Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование тилакоидных карбоангидраз Arabidopsis Thaliana

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование тилакоидных карбоангидраз Arabidopsis Thaliana"

на правах рукописи

Федорчук Татьяна Петровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ТИЛАКОИДНЫХ КАРБОАНГИДРАЗ АИАВШОРБК ТНАЫАМА

03.01.04 - биохимия

2 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2013

005541381

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Углерод является основным элементом большинства биомолекул, и его круговорот в биохимических реакциях, протекающих в организмах, необходимое условие поддержания жизни. Наряду с превращениями органических молекул, в живых клетках животных и растений происходит постоянное взаимопревращение форм неорганического углерода, углекислого газа и бикарбоната. В клетках животных и гетеротрофных бактериях в процессах, связанных, прежде всего, с дыханием, но также и в ряде других процессов, постоянно продуцируется большое количество углекислого газа. В фотосинтезирующих клетках автотрофных бактерий и растений углекислый газ, наоборот, потребляется в процессе фотосинтеза. В обоих случаях потоки этого газа очень велики в масштабах клетки и всего организма. В клетках изменение в содержании углекислого газа неизбежно связано с превращением либо его в бикарбонат, либо бикарбоната в него. Задержка в этих превращениях может не только замедлить процессы дыхания и фотосинтеза, но и серьезно изменить го-меостаз клетки и даже вызвать ее гибель. Поэтому в процессе эволюции появился фермент карбоангидраза (КА, карбонатгидролиаза КФ 4.2.1.1.), который катализирует обратимую гидратацию углекислого газа, значительно ускоряя ее:

Важность этого фермента для организмов подчеркивается тем фактом, что в процессе эволюции он независимо возникал несколько раз. Известные к настоящему времени карбоангидразы ученые делят на шесть семейств. В высших растениях, встречаются представители трех семейств: альфа, бета и гамма (Moroney et al., 2001). В 2000 году был расшифрован геном Ага-bidopsis thaliana, и было установлено, что в нем содержится 19 генов, кодирующих карбоангидразы, часть из которых с большей или меньшей точностью были найдены как находящиеся в плазмалемме, цитоплазме, митохондриях и хлоропластах (Fabre et al., 2007). В настоящее время хорошо изучена КА стромы хлоропластов, которая является самым распространенным после Рубиско белком в клетке и одним из основных компонентов растворимого белка листьев (0,5-2% от общего количества) (Badger, Price, 1994). Данная КА является также одной из самых активных КА. Это явилось причиной того, что долгое время существование КА в тила-коидах подвергалось сомнению из-за вероятности загрязнения их при выделении этим ферментом. Первые свидетельства присутствия КА в тила-коидах были получены в работе Комаровой с соавт. (1982) при исследовании хлоропластов бобов. В последующие годы наличие тилакоидных КА

со2 + н2о <-> НС03"+н

3

Сл

в высших растениях неоднократно подтверждали (Stemler, 1986; Пронина с соавт., 2002; Москвин с соавт., 1995). К настоящему времени имеется много данных в пользу того, что карбоангидразная активность тилакоидов гетерогенна, т.е. обусловлена присутствием нескольких носителей этой активности (Lu, Stemler, 2002; Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007; Шитов с соавт., 2009).

Существует достаточно много более или менее обоснованных гипотез о роли тилакоидных КА, прежде всего, об их участии в процессах, связанных с фотосинтезом (Ivanov et al., 2006). Предполагается, что эти ферменты могут участвовать как в метаболизме углерода, так и в процессе транспорта электронов. В последнем случае предполагается их участие в поставке бикарбоната как на акцепторной (Van Rensen, 1988), так и на до-норной стороне фотосистемы 2 (Allahverdiev et al., 1997; Klimov & Bara-nov, 2001). Рассматривается также участие ICA в удалении протонов, образующихся при окислении воды и способных существенно понизить рН вблизи водоокисляющего комплекса (Villarejo et al., 2002). Без сведений о природе, количестве, свойствах и расположении КА в ти-лакоидах трудно обоснованно предполагать их функции. Однако эти сведения до сих пор довольно фрагментарны и сводятся к отдельным свидетельствам, полученным в ряде, хотя и важных, но изолированных работ. Наше исследование посвящено, прежде всего, выяснению местонахождения тилакоидных КА, установлению их природы и некоторых свойств. Оно выполнено на арабидопсисе, что дало возможность использовать некоторые его мутанты с нокаутированными генами карбоангидразы.

