Клеточная и молекулярная организация СО2 концентрирующего механизма в фотосинтезирующих клетках

Пронина, Наталия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточная и молекулярная организация СО2 концентрирующего механизма в фотосинтезирующих клетках
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Клеточная и молекулярная организация СО2 концентрирующего механизма в фотосинтезирующих клетках"

£8 ОВ 92

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ПРОНИНА Наталия Александровна

КЛЕТОЧНАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ С02 КОНЦЕНТРИРУЮЩЕГО МЕХАНИЗМА В ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ КЛЕТКАХ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Отделе внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева Российской Академии Наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Ю.Г. Молотковский Т.Е. Кренделева А. К. Романова

Ведущая организация: Ботанический Институт им. В.Л.Комарова Российской Академии Наук

/ГУ,

Защита состоится " п ' " июня 1992 г. в /с~ час. на заседании Специализированного Совета Д.002.45.01 по защите диссертаций на соисканис ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологи! растений им.К.А. Тимирязева РАН (127276, Москва, Ботаническая ул., 35]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Ю.В.Балнокин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'¿^^^ТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Теория фотосинтетической продуктив-Н02ТЙТ сформулированная A.A. Ничипоровичем, сложилась на основе многолетних и разносторонних исследований, проведенных плеядой отечественных и зарубежных исследователей. Достаточно большое внимание в ней уделено факторам, определяющим и лимитирующим фотосинтетическую продуктивность растений.

Важная задача современной экспериментальной биологии - изучение внутриклеточных регуляторных реакций, выявление физиологических функций и звеньев обмена, взаимосвязь которых определяет потенциальную продуктивность растений и их возможность рационально использовать свет, элементы почвенного и воздушного питания.

В настоящее время в специальных обзорах и монографиях хорошо обсуждены основные принципы биохимической адаптации растений (Хо-чачка, Сомеро, 1977, 1988, Трунова, 1984) . Среди последних особый интерес представляют механизмы биохимической адаптации растений к воздействию низкой концентрации С02 (Alzavra. Mlyachl, 1986; Price, Omata, 1988; Пронина, Семененко, 1991).

Низкая концентрация углекислоты в атмосфере нашей планеты является одним из глобальных, постоянно действующих факторов, ограничивающих фотосинтетическую продуктивность растений. Тем не менее фотосинтетические характеристики показывают, что растения способны адаптироваться к этому фактору и увеличивать эффективность утилизации С02 путем концентрирования неорганического углерода (НУ) в клетках и центрах карбоксилирования.

Открытие в 60-х годах С-4 пути фотосинтеза позволило показать, что С02 концентрирующий механизм функционирует у некоторых наземных высших растений и основан на увеличении отношения С02/02 в зонах карбоксилирования. В настоящее время накопилось достаточно данных о существовании механизма концентрирования неорга-

Сокрщения: КА- карбоангидраза, мсКА - мембраносвязанная карбоангидраза. рКА - растворимая карбоангидраза, НУ - неорганический углерод, L-C02 cells - клетки, выращенные при низкой концентрации (0,03%) С02, Н-С02 cells - клетки, выращенные при высокой концентрации (2%) С0г, ПП - периплазматическое пространство.

нического углерода у растений, метаболизирующих углерод по С-3 пути фотосинтеза. Пока существование этого механизма хорошо обосновано для многочисленной группы одноклеточных фотосинтезирующих организмов, обитающих в водной среде и составляющих важное звено биосферы, на долю которого приходится не менее половины всей фо-тосинтетически образованной биомассы Земли.

Фотосинтезирующие клетки микроводорослей являются чрезвычайно удобным объектом для исследований в области физиологии,. биохимии и молекулярной биологии в силу целого ряда причин. К последним относятся простота организации, что позволяет исследовать адаптивные перестройки микроводорослей, в отличие от высших растений, на клеточном уровне, возможность культивирования в интенсивных полностью контролируемых условиях, относительная простота механизмов репродукции и передачи генетической информации, а также возможность получения генетических модификаций и мутантов. Вместе с тем, микроводоросли являются эукариотическими организмами, структурно-функциональная организация которых сходна с таковой у высших растений. Благодаря своим отличительным особенностям микроводоросли сыграли важную роль в изучении многих сторон фотосинтеза и вполне понятным является интерес к этим объектам и в настоящее время, в частности при изучении механизмов утилизации углекислоты.

Ограничение фотосинтеза связано не только с внешними условиями роста растений в атмосфере низких концентраций углекислоты в воздухе и находящимся в равновесии с ним низким содержанием С02> растворенного в воде, но определяется также и внутриклеточными, факторами. Хорошо известно, что рибулозобисфосфаткарбоксилаза/ок-сигеназа (РБФК/0) имеет низкое сродство к С02, Км которой составляет у микроводорослей 30- 50 цМ. а у цианобактерий около 300 д М (Мгама. М1уасЬ1,1986). Кроме того сродство РБФК/0 к С02 подавляется альтернативным субстратом - кислородом, который выделяется в-значительных количествах при световых реакциях фотосинтеза.

Тем не менее, микроводоросли, выращенные в естественных условиях, характеризуются высоким фотосинтетическим сродством к С02. Значение полунасыщающей фотосинтез концентрации С0£ для многих видов микроводорослей и цианобактерий составляет менее 1 д М, т. е. на порядок ниже концентрации растворенного С02 в воде (10/1 М С02

при равновесии с воздухом) и на несколько порядков ниже Км(С02) РБФК/0.

Анализ этих фактов привлек в конце 70-х начале 80-х годов значительный интерес отечественных (Семененко и др., 1977, 1979; Косицин, 1977; Пронина и др.. 1977. 1981; Романова. 1980; Бородин и др..1983, Рамазанов и др. 1984. Алиев, Гулиев, 1985) и зарубежных (Reed, Graham, 1977, 1979; Mlyachl et al, 1979, 1983; Badger. Kaplan, Berry. 1980; Spalding,- Ogren. 1982, 1983; Аврамова и др.. 1984; Moroney et al. 1985) исследователей к изучению биохимических процессов и регуляторных реакций, которые лежат в основе адаптации фотосинтезирующих клеток к условиям углекислотного ограничения, и позволил в настоящее время сформулировать концепцию о существовании С02 концентрирующего механизма у микроводорослей, утилизирующих углерод по С-3 пути фотосинтеза. В деталях механизм накопления неорганического углерода и концентрирования C0g в хло-ропластах остается неясным, тем не менее, многие физиологические, биохимические и, в последние годы, молекулярно-биологические исследования позволяют приблизиться к пониманию общей организации такого механизма.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: Основной целью настоящей работы явилось изучение механизмов утилизации низких концентраций углекислоты клетками микроводорослей и адаптивных реакций фотосинтезирующих организмов к условиям углекислотного ограничения, а также исследование клеточной и молекулярной организации СО,, концентрирующих систем в фотосинтезирующих клетках.

Достижение цели исследования потребовало решения следующих основных задач:

1. Изучить физиологическое проявление С02 концентрирующего механизма по активности фотосинтетического аппарата микроводорослей в зависимости от условий С02 обеспечения, интенсивности света и сопряженного действия этих факторов.

2. Выяснить механизмы утилизации НС03~ и способность клеток к ассимиляции экзогенного бикарбоната, который может служить дополнительным источником неорганического углерода при его концент-

рировании в фотосинтезирующей клетке.

3. Выяснить роль карбоангидразы и компартментации этого фермента в индукции C0g концентрирующего механизма, генерации и фиксации С02.

4. Охарактеризовать молекулярную организацию С02 концентрирующего механизма и кинетические свойства различных форм карбоангидразы фотоавтотрофных клеток микроводорослей.

5. Исследовать клеточную организацию карбоангидразной системы у представителей различных таксономических групп микроводорослей и их мутантов в зависимости от условий углеродного обеспечения. структурной организации фотосинтетического аппарата и pH градиента в различных компартментах клетки.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Б диссертационной работе выдвинуты и экспериментально обоснованы новые представления о существовании в фо-тосинтезирующих клетках карбоангидразной системы, включающей растворимые и мембраносвязанные формы фермента. Детально изучены организация карбоангидразной системы у различных таксономических групп микроводорослей, физиологические и биохимические свойства, регуляция синтеза различных форм карбоангидразы, а также адаптивные перестройки их активности в зависимости от источника и условий С02 обеспечения, а также интенсивности света. Развито представление о наличии в клетках микроводорослей конститутивных и ин-дуцибельных форм КА. Полученные данные восполняют пробел информации об организации С0£ концентрирующего механизма и показывают необходимость полностью сформированной карбоангидразной системы, включающей мембраносвязанные (мсКА) и растворимые (рКА) формы фермента, для функционирования процессов накопления неорганического углерода в фогосинтезирующих клетках и для превращения этого пула в форму, необходимую для карбоксилирования.

Показано, что мсКА у Chlorella, Chlamydomonas и Dunallella является прочно встроенным интегральным белком плазмалеммы и ти-лакоидных мембран. Установлено, что мсКА Chlamydomonas входит в состав полипептидных комплексов фотосистем хлоропласта. Исследована регуляция синтеза мсКА и рКА в клетках Chlorella и показано, что синтез рКА, индуцибельной низкими концентрациями С02, контролируется ядерным геномом клетки.

Впервые вскрыта роль света при включении механизма концентрирования неорганического углерода и индукции активности индуци-бельной низким содержанием С02 формы КА в клетках микроводорослей.

Показано, что способность утилизировать бикарбонатный ион из среды свойственна многим видам микроводорослей, принадлежащих к родам Chlorella и Scenedesmus, и разработана математическая модель, описывающая накопление НУ в клетках эукариот, центральным элементом которой является активный транспорт бикарбоната через плазмалемму, а также модель генерирования С02 из бикарбонатаого пула строки хлоропласта, в которой ключевую роль играет мсКА, локализованная в тилакоидных мембранах, и светоиндуцированный градиент протонов в люмене хлоропласта.

Полученные экспериментальные данные и сделанные на их основе обобщения позволили сформулировать представление о клаточной и молекулярной организации С02 концентрирующих механизмов в фото-синтезирующих клетках, как целостных интегрированных системах. Предложенные модели механизмов концентрирования, генерации и фиксации С02 в хлоропласте микроводорослей учитывают наличие активного транспорта НУ, индукцию карбоангидразы. как элемента С02 концентрирующей системы, pH клеточных компартментов, а также внутриклеточную локализацию и топологию КА, РБФ-карбоксилазы и фотохимических систем хлоропласта.

НАУЧНАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ: Сформулированная в работе концепция о механизмах концентрирования С02 расширяет представления о фотосинтетическом метаболизме углерода, рассматривая первичные процессы утилизации, трансмембранного переноса, внутриклеточного накопления и концентрирования НУ в хлоропласте. Становится ясным, что механизм концентрирования С02, включающий метаболические пути неорганического углерода до включения его в органические продукты, является важным регуляторным звеном жизнедеятельности фотосинтезирующей клетки, сохранения ее гомеостаза и адаптации к условиям углекислотного обеспечения.

