Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КАРБОАНГИДРАЗЫ АЛКАЛОФИЛЬНОЙ СТРОМАТОЛИТОБРАЗУЮЩЕЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ MICROCOLEUS CHTHONOPLASTES: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "КАРБОАНГИДРАЗЫ АЛКАЛОФИЛЬНОЙ СТРОМАТОЛИТОБРАЗУЮЩЕЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ MICROCOLEUS CHTHONOPLASTES: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ"



На правах рукописи

КУПРИЯНОВА Елена Владимировна

КАРБОАНГИДРАЗЫ АЛКАЛ ОФИЛЬНОЙ СТРОМАТОЛИТОБРАЗУЮЩЕЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ

МгсгосоХеия сЫНопор1а81е8\

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ

03.00.12 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2003

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН в Отделе Молекулярных основ внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов, г. Москва.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук Пронина Наталия Александровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук доктор биологических наук

Иванов Борис Николаевич Носов Александр Владимирович "

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Зашита состоится «23» декабря 2003 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 при Институте физиологии растений им, К. А, Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095) 977-80-18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «21» ноября 2003 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук СЧуР^г ^^ М. И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемыт Основы биосферы современного типа были заложены около 2 млрд. лет назад, в период господства на Земле прокариот. Древние цианобактерии превратили раннюю восстановительную атмосферу в кислородную, связав большое количество С02 в карбонаты и выделяя Ог в процессе фотосинтеза. Участие циано-бактериального сообщества в связывании атмосферного С02 на ранних этапах истории Земли подтверждается наличием в осадочных породах строматолитов - слоистых известняковых отложений, представляющих собой лигифицированные циано-бактериальные сообщества, аналогичные современным бентосным матам. Моделью для изучения строматолитобразования могут служить реликтовые микробные сообщества, сохранившиеся до наших дней в экстремальных условиях обитания.

В настоящее время строматолитобразование представляет собой довольно незначительный по масштабам процесс. Хотя циано-бактериальные маты существуют во многих районах мира, настоящие строматолиты они образуют довольно редко. Геомикробиологические процессы, имеющие место при образовании современных строматолитов, до сих пор плохо изучены, в связи с чем затруднено моделирование тех условий на нашей планете, при которых имело место формирование строматолитов докембрия, а, отсюда, и реконструкция древних биогеохимических процессов, происходивших на нашей планете. До сих пор неясно, принимают ли участие в минерализации циано-бактериального сообщества какие-либо физиологические процессы, или маг лишь структурирует естественное осадконакопление. Нами было выдвинуто предположение, что ключевую роль в этом механизме может играть фермент карбоангидраза (КА), устанавливающий обратимое равновесие в реакции гидратации-дегидратации углекислоты: СО* + Н20 5 Н4 + НСОз*. В настоящее время этот фермент найден практически у всех групп живых организмов, где он участвует в осуществлении ряда физиологических процессов, среди которых есть и идущие с отложением карбоната кальция. В то же время, организация КА системы у представителей бентосных сообществ до сих пор не изучена.

В качестве объекта использовали бентосную цнанобактерию М1сгосо1еиз сЫНопор1аБ1ез — представителя алкалофкльных сообществ, считающихся реликтом древней микробиоты, сохранившейся в экстремальных условиях содовых озер. \ ———————, .

Цели и задачи работы. Целью настоящего исследования являлся поиск внеклеточных КА, имеющих доступ к наружному субстрату, у реликтовых цианобактерий и оценка возможности их участия во внеклеточном отложения карбоната кальция.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие аада'ш:

1. Исследовать активность карбоангидразы в различных клеточных фракциях Мкгосо1еш сЫ!юпор!аме$.

2. Исследовать локализацию карбоангидраз в элементах клеточных оболочек и на тонких срезах клеток М. ШЫторШш.

3. Определить принадлежность внеклеточных карбоангидраз М. сШИопор1шен к классам этого фермента.

4. Охарактеризовать некоторые свойства внеклеточных ферментов (рН-зависимостъ, р1, молекулярную массу, пептидный профиль),

Научняы новизна. Впервые показано наличие активных внеклеточных КЛ у цианобактерий. Ферменты, обнаруженные у реликтовой алкалофилыюй цианобактерии Мсгосокю с/г&опор1Ше5, отнесены к а- и (^-классам КЛ. Наличие КА а-югасса в гля кокал иксе клеточных оболочек установлено впервые. Помимо этого, новыми являются сведения по локализации в клеточных оболочках цианобактерий фермента р-типа. Впервые получен пептидный профиль карбоангидразы с использованием метода МА1ЛМ-ТОГ масс-спектроскопии. Па основе экспериментальных данных предложена схема участия наружных карбоангидраа в минерализации циадо-бактериалыюга мата.

Научно-ииактическое значение. Полученные результаты могут быть использованы для моделирования процессов, происходивших на Земле в докембрии при формировании толщ строматолитов и становлении биосферы, а также для понимания эволюции классов карбоаигидраз.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на ежегодном симнозцуме «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997); IV и V Съездах Общества физиологов растений России (Москва, 1999; Пенза, 2003); конференции «Наукоемкие технопогии-99» (Москва, 1999); школе-конференции «Горизонты физико-химический биологии» (Пущино, 2000); международных конференциях «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии» (Пущино, 2000, 2003); международной конференции «Автотрофные

микроорганизмы» (Москва, 2000); международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва-Мииск, 2001); международном симпозиуме «Plant under environmental stress» (Москва, 2001); XVII Пущиискнх чтений по фотосинтезу и международной конференции «Первичные процессы фотосинтеза в бактериях и фотосистеме 2 растений» (Пущино, 2002), а также на различных внутри институтских семинарах и конференциях.