Целью работы было изучение тилакоидных карбоангидраз A. thaliana. В процессе работы решались следующие задачи:

1. Подобрать условия выделения из листьев A. thaliana тилакоидов и обогащенных фотосистемой 1 или фотосистемой 2 тилакоидных мембран, сохраняющих карбоангидразную активность.

2. Исследовать характеристики карбоангидразной активности тилакоидных мембран, обогащенных фотосистемой 1 (ФС1) или фотосистемой 2 (ФС2).

3. Выделить носители карбоангидразной активности из тилакоидных мембран, обогащенных ФС1 или ФС2, и исследовать их характеристики.

4. Выделить и охарактеризовать карбоангидразу тилакоидного люмена растений дикого типа и мугантных растений с нокаутированным геном, кодирующим стромальную бета-КА1.

Научная новизна работы. Подобраны условия выделения: использование детергента додецилмальтозида, повышенной концентрации ионов

магния, соответствующих скоростей центрифугирования, - и выделены фрагменты тилакоидных мембран арабидопсиса, обладающие карбоан-гидразной активностью и обогащенные ФС1 или ФС2. Выделены и очищены мембраносвязанные носители карбоангидразной активности, расположенные в тилакоидной мембране вблизи ФС1 и ФС2, и установлено, что они различаются по своим свойствам. Доказано, что в люмене тила-коидов находится ранее неизвестный носитель карбоангидразной активности, водорастворимый белок.

Практическая значимость работы. Результаты работы дают новую информацию о карбоангидразной системе тилакоидов высших растений, позволяя приблизиться к пониманию роли этих КА в фотосинтезе. Данные, полученные при изучении тилакоидных КА арабидопсиса, могут быть использованы для идентификации генов, кодирующих КА тилакоидов других растений, что даст возможность изменять активность этих генов в культурных трансгенных растениях с целью повышения их устойчивости или урожайности. Кроме того, идентификация указанных генов позволит получать методами генной инженерии их продукты, что, учитывая имеющуюся в литературе информацию о термостабильности и устойчивости низкомолекулярной КА, расположенной вблизи ФС2, открывает возможность использования этого фермента в биотехнологических процессах, связанных с большими потоками углерода.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе», (Пущино, 2008), международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), Российской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), 14-ая Международная пу-щинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), VI Съезд Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011), VII Съезд общества физиологов растений (Нижний Новгород, 2011), 17 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2013), Международная научно-методическая конференция «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013).

Личный вклад соискателя. Исследования по теме диссертации были проведены соискателем самостоятельно. Автор участвовал в постановке и решении всех экспериментальных задач, обработке полученных результатов и формулировании выводов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи: 1 в реферируемом научном российском журнале (в печати), 1 в реферируемом зарубежном журнале и 11 в материалах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах, содержит 6 таблиц, 39 рисунков. Список литературы содержит 236 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы составляет первую часть диссертации. В нем изложены современные представления о строении активных центров КА, механизмах их ингибирования и активации. Описаны отличительные свойства КА, принадлежащих к выделяемым в настоящее время шести семействам этих ферментов. Представлены данные о наличии и распределении КА в различных организмах и рассмотрены предполагаемые функции, которые КА выполняют в клетке. Дается анализ имеющихся к настоящему времени сведений о носителях карбоангидразной активности тилакоидов высших растений.