Практическая реализация исследований заключается в разработке способов культивирования микроводорослей в условиях углекислотного ограничения, а также на бикарбонатсодержащих средах (Про-

нина и др., 1991), что значительно снижает себестоимость биомассы и является новой ресурсосберегающей технологией. Разработанные в ходе проведенного исследования методические приемы могут использоваться для диагностики физиологического состояния клетки и создания регламента углекислотного режима культивирования микроводорослей, которые широко исследуются как объекты для биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов и находят все большее применение в практике народного хозяйства (Семененко, 1985, Дилов, 1985).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Результаты исследований по теме диссертации доложены (или представлены) и обсуждены на:

- Всес.• конф. по регуляции биохим. процессов у микроорганизмов (Пущино, 1972),

- Межд.симп."Рост микроорганизмов на С1 соединениях"(Пущи-но,1977),

- Научно-координационном совещ. СЭВ "Хлорофилл-белковый комплекс" (ВНР, Сегед, 1977),

- семинарах ИФР БАН (София, 1977, 1979, 1986),

- 4-м Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979),

- Конференции молодых ученых ИФР АН СССР (Москва. 1978),

- "Круглых столах", посвященных исследованиям механизмов концентрирования С02 в растительных клетках (Ленинград, 1979, Душанбе, 1982, Минск, 1990),

- Всес. совещ. по вопросу круговорота веществ в замкнутых экологических системах (Киев-Канев, 1979,1981,1983),

- Всес. совещ. "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе" (Пущино, 1981),

- Межд. конф. "Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С-3 растениях (Таллин, 1983),

- Межд.симп. "Минеральное питание растений и фотосинтез"(НРБ, Варна, 1987),

- Всес научн, конф. "Физико-химическая биология и биотехнология фототрофных микроорганизмов" (Москва, 1987),

- Конференции Федерации европейских обществ физиологов растений ГЕБРР (Югославия, 1988),

- Международном конгрессе по фотосинтезу (Стокгольм 1989),

- Всес. конф. "Преобразование световой энергии в фотосинтези-

рующих системах и их моделях" ( Пущино, 1989),

- Втором съезде ВОФР (Минск, 1990),

- Конференции, посвященной 100-летию ИФР АН СССР (Москва 1990).

- Международном совещании "Метаболизм углерода и азота при фотосинтезе" (Пущино, 1991),

- Международном симпозиуме "Фотосинтез и стресс" (Чешские Буди-евицы, 1991),

- Международной конференции "Итоги и перспективы энзимологи-ческих исследований метаболизма углерода при фотосинтезе" (Душанбе. 1991).

- Расширенном семинаре ИФР РАН (Москва. 1991)

ПУБЛИКАЦИИ: По материалам диссертации опубликовано в отечественных и зарубежных научных изданиях 42 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе .широко использовали одноклеточные водоросли, принадлежащие к родам Chlorella. Scenedesmus. Dunallella и Chlamydomonas. Список использованных штаммов и характеристика отдельных мутантов с указанием коллекции, из которой они получены приведена в таблице 1.

Культивирование водорослей проводили в накопительном или проточном режимах в стерильных условиях при постоянном освещении, оптимальной для каждой культуры температуре и непрерывном барбо-тировании суспензии газо-воздушной смесью с 2 % или воздухом с 0.03 % С02 (Владимирова, Семененко, 1962).

Синхронную культуру Chlorella sp К. получали методом программированного свето-темнового режима (Цоглин. Клячко-Гурвич, 1980).

Скорость роста и продуктивность культур определяли по числу клеток и накоплению сухой массы (Владимирова, Семененко, 1962).

Интенсивность фотосинтеза определяли по выделению 02 амперо-метрическим методом (Семененко и др. 1972) и по поглощению С02 с помощью оптикоаккустического газоанализатора 0А-2209 (Семененко и др. 1966), а также по включению меченого углерода (Георгиев," Ав-рамова,1977). Углекислотные кривые фотосинтетического выделения

Таблица1

Перечень штаммов и мутантов, использованных в работе

Название штамма

Коллекция

Примечание

Chlorella

С. sp К. С. elllpsoldea С. pyrenoldosa С. pyrenoldosa 82 vulgaris С-3 Scenedesmus obllquus

С.

IPPAS IPPAS IPPAS IPPAS ИФР БAH

IPPAS

s. accumlnatus IPPAS

s. acutus M. ИФР БAH

s. acutus 508 Dunaliella ИФР БAH Лишенный клеточной стенки мутант Sc. acutus M.

D. salina teod.D-209 IPPAS

D. terrícola IPPAS

D. salina teod. B-63 ИФР БAH

Chlamydomonas

C. relnhardtll 137+ IPPAS

C. relnhardtll CW-15 IPPAS Лишенный клеточной стенки мутант С.relnhardtll 137+

C. relnhardtll K+ ИПФС PAH Мутанты,сохранившие только

C. relnhardtll ACC-14 tl ФС1

c. relnhardtll ACC-66 l( ФСП

c. relnhardtll CC-107 tl ФС1 + ФСП

c. relnhardtll A-66-90-1 tt LHCP I

c. relnhardtll БФ-5-16 H LHCP II

c. relnhardtll БФ-5 II LHCP 1+ II

c. relnhardtll 137 mt+ MSU, США

c. relnhardtll CIA-3 II С0г резистентный мутант

c. relnhardtll CIA-5 It С02 резистентный мутант

02 измеряли с использованием электрода Кларка в клеточной суспензии объемом 4 мл в фосфатном буфере, освобожденном от C0g. Реакцию начинали добавлением соответствующего количества бикарбоната (Демидов, Бородин, 1983).

Дезинтеграцию клеток проводили в гомогенизаторе со стеклянными бусами (Семененко, Касаткина, 1972).

Фракционирование бесклеточного гомогената на фракции растворимых белков и нерастворимых клеточных компонентов осуществляли центрифугированием при 18 тыс. g 1 ч или 100 - 140 тыс. g 1 ч в зависимости от поставленной задачи.

Выделение субклеточных фракций и фрагментов хлоропластов проводили в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Полученные фракции выделяли с помощью системы для фракционирования фирмы "Isco" США по поглощению при 2-х длинах волн 660 нм и 280 нм с автоматической регистрацией.

Активность КА (КФ 4.2.1.1.) определяли электрометрическим методом с помощью микропроцессора-ионолайзера М-901 и принтера М-951 по:

1) времени реакции необходимого для сдвига рН на 0,5 или 0.1 единицы и рассчитывали в единицах Вильбура-Андерсена по формуле (Rlckll et al, 1964).

2) по изменению концентрации Н+ за единицу времени, и рассчитывали в М мин-1 на мг белка, хлорофилла или сухой массы.

Количество рибулозобисфосфашарбоксилазы (ES 4.1.1.39) определяли методом ракетного иммунофореза (Касаткина, Веденеев, 1983).

Содержание белка оценивали спектрофотометрически по поглощению при 280 нм, а такжепо методи Лоури, Кьельдаля, Бредфорда.

Солюбилизацию мембранных белков проводили с помощью детергентов тритона Х-100, додецилсульфата натрия, цвитерионных детергентов, дигитонина, лауриловой кислоты и их смесей.

Выделение КА и очистку фермента из Dunallella salina проводили с использованием аффинной хроматографии на эпокси активированной сефарозе 6В с парааминометилбензенсульфонамидом в качестве лиганда. Выделение КА из комплекса проводили с помощью конкурентного вытеснения другим ингибитором фермента. Разрушение связи КА с ингибитором проводили диализом.

Концентрирование разбавленных препаратов белка осуществляли ультрафильтрацией через мембрану фирмы "Ат1соп". Для перевода препаратов из одного буфера в другой использовали диализ или высаливание (N114)2304 с последующим обессоливанием в нужном буфере.

Электрофорез в пластинчатом геле ПААГ использовали для характеристики полипептидного состава мембран и степени чистоты препаратов, полученных в процессе их выделения. Идентификацию КА в геле полиакриламида проводили при элюции фермента с геля и гистохимическим методом по флуоресценции комплекса КА с дансила-мидом.

Молекулярную массу полипептидов определяли с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ЬаеттИ, 1970).

Жирнокислотш состав липидов исследовали методом ГЖХ (Клячко-Гурвич и др, 1990).

Ингибиторнш анализ. В качестве ингибиторов белкового синтеза использовали циклогексимид (5 мкг/мл), хлорамфеникол (1 мг/мл), а-аманитин (4 и 20 мкг/мл), рифампицин (0,3 мг/мл). Как ингибиторы КА использовали ацетазоламид (0,1мМ и 10 мМ), этокси-золамид (0,05 мМ), дансиламид (0,1 мМ), парааминометилбензенсуль-фонамид, имидазол и некоторые другие.

ФИЗИОЛОГИЯ сог СИНДРОМА У МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

В естественных условиях обитания, когда концентрация С0г является фактором, ограничивающим фотосинтетическую продуктивность, микроводоросли увеличивают эффективность утилизации НУ путем концентрирования его в клетках и центрах карбоксилирования. При этом, как будет показано ниже, клетки микроводорослей характеризуются комплексом фотосинтетических параметров, свойственных в целом С-4 растениям. Это заключение привело в настоящее время к поискам термина, описывающего эти свойства у одноклеточных фо-тосинтезирующих организмов. В дальнейшем мы будем использовать предложенный Тсузуки и Миячи (1990) по аналогии С-4 синдромом термин С02 синдром для описания фотосинтетических характеристик микроводорослей, способных к накоплению НУ.

Как будет показано ниже, при высоких концентрациях С0г, ко-

торые используют при культивировании микроводорослей в лабораторных условиях, способность клеток накапливать НУ утрачивается, а последующее снижение содержания С02 в среде вызывает индукцию механизма концентрирования НУ.

1. Фотосинтетические характеристики клеток Chlorella в зависимости от условий углекислотного питания.

Важнейшей физиологической характеристикой индукции С02 концентрирующего механизма у микроводорослей является увеличение фотосинтетического сродства к C0g, т.е. уменьшение полунасыщающей фотосинтез концентрации С02 (Км) при адаптации клеток к недостатку углекислоты в среде.

Еще в 1952 г. Уайтингем отметил, что Ки(С02) фотосинтеза для Chlorella pyrenoldosa значительно ниже концентрации растворенного С02 в среде. Однако, эти данные, достаточно часто цитируемые в настоящее время, не получили тогда хорошего объяснения и остались незамеченными. Позднее расхождение между Км(С02) фотосинтеза, концентрацией С02 в наружной среде и Км(С02) РБФК было показано для многих видов микроводорослей и цианобактерий, на основании чего была выдвинута гипотеза о существовании С0£ концентрирующего механизма в клетках микроводорослей, которая в настоящее время получает все новые подтверждения как на физиологическом, так и на биохимическом и молекулярно-генетическом уровнях.