Публикации, По материалам диссертационной работы опубликовано 14 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Объект и методы исследований», «Результаты и их обсуждение», заключения, выводов м списка цитируемой литературы, включающего 192 наименования. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков и 2 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали штамм № 27 реликтовой алкалофильной цианобактсрии Microcoleus chthonoplastes (тип Cyanophycota, класс Cyartophyceae, порядок Nostocales, семейство Oscillatorlaceae) m коллекции Института микробиологии РАН.

М. chthonoplastes - типичный бентосный организм, доминирующая форма алкалофильных и галофильиых циадо-бактернальиых магов, считающихся реликтами древней микробиоты, сохранившейся до наших дней в экстремальных условиях обитания (Заварзин, 2001). М. chthonoplastes представляет собой нитчатый организм с одино'пшми или собранными в пучок и перевитыми трихомами, заключенными л общий слизистый чехол - гликокаликс, защищающий нити от высыхания и сильной солнечной радиации. Толщина чехла может достигать 0.6 мкм (по радиусу), диаметр клетки составляет 3 мкм. Нити М. chthonoplastes способны минерализоваться. Образование минералов кальция «а наружном чехле цианобактсрии хорошо документировано как на природных образцах в циано-бактсриальном мате, так и подтверждено многочисленными лабораторными исследованиями (Герасименко с соавт., 1996; 1998; 1999а).

Условия культивирования. Культивирование М. chthonoplastes проводили в накопительном режиме в стерильных условиях при постоянном освещении люминесцентными лампами интенсивностью около 50 рМ квантов света м"2 с"1 и температуре 31 °С, Культуру

выращивали в конических колбах на среде S при pH 9.5-9.8 (Герасименко с соавт., 1996а).

Выделение кл сточных фракций M. chlhonoplastes. Дезинтеграцию клеток проводили в гомогенизаторе со стеклянными бусами, или используя French press, при давлении 500 бар. Фракции, обогащенные растворимыми и мембракосвязавиьши белками, получали разделением клеточного гомогепата при 18 ООО g (40 мин, 4 °С) (Пронина, Семененко, 1984). Клеточные оболочки М, chthonoplastes выделяли с помощью модифицированной методики (Weckesser & Jürgens, 1988). Разделение клеточных оболочек на клеточные стснки и сопутствующие им фракции проводили в ступенчатом 1радиенте плотности сахарозы (Weckesser & Jürgens, 1988). IIa всех этапах выделения к образцам добавляли раствор смеси ингибиторов протеаз для предотвращения деградации белков.

Измерение активности карбоангндразы. Активность КА определяли электрометрическим способом по изменению концентрации Н' в реакции гидратации диоксида углерода (Wilbur & Andersen, 1948) с помощью рН-метра с высокочувствительным микроэлектродом и самописцем. Активность КА рассчитывали по разнице начальной скорости реакции гидратации СОг в контроле (иеферментативная реакция) и образце и выражали в условных единицах Вильбу ра-Андерсена на мг хлорофилла или мг белка.

Определение содержании белка и хлорофилла. Содержание белка определяли методом Lowry (1951) или методом DC (модифицированный метод Lowry) согласно протоколу Bio-Rad Laboratories с использованием набора стандартных растворов. Содержание хлорофилла измеряли спектрофотометрически в метапольных экстрактах (Porra et al., 1989).

Электрофорез н н м му нодетекцин. Электрофоретическое разделение белков проводили в денатурирующих условиях в 12% ПААГ (Laemmli, 1970) или с помощью двумерного электрофореза. Для электрофореза по Laemmli использовали стандартную методику, а также растворы и буферы Bio-Rad. Количество нанесенного белка составляло 15 или 45 мкг на дорожку для гелей, предназначенных соответственно для окрашивания или имму нодетекции. Пробы солюбилодировали нагреванием при 95 °С в течение 5 мин. В случае двумерного электрофореза пользовались протоколом Amersham Biosciences и набором стандартных реагентов. В работе использовали сухие IPG поноски с иммобилизованным градиентом pH от 3 до 10, длиной 7 см (Iinmobilme DiyStrip gels, Amersham Biosciences). Количество белка составляло 100 мкг в случае геля, предназначенного

для блоттинга и 300 мкг для геля, предназначенного для окрашивания серебром и последующей масс-спектросконин MALDI-TOF. Регидратацию IPG-полосок и разделение белков по изоэлсктрической точке проводили в аппарате IPGphor Isoelectric Focusing System (Amersham) при 20 °C и максимальном токе SO рА на каждую полоску. Для разделения белков по молекулярной массе использовали 12% ПААГ.