Объекты и методы исследования. Основным объектом исследования служили отмытые с помощью специальных процедур от растворимых КА стромы и цитоплазмы тилакоиды, выделенные из них фрагменты тилако-идных мембран, обогащённые ФС1 или ФС2 (далее: ФС1-мембраны и ФС2-мембраны), а также фракция растворимых белков тилакоидов (лю-менальные белки) из мезофилла листьев А. хкаИапа. Среда инкубации отмытых тилакоидов содержала помимо солей и буфера ингибиторы проте-аз: 1 мМ а-аминокапроновую кислоту, 1 мМ бензамидин, 1мМ фенилме-тилсульфонилфлуорид. Для получения люменальных белков отмытые тилакоиды (см. Результаты) инкубировали при перемешивании в течение 20 мин с Тритоном Х-100, а затем осаждали мембраны при 175000^ в течение 40 мин. Для разделения ФС1- и ФС2-мембран полученный осадок инкубировали с Тритоном Х-100 при отношении тритон/хл, равном 1,0 в течение 20 мин, а затем осаждали мембраны при 12000^. Осадок инкубировали в тех же условиях в той же среде при отношении додецилмаль-тозид/хл, равном 4,3. Полученный после центрифугирования при 32000х§ в течение 40 мин осадок содержал ФС2-мембраны. Для получения осадка, содержащего ФС1-мембраны, супернатант центрифугировали при 175000*§ в течение 2 часов. К ФС1- и ФС2-мембранам добавляли 20%

глицерин, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. Степень взаимозагрязнения препаратов фотосистем контролировали путем измерения отношения Хл а/Хл Ь: для ФС1-мембран оно должно быть (согласно данным литературы) около 3 и выше, а для ФС2-мембран - близко к 2. Чистоту полученных препаратов оценивали также с помощью измерения спектров низкотемпературной (при температуре жидкого азота) флуоресценции, возбуждаемой светом с длиной волны 435 нм (Cederstrand, Go-vindgee, 1966). Для измерения карбоангидразной активности стромальных белков использовали супернатант b (рис. 6; см. Результаты). Карбоангидразную активность определяли, измеряя с помощью стеклянного электрода скорость изменения рН от 8,4 до 7,9 при 2°С в 14 мМ ве-роналовом буфере (рН 8,5) после добавления в ячейку дистиллированной воды, насыщенной С02 при 0°С. Контролем служила скорость спонтанной гидратации в тех же условиях при добавлении соответствующей среды вместо препарата. Активность КА выражали в мкмоль Н+ на мг хл или белка за минуту с учетом буферной емкости сред и препаратов. При исследовании влияния ингибиторов на карбоангидразную активность препараты выдерживали с ингибитором в ячейке в течение 2 минут. Ионообменную хроматографию ФС1- и ФС2 мембран проводили на колонке, содержащей Toyopearl DEAE 650 M. Мембраны предварительно обрабатывали додецилмальтозидом при отношении додецилмальтозид/хл, равном 10,0 (подробнее см. Результаты).

Аффинную хроматографию мембраносвязанных носителей карбоангидразной активности проводили на колонке, содержавшей в качестве носителя агарозу с ковалентно пришитым к ней специфическим ингибитором КА мафенидом, которая была уравновешена 50 мМ Трис-HCl (рН 8.0) и 100 мМ NaCl, и в качестве протекторов добавляли 1 мМ бензамидин, 1 мМ а-аминокапроновую кислоту и 5 мМ ЭДТА (среда 1). После нанесения препарата и инкубации в течение 40 мин колонку промывали средой, содержащей 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1 M NaCl, 8 M мочевину, 0,05% Тритон и 0,1% додецилмальтозид для удаления компонентов, неспецифически связавшихся с носителем (среда 2). Элюирование КА проводили средой 1 с добавкой 50 цМ мафенида. Полученный элюат центрифугировали в концентраторах Millipore (с размером пор 50 кДа) для удаления низкомолекулярных компонентов, в том числе мафенида, что обеспечивало реактивацию фермента. Аффинную хроматографию растворимого носителя карбоангидразной активности проводили в тех же условиях, но вместо 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) использовали 50 мМ Tpnc-H2S04 (рН 8,0); среда элюирования содержала 50 мМ Трис-1 bS04 и 100 мМ NaCl с протекторами, указанными выше.