Сравнение углекислотных кривых фотосинтеза клеток Chlorella sp.K, выращенных при высоких насыщающих фотосинтез концентрациях С02 (Н-С02 cells) и при находящихся в равновесии с воздухом низких содержаниях С02 (L-C02 cells), показало, что L-C02 cells характеризуются более высокой скоростью фотосинтеза в области низких концентраций углекислоты по сравнению с Н-С02 cells (рис.1). При этом не наблюдается значительных расхождений в значениях максимальной скорости фотосинтеза у этих типов клеток.

Как видно из рис.2, при снижении содержания С02 в газовоздушной среде с 2% до 0,03% после первичного резкого падения отмечается постепенное увеличение скорости фотосинтетического выделения кислорода, что позволяет предположить индукцию концентрирования НУ в клетках Chlorella в этих условиях. Временные параметры

NaHCOg, мМ

Рис. 1. Зависимость скорости фотосинтетического выделения кислорода Chlorella sp.K от концентрации неорганического углерода.

Клетки выращены при высоких (1) и при низких концентрациях С02 без (2) и в присутствии 0,05 мМ этоксизоламида (3).

индукции механизма, увеличивающего фотосинтетическое сродство к C0g у L-C02 cells, а также величина этого эффекта зависят от многих факторов, определяющих фотосинтетическую продуктивность растений, таких,как температура, условия минерального питания и освещенность.

Исследование интенсивности фотосинтеза при адаптации клеток к низкому содержанию С0£ в широкой области освещенности позволило нам выявить факты,не отмеченные ранее (рис.3). В области высоких насыщающих фотосинтез интенсивностей света наблюдается значительный подъем плато световых кривых фотосинтеза по мере адаптации

Рис. 2. Изменение скорости фотосинтеза клеток Chlorella sp.K при снижении концентрации С02 в среде выращивания с 2% до 0,03% без (1) и в присутствии 1мМ ацетазоламида (2)

SO 120

Время, ч

юо гоо зоо 400 soo

Интенсивность света, Вт/м"2

Рис. 3. Световые кривые фотосинтеза клеток Chlorella sp.K, адаптированных к различным условиям угле-кислотного обеспечения.

1,2 - культура выращена при 2% С02, световые кривые измерены при 255 (1), при 0,03% С02 (2); 3. 4 -культура адаптирована к 0,03% С02, световые кривые измерены при 0,03% С02 через 45 мин (3), через 4,5 ч (4)

клеток к низкой концентрации С02. В области интенсивностей света ниже 100 Вт/м2 этот эффект незначителен. Не отмечается повышения эффективности фотосинтеза у клеток Chlorella, адаптированных к низкой концентрации С02 в темноте. Таким образом, из представленных данных видно, что необходимыми условиями для увеличения фотосинтетического сродства L-COg cells к С0г является низкая концентрация С0г и свет.

При адаптации клеток к снижению концентрации С02 отмечается не только увеличение эффективности фотосинтеза, но изменяются также и другие фотосинтетические характеристики. Клетки, выращенные или адаптированные к низкой концентрации С0£) характеризуются низким УКП, отсутствием эффекта Варбурга, отсутствием или низким фотодыханием и выделением гликолата, т.е. свойствами, характерными для С-4 фотосинтеза (Alzawa, Hlyachl, 1986; Prlece, Omata,1988).

Перечисленные выше характеристики явились хорошими доказательствами наличия механизма С02 концентрирования у микроводорослей, метаболизирующих углерод по С-3 пути фотосинтеза. Наиболее весомое свидетельство способности микроводорослей накапливать неорганический углерод в клетках было получено с развитием техники центрифугирования клеток через слой силиконового масла (Badger et al 1980), позволившей показать, что внутренние пулы неорганического углерода у L-C02 cells значительно (на 2 - 3 порядка) превышают содержание С0£ в среде. Внутриклеточная концентрация НУ у L-COg cells, в отличие от Н-С02 cells, оказалась намного выше, чем можно было бы ожидать при пассивной диффузии С02 через плазмалемму и последующем равновесном распределении между С02 и НС03" согласно внутреннему pH.

2. Участие карбоангидразы в индукции механизма С02 концентрирования.

В 70-х годах рядом исследователей было высказано предположение, что при лимитирующих концентрациях С02 существенная роль в процессах биохимической адаптации фотосинтезирующих клеток может принадлежать ферменту карбоангидразе (К.Ф.4.2.1.1.). который, катализируя обратимую реакцию гидратации диоксида углерода, может

играть важную роль в регуляции фотосинтетического и дыхательного метаболизма. Это предположение высказывалось как на основании аналогии участия КА в регуляции С02 и 0г газообмена у животных клеток (Пронина , 1982), так и в связи с установленным фактом об увеличении у некоторых микроводорослей активности КА при снижении концентрации C0g (Пронина и др. 1981; Graham et al 1971; Dohler. 1974; Ingle, Coleman. 1975; Tsuzukl, 1984). При этом отмечено, что активность фотосинтетических ферментов, включая РБФК, не изменялась (Berry et al. 1976; Reed, Graham, 1977; Kaplan et al.. 1980).

С;

J i

S 10 12 Вргмя, ч

Рис. 4. Влияние концентрации С02 на активность мембра-носвязанной и растворимой форм КА в клетках Chlorella sp. К

1- мембраносвязанная КА, 2- растворимая КА, со-

держание СО в воздухе:

(+С02) -2%,

(-С02)-0.03%.

На рис.4 представлены полученные нами данные по изменению активности КА у Chlorella sp.К в зависимости от концентрации C0g. Как видно из этого рисунка, активность КА существенно увеличивается при снижении и снижается при увеличении концентрации С02 в среде для культивирования микроводорослей.

Дальнейшие доказательства участия КА в индукции механизма С02 концентрирования у L-C02 cells были получены при изучении изменений активности КА и интенсивности фотосинтеза при действии таких важных для фотосинтеза факторов,как интенсивность света и концентрация С02. Нами (Пронина и др. 1981) впервые была показана

СО Ч

S 6-1 к

О 30 G0 90 Бремя, мин

Рис. 5. Изменение интенсивности фотосинтеза (1) и активности карбоангидразы (2) при адаптации клеток Chlorella к низкой концентрации С02 в условиях различной освещенности: 15 Вт/м2 (пунктир), 50 Вт/м2 (сплошная линия).

корреляция между изменениями активности КА и интенсивности фотосинтеза в клетках Chlorella и Scenedesmus при изучении сопряженного действия света и низкой концентрации углекислоты. Также как и фотосинтез, индукция активности КА у Chlorella при снижении концентрации С02 (рис. 5) зависит от интенсивности света, значительно увеличиваясь при высоких освещенностях. В условиях слабой освещенности клеток не обнаруживается значительного увеличения интенсивности фотосинтеза и активности КА у L-C0£ cells. При этом обращает внимание такой факт, что снижение концентрации С0£ в темноте не приводит к увеличению активности КА. также как и интенсивности фотосинтеза, о чем упоминалось выше.

Необходимость КА для увеличения фотосинтетического сродства микроводорослей при недостатке С02 показано также с помощью инги-биторного анализа. Подавление активности КА специфическим ингиби-16

тором фермента этоксизоламидом приводит к снижению фотосинтетического выделения кислорода и увеличению Кк(С0г) у L-CO cells (рис.1) и не оказывает влияния на Н-С02 cells.

Таким образом, опираясь на собственные данные и анализируя литературу о влиянии ингибиторов КА на фотосинтетические параметры, вызывающие увеличение Кн(С02), углекислотного компенсационного пункта, фотодыхания, выделения гликолата (Alzawa, Mlyachl, 1985), мы пришли к заключению, что КА является необходимым звеном утилизации низких концентраций С02 атмосферы и участвует в механизме С02 концентрирования. Необходимыми условиями для увеличения активности КА, также как и для индукции механизма C0g концентрирования, являются низкая концентрация С02 и свет. В дальнейшем исследования механизма индукции КА при снижении концентрации С02 показали, что решающее значение для синтеза фермента может иметь даже не концентрация С02, а соотношение С02/02 в газовоздушной среде (Рамазанов и др. 1986).

3. Биохимические и молекулярно-биологические подходы к изучению механизма С02 концентрирования.

Весомые доказательства участия КА в концентрировании НУ получены в последние годы с помощью С02 резистентных (C0ZR) мутантов, утративших способность к росту при низкой концентрации НУ воздуха и требующих для своего роста высоких концентраций С02 в среде (Spalding et al, 1983, 1989, Moroney et al, 1989).

На рис.6 приведены ростовые характеристики Chlamydomonas relnhardtii дикого типа и двух его C02R мутантов, любезно предоставленных нам Морони. Мутанты характеризуются слабым ростом, по сравнению с диким типом клеток, при выращивании на низких концентрациях С02, тогда как при высоких - эти различия незначительны.

Исследования фотосинтетических характеристик (рис. 7, 8) и активности КА (табл. 2) у этих штаммов показали, что,в отличие от дикого типа. C02R мутант С.relnhardtii CIA-3, нуждающийся в высокой концентрации С0£ для роста и лишенный активности КА в хлоропласте, не способен увеличивать эффективность утилизации НУ при снижении концентрации С0£ в среде. У клеток дикого типа в услови-

Рис. 6. Ростовые характеристики С. reinhardtii (дикий тип). CIA-3 и CIA-5 при выращивании культур при высоких (2%) и низких (0,03%) концентрациях C0g

ях низкой концентрации С02 отмечается увеличение скорости фотосинтеза, тогда как у мутанта CIA-3 такой адаптивный ответ отсутствует (рис. 7). Значения Км(С02) фотосинтеза у L-COg cells дикого типа значительно уменьшается по сравнению с Н-С02 cells (рис. 8 А), что свидетельствует об увеличении фотосинтетического сродства к С02 у Chlamydomonas, также как и у Chlorella (рис. 1). В отличие от дикого типа, у C02R мутанта С. reinhardtii CIA-3 такой адаптивный ответ отсутствует и Км(С02) L-C02 cells и Н-С02 cells у CIA-3 практически совпадают и даже превышают Км(С02) Н-С02 cells дикого типа (рис. 8 Б).