Для Вестерн блот анализа пользовались протоколом Bio-Rad Laboratories и набором стандартных реагентов, В качестве первичных антител использовали афинко очищенные антитела к белку Cah3 (а-КА) и к митохондриальной ß-KA из С. re'mhardtiit ß-KA m хлоропластов шпината и ß-KA из Соссотуха, а таюке антитела к белку DÍ из тилакоидных мембран С. reinhardtii. В качестве вторичных антител использовали антитела, конъюгированные с нероксидазой хрена (Amersham Life Science). Специфическое связывание визуализировали, используя зсемолюминесцентные растворы (KCL, Amersham),

Масс-спектроскопин MALDI-TOF. Подготовку белковой пробы и проведение анализа методом MALDI-TOF MS («Matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight mass spectroscopy», «ионизация лазерной десорбцией в матрице в сочетании с время пролетным масс-анализом») проводили согласно протоколу

(http://molbiol.soton.ac.uk/mass-spec/ingel.htm). Расщепление белка трипсином проводили без экстракции, в полиакриламидиом геле, после его предварительной обработки. Образцы готовили, смешивая одну часть белкового образца с девятью частями матрицы (а-циано-4-гндрок&щиннамовая кислота в 0.1% трифторуксусной кислоте, 30% ацетона). Анализ проводили на масс-спектрометре Brukcr Reflection II MALDI-TOF (Германия). Для сравнения пептидных профилей белков и поиска их гомологии использовали базу данных Prospector (http://prospector.ucsf.edu). Молекулярные массы пептидов при поиске в базах данных определялись с точностью до 100 ррт.

Иммуно-элекгронная микроскопия. Электронпо-

иммунохимическнй анализ проводили согласно описанной методике (Маркелова с соавт., 1990). Для иммуноцшшимической реакции, которую проводили после фиксации материала 4% формалином,

использовали антитела к а-КА (Cah3) из С. reinhardtii и Protein-A-Gold (Sigma). Ультратонкие срезы исследовали на микроскопе JFM J KOL X-100 (Япония) без дополнительного контрастирования.

Определение внутриклеточного pH. Цитошшматическнй pH определяли с помощью спектроскопии 3|Р-ядерного магнитного

резонанса (31Р-ЯМР) на MSL-200 "Bruker" (Германия) в ампулах диаметром 10 мм. Дня удобства снятия спекгров ЯМР использовали цггамм Z-9404 одноклеточной алкалофильной цианобактерии Rhabdoderma lineare щ коллекции Института микробиологии РАН. Образцы для снятия ЯМР спектров готовили, как описано Mitsumori & Ito (1984). В качестве стандарта использовали 85%-ную ортофосфорную кислому. Спектры снимали при температуре 22 °С и частоте электромагнитного излучения 81 МГц, с числом сканирований 3-6 тыс. Цитошшзматический рН определяли, используя зависимость химическою сдвига пика неорганических фосфатов цитоплазмы от рН. Для построения стандартной кривой использовали клеточный экстракт Л. lineare в б М НСЮ4 согласно Kuchitsu et al. (1989). Идентификация пиков резонансных сигналов была проведена на основе имеющихся литературных данных (Roberts, 1984).

Биоинформатикя. Для поиска аминокислотных последовательностей КА разных классов использовали программу BLASTp (http:/Avww.ncbi.nlm.nili.gov). Сравнение первичной последовательности белков для анализа их гомологии, сравнение профилей трипсинизации белков, а также построение филогенетических деревьев проводили при помощи программного продукта LaserGene (DNASTAR Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность карбоангидрязы в клеточных фракциях М. chtimwplastes. Активность КА в интактных клетках и в различных клеточных фракциях М, chthanoplastes, рассчитанная на основе данных серии независимых экспериментов, приведена в таблице.

Таблица. КА активность в клеточных фракциях М chthonoplastes

Клеточные фракции КА активность, КА активность,

усл. едУмг Хл усл. ед./ мкг белка

интактные клетки 24 ±4 238±П

клеточные оболочки - 318± 14

гомогепаг — —

растворимые белки -

мембранные белки - -

Активность фермента была обнаружена только в интактных клетках и во фракции клеточных оболочек М. сЫНопор1ая1ез> что

свидетельствует о наличии у него внеклеточных форм К А, имеющих доступ к наружному субстрату. Хотя в процессе выделения клеточных оболочек активность фермента неизбежно снижается, тем не менее, средние значения активности свидетельствуют о том, что ободочки обогащены КА по сравнению с иитактньши клетками (таблица). Обнаруженная нами активность наружного фермента у М сЫЬопорШш сопоставима по значению с активностью некоторых других прокариотических КА, например, с активностью внутриклеточного фермента у АпаЪаепа уапаЬИк (Уайахуа М а!., 1984), а также с активностью КА, найденных в хлорогшастах микроводорослей (КаШпап е1 а1., 1994). Во фракциях суммарного гомогената, растворимых и мембраносвязанных белков М сЫНогюр1шея активность КА не была зарегистрирована - возможно, в силу низкой активности фермента, или из-за его невысокой концентрации среди прочих белков этих фракций. Однако активность КА в этих фракциях обнаруживается при других условиях культивирования, как нами было показано ранее (Куприянова с соавт., 2003).

Идентификацию карбоангндраз а-тнпа среди нолнпсптидов клеточных фракций М. сЫНотр1а$Ш проводили методом Пестери блот анализа с использованием антител к СаЬ-3 белку (а-КА) из С. гешкаг&И, которые «узнавали» лишь одну белковую полосу в районе 34 кДа (рис. !)■ Усиление специфического сигнала отчетливо видно во фракции клеточных оболочек по сравнению с остальными фракциями. Наличие сигнала во фракции растворимых белков можно объяснить недостаточным разделением с мембранной фракцией, а также частичным вымыванием фермента из оболочек в процессе выделения.

Рис. 1. Идентификации КА «-типа среди погшлеятидов М. ШЬопорШ&ев. Результаты

эгистроф еретического разделе' ния белков клеточных фракций (А) и соответствующего Вестерн блот анализа (6) с антителами к тилакоидной а - КА СаЬ-З из С. 4 ге/лйаг<№/. Цифрами обозначены а -КА следующие фракции: 1 - общий бесклеточный гомогенат; 2 ~ фракция, обогащенная растворимыми белками: 3 - фракция, обогащенная мембранными белками; 4 - клеточные оболочки; М ~ метчики моле купвр ной массы. Стрелкой показан специфический сигнал и положение СаЬ-З лодобнога белка в геле.

