydrases: widening perspectives of their evolution, expression and function. BioEssqys 10,186-192.

124. Tamai S., Waheed A., Cody L.B., Sly W.S. (1996) Gly-63 -> Gin substitution adjacent to His-64 in rodent carbonic anhydrase IVs largely explains their reduced activity. Proc.Natl. Acad Sci. USA 93, 13647-13652.

125. Taoka S., Tu S., KistlerK.A., Silverman D.N. (1994) Comparison of intra- and intermolecular proton transfer in human carbonic anhydrase II. Journal of Biological Chemistry 269 (27): 17988-17992.

126. Thaler M., Simonis W., Schoenknecht G. (1992) Light-dependent changes of the cytoplasmic proton aiid chloride activity in the green aiga. Eremosphaera viridis. Plant Physiology 99(1),103.110 ' : ;f!!\

127. Tu C., Paranawithana S.R., Jewell D. A., Tanhauser S.M., Lograsso P.V., Wynns G.C., Laipis P. J., Silverman D.N. (1990) Buffer enhancement of proton transfer in catalysis by human carbonic anhydrase m. Biochemistry 29(27), 6400-6405.

128. Utsumoniya E. and Muto S. (1993) Carbonic anhydrase in the plasma membranes from leaves of C3 and C4 plants. Physologia Plantarum 88,413-419.

129. Vaklinova S.G., Goushtina L.M., Lazova G.N. (1982) Carboanhydrase activity in chloroplasts and chloroplast fragments. Comptes rendus de VAcademie bulgare des Sciences 35, N. 12, 1721-1724.

130. Vaklinova S.G., Goushtina L.M., Lazova G.N. (1984) The role of carbonic anhydrase in the electron transport during photosynthesis. Comptes rendus de VAcademie bulgare des Sciences 37, N.5, 677-680. ' 1 ! :

131. Van Rensen J.J.S. (1982) Molecular mechanisms of herbicide action near photosystem H. Physiol. Plant. 54, 515-521.

132. Van Rensen J.J., Tonk W.J.M. and Bruijn S.M. (1988) Involvement of bicarbonate in the protonation of the secondary quinone electron acceptor of Photosystem II via the non-haem iron of the quinone-iron acceptor complex. FEBS Letters 226, 347-351.

133. Vermaas W.F.J, and Van Rensen J.J.S. (1981) Mechanism of bicarbonate action on photo-synthetic electron transport in broken chloroplasts. Biochim. et Biophys. Acta 636,168-174.

134. Villarejo, A; Orus, MI; Martinez, F (1997b) Regulation of the C02-concentrating mechanism in Chlorella vulgaris UAM 101 by glucose. Physiologia Plantarum 99 No. 2, p. 293-301.

135. Waheed, A; Pham, T; Won, M; Okuyama, T; Sly, WS (1997) Human carbonic anhydrase IV: In vitro activation and purification of disulfide-bonded enzyme following expression m Escherichia coli. Protein Expression and Purification 9 No. 2, 279-287.

136. Warburg O., Krippahl G., 1958 Hill-Reaktionen Z Naturforsch. 13b, 509-514.

137. Wessing, A; Zierold, K; Bertram, G (1997) Carbonic anhydrase supports electrolyte transport in Drosophila Malpighian tubules. Evidence by X-ray microanalysis of cryosections. Journal of insect physiology 43 No. 1,17-28

138. Whitmarsh J, Cramer W.A. (1977) Kinetics of the photoreduction of cytochrome b559 by photosystem II in chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta 460, 280-289.

139. Whitmarsh J, Cramer W.A. (1978) A pathway for the reduction of cytochrome b559 by photosystem II in chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta 501, 83-93.

140. Whitmarsh and Govindjee (1998) The Photsynthetic Process: http://www.life.uiuc.edu/govindjee/paper/gov.html

141. Wincencjusz H., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V., Gorkom HJ. (1996) Bicarbonate-reversible formate inhibition at the donor side of Photosystem n. Biochem. Biophys. Acta 1273, 1-3.

142. Winterman J.F.G.M., De Mots A. (1985) Spectrophotometric characteristics of chlorophyll a and b and their pheophytins in ethanol. Biochim. et Biophys. Acta 109,448-453.

143. Wistrand P.J. (1984) Properties of membrane-bound carbonic anhydrase. In: Ann. NY. Acad Sei. 429, 195-206.

144. Wuebbens, MW; Roush, ED; Decastro, CM; Fierke, CA (1997) Cloning, sequencing, and recombinant expression of the porcine inhibitor of carbonic anhydrase: A novel member of the transferrin family. Biochemistry 36 No. 14,4327-4336.

145. Wydrzynski T., Govindjee (1975) A new site of bicarbonate effect in photosystem II of photosynthesis; evidence from chlorophyll fluorescence transients in spinach chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta 387,403-408.108

146. Yruela I., Allakhverdiev S.I., Ibarra J.V., Klimov V.V. (1998) Bicarbonate binding to the water-oxidazing complex in the photosystem n. A Fourier transform infrared spectroscopy study. FEBS Letters 425 (3), 396-400.

147. Zhu S.L. and Sly W.S. (1990) Carbonic anhydrase IV from human lung. J. Biol Chem. 265, 8795-8801.