Как видно из табл. 2, в которой представлены характеристики C0gR мутантов С.reinhardtii, полученные рядом авторов (Spalding, 1990; Moroney, 1990; Suzuki et al. 1990; Price et al, 1990, Pronlna, Borodin, 1992), ингибирование способности клеток утилизировать низкие концентрации С02 связано с подавлением активности

Таблица 2

Характеристика С021? мутантов С. ге1гЛагсШ1

Штамм Рост

на воздухе

Накопление НУ на воздухе

Активность КА хпКА эксКА

Число индуцируемых белков

ОТ

ршр-1 са-1 С1А-3 С1А-5

+/-

+/-+/-

высокое низкое

очень высокое очень высокое низкое

высокая высокая 4

высокая высокая 2 низкая низкая

нет есть 4

есть нет нет

I и I и

Рис. 7. Изменение фотосинтетических характеристик дикого типа СЫатуаотопаз ге1гЛагс1Ш (А) и мутанта С1А-3 (В), утратившего способность расти при низких концентрациях С02, когда клетки, выращенные при высокой концентрации С02 (I), переносятся - на воздух (II).

Время адаптации 2 ч. Скорость выделения 02 измерена при 11 рМ С02 (заштрихованный столбик) и 786 цМ С02 (черный столбик), рН 5,8. КА путем мутагенеза, хотя у ряда мутантов сохранялась при этом способность к накоплению НУ в клетке. Полученные нами фотосинтетические характеристики штамма С1А-3, лишенного хлоропластной КА (рис. 7,8), указывают на важную роль этой формы КА в утилизации низких концентраций С02. Этот мутант интересен кроме того и тем.

— -X/

I/ I/

Рис. 8. УглекислоТные кривые фотосинтетического выделения кислорода в зависимости от 10>5 концентрации NaHC03 у L-C02 cells (сплошная линия) and Н-С02 cells (пунктирная линия) дикого типа С. relnhardtll (A) and COgR мутанта CIA-3 (В). Цифры на кривых обозначают время адаптации к 0,03% С02.

NaHC03, мМ

что, несмотря на отсутствие КА в хлоропласте и способности ассимилировать низкие концентрации С02, он накапливал НУ в клетках.

Среди полученных COgR мутантов (табл. 2), наряду со штаммами, утратившими КА. были выделены мутанты, не способные к накоплению НУ, у которых, как предполагается, нарушена система активного транспорта НУ ( Spalding et al, 1990).

Такой физиолого-генетический подход к исследованию механизма С02 концентрирования позволил получить новые данные не только о необходимости КА для увеличения эффективности фотосинтеза, но и исследовать генетический контроль этого механизма и вскрыть молекулярную организацию С02 концентрирующей системы. На рис. 9 обобщены современные представления о генетическом контроле механизма С02 концентрирования, которые основаны на изучении свойств C02R

нсо:

neo;

о,-

ЭТД " хлоропласта

ГЕНОМ

ХЛОРОПЛАСТА

psbA

ГЕНОМ ЯДРА

- ршр-1

• С1Л-5

- са-1 CIA-3

psbl

Рис. 9. Генетический контроль фотосинтеза и механизма С02 концентрирования у Шатуйотопаз. ршр-1 и С1А-5 - мутация связана с гипотетическим переносчиком НУ, са-1 и С1А-3 мутация связана с -КА локализованной в хлоропласте или периплазмати-ческом пространстве. (Аббревиатура остальных генов указана Уоко1а а1. 1987).

мутантов, утративших способность утилизировать низкие концентрации С02 и требующих для роста высоких содержаний углекислоты. Становится ясно, что для индукции накопления НУ необходимы не только низкие концентрации С02, свет, дополнительный синтез КА, но и способность к активному внутриклеточному транспорту НУ.

4. Экзогенные источники неорганического углерода.

Не возникает сомнений, что действие С02 концентрирующего механизма связано с дополнительным потоком НУ в клетки при выращивании их в условиях недостатка углекислоты. Расчеты показывают, что внутриклеточные концентрации НУ в таких клетках значительно превышают значения, которые могут быть достигнуты за счет пассивной диффузии С02 через плазмалемму. а также последующего равновесного распределения между С02 и НС03~ в соответствии с внутренним значением рН (Badger et al.. 1980; Relnhold et al, 1987; Miller et al., 1985,' 1991; Espíe et al, 1985, 1991; Frldlland. Pronlna, 1991). Эти данные, а также приведенные выше данные моле-

со

кулярно-биологического анализа, однозначно свидетельствуют в пользу существования активного транспорта НУ, обеспечивающего накопление НУ в клетке. Пока остается неясным, в какой форме НУ (С0г, НС03~ или С02 + НС03~) проникает в фотосинтезирующие клетки водорослей. Существует предположение, что, хотя С02 легче утилизируется. чем НС03" из среды,тем не менее, при индукции механизма С02 концентрирования НУ переносится через плазмалемму, по-видимому, в форме НС03".

В качестве модельных объектов для исследования механизмов транспорта НУ и определения экзогенного источника НУ могли бы служить два вида водорослей Chlorella и Scenedesmus, которые существенно различаются способностью ассимилировать. С0£ и НСО " (Osterlind et al,1952). Однако, проведенные нами (Аврамова, Пронина и др.,1984) исследования способности ряда микроводорослей, принадлежащих к родам Chlorella и Scenedesmus, ассимилировать экзогенный бикарбонат показали, что многие из них,. в том числе и Chlorella, могут использовать ион бикарбоната наряду с СО

На рис.10 показано, что продуктивность С. sp.K и S. acutus при выращивании на бикарбонатсодержащих средах при высоких pH

Рис.10. Продуктивность

Chlorella sp.K и Scenedesmus acutus при различных условиях выращивания. А- 0,03% С02; Б-светлый столбик - контроль (2% С0£). темный столбик- опыт (питание НС03"). Пунктиром выделены темновые (16ч) и световые (8ч) периоды адаптации, и- исходное (в начале адаптации) содержание сухой массы, к- содержание биомассы в конце светового периода адаптации, прирост сухой массы за время адаптации

1.5 1.0

0.5

к т 5

ГС

та

& 1.0

0,5

J Scenedesmus

А IБ

И п к ипкипкип

достигает значений, полученных при культивировании их в условиях насыщающих фотосинтез концентраций С02. Однако, необходимо отметить, что вследствие легкой взаимообратимости С02 /НС03" форма НУ, преобладающая в наружной среде и проникающая в клетку через плазмалемму, может не совпадать. В последнем случае, если реакция образования С02 из НС03" лежит на пути транспорта углекислоты, в клетке должна была бы возрастать роль наружной КА в ассимиляции экзогенного бикарбоната.

В связи с этим остается неясным значительное снижение активности КА в наружных мембранах при выращивании водорослей на би-карбонатсодержащих средах (Фурнаджиева. Пронина и др., 1990). Более того добавление в бикарбонатсодержащую среду ингибитора КА -ацетазоламида. непроникающего в клетку, не только не снижает продуктивность культур, но даже вызывает ее увеличение (табл. 3). Очевидно, снижение или ингибирование активности КА наружных мембран приводит к улучшению углеродного обеспечения клеток, позволяя исключить обратную десорбцию С02 из клетки, которая может иметь место в результате более высокого pH в среде, по сравнению с цитоплазмой.

Учитывая сходство адаптивных реакций карбоангидразной системы Chlorella и Scenedesmus при ассимиляции низких концентраций углекислоты и бикарбоната,можно заключить, что концентрирование НУ у L-C02 cells может быть связано с дополнительным потоком

Таблица 3

Влияние ацетазоламида на . накопление биомассы клетками Chlorella и Scenedesmus при ассимиляции экзогенного бикарбоната

Условия выращивания Прирост биомассы мг/мл

Chlorella Scenedesmus

12 12

Контроль (НС03") 3.75 2,20 1.58 2,57

Опыт (НС03" +1мМ АЗА) 3,95 2.68 2,42 2,90

Примечание. Представлены данные двух опытов (1.2).

НС03~. в котором КА периферических мембран не принимает участия. Математическое моделирование (Гг1сП1ап(3, Ргоп1па, 1992) процессов диффузии С0г и НС03" в окружающей клетку среде в присутствии и отсутствии КА, а также диффузии С02 и НС03" через клеточную оболочку в периплазматическое пространство, позволили нам также сделать вывод о существовании механизма активного транспорта НС03~ через плазмалемму. который подтверждает полученные нами и имеющиеся в литературе данные.

Очевидно, что при кислых рН среды, когда основное количество НУ в среде представлено в форме С02, КА может играть существенную роль в накоплении НУ в клетке путем образования НС03~ в компарт-ментах, имеющих щелочные значения рН. В этом случае поток НС03" в клетку или/и в хлоропласт может обеспечивать накопление НУ в клетке, превышающее содержание С02 в среде. Прямые доказательства наличия переносчиков НУ пока отсутствуют, неизвестна также их возможная локализация у эукариотических клеток в мембране хлоропласта или в наружных мембранах.

ОРГАНИЗАЦИЯ КАРБ0АНГИДРАЗН0Й СИСТЕМЫ В КЛЕТКАХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ.

I. Зависимость активности карбоангидразы от углекислотного и светового режима культивирования.

Долгое время КА считали растворимым ферментом, индукцию синтеза которого вызывает снижение концентрации С02 в среде. Проведенные нами в 1977 г. исследования локализации и распределения КА в клетках различных видов Chlorella позволили сделать 2 важных вывода, не отмеченных ранее. Во-первых, было показано, что КА обнаруживается у Chlorella и при культивировании клеток при высоких, насыщающих фотосинтез концентрациях С02 (рис.11). Во вторых, оказалось, что фермент при этих условиях культивирования полностью локализован во фракции нерастворимых клеточных компонентов и находится в мембраносвязанном состоянии. Эти данные позднее были подтверждены многими исследователями (Фирус, Романова, 1985, Mlyachl et al., 1986., Moroney et al., 1987: Huslc, Qulgley. 1990; Coleman et al.. 1991).

3 О

« О

Ез \

л Ен

8 я

РУ

Chlorella зР.к

vulgaris

enoldosa

elllpsoldea| ü

Scenedesmus

_acumlnatua_

acutus obllquus

■L _

Гошгенат

pKA CZJ мсКА

Рис.11. Распределение активности KA в неточных компонентах разных видов Chlorella и Scenedesmus. Культуры выращенны при 2Z С02.

Chlamydomonas

ЕВ Гокогенат И pKA CZD мсКА Рис.12. Распределение активности КА в клеточных компонентах разных видов Dunaliella и Chlamydomonas reinhardti i.

Культуры вырацэнны при 2Z С02.

Дальнейшие исследования показали, что существуют различные типы внутриклеточного распределения КА, свойственные разным организмам. Так, например, в отличие от видов Chlorella, у Н-С02 cells Scenedesmus (рис.11) КА преимущественно обнаруживается во фракции растворимых белков. В клетках Dunallella и Chlamydomonas (рис.12) активность КА определяется, как в растворимых, так и нерастворимых компонентах клетки.