(А)

(Б)

Поскольку балок Cah-З локализован в ФС II тилакоидных мембран С. reinhardtii (Park et al., 1999), необходимо было убедиться, что специфический сигнал, обнаруженный нами в клеточных оболочках М. chthonoplaxtex, не является причиной контаминации этой фракции тилакоидными мембранами цианобактерии. С этой целью нами был осуществлен иммуноблоттинг тех же выделенных из М. chthonoplastes образцов с использованием антител к мажорному белку фотосистемы II - 1)1 (PsbA), являющегося специфическим маркером тилакоидов (Nishiyamaet al, 2001).

Рис, 2. Тест на отсутствие тилакоидных мембран в выделенной иэ М. сШапорШ1е$ фракции клеточных оболочек.

(А) - результаты иммуноблоттннга с антителами я типакоидной СаЬ-З из С. гвтЬалШг, (Б) - результаты иммуно-Ълоттинга с антителами к 01-белку. 1 - общий бесклеточный гомогенат; 2 -фракция, обогащенная растворимыми белками; Э - фракция, обогащенная мембранными белками; 4 - клеточные оболочки.

Результаты иммуноблоттннга (рис. 2) показывают наличие специфического сигнала 01 во всех фракциях, кроме клеточных оболочек, что свидетельствует об отсутствии в последних тилакоидпых мембран. Сигнал во фракции растворимых белков, так же как и в предыдущем случае, является результатом недостаточного разделения фракций растворимых и мембранных белков.

Необходимо отметить, что тилакоидная КА, найденная у микроводорослей и у высших растений, до сих ссор не обнаружена в мембранах тилакоидов у цианобактерий. Однако нельзя исключить наличие в типакоидной мембране у этих организмов у- или Р-КА, поскольку во многих цианобактериальных клетках обнаружены ферменгы или гены этих классов, Поэтому уверенность в чистоте фракции клеточных оболочек М. сШопорШея от тилакоидных мембран необходима также при попытке поиска в ней КА р-типа.

Идентификация карбоангндраз Р-типа среди ношшептидов М. сЫ1и>нор1Шех. Для поиска в клеточных фракциях М сМюпор1Ше$ КА, принадлежащих р-классу, использовали антитела против КА р-

типа из разных организмов: хлоропластов шпината, митохондрий С геЫгаг&И, а также антитела против внутриклеточной КА из зеленой микроводоросли Соссотуха. Выбор различных антител обусловлен множественностью форм р-КА. Рис. 3 демонстрирует результат кросс-реакции поли пептидов клеточных фракций М. сЫЬопор1шех с антителами к КА шпината (А) и С. геШшг<1Щ (Б). В то же время, иммунодетекция полипептидов всех изучаемых фракций М. сЫкопор1а&Ш с антителами к КА Соссотуха выявила полное отсутствие кросс-реакции (не показано).

Рис, 3. Идентификация КА р-типа среди лолипептццов м сМюндоГа&ез. Результаты Вестерн бпот энапиаа с аиттелами против КА р-типа; (А) -антитела против р-КА митохондрий С. тМа«Щ (Б) - антитела против р - КА из хлоропластов шпинате. 1 - о&ций беекпеточный гомогенат; 2 -фракция, обогащенная растворимыми бетами; 3 - франция, обогащенная мембранными белками; А - клеточные оболочки.

Таким образом, в дополнение к обнаруженному нами ферменту а-типа, в клеточных оболочках М chthonoplastes присутствуют, по крайней мере, две формы ß-KA. Многочисленные специфические сигналы в клеточных оболочках М. chthonoplastex, по-видимому, обусловлены неполной денатурацией нативных КА, представляющих собой, согласно литературным данным, структуры, отличные от мономера (Smith & Ferry, 2000).

Сигнал во фракции, обогащенной растворимыми белками, может быть результатом кросс-реакции с карбокеисомалмюй ß-KA М. chthonoplastes, наличие которой у цнанобактерий является хорошо документированным фактом (Kaplan & Reinhold, 1999). В то же время, нельзя исключить, что наличие специфического сигнала во фракции 2 (рис. 3, А) вызвано недостаточной очисткой фракции растворимых белков от элементов клеточных оболочек.

Наше дальнейшее исследование было посвящено изучению наружной КА а-класса. Для понимания функциональной роли этот фермента в клетках М. chthonoplastes, было необходимо определить его свойства, а также точную локализацию в клеточных оболочках цианобактерии.

кДа 101

55

36 29

21

12 3 4

2 3 4

(А)

(Б)

Исследование локализации карбоннгндразы и-тния в

элеменшх клеточных оболочек М. еАЖопор1а$1е5. Известно, что клеточные оболочки цианобактерий имеют довольно сложную структуру и состоят из внешней мембраны с гликокаликсом, нептидогликанового слоя и цитогглазматической мембраны (Сапй, 1994). В этой связи изучение точной локализации обнаруженной нами КА а-шна в элементах, составляющих клеточные ободочки М. сШюпорШхи'А', представляет собой отдельную задачу.