Нативный электрофорез мембраносвязанных КА проводили при 4°С в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) при силе тока 10 мА в течение 3-4

часов. Верхний буфер содержал 0,2 % дерифат. Перед нанесением на гель препараты обрабатывали 0,1% додецилмальтозидом (Peter, Thornber, 1990). Электрофорез растворимых белков проводили при 4°С в градиентном 7-12% ПААГ, содержащем 20% глицерин при силе тока 10 мА в течение 5-6 часов (Davis, Ornstein, 1959). В обоих случаях использовали камеру Mini-PROTEAN 3 Cell, BIO-RAD.

KA в ПААГ выявляли высокочувствительным методом, основанным на регистрации изменения синей окраски геля, окрашенного бромтимоловым синим, на желтую в месте локального понижения pH при помещении геля в воду, насыщенную С02 при 0°С (Edwards, Patton, 1966). Действие ингибитора КА ацетазоламида на карбоангидразную активность в ПААГ изучали, инкубируя гели после проведения нативного электрофореза в 44 мМ вероналовом буфере с добавлением 10 мМ ацетазоламида. Денатурирующий электрофорез элюатов, полученных после аффинной хроматографии, проводили в градиентном ПААГ 14-20% (Schagger, von Jagow, 1987) при силе тока 70 мА в течение 22-24 часов в камере PROTEAN 11 xi Cell.

Белок в гелях выявляли с помощью окрашивания Кумасси G-250. Для определения молекулярной массы белков в условиях нативного электрофореза использовали смесь из четырех альбуминов-метчиков (Sigma) с молекулярными массами 198, 132, 99, 66 кДа. В денатурирующих условиях использовали неокрашенные метчики фирмы Fermentas: ß-галактозидаза (116,0 кДа), альбумин (66,2 кДа), овальбумин (45,0 кДа), лактатдегидрогеназа (35,0 кДа), REaseBsp981 (25,0 кДа), ß-лактоглобулин (18,4 кДа), лизоцим (14,4 кДа).

Выделение РНК и проведение обратной транскрипции. Листья растений арабидопсиса, предварительно замороженные в жидком азоте, гомогенизировали растиранием стерильными пестиками. Экстракты РНК выделяли с помощью набора реагентов Quaigen, и проводили обратную транскрипцию с помощью набора реагентов Omniscript RT (Qiagen) и праймеров, содержащих поли(Т) последовательность. С полученными кДНК дикого типа и мутантов, нокаутированных по гену At3g01500, кодирующему бе-та-КА1 проводили ПЦР с использованием праймеров, комплементарных индивидуальным последовательностям гена At3g01500: 5' ССТ СТС CGA ААС TAG СТС TGT ТАА 3' (прямой) и 5' CTG ТСС ССС AAG ATT ТТА ATT CTG ТАА А 3' (обратный). Электрофорез ДНК проводили в 1% ага-розном геле, содержавшем в качестве буфера 89 мМ Трис-борат и 20 мМ ЭДТА с использованием бромистого этидия для визуализации ДНК в геле.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорчук, Татьяна Петровна, Пущино

■

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ

04201 453579

ФЕДОРЧУК ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ТИЛАКОИДНЫХ КАРБОАНГИДРАЗ АЯЛтООГБ^ ТНАШМА

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: доктор биологических наук, Иванов Борис Николаевич

Пущино-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.....................................5

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................7

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................9

1.1. Физико-химические свойства углекислоты.........................................9

1.2. Значение КА в клетках животных...................................................10

1.3. Фотосинтез: структура и реакции...................................................12

1.3.1 .Строение хлоропластов и тилакоидов............................................12

1.3.2. Преобразование энергии в тшакоидной мембране............................13

1.4. Гипотетическая роль КА в тилакоидах высших растений......................16

1.5. Механизм концентрирования СО2...................................................19

1.5.1. СКМв клетках цианобактерий....................................................20

1.5.2. СКМ СМатуйотопс^ геткаЫШ как пример концентрирования углекислого газа в эукариотических зеленых водорослях............................................21

1.5.3. При других типах фотосинтеза (С4 и САМ)...................................23