Однако, уже из данных, приведенных в табл. 2, ясно, что для утилизации низких концентраций углекислоты необходима полностью сформированная КА система, включающая различные формы КА. Соотношения этих форм КА определяются видовыми особенностями штаммов и зависят от целого ряда факторов, таких, например, как концентрация С02 в среде, интенсивность света, температура, источник азотного питания.

Распределение активностей КА во фракциях растворимых и мембранных белков у Chlorella и Scenedesmus в зависимости от концентрации С02 и интенсивности света представлено на рис.13 и 14. У Chlorella при 2% С02 вся КА находится в мембраносвязанном состоянии. Активность этой формы КА зависит от интенсивности света, увеличиваясь в первые часы при высокой освещенности (рис.13). Дальнейшее снижение активности мсКА при увеличении интенсивности света связано с увеличением плотности культур и самозатенением клеток. При снижении концентрации С02 с 2% до 0,03% практически все увеличение суммарной активности КА, измеренной в бесклеточном гомогенате. обусловлено синтезом новой формы КА, локализованной во фракции растворимого белка. Это увеличение активности рКА не связано с солюбилизацией мсКА, поскольку активность последней не уменьшается, а даже несколько возрастает.

У Scenedesmus увеличение активности КА при снижении концентрации C0g также связано с синтезом дополнительной формы мсКА (рис.13). Как видно из рис 14, формирование КА системы у L-COg cells существенно зависит от интенсивности света.

Синтез рКА у L-C02 cells Chlorella определяется уровнем лимитирования фотосинтеза концентрацией С0£. Как видно из рис.15, наблюдается обратная корреляция между лимитированием фотосинтеза низким содержанием С02 в газовоздушной фазе и синтезом рКА. Обращает внимание тот факт, что углекислотная кривая клеток, не адап-

Chlorella

Scenedesmus

Ч б

J t z Время, v

В 24 Z Время, v

Рис.13. Динамика изменения активности КА Chlorella sp.K и Scenedesmus acutus при последовательной адаптации клеток к свету высокой интенсивности и к низкой концентрации С02. КА активность: А - при переходе от 15 к 150 Вт/м2, Б - при переходе от 2% концентрации С02 к 0.03% при 150 Вт/м2; 1 -гомогенат, 2 - мсКА. 3 - рКА, 4 - интактные клетки, 5 - накопление сухого вещества.

Рис.14. Динамика изменения активности КА Chlorella sp.K и Scenedesmus acutus при адаптации клеток к низкой концентрации С02 в условиях низкой освещенности (15 Вт/м2). Обозначения как на рис. 13.

<а m а> н к

К о о Е-О О

л Е-о о ж

СП S о я ш Ея

л Н о

0 X ш К Е-И

К)

<е к

300 «

Рис.. 15. Зависимость активности КА и тосинтеза от концентрации СО

5 [С021% интенсивности фо-

же.

1- активность КА; интенсивность фотосинтеза L-C0, cells (2) и Н-С02 cells (3). На вставке то Прирост интенсивности фотосинтеза вычислен по отношению к кривой 3, прирост активности КА отношению к значению активности при высоких концентрациях С0„.

тированных к пониженной концентрации С02 (кривая 3) и адаптированных в течение 5 ч после снижения концентрации С0£ (кривая 2); имеет различный характер. Возможно, что отсутствие линейной зависимости скорости фотосинтеза от концентрации С02 объясняется включением механизма С02 концентрирования при концентрациях С02 ниже насыщающих фотосинтез.

Эти данные и приведенные выше данные ингибиторного (рис.1) и молекулярно-биологического анализа (рис.7, 8) дали нам основание думать, что дополнительный синтез КА также является необходимым условием индукции механизма C0g концентрирования у L-CO,, cells.

2. Локализация КА в клетках микроводорослей. Генетический контроль синтеза карбоангидразы.

Локализация рКА. В связи с неопределенностью наших знаний относительно механизма С02 концентрирования и функциональной роли 28

КА в клетке представляют большой интерес данные о локализации КА в клетках микроводорослей. Необходимо отметить, что важность выяснения локализации КА была понята нами одними из первых.

Появление рКА в клетках Clorella полностью блокируется цик-логексимидом (рис. 16) и а-аманитином. Таким образом, увеличение активности рКА является результатом индукции ее синтеза de novo при низких концентрациях СО,.

■л н о

0 X ю К н и

f4xxnLupu*»rj

г,о »,5

Время, ч

Рис.16. Влияние циклогексими-да и хлорамфеникола на индукцию активности КА у Chlorella при адаптации клеток к 0,03% С02. Черные столбики контроль. ЦТ- + циклогексимид, ХФ - + хлорамфеникол.

Характер действия ингибиторов транскрипции и трансляции свидетельствует о том. что индуцируемая низкой концентрацией С02 рКА в клетках Chlorella кодируется в ядерном геноме, трансляция ее мРНК происходит на 80 S рибосомах в цитоплазме. Индукция синтеза рКА в клетках Chlorella стимулируется светом (рис.5, 13, 14) и подавляется высокими концентрациями С02 (рис. 4).

Индукция de novo синтеза рКА при снижении содержания C0g в среде была практически одновременно обнаружена у другого штамма хлореллы - Chlorella 11h (Mlyachl, 1981). Позднее явление индукции de novo синтеза'и усиление синтеза КА в зависимости от интенсивности и качества света было показано у целого ряда объектов многими авторами (см. обзор Пронина. Семененко, 1991).

Предложена гипотеза, предполагающая, что в качестве индуктора синтеза рКА в клетках Chlorella может выступать глиоксилат -

продукт фотодыхания по гликолатному пути (Рамазанов и др. 1986).

Регуляция синтеза карбоангидразы. У всех исследованных нами представителей одноклеточных водорослей активность индуцибельной формы КА возрастает при снижении концентрации C0g. Необходимым условием индукции синтеза рКА у Chlorella при недостатке С02 является свет (рис.5,13,14). Синтез рКА при этих условиях контролируется ядерным геномом клетки и осуществляется на 80 S рибосомах (рис. 16). Исследование роли света в индукции КА у Chlamydomonas показало, что мРНК накапливаются и в темноте у L-C0£ cells, но транскрипция КА осуществляется на 80S рибосомах только на свету (Coleman, 1990).

Современные представления о генетическом контроле механизма C0g концентрирования (рис. 9) хорошо согласуются с полученными нами данными о ядерном контроле за синтезом рКА в цитоплазме. Ядерные мутанты Chlamydomonas relnhardtll, лишенные способности расти на низких С02, проявляют чрезвычайно низкую активность КА в клетке (табл.2).

Функциональная роль рКА. Данные, представленные на рис. 15, показывают, что индуцированная низкими концентрациями С02 рКА участвует в механизме С02 концентрирования в клетках Chlorella. Подавление ее активности специфическим ингибитором КА этоксизола-мидом, хорошо проникающим в клетку, приводит к увеличению Км(С02) до значений, характерных для H-COg cells (рис.1). Конкретный, механизм участия рКА в концентрировании С0£ до сих пор остается неясным. Предполагается, что'концентрирование НУ происходит в результате дополнительного потока НС03" в L-C02 cells. Неясно также, где локализован этот механизм - в плазмалемме или в мембране хлоропласта. В этой связи представляются важными доказательства о возможности накопления НУ хлоропластами (Могопеу, 1985, Suitemayer et al. 1991). В этом случае функция рКА цитоплазмы может сводиться к образованию НС03" как возможного субстрата для накопления НУ при транспорте его через мембрану хлоропласта.

Локализация мембраносвязанной карбоангидразы. Возникает вопрос о локализации конститутивной мсКА в клетках Chlorella. Как

видно из рис. 13. часть общей активности мсКА в клетках Chlorella обнаруживается в интактных неразрушенных клетках, что указывает на локализацию этой формы КА в наружных мембранах клетки. Исследование локализации мсКА с помощью метода выделения фрагментов хлоропластов и субклеточных фракций Chlorella в градиенте сахарозы показало, что мсКА локализована в плазмалемме и в тилакоидных мембранах (рис.17). Для водорослей, выращенных при 2% С02, около 80% активности мсКА определяется в наружных мембранах клетки и только 20% во фракции тилакоидных мембран.

Рис.17. Распределение Хл (А), белка (Б), цинка (В,2), марганца (В,3) и активности КА (В, 1) при фракционировании в градиенте плотности сахарозы клеточных мембран хлореллы.

При снижении содержания С02 суммарная активность мсКА не изменяется, но увеличивается ее активность в тилакоидных мембранах и снижается в наружных мембранах клетки особенно при щелочных значениях pH среды (Фурнаджиева, Пронина и др., 1990). При кислых pH этот эффект снижения активности КА в наружных мембранах L-C0g cells Chlorella незначителен или отсутствует.

Более точно локализация КА в хлоропласте исследована с помощью мутантов Chlamydomonas, лишенных отдельных хлорофилл-белковых комплексов (рис. 18А). Как видно, наибольшее сохранение активности наблюдается в мутантах, сохранивших обе фотосистемы, только ФС1 и в меньшей степени ФСП. но лишенных светособираю-

Рис.18. Характеристика (А) и активность КА (Б) у фотосинтетических мутантов СЫатуйотопаз ге1гЛагс1и1, дефектных по хлорофилл-белковым комплексам фотосистем.

На схеме (А) указаны сохранившиеся в хлоропласте компоненты фотосистем. Заштрихованный столбик -растворимая КА. незаштрихованный - мембраносвя-занная КА.

щих хлорофилл-белковых комплексов (рис. 18Б). Можно думать, что КА хлоропласта входит в состав лолипептидных комплексов фотосистем.

Наличие КА в частицах, содержащих ФСП, показано для ряда высших растений (31еш1ег, 1985, Ваклинова и др, 1986. Пронина, Аллахвердиев и др.,1989). тогда как присутствие активности мсКА в частицах ФС1. выделенных из гороха (Пронина, Аллахвердиев и др.,1989), а также у мутантов, сохранивших только ХБК ФС1, (рис.18) показано нами впервые. Наличие КА в наружных мембранах клетки обнаружено в настоящее время у многих видов водорослей Шатуйотопаз. Оипа11е11а. Бсепейезтиз. РогрЬуг1<11ит, Сое1аз1;гит (А1гата, М1уасМ. 1986, -Фурнаджиева и др., 1986, Пронина, Семенен-

ко. 1991).

Регуляция синтеза мембраносвязанной карбоангидразы. Данные, полученные нами при изучении зависимости активности мсКА от условий углекислотного питания клеток, позволяют сделать заключение об отсутствии регуляторного влияния концентрации С02 на синтез этого фермента. Активность мсКА определяется, по-видимому, внутриклеточными факторами такими, например, как pH клеточных ком-партментов.

Отчетливо прослеживается зависимость активности мсКА клеток Chlorella от интенсивности света (рис.19). Для Chlamydomo'nas ясно показано (рис.18), что активность мсКА и ее наличие в хлороплас-

Gilorella

ог:н.ед.