После разделения клеточных оболочек М сИ(Ъотюр1ше.у с помощью ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (60, 55, 50, 45 и 40 %), нами были получены три фракции, расположенные снизу вверх по плотности в градиенте в следующем порядке: клеточные стенки, представляющие собой две нижних фракции; фракция неких фрагментов клеточных оболочек (предположительно, гликокаликса, легко отделяющегося от клеточных оболочек при их обработке), расположенная между 50 и 55% растворами сахарозы; легкая фракция цнгоплазматических мембран, лежащая поверх 40% раствора сахарозы.

Д»я идентификации а-фермента в этих фракциях нами был применен метод Вестерн блот анализа с использованием антител к белку Са1ьЗ, результаты которого представлены на рис, 4, из которого видно, что узнаваемый антителами СаЬ-З подобный белок после

предположит«] ыю

Рис. 4. Электрофорети-честое разделение гтоли-пептидов фракций клеточные оболочек М сМю/юр^йв (А) и Вестерн блот анализ (Б) с антителами к белку Са(1-Э,

1 - гомогенат; 2 -клеточные оболочки; 3 -клеточные стенки; 4 — гликокаликс; 6 - цито-плазматические мембраны; М - метчики молекулярного веса.

Локализация КА в ппикокалнксе была подтверждена с помощью иммуноалектроннога анализа клеточных срезов и выделенного препарата клеточных оболочек М. chtho^юpíastesг при использовании тех же антител к а-КА (СаЬ-3) из С гетНагШп (рис. 5). На представленных фотшрафиях хорошо видны электронноплотные

разделения оказался во фракции, охарактеризованной нами как гликокаликс.

метки коллоидного золота в окружающем клетку полисахаридном чехле (рис. 5, А) и в препарате изолированных клеточных оболочек (рис. 5, Б). Из сравнения этих результатов можно сделать вывод, что специфический сигнал, наблюдаемый в препарате клеточных оболочек, обусловлен присутствием СаИ-З подобного фермента в гликокаликее М сй/йоиор/ш^.

гликокаЬикс Г.. - \ • ■

713 ^ t.\f'-4

клетка

(Al

Рис. 5. Результаты имму-ноэлекфонной микроскопии клеточных срезов и выделенного препарата клеточных оболочек М. ей ГЛолорйиНе®.

(А) - клеточный срез М. сМАомДОвод; (Б) изолированные клеточные оболочки. Стрелками показе ко положение

элекгроноплотных меток.

В качестве первичных антител использованы антитела к а-КА (СаИ-З) из С. ге1пШтШ1.

Зависимость активности наружных КА М. сН&опор1а$Ш от рН внешней среды. Максимальная активность внеклеточной КА М. сЫЬопор1ше$ обнаруживается при сильнощелочном рН около 10, являющемся оптимальным значением для роста этого алкалофида; помимо этого, наблюдался еще один максимум активности фермента в области рН 7.5 (рис. б). При рН около 6.5 и 8 активность фермента не обнаруживалась.

Рис. 6. Зависимость активности наружной КА М. ШШорШм ОТ рН культуральной среды.

Наличие максимумов наружного можно

присутствием

двух активности фермента объяснить нескольких

КА разных классов (а- и Р~) в клеточных оболочках M, chthonoplastes. Таким образом, высокие

показатели активности наружных КА при сильнощелочных рН, характерных для среды обитания М.

chthonoplastes, могут

отражать эффективность работы а-КА, имеющей доступ к наружному субстрату, либо суммарную активность одновременно присутствующих в гликокаликсе а- и р-форм фермента. Максимум активности в области рН 7.5 может объясняться присутствием КА р-типа в пери плазматическом пространстве, которое, как предполагается, имеет значения рН, близкие к физиологическим.

Характеристика изоэлсктрической точки а-КА гликокаликса М. ск&опор/аыех, Результаты двумерного электрофореза с последующей им му по детекцией при использовании антител к белку СаЪ-З дают возможность оценить характеристику белкового состава фракции гликокаликса М. сЫИопор!ше$, а также изоэлектрическую точку наружной а-КА (рис. 7). Анализ геля, полученного после прокрашивания белков серебром, выявил присутствие в препарате гликокаликса М. сЫкопор1шея приблизительно 15-20 различных полипептидов. Интересно отметить, что практически все белки этой фракции кислые с изоэлектрической точкой р1 в области от 3 до 5. Однако, белок, присутствующий в этой фракции в наибольшем количестве, являлся шапочным. Его изоэлектрическая точка была нами оценена в районе р1 9.5, а молекулярная масса — около 18 кДа. Результаты иммуноблоттинга показали, что специфический сигнал, соответствующий СаЬ-3 - подобному белку, находится в области кислых рГ (приблизительно 3.5). Его молекулярная масса не отличалась от оцененного при помощи одномерного электрофореза по ЬаеттЦ и составляла приблизительно 34 кДа.

кДа 101 -

65 3629

21-

рНЗ

рН 10 рН 3

рню

- ■ г; Í

а-КА

34 кДа, р| 3.6

ч

«1

(А)

(Б)

Рис. 7, Двумерный электрофорез (А) и Вестерн бгот ашлиэ (Б) о антителами против СэЬ-Э {а • КА) фракции гликокаликса М. сШопор/айвй.

1 - полажвние Cah-З подобного белка в rene; 2 - мажорный белок фракции гликокаликса.

MALDI-TOF масс-спектрометрнческий анализ белков гликокаликса М chthotwplastes. Пептидный профиль СаК-3 -подобного белка, полученный с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF, представлен на рис. 8.

Рис. 8. Пептидный профиль а-КА гликокаликса М chWKwiop/astas, полученный с помощью масо-спектроскопии MALDI-TOF,

Сравнение этого профиля с профилями известных белков из базы данных Prospector, с учетом молекулярной массы и изоэлектрической точки, показало сш гомологию с одним из белков неизвестной функции из цианобактерии Nostoc pmeti/orme (ZP 00109625). В свою

очередь, этот белок показал высокую степень гомологии с гипотетическим белком (ZP„000730U) из другой осциллаториевой цианобактерии - Trichodesmium erythraeum.

Полученный нами пентидный профиль мажорного белка щ выделенной нами фракции гликокапикса М chthonoplastes (данные приведены в диссертации) показал гомологию с белком секреторного типа Spy из Е, coli, функция которого в бактериальной клетке до конца не ясна (Hagenmaier et al. 1997). Это являлось дополнительным критерием отсутствия контаминации выделенного нами гликокапикса другими клеточными фракциями.

На первый взгляд, проблема идентификации Cah-3 - подобного белка из гликокаликса At chthonoplastes заключается только в недостаточной информации о белках цианобактерий, что препятствует поиску аналогичных белков у изучаемого нами организма. Однако следует отметить, что хотя масс-спектроскопия MALDI-TOF является довольно мощным методом протеомики, ее применение обосновано для идентификации белков, имеющих продолжительные консервативные аминокислотные последовательности.

I—.—I—.——I—. ГР I—.—I—г-1^—.—■

20 <40 во ГО 100 120 «40 «0 100 20® 220 И0 2вО ЙВО 300 СапЗ С. Г.

ТТЛ!-!-1—ГП—I-n-1—ГШ ГП Г

: г | г 1 1 1-1

( 1 1 1 20 « СО so 100 120 440 1ео 100 200 1 220 Г 1 1 240 20С

"П Т 1 1 1 1 1 1 11 II II 1 "I 1 1

1 -1 '1 20 <10 ео 00 100 120 МО 100 МО 200 220

1 " " ИМ tin 1 1II I I II ■ II 11 ' ■ 1111 VI 1 1,

га 40 ад 80 (00 120 1« «0 Ш 200 220 240 200

ТТТГСП—I—Г~Т

ЕсаАА v. ЕсаА 7942 а-СА Н. s.

Рис. в. Сравнение профилей трипсинюяцм* различных карВоаигидраэ а-тила. Расчетные данные модупя Protean программы ¡.aserGeoa (Drtaetar Corp.). Серые боксы показывают локализацию консервативных участков аминокислот ых последовательностей. С. г, -Cftamydoownas relnhardtlr, A.v. - Anabaana variabilis; 7842 - Sy/weftococcws ер. PCC 7042; H. а - Human sapiens.

В то же время, гомология первичной последовательности различных КА даже в пределах одного класса довольна низка, поскольку консервативными в данном случае являются только аминокислоты, формирующие активный центр фермента. Поэтому гипотетические пептидные профили трипсвнизации, соответствующие этим белкам, сильно отличаются друг от друга (рис.

9), из чего можно заключить, что применение MALDI-TOF масс-спектроскопии для идентификации КА может не принести ожидаемого результата. Тем не менее, впервые полученный нами пептидный профиль карбоангидразы с помощью MALDI-TOF масс-спектроскопии, представляет собой значительный интерес для протеомики.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фермент КА является довольно широко распространенным в природе. Биологическая роль КА, определяемая катализом реакции гидратации-дегидратации углекислоты, весьма разнообразна. Функция этого фермента в живой клетке состоит либо в регулировании процессов удаления или поставки С02/НС03" во многих эвзиматических реакциях, либо в поставке этих субстратов для переносчиков при их транспорте через клеточные мембраны (Пронина, 2000; Smith & Ferry, 2000), Выполняя эти функции, фермент принимает участие, в том числе и опосредованное, в самых разнообразных процессах жизнедеятельности. Для многих эукариотических водорослей, протист, а также животных организмов известны примеры кальцификации с участием КА (Furla et al., 2000, Qufroga & Gonzalez, 1993). Эукариотам свойственны механизмы внутриклеточного отложения карбоната кальция, обусловленные функционированием фермента во внутреннем пространстве клетки. В отличие от них, прокариоты откладывают кальций вне клетки, и, следовательно, здесь необходимо участие внеклеточной КА. Представляется вполне вероятным, что фермент, локализованный в наружных слоях клетки, может участвовать в минерализации цианобактерий. Таким образом, ферментативная активность КА могла способствовать и образованию строматолитов докембрия.

В настоящее время хорошо установленным фактом является участие КА в процессе автотрофной ассимиляции неорганического углерода (Q) в цнанобактериях. Считается, что функция внеклеточных форм фермента а-ЕсаА и р-ЕсаВ связана с транспортом Q из среды в клетку и состоит в образовании СОг и/или НСО/ - субстратов для переносчиков углерода, локализованных в цитошазматической мембране; в то время как внутриклеточные р-КА IcfA и СсаА, входящие в состав карбоксисом, участвуют в генерации С02 в месте его фиксации РБФК (Kaplan & ReînJiold, 1999).

Установленная нами локализация фермента сс-тигга в гликокаликсе М. сЫНопорШез не вызывает сомнения. Обнаруженные, по крайней мере, две КА р-типа, могут находиться как в глнкокаликсе, так и в пери плазматическом пространстве клеточных оболочек цианобактерии, В пользу этого предположения свидетельствуют полученные нами данные о зависимости активности внеклеточных КА от рН внешней среды.

Общая схема, отражающая роль наружных КА в фотосинтетнческой ассимиляции С1 у М сЫЬопор\шех и связь зтого процесса с отложением карбоната кальция показана на рис. 10.

янчшнвя |»нпги}ипйтлчныи периплдзмя среда cnaii |>Н >0 (+<7,5-«

рНВ

со, <.........

НСО,- —

( Са2+ Са<НСО,Ь 1

СаСО,

« СО/

'НСО3-

цитоплши рН7

It

-нсо

Itl

Н* \

!ЖА

♦HCOj*

он-

кацбчксисома

Рис. 10. Роль наружных КА в фотостггетической ассимиляции неорганического углерода у М. chthonoplastes и связь этого процесса с внеклеточным отложением карбоната кальция.

рН внешней среды, равный 8, соответствует морским условия обитания, при которых наблюдается отложение CaCOj на поверхности М, cMbonoplastes.

При сильнощелочных значениях рН содовых озер (около 10), весь растворенный в воде С; присутствует в виде карбоната и бикарбоната. Для цианобактермй показано существование нескольких систем переноса HCOj" (Badger & Price, 2003), Большая часть бикарбоната, утилизированного клеткой вне зависимости от механизма его транспорта, поступает в карбоксисому, где при помощи внутриклеточной КА Р-типа превращается в СО2 для последующей фиксации РБФК. Однако, часть поступившего в клетку НС03" может спонтанно превращаться в С02 еще до фиксации при фотосинтезе по

уравнению Гендерсона-Хассельбаха (Пронина, 1992), вследствие более низких значений внутриклеточных рН по сравнению с окружающей средой. Ранее нами было показано, что цитонлазмапгический рН алкалофилов находится в нейтральной области (Куприянова с соавт., 2003). Образовавшаяся углекислота должна «вытекать» из клетки по градиенту концентрации, а находящиеся в клеточных оболочках КА а-и р-тигса могут препятствовать этой утечке, превращая С02 обратно в бикарбонат и поставляя его дня переноса через мембраны цианобактерии (рис. 10).

При рассмотрении связи фотосинтетической ассимиляции Q с отложением кальция необходимо иметь в виду условия обитания, близкие к морским (рН около 8), дня которых показаны примеры минерализации М. chthonopJastes (Герасименко, 2002), Как известно, строматолитобразование в содовых озерах не происходит вследствие того, что при сильнощелочных рН кальций исчезает из раствора как макрокомпоненг и отлагается на дне в виде химически осажденного СаСОз (Заварзин, Жилина, 2000).

Оба известных для клеток цианобактерий механизма утилизации бикарбоната связаны с подщелачиванием околоклеточного пространства. Утилизация бикарбоната может происходить (I) в обмен на выделение гмдроксила в окружающую среду (McConnaughey, 1994), и/или (2) быть связанной с симпортом ионов натрия (Badger & Price, 2003). Последнее приводит к подщелачивайию цитоплазмы и активации вслед за этим На+~АТФазы, важного компонента рН-стата цитозоля алкалофилов, осуществляющего обмен Na+ на протон из окружающей среды (Пагис, 2003). Таким образом, оба механизма утилизации бикарбоната ведут в конечном итоге к увеличению рН околоклеточного пространства, что схематически отражено на рис. 10.

Достижение рН околоклеточных слоев значений, выше 9, будет приводить к образованию гранул карбоната кальция на гликокаликсс цианобактерии, при наличии свободного Саг+ в окружающей среде. Таким образом, фотосинтетическая ассимиляция Q клетками М. chthonoplastes будет сопровождаться их минерализацией. Роль КА сводится к стабилизации рН в околоклеточном пространстве и поддержании концентрации субстрата (НС03~), необходимого как для обеспечения фотосинтеза, так и отложения СаС03.

Подобный механизм минерализации циано~бактериал ьных сообществ мог иметь место и в докембрии при формировании толщ древних строматолитов. Однако остается неясным, происходил ли он при участии наружной а-КА или же обеспечивался работой ферментов других классов. Считается, что а-класс КА является самым молодым,

эволюционировавшим из общего родового гена лишь 0,5-0.6 млрд. лет назад, поскольку он обнаруживается главным образом у млекопитающих (Smith & Ferry, 2000). В то же время, наличие а-КА у исследуемого нами реликтового организма - М. chthonoplastes, возраст которого, согласно палеонтологическим исследованием, составляет более 3.5 млрд. лет (Сергеев, 1992), может указывать на такое же древнее происхождение а-класса КА, как р-, и у-классов этого фермента.

ВЫВОДЫ

1. Показано наличие активности КА во фракции клеточных оболочек, а также в интаклшх клетках Microcoleus chthonoplastes, что свидетельствует о наличии у него внеклеточного фермента, имеющего доступ к наружным С02/НС03" - субстратам.

2. Для наружных КА показана высокая максимальная активность в области высокощелочных рН (около 10), характерных для среды обитания М. chthonoplastes, и пик ферментативной активности в области рН 7.5.

3. С помощью Вестерн блоттинга с афинно очищенными антителами против белка Cah-З (а-КА), а также антителами против р-КА из разных организмов, установлено наличие в клеточных оболочках М. chthonoplastes КА а - и Р-типов.

4. Внеклеточная К А а-типа М chthonoplastes локализована в гликокаликсе цианобактерии.

5. Cah-З - подобная КА М, chthonoplastes характеризуется молекулярной массой около 34 кДа и изоэлектрической точкой в области pi 3.5.

6. Получен пептидный профиль а-КА с использованием метода MALDI-TOF масс-спектроскоп и и.

7. Предложена схема участия внеклеточных КА М, chthonoplastes в фотосиатетической ассимиляции углерода и связи этого процесса с отложением СаС03 при минерализации циано-бактериального мата, учитывающая локализацию КА в наружных слоях цианобактерии и градиенты рН в окружающей среде и различных компартмеитах клетки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куприянова, Е.В., Мишина, И.М., Пронята, H.A., Семенепко, В.Е. (1997) Изменение внутриклеточного pH при адаптации Dmaliella salina к DiO. Тез. 3-го ежегодного симп. «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» Москва. Июнь 27-28,1997. с. 24.

2. Жила, U.M., Куприянова Е.В., Пронина, H.A. (1999) Локализация тилакоидной карбоангидразы в клетках Cklamydomonm reinhardtií Тез, IV Съезда Общества физиологов растений России. Москва. Октябрь 4-9,1999. с, 292-293.

3. Мишина, И.М., Алексеева, С.Г., Куприянова, Е.В., Пронина, II.A.

(1999) Изучение адаптации Chlorella sp. К к высокодейгерированным культу рал ьным средам с помощью 3|Р-ЯМР спектроскопии. Тез. конф. «Наукоемкие технологи и-9 9». Москва. Октябрь 25-29,1999.

4. Куприянова, Е.В., Жила, Н.М., Ладыгин, В.Г., Пронина, H.A.

(2000) Идентификация карбоангидразы в хлорофилл-белковых комплексах Chlamydomonas reinhardtii. Тез. школы-конф. «Горизонты физико-химический биология». Пущино, Май 28 -июнь 2,2000. с. 312-313.

5. Пронина, H.A., Куприянова, Е.В., Герасименко, Л.М., Заварзин, Г.А. (2000) Роль карбоангидразы цианобактерий во взаимодействии циклов неорганическою и органического углерода. Тез. нац. конф. с межд. участием «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии». Пущино. Ноябрь 20-24,2000. с. 46-47.

6. Пронина, H.A., Куприянова, Е.В., Герасименко, JI.M., Заварзин, Г.А. (2000) Локализация и свойства карбоангидразы алкалофильных цианобактерий. Тез. межд. конф. «Автотрофные микроорганизмы». Москва. Декабрь 13-15,2000. с. 152.

7. Куприянова, Е.В., Лебедева, IÍ.B,, Пронина, H.A., Лось, ДЛ.

(2001) Различные формы карбоаыгидраз в клетках цианобактерий. Тез. межд. симп. «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология». Москва, 18-21 ноября. Минск, 22-24 ноября. 200 I.e. 90-91,

8. KoHprianova, E.V., Lebedeva, N.V., Pronina, N.A. (2001) The a-type carbonic anhydrase is found in glycocalix of the alkalophilic cyanobacteriiim Microcoleiis sp. Abstr, Intl. Symp. «Plant under environmental stress», Moscow. October 23-28,2001, c. 139.

9. Кои pria o ova, E.V., Lebedeva, N.V., Dudoladova, M.V., Zhila, N.M., Pronina, N.A. (2002) The role of a-type carbonic anhydrase in accumulation of inorganic carbon and regulation of photosynthesis. Тез. XVII Путинских чтений по фотосинтезу и межд., конф. «Первичные процессы фотосинтеза в бактериях и фотосистеме 2 растений». Пущино, 2002.

10. Пронина, H.A., Аллахвердиев, С.И., Куприянова, Е.В., Клячко-Гурвич, Г.Л. Климов, В.В. (2002) Локализация карбоангидразы в субхлоропластных частицах гороха. Физиология растений 49: 341349.

11. Куприянова, Е.В., Дудоладова, М.В., Лебедева, Н.В., Маркелова, А.Г., Герасименко, Л.М., Заварзин, Г.А., Пронина, H.A. (2003) Возможное участие экзогенных карбоангидраз в цнскальцификации алкалофилъных цианобактерий. Тез. второй межд. конф. «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии». Пущино. Июнь 16-20,2003. с. 68-70.

12. Куприянова, Е.В., Маркелова, А.Г., Заварзин, Г.А., Пронина, H.A. (2003) Карбоангидразы строматолит-образующей цианобактерии Microcoleus chthonoplastes. Тез. V Съезда Общества физиологов растений России и межд. конф. «Физиология растений ~ основа фитобиотехиологии». Пенза. Сентябрь 15-21,2003. с. 52.

13. Куприянова, Е.В., Лебедева, Н.В., Дудоладова, М.В., Герасименко, Л.М., Алексеева, С.Г., Пронина, H.A., Заварзин, Г.А. (2003) Активность карбоангидраз у алкалофильных цианобактерий содовых водоемов. Физиология растений 50: 598-606.

14. Куприянова, Е.В., Маркелова, А.Г., Лебедева, Н.В., Герасименко, Л.М., Заварзин, ГЛ., Пронина, H.A. (2004) а-карбоанпшраза алкалофильной цианобактерии Microcoleus chthonoplastes локализована в гликокаликсе. Микробиология 73: - в печати.

Издательство ЦПИ при механино- м атемати песком факультете МГУ им- М.В. Ломоносова,

Подписано в печать // ¡№03-1. _ Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. /.¿¿Г Тираж //0 экз. Заказ 4 /

Лицензия на. издательскую деятельность ИД В 04059, от 20.02.2001р.

Отпечатано с ор игнкал-макета на типографском оборудовании механико-математического факультета и Франко-русского центра им. A.M. Ляпунова.

г/Ч-

»2070^