1.6. Семейства карбоангидраз и механизм осуществления каталитической реакции...............................................................................................25

1.6.1. а-КА......................................................................................26

1.6.2. р-КА.....................................................................................29

1.6.3. у-КА......................................................................................33

1.6.4. д-КА......................................................................................34

1.6.5. е-КА......................................................................................34

1.6.6. С-КА......................................................................................34

1.7. Замещение атома цинка на другие металлы в активном центре КА.........35

1.8. Ингибиторы и активаторы К А.......................................................36

1.8.1. Ингибиторы КА.......................................................................36

1.8.2. Активаторы КА......................................................................38

1.9. Растворимые и мембраносвязанные КА высших растений и их место в растительной клетке.............................................................................40

1.9.1. Плазмалеммные КА..................................................................41

1.9.2. Цитоплазматические КА...........................................................41

1.9.3. Митохондриалъные КА..............................................................42

1.9.4. Хлоропластные КА...................................................................43

1.9.4.1. Стромалъные КА...................................................................43

1.9.4.1.1. Р-КА 1................................................................................43

1.9.4.1.2. а-КА1...............................................................................45

1.9.4.2. ТшакоидныеКА...................................................................46

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................51

2.1. Условия выращивания растений....................................................51

2.1.1. Pisum sativum..........................................................................51

2.1.2. Arabidopsis thaliana...................................................................51

2.2. Проверка наличия РНК стромальной КА в листьях мутантных растений, нокаутированных по Р-КА1 в A. thaliana с помощью ПЦР с обратной транскрипцией................................................................................................52

2.3. Электрофорез ДНК.....................................................................53

2.4. Выделение тилакоидов................................................................53

2.4.1. Из листьев P. sativum...............................................................53

2.4.2. Из листьев A. thaliana...............................................................53

2.5. Выделение тилакоидных мембран обогащенных фотосистемой 1 (ФС1-мембраны) или фотосистемой 2 (ФС1-мембраны) из листьев

A. thaliana.....................................................................................54

2.6. Характеристика препаратов фотосистем..........................................54

2.7. Выделение и очистка мембраносвязанного носителя КА активности, расположенного вблизи ФС1 A. thaliana.........................................................55

2.7.1. Ионообменная хроматография....................................................55

2.7.2. Осаждение белков ацетоном......................................................55

2.7.3. Аффинная хроматография мембраносвязанных КА..........................56

2.8. Выделение фракции люменальных белков.......................................56

2.8.1. P. sativum..............................................................................56

2.8.2. A. thaliana.............................................................................56

2.9. Выделение и очистка растворимого носителя КА активности...............57

2.10. Определение КА активности......................................................57

2.11. Определение концентрации хлорофилла в образце...........................57

2.12. Электрофорез..........................................................................58

2.12.1. Условия проведения нашивного электофореза мембраносвязанных белков..............................................................................................58

2.12.2. Условия проведения нашивного электрофореза растворимых белков. .58

2.12.3. Условия проведения денатурирующего электрофореза...................58

2.13. Визуализация карбоангидразы в полиакриламидном геле..................58

2.14. Окрашивание гелей на белок.........................................................59

2.15. Определение молекулярной массы белков в геле................................59

2.16. Определение содержания белка......................................................59

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.................................................................60

3.1. Выделение ФС1 и ФС2-мембран из тилакоидов A. thaliana и их характеристика.............................................................................................60

3.1.1. Влияние MgCh и детергентов на распределение фотосистем при разделении мембран тилакоидов A. thaliana.......................................................60

3.1.2. Влияние ингибиторов и детергентов на КА активность ФС1- и ФС2-мембран.........................................................................................62

3.2. Выделение и очистка КА ФС1........................................................65

3.2.1. КА активность в препаратах ФС1- и ФС2-мембран после проведения ионообменной хроматографии ................................................................65

3.2.2. КА активность «низкосолевой» и «высокосолевой» фракций после аффинной хроматографии..........................................................................67

3.2.3. Получение препаратов ФС1-мембран в присутствии 1% альбумина.....71

3.3. Выделение и очистка КА люмена...................................................75

3.3.1. Получение люменалъных белков...................................................75

3.3.1.1. P. sativum.............................................................................75

3.3.1.2. A. thaliana............................................................................77

3.3.2. Свойства люменалъной КА..........................................................81

3.3.2.1. Влияние ТритонаХ-100 наКА активность люмена............................81

3.3.2.2. Влияние альбумина, дитиотрейтола (ДТТ)и EZ на КА активность.....83

3.3.3. Выделение и очистка КА из фракции люменалъных белков..................86

3.3.3.1. Выделение и очистка КА из фракции люменалъных белков с помощью пресса Френча.................................................................................89

ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................................90

ВЫВОДЫ.....................................................................................96

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................97

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат;

АМФ - аденозинмонофосфат;

цАМФ - циклический АМФ;

АТФ - аденозинтрифосфат;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ВОК - водоокисляющий комплекс;

ГМФ - гуанозинмонофосфат;

ДМ - Р-додецилмальтозид (п-додецил-Р-Б-мальтозид); ДМ/хл - Р-додецилмальтозид/хлорофилл;

ДТТ — дитиотреитол (трео-2,3-Дигидрокси-1,4-димеркаптобутан);

КА - карбоангидраза;

мКА - митохондриальная КА;

НАДФ+ - окисленный никотинамидаденин-динуклеотидфосфат;

НАДФН - восстановленный никотинамидаденин-динуклеотидфосфат;

ПААГ - полиакриламидный гель;

пКА - плазмалеммная КА;

Р680 - первичный донор электронов РЦ ФС1;

Р700 - первичный донор электронов РЦ ФС2;

рАЦ - растворимые аденилатциклазы;

Рубиско - рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа;

САМ - метаболизм по типу толстянковых;

СК - салициловая кислота;

СКМ -СОг концентрирующий механизм;

ССК - светособирающий комплекс;

тКА - карбоангидраза тилакоидов;

тритон/хл - Тритон Х-100/хлорофилл;

ФЕП - фосфоенолпируват;

ФС1 - Фотосистема 1;

ФС2 - Фотосистема 2;

Хл - хлорофилл;

цКА - цитоплазматическая КА;

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот;

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь;

АЪ - ацетазоламид (5-ацетиламино-1,3,4-тиадиазол-2-сульфонамид;

EZ - этоксизоламид (6-этокси-2-бензотиазолсульфонамид);

С, - неорганический углерод;

Cam - КА Methanosarcina thermophila;

СсаА - КА бета-семейства карбоксисом цианобактерий;

СсшМ - неактивная КА гамма-семейства карбоксисом цианобактерий;

ChpX - белки цианобактерий, функционирующие подобно КА;

GFP-fusion метод, основанный на встраивании в геном гена зеленого флуоре-

центного белка;

I50— концентрация ингибитора, при которой активность фермента снижается наполовину;

PMSF - фенилметилсульфонилфлуорид.

ВВЕДЕНИЕ

Углерод является основным элементом большинства биомолекул, и его круговорот в биохимических реакциях, протекающих в организмах, - необходимое условие поддержания жизни. Наряду с превращениями органических молекул, в клетках животных и растений происходит постоянное взаимопревращение форм неорганического углерода: углекислого газа и бикарбоната. В клетках животных и гетеротрофных бактериях в процессах, связанных, прежде всего, с дыханием, но также и в ряде других процессов, постоянно продуцируется большое количество углекислого газа. В фото-синтезирующих клетках автотрофных бактерий и растений углекислый газ, наоборот, потребляется в процессе фотосинтеза. В обоих случаях потоки этого газа очень велики в масштабах клетки и всего организма. В клетках изменение в содержании углекислого газа неизбежно связано с превращением либо его в бикарбонат, либо бикарбоната в него. Задержка в этих превращениях может не только замедлить процессы дыхания и фотосинтеза, но и серьезно изменить гомеостаз клетки и даже вызвать ее гибель. Поэтому в процессе эволюции появился фермент карбоангидраза (КА, карбонатгидролиаза КФ 4.2.1.1.), который катализирует обратимую гидратацию углекислого газа, значительно ускоряя ее:

СОз + Н20 НСОз" + н+

Важность этого фермента для организмов подчеркивается тем фактом, что в процессе эволюции он независимо возникал несколько раз. Известные к настоящему времени карбоангидразы подразделяют на шесть семейств. В высших растениях встречаются представители трех семейств: альфа, бета и гамма (Moroney et al., 2001). В 2000 году был расшифрован геном Arabidopsis thaliana, и было установлено, что в нем содержится 19 генов, кодирующих карбоангидразы, часть из которых с большей или меньшей точностью были найдены как находящиеся в плазмалемме, цитоплазме, митохондриях и хлоропластах (Fabre et al., 2007). В настоящее время хорошо изучена КА стромы хлоропластов, которая является самым распространенным после Рубиско белком в клетке и одним из основных компонентов растворимого белка листьев (0,5-2% от общего количества) (Badger & Price, 1994). Данная КА является также одной из самых активных КА. Это явилось причиной того, что долгое время существование КА в тила-коидах подвергалось сомнению из-за вероятности загрязнения их при выделении этим ферментом. Первые свидетельства присутствия КА в тилакоидах были получены в работе Комаровой с соавт. (1982) при исследовании хлоропластов бобов. В последующие

годы наличие тилакоидных КА в высших растениях неоднократно подтверждали (Stem-ler, 1986; Москвин и др., 1995; Пронина и др., 2002). К настоящему времени имеется много данных в пользу того, что карбоангидразная активность тилакоидов гетерогенна, т.е. обусловлена присутствием нескольких носителей этой активности (Lu & Stemler, 2002; Игнатова и др., 2006; Rudenko et al., 2007; Шитов и др., 2009).

Существует достаточно много более или менее обоснованных гипотез о роли тилакоидных КА, прежде всего, об их участии в процессах, связанных с фотосинтезом (Ivanov et al., 2006). Предполагается, что эти ферменты могут участвовать как в метаболизме углерода, так и в процессе транспорта электронов. В последнем случае предполагается их участие в поставке бикарбоната как на акцепторной (Van Rensen, 1988), так и на донорной стороне фотосистемы 2 (Allahverdiev et al., 1997; Klimov & Baranov, 2001). Рассматривается также участие КА в удалении протонов, образующихся при окислении воды и способных существенно понизить рН вблизи водоокисляющего комплекса (Villarejo et al., 2002).

Без сведений о природе, количестве, свойствах и расположении КА в тилакоидах трудно обоснованно предполагать их функции. Однако эти сведения до сих пор довольно фрагментарны и сводятся к отдельным свидетельствам, полученным в ряде, хотя и важных, но изолированных работ. Наше исследование посвящено, прежде всего, выяснению местонахождения тилакоидных КА, установлению их природы и некоторых свойств. Оно выполнено на арабидопсисе, что дало возможность использовать некоторые его мутанты с нокаутированными генами карбоангидразы.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Карбоангидраза - фермент, осуществляющий катализ обратимой гидратации углекислого газа с образованием протона и бикарбоната,

С02 + Н20 НСОз" + Н+

впервые был найден в красных кровяных тельцах в 1932 г. (Meldrum & Roughton, 1933). В дальнейшем многочисленные биохимические исследования карбо-ангидраз позволили обнаружить их во всех органах, тканях и клетках живых организмов, от прокариот до человека (Elleuche & Poggeler, 2010), поскольку субстраты этой реакции вовлечены практически во все метаболические процессы. Молекулы диоксида углерода, бикарбонат ионов и протонов неразрывно связаны между собой в биологических системах. Изменения концентрации любой из этих молекул отражается на концентрации других двух, и все они играют центральную роль в жизни клетки. Клеточные ферменты и химические реакции чувствительны к pH, и клетки при участии карбоан-гидраз активно транспортируют протоны и бикарбонат через клеточную мембрану для поддержания pH (Roos & Boron, 1981; Casey et al., 2006). Кроме того, CO2/HCO3" является буфером внешнеклеточных и внутриклеточных физиологических сред и является субстратами и конечными продуктами таких процессов как кальцификация, фотосинтез и дыхание.

1.1. Физико-химические свойства углекислоты

Основным источником углерода в клетках высших растений является углекислый газ атмосферы. Соединения, которые имеют общее название «неорганический углерод» (С,), в природе встречаются как в виде негидратированной или гидратированной молекулы углекислого газа, так и в форме бикарбонатного или карбонатного иона. Общая концентрация Сг описывается следующей формулой (1):

Ci= [ С02(раств)] + [ НгСОз] + [ нсо;] + [ СОз] (1)

Содержание СО2 в атмосфере относительно небольшое - около 400 ррт. При такой его концентрации значение в воде равно приблизительно 10-12 мкМ. Уникальным свойством СО2 является хорошая растворимость в воде, которая в 35 раз превышает таковую Ог и в 60 раз - N2. При 0°С и 1 атм парциального давления в 1 кг воды растворяется 0,077 моль СО2 (Faurholt, 1924; Knoche, 1980). Это связано с тем, что СО2 -

плоская трехатомная молекула, имеющая дипольный момент, равный нулю, и симметричную линейную структуру (0=00) (Mitz, 1979).

Растворенный в воде СО2 гидратируется с образованием двухосновной угольной кислоты, весьма нестойкого соединения, диссоциирующего в водных растворах до Н+ и НСОз. Данная реакция имеет константу диссоциации (ki), равную 4,5x10"7. На второй стадии угольная кислота образует 2Н+ и СО32" с константой диссоциации (кг) для данной реакции равной 5,6x10"" (2):

СОгсга»)— CtWre) — НаСОэ—Н+НСО'з—2Н+С0з" (2)

pKi и рКг равны 6,35 и 10,25 соответственно (Faurholt, 1924). Поэтому при pH ниже 6,4 превалирует СО2, в диапазоне 6,4-10,3 преимущественной формой является ион НСОз", и СОз2" - при pH выше 10,3 (Faurholt, 1924, Рабинович, 1951 ). Из этого следует вывод, что содержание различных форм неорганического углерода зависит от концентрации ионов водорода в растворе.

Проникновение НСОз", СО32" и Н2СО3 через липидную мембрану сильно затруднено, тогда как растворимость СО2 значительно повышается в органических растворителях по сравнению с водными растворами, и он легко проходит через слои липидов (Smith, 1988).

СО2 из апопласта (pH которого около 5), попадая в цитоплазму с pH около 7,45, и строму, pH которой на свету около 8, превращается в НСОз > образуя кратковременный источник С,- в клетке.

При нейтральных pH процессы спонтанных реакций гидратации-дегидратации

С, - процессы достаточно медленные. Константа скорости гидратации Кнго составляет

2 1 1 3,7х 10" сек", а константа скорости дегидратации - 14 сек" (Smith, 1988). Для наступления полного равновесия требуется около 1 мин (Faurholt, 1924).

1.2. Значение КА в клетках животных

КА в клетках животных выполняют самые разнообразные функции: обеспечивает быстрый доступ к «запасённому» бикарбонату, например, в лёгких, усиливает «истечение» метаболического СО2 из хрусталика глаза (Friedland & Maren, 1981), катализирует производство НСОз как иона, участвующего в симпорте Na в секреторных тканях (Maren, 1988). КА играет роль в установлении баланса электролитов и поддержании pH в клетках и тканях (рис. 1) (Davies, 1973), регуляции дифференциации амелобластов через pH-зависимый сигнальный путь (Wang et al., 2010), в транспорте электролитов в клетках мальпигиевых сосудов Drosophila malpighian (Wessing et al., 1997). Катализи-

руемая гидратация СО2 приводит к усилению диссоциации комплекса гемоглобин-кислород (Förster & Steen, 1968) КА при этом доставляет протоны и ионы бикарбоната к ион-транспортным системам клеточной мембраны, причём функционирование К