^ юо гоо зоо

Интенсивность с6ета.Ю3эрг/см*-с

Рис.19. Зависимость активности КА и фотосинтетической продуктивности клеток Chlorella sp.K и Scenedesmus acutus от интенсивности света. 1 - активность КА в накопительной культуре, 2 -активность КА в культуре со стабилизированной плотностью, 3 - продуктивность культуры. Столбиком показан уровень активности КА в темноте.

те коррелирует со способностью клеток осуществлять частные реакции фотосинтеза.

Применение ингибиторов белкового синтеза для изучения регуляции синтеза мсКА не оказалось действенным инструментом. Причины этого кроются в том, что, во-первых, мсКА включает 2 формы - наружную, локализованную, вероятно, в плазмалемме, и внутреннюю -хлоропластную, синтез которых может находиться под контролем разных геномов клетки. Во-вторых. мсКА является конститутивным ферментом. В-третьих, ингибиторный анализ при исследовании световой индукции мсКА у Chlorella также не принес успеха, что может быть связано с разрушением хлорамфеникола под действием света высокой интенсивности.

Функциональная роль мсКА. Функциональная роль мсКА наружных мембран может состоять в участии фермента в облегченной диффузии С0г в клетку или в образовании НС03" в периплазматическом или околоклеточном пространстве, который служит субстратом для транспорта НУ при его накоплении. Эта роль экстрацеллюларной мсКА особенно велика при кислых значениях pH среда, когда концентрация экзогенного бикарбоната невелика. Эти данные хорошо согласуются с расчетными данными предложенных нами моделей накопления НУ при различных pH среды и экспериментальными данными (Frldlyand, Pronlna, 1992).

Значение хлоропластной формы КА для утилизации низких концентраций С02 хорошо демонстрируется на примере фотосинтетических характеристик C0ZR мутанта С. relnhardtll CIA-3, лишенного КА в хлоропласте (рис.7,8) и утратившего адаптивные свойства дикого типа увеличивать эффективность фотосинтеза при недостатке С02. Следует еще раз подчеркнуть, что исследованный нами мутант CIA-3 сохранил высокую способность к накоплению НУ (табл. 2). В этой связи необходимо отметить, что функция КА хлоропласта может состоять в преобразовании накопленного пула НУ в форму, пригодную для карбоксилирования.

III. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И СВОЙСТВА КАРБОАНГИДРАЗЫ.

Нами были получены гомогенные препараты мсКА, а также высо-коочищенные препараты индуцируемой низкой концентрацией С02 рКА из клеток Dunaliella salina. Выделение и очистку КА из фракции растворимого белка проводили методом фракционирования сульфатом аммония и аффинной хроматографии. В качестве аффинной матрицы была выбрана эпоксиактивированная сефароза 6В (Pharmacia, Швеция), к которой пришивали специфический ингибитор КА парааминобензен-сульфонамид (ПАМБС) (Serva, Швеция).

Сефарозу (9г, около 30 мл) промывали последовательно дистиллированной водой и 0,1 M раствором карбоната натрия, содержащем 20 % диоксана (рН 11, карбонатный раствор). 1,395 г ПАМБС растворяли в карбонатном растворе и добавляли к сефарозе, смесь составляла около 120 мл. рН смеси доводили до И 1М NaOH. Присоединение ПАМБС к эпокси-сефарозе 6В осуществляли на качалке при 50°. 40ч. Реакцию останавливали фильтрацией геля на стеклянном фильтре G-3 последовательными промываниями карбонатным раствором рН 8,1 (1 л), водой (600 мл). буфером карбоната натрия рН 8.1 и 0,1 M CH3C00Na рН 4-5. Оставшиеся активные группы блокировали 1 M трис-HCl рН 9, 0 (50 мл) в течение 6 ч при комнатной температуре при помешивании. Затем гель отмывали дистиллированной водой и хранили в холодильнике при 4°С.

рКА выделяли из 10 мл плотноупакованного объема клеток D. salina, которые разрушали и затем фракционировали гомогенат, как описано в методике. Супернатант фракционировали сульфатом аммония. Осадок между 30-70% насыщения суспендировали в 6 мл фосфатного буфера и обессоливали методом диализа или гельфильтрации через Сефадекс G-25 fine. Полученную фракцию растворимого белка загружали в аффинную колонку (1 х 12 см). Колонку последовательно промывали буферами 25 мМ трис-HCl, 22 мМ сульфат натрия рН 8,7 (Буфер А, 155 мл), 25 мМ трис-HCl, 0.3 мМ NaC104 рН 8,7 (Буфер Б, 80 мл). Белок элюировали с колонки 0,1 M ацетатом натрия, 0,5 M NaClO^ рН 5,6 (Буфер С), согласно Yang et al, 1985.

Таблица 4

Выделение и очистка КА из D. salina

.Фракция Содержание Общая Удельная Степень

общего белка, активность активность очистки

мг М/мин мг белка х 10 -8

Супернатант, 81,65 59,85 0,73 1

18 тыс g Аффинная хроматография. Р-З 0.24 55.4 230.8 316

Белковые фракции регистрировали и собирали с помощью системы для хроматографии "1зсо" (США), используя сепаратор пиков. Полученные фракции белков осаждали сульфатом аммония и обессоливали диализом против фосфатного буфера. Все фракции проверяли на содержание КА по активности.

На рис.20 представлена характеристика белковых фракций, полученных с аффинной колонки по выходу белка и активности КА. Стерве

140

2С

1С

ICO

300

Рис. 20.

с по-

200

Объем, мл

Очистка карбоангидразы Dunallella salina мощью аффинной хроматографии. 1- поглощение при 280 нм при смене буфера (состав буферов указан в тексте), 2 - активность КА.

пень очистки фермента составляла около 300. Молекулярная масса рКА из D. salina составляла 55 кД.

С помощью смеси детергентов (тритона Х-100. 1% и цвитергента 3-14. 0,5 %) удалось солюбилизировать около 50% мсКА из фракции тилакоидных мембран D. salina. Молекулярная масса выделенного полипептида составляла около 30 кД.

Эти формы фермента рКА и мсКА различаются не только величиной молекулярной массы, но и чувствительностью к ингибиторам фермента. Константа ингибирования рКА этоксизоламидом составляла 7 х 10"5 М. дансиламидом 2.5 х 10"4 М и мсКА 2 х 10"7 М и 3 х 10~5 М соответственно.

мсКА из клеток Chlorella является прочновстроенным интегральным белком тилакоидных мембран и плазмалеммы и, в отличие от представленных выше данных, полученных на Dunallella, не солюби-лизируется многими детергентами как ионного, так и неионного типа (Пронина и др.,1981). Исследование физико-химических свойств рКА и мсКА Chlorella sp.K от концентрации водородных ионов, концентрации субстрата и от температуры (Пронина, 1982) показало, что эти формы КА различаются значениями температурного оптимума. мсКА имеет два оптимума 25° и 35°, что,очевидно,связано с гетерогенностью этого фермента и наличием мсКА в хлоропласте и плазмалем-ме. Оптимальной температурой для действия рКА является 30°.

Таким образом, представленные выше данные показывают наличие множественных молекулярных форм КА в клетках водорослей, которые различаются не только молекулярной массой, но и кинетическими свойствами.

1У. МЕХАНИЗМ С02 КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ

Выше рассмотрены вопросы, касающиеся молекулярной организации С02 концентрирующей системы и регуляции ее активности на различных уровнях. В этом заключительном разделе автореферата мы попытаемся обсудить в целом механизмы утилизации НУ микроводорослями. Очевидно, что большая роль в утилизации НУ принадлежит не только активации транспорта НУ и карбоангидразы,как элементов С02 концентрирующей системы, но структурно-функциональной организации

хлоропласта. Становится ясно, что способность микроводорослей накапливать НУ является проявлением их адаптивной реакции на низкое содержание С02 в атмосфере, которая заключается не только в индукции механизма С0г концентрирования, но и в регуляции фотосинтеза.

Рис.21. Возможные механизмы трансмембранного переноса и концентрирования неорганического углерода в клетках микроводорослей.

Цифрами обозначены: 1- прямая диффузия С0£; 2 -облегченная диффузия С02; 3 - активный транспорт бикарбоната. Размеры НС03~ и С02 отражают их концентрацию.

На рис. 21 в общем виде приводится предложенная нами впервые (Пронина и др.,1981) схема возможных механизмов концентрирования НУ в клетках микроводорослей с участием КА, где наряду с прямой диффузией С0£ до центров карбоксилирования, которая, очевидно, является механизмом обеспечения фотосинтеза НУ при высоких концентрациях С02 в среде, рассматриваются механизмы накопления НУ при адаптации клеток к недостатку диоксида углерода. К последним относятся: 1) Облегченная диффузия С02 из среды в клетку за счет механизма каталитического образования С02 из НС03" в примембран-ных слоях клетки, что способствует выравниванию профиля С02 в среде. 2) Облегченная диффузия С02 в клетке за счет создания в

ней пула НС03* при щелочных рН внутриклеточных компартментов с последующим преобразованием его в С0г в хлоропласте в результате каталитического действия КА. 3) Активный транспорт НУ в форме НС03" через плазмалемму. Эта модель учитывала физико-химические особенности специализированных компартментов фотосинтезирующих клеток и селективные свойства окружающих их мембран. Большое внимание в ней уделено также концентрированию диоксида углерода в хлоропласте и превращению пула НУ в форму, удобную для карбокси" лирования.

Все предложенные в настоящее время модели, описывающие действие механизма С02 концентрирования у микроводорослей, различаются, главным образом, локализацией помпы НУ. обеспечивающей активное накопление НУ, и формой НУ (С0г. НС03~, С02 + НС03"), в которой последний транспортируется в клетку или в хлоропласт. Одни авторы придерживаются идеи, что С02 является единственным видом НУ, проникающим через мембраны (Tsuzuki, 1983), другие считают, что через плазмалемму диффундирует образованный из НС03" с помощью экстрацеллюларной КА диоксид углерода (Aizawa, Mlyachi, 1986), тогда как через мембрану хлоропласта активно транспортируется НС03" (Moroney et al. 1987 ). В качестве альтернативы ряд исследователей предполагают, что через плазмалемму в дополнение к потоку С02 транспортируется НС03" (Spalding et al, 1985), а в последние годы сделано заключение об одновременном активном транспорте С02 и НС03" в клетку (Sultemeyer et al, 1991).

Проведенные нами (Frldlyand, Pronlna, 1992) численные оценки роли диффузии С02 и НС03" в окружающей клетку среде в присутствии КА и без нее, а также диффузии С02 и НС03" через клеточную оболочку в ПП позволили сделать вывод, что механизм активного транспорта НС03~ через плазмалемму более полно объясняет совокупность полученных нами и имеющихся в литературе данных, чем механизм пассивного транспорта С0£ через плазмалемму с последующим концентрированием его в клетке, возможно, с помощью осуществления активного транспорта НУ через мембрану хлоропласта.

Поскольку форм.аНУ, в которой он накапливается и фиксируется в клетке, различаются, возникает также задача преобразования высокого пула НС03" в необходимую для карбоксилирования молекулярную форму C0g. Нами (Пронина, Семененко. 1984) были предложены два

возможных механизма преобразования пула НУ в хлоропласте в форму, пригодную для карбоксилирования: (рис. 22).

Первый механизм (рис. 22а) - увеличение концентрации С02 в зоне карбоксилирования за счет дегидратации бикарбоната стромы, когда равновесие С0г/НС03" сдвигается в сторону образования С02 в

Рис.22. Схема возможных механизмов генерации С02 в зонах карбоксилирования с участием мембраносвязанной КА в зависимости от топологии фермента в тилакоидной мембране, а) дегидратация бикарбоната в зоне образования кислых продуктов фиксации С02; б) дегидратация бикарбоната при использовании кислого рН в люмене.

фиксации С02 (о6легченная диффузия С0г). В этом случае КА участвует в начальных этапах фиксации С02, переводя бикарбонат-преобладающую форму НУ стромы, в форму, пригодную для карбоксилирования и выравнивает профиль концентрации С02 в хлоропласте. Как концентрирующий С02. этот механизм надо понимать.условно, так как образование диоксида углерода в результате действия КА определяется скоростью фиксации углекислоты и выходом продуктов фиксации.

Второй механизм (рис. 226) является истинно концентрирующим С02 в примембранных слоях тилакоидов. В этом случае НСОд" транспортируется в люмен, в котором при кислом значении рН реакция, катализируемая КА, сдвигается в сторону образования C0g. Далее С02 из люмена транспортируется по градиенту концентрации в строму и увеличивает его концентрацию в примембранных слоях тилакоидов. Как предполагают Морони и Масон (1991). предложенный нами механизм значительно более выгоден с энергетической точки зрения, учитывая, что во многих моделях предполагается трата одной молекулы АТФ на транспорт С02 или НС03~. Основаниями для последнего

механизма являются: проницаемость тилакоидной мембраны для НС03" (Молотковский, Яковлева. 1983). наличие высокой крутизны градиента в хлоропласте на свету, что создает физико-химические условиях для протекания реакции дегидратации бикарбоната в люмене и, наконец. наличие КА в мембране тилакоидов (рис. 17), а также световая зависимость ее активности (рис. 19).

Безусловно обе модели имеют ограничения и недостатки. Как в первом, так и во втором случаях необходимо исключить наличие КА в строме хлоропласта, поскольку образованный в хлоропласте или в люмене диоксид углерода может снова преобразоваться в НС03" прежде,чем достигнет центров карбоксилирования. Для функционирования этих механизмов необходима тесная кооперация КА и РБФК, либо особая компартментация этих ферментов в структуре, позволяющей создавать в ней повышенную концентрацию С02. Во втором случае также необходимо наличие непроницаемой мембраны для поддержания повышенной концентрации С02 в местах карбоксилирования.

У цианобактерий эти ограничения снимаются в предложенной Рейнхолд с соавт. в 1986 "карбоксисомальной модели фотосинтеза", центральным элементом которой является компартментация КА и РБФК/0 в карбоксисомах. По аналогии с этой моделью и на основании анализа литературных данных и собственных исследований мы предложили новую гипотезу (рис. 23) о центральной роли пиреноида.

ХЛОРОПЛАСТ ■

крахмал

ПИРЕНОИД

РБФК цикл А. Кальвина

НСО-'

Т НС03 —->■ HCOg АТФ аза

HgO

X вен

Рис.23. Механизм генерации С02 в пиреноиде хлоропласта, (описание в тексте)

содержащего РБФК/О (Владимирова и др.. 1982) и КА (М1уасМ е1 а1, 1991) в концентрировании, генерации и фиксации С02 в хлоропласте. Генерация С02 в пиреноиде катализируется КА, локализованной в ла-меллах, проникающих в пиреноид и содержащих ФС1 (УПгу е1 а1. 1989; М^агйу е1 а1. 1990). Во внепиреноидных ламеллах. где локализуется ФСП, генерируется 02. Крахмальные обкладки создают сопротивление диффузии С02 из пиреноида. Центральный элемент модели - кооперация РБФК/О и КА в пиреноиде, где образуется и фиксируется С02, а также наличие пространственной организации процессов генерации С02 и 0£ в хлоропласте, что увеличивает соотношение С02/02 в местах карбоксилирования и снижает оксигеназную функцию РБФК/О. Таким образом, решаются проблемы влияния высоких концентраций 02 на фиксацию С02 и снижения скорости диффузии С02 из клетки. При этом функционирование пиреноида, как самостоятельного метаболического компартмента, может вносить существенный вклад в увеличение эффективности фотосинтеза при снижении концентрации С02.

Рис.24. Возможный механизм взаимодействия С02 концентрирующей и кислородвыделяющей систем.

Рассматриваются также возможные механизмы участия мсКА в регуляции собственно фотосинтетических реакций хлоропласта (рис.24), которое может быть связано с образованием бикарбоната, оказывающего влияние на регуляцию многих внутрихлоропластных процессов таких,как скорость транспорта электрона в ЭТЦ хлоропласта, реакция Хилла и др. (Уегтааз, Соу1псШ, 1981). Влияние инги-42 '

биторов КА на фотосинтетические параметры указывает также на участие мсКА в регуляции фотосинтеза и на донорной стороне ФСП (31ет1ег а1, 1985, Пронина, Аллахвердиев и др., 1989).

Необходимо особо подчеркнуть, что состояние проблемы усвоения НУ микроводорослями при низких концентрациях С02 позволяет в настоящее время приблизится к пониманию клеточной и молекулярной организации С02 концентрирующих механизмов у С-3 растений и требует привлечения к ее решению как физиолого-генетических и биохимических методов, так и методов математического моделирования этих процессов.

ВЫВОДЫ

Проведено комплексное исследование клеточной и молекулярной организации первичных процессов поглощения, трансмембранного переноса и внутриклеточного транспорта неорганического углерода, а также концентрирования С02 в хлоропласте в зонах карбоксилирова-ния( как одной из специализированных функций растительных фотоав-тотрофных клеток с С-3 путем метаболизма углерода^ показано:

1. Способность микроводорослей, метаболизирующих углерод по С-3 пути фотосинтеза, к усвоению неорганического углерода при низких концентрациях обусловлена высоким фотосинтетическим сродством клеток к С02, в отличие от С-3 наземных растений.

2. Высокая эффективность фотосинтеза микроводорослей в условиях низких концентраций С02 обеспечивается включением в клетках механизма концентрирования неорганического углерода. Показана роль света в индукции механизма концентрирования неорганического углерода при недостатке С02.

3. Исследована организация С02-концентрирующей системы, элементами которой являются КА и, вероятно, переносчики НУ и показано, что для увеличения эффективности фотосинтеза при лимитировании его недостатком углекислоты необходимы активация транспорта неорганического углерода в клетку и дополнительный синтез КА.

4. Показана способность микроводорослей ассимилировать экзогенный бикарбонат и предложены модели, описывающие накопление неорганического углерода при низких концентрациях С0г, которые рассматривают вклад облегченной диффузии С02 и активного транспорта НС03". Разработана математическая модель накопления неорганического углерода, учитывающая роль КА, периплазматического пространства, неподвижного слоя среды вокруг клетки и клеточной оболочки, что позволяет сделать вывод о существовании активного транспорта бикарбонатного иона в клетку.

5. Показано существование карбоангидразной системы в клетках микроводорослей и исследована ее организация у некоторых видов СЫогорЬусеае в различных условиях светового и углекислотного режимов выращивания культур, а также при сопряженном действии этих факторов. Карбоангидразная система включает конститутивные и ин-дуцибельные формы фермента, которые различаются состоянием (мемб-раносвязанная и растворимая формы КА), локализацией в клеточных компартментах. адаптивными и молекулярными свойствами, а также функциональной ролью в клетке.

6. Вскрыта физиологическая роль отдельных изоформ КА, локализованных в разных компартментах и мембранах клетки, и приведены доказательства необходимости полностью сформированной карбоангидразной системы для ассимиляции С02 при низких концентрациях. Предложены модели механизмов концентрирования, генерации и фиксации С02 в хлоропласте микроводорослей, которые учитывают рН клеточных компартментов, селективные свойства мембран, внутриклеточную локализацию КА, РБФ-карбоксилазы и фотосистем.

7. На основании собственных исследований и анализа литературных данных предложена новая гипотеза о центральной роли пиреноида, содержащего РБФК/0 и КА, в концентрировании, генерации и фиксации С02 в хлоропласте. Генерация С02 в пиреноиде катализируется КА, локализованной в ламеллах, пересекающих пиреноид и содержащих ФС1. Во внепиреноидных ламеллах, где локализуется ФСП, генерируется 02. Крахмальные обкладки создают сопротивление диффузии С0£ из пиреноида. Центральный элемент модели кооперация

РБФК/О и КА в пиреноиде, где образуется и фиксируется С02> и наличие пространственной организации процессов генерации С02 и 02 в хлоропласте, что увеличивает соотношение С02/02 в местах карбок-силирования и снижает оксигеназную функцию РБФК/О.

8. Рассматриваются возможные механизмы участия мембраносвя-занной КА в регуляции собственно фотосинтетических реакций хлоропласта, объясняющие влияние бикарбоната на регуляцию многих первичных процессов фотосинтеза, комплексное действие которого на фотохимические реакции хлоропласта известно как "бикарбонатный эффект". Приводятся результаты ряда экспериментальных"данных о влиянии КА на донорной стороне ФСП, которые могут служить косвенными доказательствами, подтверждающими гипотезу Варбурга об участии НС03~ в качестве донора электрона.

9. Организация С02 концентрирующей системы в хлоропласте позволяет предполагать участие КА во взаимодействии С0£ концентрирующей и 02 выделяющей систем фотосинтезирующей клетки.

10. Сформулирована концепция о механизмах концентрирования С02, которая расширяет представления о фотосинтетическом метаболизме углерода, рассматривая первичные процессы утилизации, трансмембранного переноса, внутриклеточного накопления неорганического углерода и концентрирования его в хлоропласте. Концепция показывает, что механизм концентрирования С02, включающий метаболические пути неорганического углерода до включения их в органические продукты, является важным регуляторным звеном жизнедеятельности фотосинтезирующей клетки и сохранения ее гомеостаза.

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Касаткина Т.И., Пронина Н.А.,Семененко В.Е. (1974) Выделение высокомолекулярных белков типа рибулозо-1,5-дифосфаткар-боксилазы из сложной смеси растворимых белков методом диск-электрофореза в градиентном геле полиакриламида. / Материалы УП1 Всес. рабочего совещ. по по вопросу круговорота веществ в замкнутой

системе. Наукова Думка. Киев. С.95-99.

2. Kasatkina Т.I., Vladlmlriva М. G., Pronlna N. А., Semenenko • V.E. (1977) A comparative Immunochemical study of RDP-carboxylases In some procarlotlc phototrophs./Microbial growth on CI compounds. Abst. Int. symp. Pushchlno. pp. 133-134.

3. Pronlna N. A. (1977) Light-dependent activity of membrane-bound carbonic anhydrase in Chlorella cells./SEV-problem 1-18,2, Szeged.

4. Семененко B.E., Аврамова С., Георгиев Д.,Пронина H.A. (1977) Сравнительное изучение активности и локализации карбоан-гидразы в клетках Chlorella и Scenedesmus. /Физиология растений. 24 (5), С. 1055-1059.

5. Касаткина Т. И.. Пронина Н. А., Семененко В. Е. (1979) Рибу-лозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза хлореллы и регуляция ее синтеза под действием света разной интенсивности./Роль низших организмов в круговороте веществ в замкнутых экологических системах.Наукова Думка. Киев. С. 298-304.

6. Семененко В. Е., Купцова Е. С., Касаткина Т. И., Пронина H.A., Владимирова М. Г., Зверева М. Г. .Кузнецова Л. Г. (1979) Кинетические характеристики обратимой репрессии синтеза белков и функциональной активности хлоропласта стереохимическими аналогами глюкозы. / Роль низших организмов в круговороте веществ в замкнутых экологических системах. Наукова Думка. Киев. С.313-320.

7. Семененко В.Е., Пронина H.A..Купцова Е.С. (1979) Две формы карбоангидразы в клетках Chlorella и действие 2-дезокси-Д-глю-козы на их синтез./Тезисы IY Всес.Биохим.съезда. Т.1, С.273-274.

8. Семененко В. Е.. Аврамова С.. Георгиев Д. .Пронина H.A. (1979) О световой зависимости карбоангидразной активности клеток Chlorella и Scenedesmus./Физиология растений. 26(5), С.1069-1075.

9. Пронина H.A., Аврамова С., Георгиев Д., Семененко В. Е. (1981) Динамика карбоангидразной активности Chlorella' и Scenedesmus при адаптации клеток к свету высокой интенсивности и к низкой концентрации С02./Физиология растений. 28(1), С.43-52.

10. Пронина H.A., Рамазанов 3.М.,Семененко В.Е. (1981) Зависимость карбоангидразной активности клеток Chlorella от концентрации С0г./Физиология растений. 28(3), С.494-502.

11. Пронина H.A., Цоглин Л.Н., Семененко В.Е. (1981) Динамика

карбоангидразной активности в клеточном цикле хлореллы./Энергетика, метоболические пути и их регуляция в фотосинтезе. Тез. докл. Всес. Совещ. Пущино. С. 44.

12. Пронина H.A. (1982) Локализация, свойства и функциональная роль карбоангидразы в клетках водорослей./Автореферат канд.диссертации. Москва.

13. Пронина H.A. .Цоглин Л.Н. (1983) Об участии карбоангидразы в усвоении низких концентраций С02./В сб. XI Всес. рабочего совещ. по вопросам круговорота веществ в замкнутых системах на основе жизнедеятельности низших организмов. Наукова Думка. Киев. С. 127-131.

14. Пронина H.A., Рамазанов 3.М.,Семененко В.Е. (1983) Кар-боангидразная система фотосинтезирующих клеток: организация, функциональная роль, регуляция синтеза./ Регуляция метаболизма первичных и вторичных продуктов фотосинтеза. Тез.Межд. симп . Пущино. С. 16-17.

15. АврамоваС., Пронина H.A., Семененко В.Е.,Пешева И. (1984) Карбоангидразная активность и усвоение бикарбонатного иона Chlorella и Scenedesmus./.Хидробиология (БАН). Т.20, С.8-15.

16. Касаткина Т.И., Пронина Н.А.,Семененко В.Е. (1984) Количественное выделение, фракционирование и характеристика рибуло-зо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы клеток Chlorella./ Физиология растений. Т. 31, С. 130-140.

17. Пронина H.A., Семененко В.Е. (1984) Локализация мембра-носвязанной и растворимой форм карбоангидразы в клетках хлореллы. /Физиология растений. Т.31(2), С.241-251.

18. Рамазанов З.М., Пронина Н.А.,Семененко В.Е. (1984) 0 кислородной зависимости индукции синтеза С02-зависимой растворимой формы карбоангидразы в клетках хлореллы. /Физиология растений. Т.31(3), С.448-455.

19. Семененко В. Е., Пронина Н. А., Рамазанов 3. М. (1985) Карбоангидразная система фотосинтезирующих клеток: организация, функциональная роль, регуляция./ Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в СЗ -растениях. Валгус.Таллин. С.66-77.

20. Рамазанов З.М.. Пронина Н. А.. Семененко В.Е. (1986) Регу-ляторная роль оксигеназной функции РБФК в индукции С02-зависимой растворимой формы карбоангидразы в фотосинтезирующих клетках хло-

реллы./ Тез.5 Всес. биохим. съезда. Наука. С.68

21. Pronlna N. A., Furnadzleva S.. Shaplguzov J.М..Semenenko • V.E. (1988) Influence of protein synthesis Inhibitor on the carbonic anhydrase system in Chlorella cells./ International symposium on plant mineral nutrition and photosynthesls'87 (Vacllnova S.et al. ed.), Sofia, pp.258-262.

22. Пронина H.A..Сенененко B.E. (1988) Локализация связанной карбоангидразы в мембранах клеток хлореллы. /Физиология растений. Т.35(1), С.51-61.

23. Pronlna N. A..Semenenko V.E. (1989) The membrane-bound carbonic anhydrase take part In C02 consentratlon In algae cells. / Physlologla Plantarum 76 Fasc.3, part 2, A49.

24. Купцова E.C.. Пронина H.A.,Семененко В.Е. (1989) Скрининг различных видов одноклеточных водорослей на содержание лек-тинов и их внутриклеточная локализация./ Изучение и применение лектинов. Тарту. С. 154-159.

25. Пронина Н.А., Аллахвердиев С.И., Клячко-Гурвич Г.Л., Климов В. В. .Семененко В.Е. (1989) Локализация карбоангидразы в частицах фотосистемы I и фотосистемы II хлоропластов гороха./ Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях. Тез докл. Всес. конф. Пущино. С.172-173.

26. Pronlna N. А., Semenenko V.E. (1990) Membrane-bound carbonic anhydrase take part In C02 concentration In algae cells. / Current research In photosynthesis. Kluger acad.publ., Dordrecht-Boston-London, pp.498-502.

27. Петков Г.. Клячко-Гурвич Г.Л., Фурнаджиева С., Пронина Н. А., Рамазанов З.М. (1990)' Генотипические различия и фенотипи-ческие изменения жирно-кислотного состава липидов у штаммов Dunallella sallna./Физиология растений. Т.37(2), С.356-362.

28. Пронина Н.А., Клячко-Гурвич Г.Л.. Ладыгин В.Г.,Семененко В. Е. (1990) Активность карбоангидразы у мутантов Chlamydomonas relnhardtll с различной организацией фотохимических систем хлоропластов. /Физиология растений. 37(5), С.899-906.

29. Пронина Н.А.(1990) С02-концентрирующие механизмы. Бюллетень ВОФР. вып. 8. С. 25-26.

30. Пронина Н.А. (1990) Клеточная и молекулярная организация С02 концентрирующей системы в фотосинтезирующей клетке./ Тез. 2

съезда Всес.общества физиологов растений. Минск.

31. Касаткина Т.И., Пронина Н.А. (1990) Влияние качества света на активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы и карбоангидра-зы клеток Chlorella /Тез. 2 съезда Всес.общества физиологов растений. Минск.

32.фурнаджиева С.. Пронина Н.А., Андреева Р., Петков Г.,Се-мененко В.Е. (1990) Участие карбоангидразы в ассимиляции бикарбо-натного иона клетками хлореллы и сценедесмуса. /Физиология растений. Т. 37 (1). С.22-30

33. Pronina N. А. (1991) Organization and physiological role of the C02 concentrating mechanism In photosyntheslzlng' cells./ Photosynthetlca 24(4), pp.649-650.

34. Pronina N.A., Furnadzjleva S.T., Pesheva I.S. (1991) Carbonic anhydrase localization In Dunallella cells./Докл. на Болгарската академия на науките. 44(4), pp.93-95.

35. Пронина Н.А.,Семененко В.Е. (1991) Молекулярная и клеточная организация С02 концентрирующих механизмов в фотоавтотроф-ных клетках микроводорослей./Альгология Т. 1(2), С.80-92.

36. Клячко-Гурвич Г.Л.. Ладыгин В.Г., Пронина Н.А., Рябых И.Б., Семененко В.Е. (1991) Специфичность состава жирных кислот липидов у мутантов Chlamydomonas relnhardtll с различной организацией фотосистем хлоропластов./ Физиология растений Т.38 (6),

С. 1171-1180.

37. Пронина Н.А.. Фурнаджиева С., Семененко В.Е. (1991) Способ культивирования микроводорослей на бикарбонатсодержащих средах. Заявка на авторское свидетельство N 4822056, приоритет от 8.05. 1990, положительное решение от 28.03.91.

38. Ладыгин В.Г., Клячко-Гурвич Г.Л. .Пронина Н.А. (1992) Влияние мутаций, блокирующих пигмент-белковые комплексы на состав липидов и активность карбоангидразы./

Тез. 2 съезда Всес. общества физиологов растений. Минск. С.117

39. Бражникова Т.А..Пронина Н.А. (1992) Две формы карбоангидразы в клетках Dunallella. / Тез. 2 съезда Всес.общества физиологов растений. Минск. С. 29.

40.Пронина Н.А., Семененко В.Е. (1992) Роль пиреноида в концентрировании, фиксации и генерации С02 в хлоропласте./Физиология растений. Т.39 (4) (В печати).

41. Frldlyand L.E.. Pronlna N. A. (1992) Role of unstirred layer, cellular envelope and periplasmlc space carbonic anhydrase In regulation of C0Z concentration mechanism In mlcroalgae. /Plant and Cell Physiol. (В печати).

42. Pronlna N. A., Borodin V. V. (1992) C02 stress and C0£ concentration mechanism: investigation by means of photosystem -dlflclent and carbonic anhydrase-dlflclent mutants of Chlamydomonas relnhardtll./Photosynthetlca (В печати)

Информация о работе

Пронина, Наталия Александровна
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы