Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВОЛИПИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ФОТОСИСТЕМЫ I И ФОТОСИСТЕМЫ 2 ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВОЛИПИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ФОТОСИСТЕМЫ I И ФОТОСИСТЕМЫ 2 ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА"

2?33$

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ШОХИМИИ ИМ.А.Н.БАХА

/ ■■ ; ■'. л : \ ■■■

На правах рукописи

Н*И»ШУТЙЛОВА

I

ШДБЛШИВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПИШЕНТ-ЕЕЛКОВСООШИДШа; НСЫШЕКСОВ ФОГОСИСТШЫ I И ФОТОСИСГГаН 2 ХЛОРОППАСТОВ ГОРОХА

(03.00.04 шшмия)

Автореферат \ диссертации на соискание ученой степени : кандидата биологических наук

МОСКВА - 1976

АКАДЕМИЯ НДО СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ШОХИМИИ им.А.Н.БАХА

На правах рукописи

Н.И» ¡ПУТИЛОВА

ЩДШЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ШИМЕНТ-ЕЕЛКОВОЛИЦИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ФОТОСИСТШЫ I И ФОТОСИСТЕМЫ 2 ХЛОРОШАСГОВ ГОРОХА

(03.00.04 БИОХИМИЯ)

Автореферат диссертации аа соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1976 .

Работа выполнена в Институте фотосинтеза АН СССР

Научные руководители:

доктор биологических наук В.М.Кутюркн #

старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Ю.Е.Ерохин

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Ю,Г,Модотковский старшие научный сотрудник, кандидат биологических наук Л.М.Воробьёва

На официальный отзыв работа направлена в Институт фотобиологии АН БССР

Защита диссертации состоимся "_"_1976 г.

на заседании Ученого совета Ордена Ленина Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР.

С диссертацией мовно ознакомиться в библиотеке Биологического отделения АН СССР (Москва, В-7І, Ленинский проспект, 33)

Автореферат разослан " ^оЛ. 1976 г.

Просьба отзывы и замечания посылать по адресу: Москва В-7І, Ленинский проспект, 33, Ордена Ленина Институт биохимии им.А.Н.Баха АН СССР, ученому секретарю

кандидат биологических наук

Н.Н. Дьячков

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Важнейшим промежуточным звеном клеточной структуры, живых организмов являются, надмолекулярные комплексы, состоящие из геометрически подогнанных и соединенных нековалеягяш взаимодействием биологических макромолекул: белков, лшшдов, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.дм Различные надмолекулярные комплексы объединятся в органеллы - ядра, митохондрии, хлоропласты и другие тельца •и включения, определяя их функциональную специфику и структурное многообразие.

Предмет настоящего исследования - надмолекулярные пиг-мент-б едаоволипидны е комплексы (ПБЛК) хлоропласт ов высших растений. Эти комплексы являются основными структурными и функциональными единицами фотосинтезирупцих мембран хлоро-пластов. Исследование ПЕПК имеет важнейшее значение в изучении структурной организации и биохимических реакций фотосинтетического аппарата растительной клетки. Шфокое использование комплексов в качестве объектов исследования может сыграть большую роль в изучении механизма первичных реакций фотосинтеза, фотосинтетического транспорта электронов, а также процессов, могущих повлиять на направленное изменение продуктивности фотосинтеза.

Работы по изучению пигмент-белковолипидных комплексов хлоропластов велись по двум направлениям. Первое - 8то исследование состояния хлорофилла в пластидах листа. В развитии данного направления первостепенная роль принадлежит советским ученым: Любименко (1921-1923)» Годневу и др. (1947^1963), Красяовскому и др.<1948-1973), Осиновой и др. {1947-1974), Литвину и др. (1957-1974), Шлыку и др. (19571974), Островской и др. (1969-1975). Второе направление -это история длительного совершенствования методов выделения хлорофилл—белковых комплексов и исследования их э состоянии in vitro, где основной вклад был сделан зарубежными учеными (Smith, I938-I94I; Wolken, 1962; Kahn, 1964; Ogawa et al.» 1966; Thornber et al., X967-X974; Vesaeis et al., 1968-1973; Vernon et al.,' I97I-I972; Ke et al., 1974)* В настоящее время установлено существование трех видов ПБЛК: комплекса, обогащенного содержанием реакционного центра фотосистемы I, комплекса, обогащенного содержанием реакцион-

-г -

ного центра фотосистема 2 и комплекса, содержащего светосо-бирающие пигменты. (В данной исследовании для удобства изложения мы ввели следухше сокращенные обозначения указанным комплексам: ПБЯК РЦ ФС-I, ПЕПК РЦ ФС-2 и ВС-ПЕЛК соответственно). Исследованиями ш изолированных комплексах была установлена специфичность их пигмент—белкового состава, различие видов катализируемых ими окислительно-восстановительных реакций, проведено изучение рада спектральных свойотв. Можно считать общепринятым, что основный процессом, происходящим в HESS Щ, является процесс превращения энергии поглощенного света в свободную химическую энергию разделенных зарядов, которая используется в последувдих гямяовюс реакциях фотосинтеза. Благодаря этому данные комплексы играют ключевую роль в первичных реакциях фотосинтеза, в то время как основное функциональное назначение ВС-ПЕЛК - роль светособиравдей антенны. Не вызывал сомнения и тот факт, что уникальные фотохимические свойства ПЕПК обусловливаются их надаолекулярной структурой.

Однако достигнутые успехи в изучении хлоропластных комплексов следует рассматривать лишь как начало обширного этапа их исследования. По-прежаему первоочередной задачей ученых является задача выделения комплексов, т.к. разработанные метода еще недостаточно совершенна, длительны, трудоемки и отличаются сравнительно низкой эффективностью. Далеко не ясны закономерности и специфика компонентного состава, фотохимических и спектральных свойств изолированных комплексов и прежде всего функционально наиболее сложного ПЕЛК Щ ФС-2, сравнительно недавно обнаруженного и мало изученного. Недостаточно внимания уделяется изучению ВС-ШЖ. Практически отсутствует информация о функциональной роли отдельных составляющих компонентов ПЕЛК. Только намечаются подходы к изучению принципов построения данных надмолекулярных структур. Эти вопросы определили содержание настоящей работы.

Целью и задачей исследования было!

I) Разработать бьгсграй и эффективный метод одновременного выделения трех -видов пишент—белковолипидннх комплексов фогосингезирущих мембран хлоропластов гороха — фотока-талитически активных ПЫПС РЦ ФС-I и ПЕЛК Щ ФС-2 и вспомо-

гателеного светос обирающего комплекса.

2) Провести сравнительное исследование компонентного состава, фотохимических и спектральных свойств изолированных комплексов*

3) В..связи с развиваемыми представлениями (Кутюрин и др., 1965-1975) о возможности биологического окисления води при фотосинтезе непосредственно пигментной системой 2 представляло особый интерес изучение эндогенных электронно-до-норных свойств комплексов фотосистемы 2 хлороплаотов.

4) Исследовать фотоиндуцируемне превращения каротинои-дов, входящих в структуру изолированных комплексов» с целью изучения их функциональной роли в составе ПЕНК, а также возможного участия в механизме фотоокисления води.

ОБЪЕКТЫ И штода ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение ксмпле&сов осуществляла из ламелл гран хлоропластов листьев гороха по специально разработанному методу (см. содержание работы). Солюбилизацизэ гран производили не-ионогенным детергентом тритоном X-ІОО. Исходные хлоропласт получали по методу (Jsgendorf and Атгоп, IS68) в среде* содержащей 20 ыМ трло-НСІ-буфер СрН 7,8), Q,4 М сахарозу, 10 Ш NaCl и 5 Ш аскорбат натрия. Для отделения гран хлоропласти подвергали осмотическому шоку в 500-кратном объеме раствора І Ш МбРіг - 5 ыМ трис-буфера (рН 8,0) и отбирали фракцию, оседавшую в интервале X000-5000g в течение 20 мин (Контроль осуществляли по электронномикроскопическим снимкам X

В работе исследовали с вежевыделе нные и диализованные , растворы комплексов, хранившиеся в темноте при 4°С в течение 3-4 суток. Содержание тритона 1-100 в исходных концентрированных растворах комплексов составляло 0,05%; концентрация трис-HCI—буфера (рН 8,0) — 5 Ш. В случае необходимости более полного удаления детергента, например, при анализе каротиноидов, при регистрации спектров поглощения в области ближнего ультрафиолета и т.д., растворы комплексов подвергали двухсуточному диализу против 200-кратного объема 2,5 idt грис-ШІ-буфера, рН 8.0.

Б отдельных опыт ах для сравнения исследовались водно-тритоновые коллоидные растворы хлорофиллов а+б в 0,05$ тритоне Х-100 - 5 ыМ трис-НС1-буфере (pH 0,0), а также ацетоновые раствора зеленых и желтых патентов листьев гороха.

Метода анализа компонентного состава изолированных комплексов. Определение содержания хлорофиллов проводили спектрофотоыетрически по методу (Temon, I960; Bruinsma» 1963). Каротиноиды анализировали методом тонкослойной хроматографии яа смеси МеР-Са(Ш>2-СаСОз (Корнюшенко, Сапожников, 1X9). Концентрацию белка определяли ыетодш Лоури (Lowry, 1951) с учетом присутствия в анализируемых образцах хлорофилла и его вклада в окраску с реактивом Фалина. Полную экстракцию липидов осуществляли по методу (Bllgfa and Oyer, 1959). а суммарное содержание недигментных лишщов (за вычетом хлорофиллов, каротиновдов и тритона Х-100) устанавливали гравиметрически. Фосфошшвды анализировали по методу Ни-ловой (1964). Идентификацию цитохромов и их количественный анализ проводили по методу (Bendall et si., 1971) из разностных (восстановленный минус окисленный) спектров поглощения комплексов в интервале 530-680 им на спектрофотометре . "Hitachi - модель 356". Концентрацию П700 находили из хеип-индуцированных спектров поглощения (окисленный минус восстановленный) по величине уменьшения поглощения при 700 ш на спектрофотометре "Specord 07 vis". Расчеты производили исходя из значения дифференциального коэффициента молярной экстинкдии, равного 64 ьйГ^сьГ1 (Hiyama and Ке, 1972). Электрофоретические исследования комплексов проводили по Матсону (líatflon, 1965) на 7,5? полиакриламидном геле в фос-фат-глшщновом буфере, pH 8,9; сила тока - 4 ма/саг; весовое соотношение хлорофилл/тритон в подготовленных растворах комплексов создавали равным 1/50. Коэффициент свдимента-» ции ПИК определяли методе»* скорости седиментации в аналитической ультрацеатрвфуге ЗГЦА-3.

Измерение Фотохимической активности изолированных комплексов в окислительно-восстановительных реакциях. Скорость фотовосстановления феррицканида определяли методе« Крогмана и Ягендорфа (Ктоernenn and Jagendorf, 1957). Измерение скорости реакций фотовосстановления 2,6-дихлорфенолиидо-

фенола (ДШЙ) от эндогенных или от искусственных доноров -электрона: дифеяилхарбазида или гидроксилампна, а также реакции фотоокисления восстановленного ДКФЩ проводили непосредственно под лучсйі ектишгааого света по изменении поглощения при 590 нм. Измерения производили с помощью спе» циально сконструированной установки с фосфороскопом и боковым освещением, которая была аналогична установке, описанной ранее конструкции (Каралетян, Климов, 1971), Скорость, реакции фотовосстаяовления НАДО* определяли из интенсивности флуоресценции, обусловленной восстановленной фораой коферменте. Реакцию проводили в присутствии ферредоксина, ферредоксиа-й№-оксадоредукгаэы и пластоцианива (ПЦ) при температуре 25° в течение 4 мин. Состав реакционных сред во. всех опытах использовала общепринятый (weseele et al*, 1973X Концентрация ПБДК соответствовала 7-10'мкг Хл/мл; интенсивность актидагеного света - 1,9x10^ эрг/см^-сек.

Спектральные исследования. Спектры низкотемпературной (-I96 C) флуоресценции комплексов измеряли на снектрофлуо-риметре, собранной на. базе двух монохрома!оров, лашш ДКСШ-1000 и ФЗУ-79. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Onicem SP-8000", Длительную лшинесценцию изолированных ПЕПК измеряли при комнатной температуре по мето» ду Шувалова и Красновского (І97І)1'. Спектры фотоиндушро-ванного изменения поглощения хлорофилл ов реакционных центров ФС-І и ФС-2 (свет минус темнота) получали по методу Карапетяна и др. (1973) на специальной установке о фосфороскопом и доковым освещением, упоминавшейся выше. Чувствительность установки составляла ед.о.п. Измерения фотоиндуцируемых изменений шкода флуоресценции проводили на той же установке1'. Исследования фотопотенциала в системе, содержащей ПЕЛК ФС-І а ъ-бенэсшшов проводили по методике Евстигнеева (1966). Спектрі действия фотопотенциала регистрировали на установке УС-ІІ, световой потек которой был энергетически выравнен.

Приносим глубокую благодарность старшему ваучвоыу сотруднику В. А.Шувалову и В.В.Климову за участие в этих экспериментах.

При исследовании электронно-доноряой активности комплексов ФС-2 величину фотовыцветания хлорофилла измеряли параллельно с измерением скорости реакции фотовосстановле-шш феррициаяида. Процент выцветания хлорофилла находили по убшвг зкстяикцш комплексов в красной максимуме поглощения.

Для изучения фотоиндуцируемых изменений каротиноядного состава у изолированных ПЕЛК и у ацетоновых растворов пигментов освещавшуюся в течение 4 мин аликвогу раствора объекта и темнового контроля переводили в петролейний эфир, следя за полним обесцвечивание« водной фавн. Затем эфирный экстракт быстро наносили на хроыатографическую пластинку и разгоняла в восходящем токе рас творит елей. Соответствие между величинами суммарного фотовыцветаяия каротнноадов и хлорофшиов устанавливали спектрально по величине уменьшения поглощения при 490 ни для желтых пигментов, а для хло-рофиллов - в красной максимуме поглощения. Измерения проводили на спектрофотометре "Speeord от vis-,

Электронномикроскопические исследования проводили в Институте биофизики АН СССР совместно с Д.Д.Мошсовым.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка метода выделения шігменг-бедковолидидных комшгекоов фотосистемы I и фотосистемы 2 хлоропластов

гороха (Глава I)

Сложность биохимическое задачи выделения хлоропластных ПЕЛК обуславливается гетерогенностью их состава, водонераст-воримостмэ, их включением в структуру мембран, а также отсутствием ясной и полной информации об их свойствах. Методическая трудность состоит не только в достижении разделения комплексов, но и в обеспечении сохранности их фотокаталитической активности в окислительно-восстановительных реакциях. Так, существенным недостатком широко' распространенного метода электрофоретического разделения хлорофилд-белкошх комплексов хлоролластов, ссишбилизированкых в растворе додецилбенздясульфата натрия, являлось то, что он

не дозволял получать фотокаталитически активные комплексы о -устойчивой надмолекулярной структурой,а также не позволял получать все три вида хлоропластных ШЩТЬогпЪег et al.,1974).

В настоящее время единственным методом, удовлетворяющий требованию выделения фотокаталитически активных комплексов реакционных центров и вместе с тем позволяющим выделить все три вида хлоропластных ПБЛК, является метод фракционирования солюбилизированных тритоном или дигитонином субмембраняых фрагментов в градиенте шхотности сахарозы (v«mon et al., І97ІД972; Weasels et al., 1972,1973). Однако разделение ПЕЛК по величине их плотности значительно осложняется склонностью хлоропластных комплексов к агрегации. Это приводит к необходимости неоднократного повторения центрифугирования в градиенте плотности и к необходимости допйлнительных хромато-графических очисток, что значительно усложняет процедуру виде леяия и увеличивает ее длительность (до 7-8 суток для каздого комплекса).

Приступая в 1968 году к разработке метода выделения хло-г ропластных ПЕДК, мы поставили в качестве первоначальной задачи выделение фотокаталитически активного комплекса фотосистемы 2, представлявшего для нас наибольший интерес. Эта задача была решена с пшощью дифференциального центрифугирования и хроматографического разделения материала хлоропластных гран на ДЭАЭ-целлилозе. Затем мы показали возможность разделения комплексов фотосистемы I и фотосистемы 2 методом дробной ЭЛХЬ» ции ПБЛК, сорбированных на ДЭАЗ-целлшозе. Критерием разделения служил пигмент-белковый состав комплексов и их активность в реакциях фотовосстановления феррицианида и При этом,

в процессе экспериментальных наблюдений была выявлена гетерогенность комплекса фотосистемы 2 и его частичное высаливание при стоянии в концентрированных (по хлорофиллу) водно-тритоновых растворах. Образующийся осадок характеризовался существенно большим содержанием хлорофилла б и ксантофиллов и был неактивен в окислительно-восстановительных реакциях. Последущие исследования позволили идентифицировать этот осадок как вспомогательный светособираодий комплекс, отде-ляшийся в данных условиях от фотокаталитически активного ПЕЛК РЦ ФС-2. Далее, осуществляя предварительное высаливание ВС-ПБДК из исходного раствора суммы хлоропластных ПБДК,

мн достигли эффективного разделения ПЕЛК ГЦ ФС-1 и птэтк Щ ФС-2 методом ионобмеяной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с помощью дробного элюирования. Это указывало на существенную разницу величины присущего комплексам РЦ отрицательного электрического заряда, основными носителями которого, по-видимому, являются входящие в их состав белковые молекулы и фосфолипидн. Идентификацию изолируемых комплексов осуществляли на основе данных компонентного состава и типа фотоката-лизируемых ими окислительно-восстановительных реакций.

Полная схема выделения дигнеят-белковолипидных коыд-лексов хлоропластов гороха представлена на рис.1; на рис.2-графический профиль элщии ПЕЛК РЦ ФС-1 и ПЕЛК И[ ФС-2. Следует подчеркнуть, что успех хроматографического разделения комплексов ГЦ существенно зависел от стадии предварительного удаления ВС-ПЕПК. Это обусловливалось, с одной стороны, доминирующим количественным содержанием светособираю-щего комплекса в исходных ламеллах, а с другой - близостью его элхщионного параметра с элюциошшм параметром ТШДК РЦ ФС-2. Это объясняет, почему нам первоначально удавалось разделять только комплекс ФС-1 и комплекс ФС-2, где последний представлял собой сумму ТТБДК РЦ ФС-2 и ВС-ПБДК»

Электронно-микроскопические снимки первого элюата суммы комплексов не обнаруживают присутствия в растворе мембранных пузырьков, свидетельствуя тем самым о полноте солю-билизации ламелл до отдельных пигмент—бе лковолишздвых комплексов.

Разделение комплексов, осуществленное нами на основе их наиболее отличительных признаков, способствовало хорошей воспроизводимости метода и высокому количественному выходу* выход тгпту И! ФС-1 был равен 13?! (до хлорофиллу от исходного содержания хлорофилла в хпоропластах), выход ПЕЛК Щ ФС-2 - 1-2% и выход ВС-ПЕПК - 22$. В связи с. небольшой длительностью и несложностью примененных процедур общее время, затрачиваемое на выделение комплексов, составляло одни сутки.

Изложенный метод позволяет осуществить выделение ПЕЛК РЦ ФС-2 и ВС-ПЕИК не только из исходных гран, но и из суб-хлоропластных фрагментов ФС-2, предварительно значительно обедненных содержанием фотосистемы I. При этш были подобраны методические условия выделения фрагментов, практически

Рис.I. Схема выделения пигмент—бежоволшпщных комплексов фотосистемы I и фотосистемы 2 хлоропласте® гороха

Лизировадяые хлоропласти

Гоыогениз: Х-100 .

буфера, ии і тритон/хлорофилл

Солюбилкзированнне ламеллы

Перемешивание на ледяной базе в течение часа. Центрифугирование (БОООхе, 20 мин)

Г----)

Осадок (отброшен) Супернатант

1) Наслаивание на колонку о ДЭАЭ-целдюлозой, уравно-вешеяяуюрастворш 0 тритона 1-І 00 - 5 мМ трис-ИСХ-буфера, рН 8,0.

Промывание уравновешивающим буфером --

2) Элюция раствором 0,3 Н Басі в уравновешивающем буфере --

-•-Удаление тритона Х-100 и солюбилизировашшх пигментов

- Субламелляраые пигмент-белковолшшдные комплексы

Стояние в течение 5 часов до значительного помутнения. Центрифугирование 14000X6, 60 мин)

Супернатант

1) Наслаивание на колонку с ДЭАЭ-целлюяозой, уравнек вешенятораствором 0,05£-тритона Х-100 - 5 Щ л трио-НС1-буфера, рН 8,0.

Промывание уравновешивающим буфером -•

2) Злщия растворам 0,075 М НвСі в уравновешивающем буфере -*

3) Элюция раствором 0,2 М НаСі в уравновешивающем буфере --

П ._,

Осадок{ВО-ПЕДК

Прозрачный раствор

ПИК РЦ ФС-І

ПЫЖ РЦ ФС-2

J

I i.

^ Рис.2. Графический про-

РЦ ФС-I (I) и 1Ш РЦ

■vl ФС-2 (2) ступенчато воз-

I рас тающими к онцентрациями

раствора хлористого натрия

в уравновешивающем буфере,

филь элщии ПЕЛК

W JW Ш ш ОЛем эйюата, мя

: лишенных Ш00, с помощью комбинированного действия дигито-ниаа и тритона Х-100 и дафференциального центрифугированяя. Полученные фрагаенты характеризовались высшим соотношением коротковолнового и длинноволнового максимумов низкотемпературной С-196°С) флуоресценции (Ф685А735 = 5,9) и были в 10-15 раз более обеднены содержанием ¿700, чем обычно получаемые ПО схеме Андерсон Е Бордмаяа (Anderson and Boardman, I96&) "тяжелые" субхлоропластные фрагменты фотосистемы 2. Наряду с этим они сохраняли довольно высокую активность в окислительно-восстановительных реакциях фотосистемы 2 и способность к фотоиндуцированноаду изменению выхода флуоресценции.

Изолируемый из этих фрагментов светособирапций комплекс был полностью идентичен БС-ПЕЛК, выделяемому из хлоро-пластных гран. Комплекс РЦ ФС-2, выделенный из субхлоро-шгастных фрагментов фотосистемы 2 (обозначен далее - IIEffKg РЦ ФС-2) содержал несколько большую примесь свегособиразо-щих пигментов по сравнению с ПБЛК^ РЦ ФС-2, выделяемому из хлоропластных гран. Последнее обстоятельство, по-видимому, объяснялось значительным возрастанием содержания ВС-ПЕПК у лишенных П700 субхлородластных фрашентов фотосистемы 2.

. - II -

Исследование компонентного состава, фотохимических и спектральних свойств изолированных комплексов (Глава 2)

Критерием для идентификации изолированных комплексов служили данные компонентного состава (табл.1) и фотошмиче-ской активности (табл.2). Характерными особенностями состава комплексов реакционных центров при сопоставлении с составом ВС-ПЕЯК являются следущие: доминирующее содержание хлорофилла а по сравнению с хлорофиллом б и fi -каротина по сравнению с ксантофиллами; присутствие цитохрсаюв; значительно большая концентрация белка.. Содержание непигмент-, них лшшдов в расчете на I мг белка у комплексов реакционных центров практически одинаково и составляет 18—1935. Состав ПВДК РЦ ФС-І существенно отличается от состава ШЇЕК РЦ ФС-2 типом включенных цитохромов: у ПЕЛК РЦ ФС-І - это цитохроми f и bg, а у ПЕЛК РЦ ОС-2 - цитохром (рис.З). Кроме того, ПЕЛК РЦ ФС-І характеризуется в 4-4,5 раза более низкий содержание бедка и присутствием П700 в концентрации I молекула на 60 молекул хлорофилла* Соотношение 1/60 является значительно более высоким показателем, чем у частиц, получаемых дифференциальным центрифугированием. Ни у ПЕЛК РЦ ФС-2, ни у ВС-ПЕЇЇК хемииндуциро-ванный сигнал П700 мы не наблюдали. Компонентный

Рис.З. Темновые разностные

(восстановленный минус ' окисленный) спектры поглощения ¿-полос цитохромов в составе ПЕЛЕ РЦ QC-I (А), TTKUKj Щ ФС-2 (Б) и ВС-ПЕЛК ,—,—г- ——,—(В) при комнатной температуре

540 560 580 НО W 580 StO SÍO S&0 ПуНКТИрНОЙ ЛИНИЄЙ ОбОЗНаЧеНЫ

спектры аскорбат минус ферри-цианид, сплошной - дитиокит минус феррицианид, Концентрация хлорофилла составляла 40 мкг/мя» длина оптического цуги I см.

состав комплексов реакционных центров, кроме отличительных особенностей, характеризуется и некоторым сходством, лрояв-лжпщшся в распределении пигментов и в практически одинаковом процентном содержании непигментных ЛИШЗДОВ по отношению к весу белка.

Таблица I

Биохимический состав пишеят-белковалипидных комплексов, изолированных из хлоропластов гороха. Величины даны в нмоль на 100 нмоль хлорофилла, исключая липиды и белок

нмоль

100 нмоль хлорофилла

ПБЛК РЦ ФС-1

ПБПК^ РЦ ФС-2

пбико m ФС-2

ВС-ПЕПК

Хлорофилл а 88,80 82,80 77,30 54,60

Хлорофилл б 11,20 17,20 22,70 45,40

Хлорофилл а АлорофийЛ 6 7,90 4,80 3,40 1,2

¿-Каротин 10,60 7,38 7,56 2,28

Виолаксантин 0,58 0,80 1,00 1,69

Лптеин 0,70 3,80 4,17 8,20

Антераксантин 0,33 0,82 0,96 2,05

Неоксантин 0,42 0,33 0,50 4,24

Каротин сумма ксантофиллов 5,21 1,27 1,15 0,14

Цитохром f 0,60 0,27 0,18 0

Цитохрш bg 0,91 0 0 0

Цитохром Ъ559 0 3,4 2,0 0

Общее содержание 0,377 0,285

лшшдов Тит) 0,087 - ■

Белок (мг) 0,45 2,10 1,9 0,19

ХлопоФилл 60 СО СО

П700

В составе ВС-ПВЛК хлорофилл б присутствует в соизмеримых количествах с хлорофиллом а, а содержание ксантофиллов существенно выше содержания каротина. Эти характеристики стабильно получаются всеми исследователями. Что же касается содержания цитохромов и бедка, то здесь литераиурные

данные противоречивы и зависят от метода выделения (тьогп-ber et al., 1967,1974; Temon et al., 1971). Наши анализы показали, что соотношение хлорофилл/белок у ВС-ПБЛК также является постоянной величиной во всех выделениях как из исходных гран, так и из фрагментов ФС-2, а цитохрош полностью отсутствуют. У ВС-ПЕЛК непигментные липиды составляют 150$ по отношению к весу белка, а общее количество липи-дов и пигментов вдвое больше весового количества белка. Такой высокий процент гидрофобных компонентов, по-видимому, и обусловливает склонность к агрегации, наблвдадауюся у данного комплекса в соленых водно-тритоновых растворах, благодаря которой ВС-ПЕЛК лепсо отделим от комплексов-реакционных центров. Гидрофобные свойства ВС-ПЕЛК и расчеты, показывающие, что в количественном отношении он является основным комплексом ламелл хлоропластов, позволяют предположить, что ВС-ПБПК играет роль не только светособирающей антенны, но и структурообразующего фактора фотосиктеэируицих мембран.

Таблица Z

Фотохимическая активность пигмент-0елковалшпшшх комплексов. Скорости реакций даны в мкмоль/мгХл -чао

""' 1 11 ч" I ......-i^I—.1 , - . | ..

; Фот овос с танов4Фотовос+Фотоокисле ниб¡Фотовос-{ление ДШЙ> xi станов-j ДХФИФ•Но х) ¡станов-1-¡леше 1-г*-i

Комплекс

:.......- ■ ч ¡ленив

|ЗНД0-е|СТ тщщхх)

-щ

+ПЦ

ление. НАМ*

от

ПЕЛК РЦ ФС-1 nEHKj И! ФС-2 ПШ^ РЦ ФС-3 ВС-ПБДК

0 0 1,05 24 96 36

12,3 95 34 30 93 29

4,8 53 26 8 28 7,5

0 1,8 4,7 2,3 2,3 0

х) Значение средней абсолютной ошбки измерения равно

¿0,5 мкмольДт Хл*час. хх) Значение средней абсолютной ошибки измерения равно ±0,8 мкмоль/мг Хл*чао,

Из данных по фотокаталитической активности (табл.2) можно видеть, что специфическим свойством ПЕЛК РЦ ФС-2 -является реакция фотовосстановления ДХФШ, идущая наиболее

Рис.4. Спектры поглощения ПЕНК РЦ

ФС-1 (---), ПБКК^

РЦ ФС-2 (- )

и БС-ПЕПК (----).

Рис,5. Разностные (свет минус темнота) спектры поглощения

фотоакгивявх хдорофяллов реакционных центров: П700 .у ПЕЛК ГЦ ФС-1 (I; концентрация хлорофилла равна 6,6 мкг/мл) и П689 у ПЕДК^ 2 ЗД ФС-2 (2 и 3 соответственно; концентрация хлорофилла * равна 30 мкг/мл).

Рис.6. Спектры низкотемпературной флуоресценции (-196°С)

ПБПК РЦ ФС-1 (I), хяоропластов гороха (2), БС-ПБЯК (3), ПЕЯК1 Ш ФС-2 (4), ПЕПКо ГЦ ФС-2 (5) и ПЕШ^ ЕЦ ФС-Й после длительного диализа (6). Концентрация хлорофилла в образцах составляла 4-6 мкг/мл.

активно от экзогенного донора дш^енилкарбазида ЩВК). Благодаря данной реакции ПБДК РЦ ФС-2 и был вперше обнаружен In Titro (Yernon et al., I97X). В настоящее время реакция фотовосстановления ОТй® от дифенилкарбазида (как и присутствие цитохрсма ъ-559) рассматривается как тест на реакционный центр ФС-2. 7 других комплексов она полностью отсутствует. Реакция фотовосстановления феррицианида (ФЦ) также характерна преимущественно для ПБПК РЦ ФС-2. Следует подчеркнуть еще одну выявленную наш специфическую особенность ПБПК Щ ФС-2 - это термолабильность его фотокаталим-ческой функции. Температурная обработка до 40-44? в течение 4 мин практически полностью инактивирует комплексы, Ингиби-ругацее действие диурона равно 30%, о-фенантролина - 77%,

Способность к фотоокиолению JUHIS.Hg и к фотовосстановлению НАДО* является общим свойством комплексов реакционных центров фотосистемы I и фотосистемы 2. ВС-4Ш1К фотокаталитя-чесхой активностью не обладает.

На рис.4-6 приведен рад спектральных характеристик изолированных комплексов: спектры поглощения, спектры фотоактивных хлорофиллов реакционных центров и низкотемпературной флуоресценции. Приведенные характеристики находятся в близком соответствии с данными литературы и подтверждают происхождение комплексов из соответствующих пигментных систем, а также их структурную и функциональную индивидуальность.

Электронно-донорные свойства изолированных комплексов фотосистемы 2 (Глава 3)

Параллельно совершенствованию метода выделения пигмент— белковолипидных комплексов хлороллас тов проводилось изучение электронно-донорных свойств комплексов фотосистемы 2 методом сравнения электрон-эквивалентов окисленного хлорофилла в реакции фотовосстановления ФЦ растворами комплексов и хлорофиллов а+б in vitro. Было показано, что в водно-тритоновом растворе пигментов на одну молекулу окисленного хлорофилла приходится 8 молекул восстановленного ФЦ. В то же время у растворов ПБПК, содержащих преимущественно коми-

лекс фотосистемы 2, найденные величина электрон-эквивалев-тов окисленного хлорофилла бшш в несколько раз выше. Это указывало на присутствие в составе ПЕЛК ФС-2 эндогенных доноров электрона, участвупцих наряду с хлорофиллом в -реакции фотовосстановления ФЦ. Обработка проназой подавляла фотокаталитическую активность ПЕЛК в данной реакции, что свидетельствовало о<5 определенной роли надмолекулярной структуры в поддержании электронно-донорной активности комплекса.

Изучение стехиометрии участников реакции фотовос становления ФЦ во фракциях комплекса ФС-2, очищенных от принеси ФС-1, подтвердило высокую величину электрон-эквивалента окисленного хлорофилла в составе ПЕЛК ФС-2 (табл.3). Исследование проводили в анаэробных условиях в отсутствии альтернативного акцептора электронов - кислорода. Число переносимых электронов на единицу окисленного хлорофилла была максимально ь лервые 4 мин освещения, а затем быстро падало, что, по-видааоыу, была связано с возникающим дефицитом эндогенных доноров шш нарушением пространственной сопряженности системы донор-хлорофилл-акцептор» Наблвдаащееся различие в найденных величинах электрон-эквивалентов у элгируемшс с колонки фракций ПЕЛК ФС-2* по-видимому, обусловливалось разницей в содержании реакционных центров ФС-2.

Обнаруженные нами в составе комплексов ФС-2 эндогенные доноры, очевидно, можно разделить на две группы. Первая группа - «то случайные доноре, подвергающиеся сенсибилизируемому окислении при фотохимических реакциях и тем самым вносящие вклад в восстановительный пул комплексов. Вторая группа доноров - это физиологические (первичный и вторичный) доноры, связанные со структурой реакционного центра ФС-2 и служащие для быстрого ревосстановления фотоокислен-ного хлорофилла ГЦ ФС-2. Основными представителями первой группы доноров, по-видимому, являются каротиноида. Такое предположение можно сделать исходя из хорошо известного факта их защитной функции в процессе фотосинтеза,направленной на предотвращение фотос енсибилизируемого хлорофиллом окисления других компонентов структуры. Исследования на изолированных комплексах подтвердили защитное ангиокиоли— тельное действие желтых пигментов в составе ПБШС. При атом сами каротиноида подвергались необратимому фотоокислению»

Таблица 3

Соотношение окислительно-восстановительных грамм-эквивалентов участников реакции фотовосстановяенш ФЦ растворами ПБЛК ФС-2 и ПКИКФС-1 в анаэробных условшп

Номер образца

ДЕЯК ФС-2 4 19,1 0,75 25,5

I 31,4 30 32,8 2,27 14,4

(Хл а/Хл 6=2,3) 60 39,5 2,80 14 Д

4 20,7 ХД 18,8

2 34,2 10 33,6 2,8 12,0

(Хл а/Ел 6=2,1) 20 50,0 4,5 ИД

30 59,1 6,0 9,8

3 4 7.6 ОД 76

(Хл а/Хл 6=2,7) 12,6 60 9.1 0,3 33

4 15,5 0,7 22 Д

4 25,6 20 28,2 1,75 16,6

(Хл аДл 6=2,4) 40 44,6 2,5 17,8

50 44,0 2,7 16,3

5 4 18,2 0,75 24,2

(Хл аДл 6=2,3) 30,0 45 33,2 2,60 12,7

4 27,3 2,0 13,6

6 9 37,9 2,9 13,1

45,0 15 53,2 3,6 14,7

(Хл а/Хл 6=1,6) 40 66,8 3,6 13,3

60 73,8 5,5 13,4

ШЖ ФС-1 1,05 4 0,64 0,05 12,8

(Хл а/Хл 6=7,1) 60 5,9 0,42 14,0

Скорость фотовосстановления

ФЦ.

мкмояь мг дл.чао

Время; КоличесттКоличест43лекгроЕ-ОСВ6-:ВО вое- (ВО ОКЕС-•эквивалента! станов- ¡ленно^ -лент ,* »ч »ленного |хлоро- ¡1 нмоль (мшц; ¡фц за {филла за'окислен-

Iвремя ¡время *,'вого хяо-¡нмоль Iнмоль ¡рофидла 110 нмолШи Йм6л5>1 (нмоль ч !Хл !1л ¡восст.ФЦ)

идущему наиболее активно во фракциях ПЕПК РЦ ФС-2. Однако подсчеты показали, что максимальное количество необратимо окислившихся каротиновдов составляет 0,3 ныоль на 10 нмодь хлорофилла и фактически ничтожно мало по сравнению с процессом фотосенсибилизированного переноса электронов на первом этапе* Таким образом, по-видимому, основным источником эндогенного электрона при фотохимических реакциях комплекса ФС-2 является вторая группа доноров, а именно, физиологические доноры.

Исследование особенностей длительной лгатнесценции ПБДК РЦ ФС-2 в сравнении с ПЕПК РЦ ФС-І под-. твердило наличие физиологических доноров в составе изолированных ПЕПК Ш ФС-2 (рис.7). Добавление феррициалида к

Рис.7. Кинетика затухания после* свечения ШИК РЦ ФС-І (А) и ПБЕКд РЦ ФС-2 (Б) после импульса возбуждающего света (ІСГ® сек, дх). Возбуждение производили через светофильтр КС-ІІ; излучение измерялось через КС-Х9. А - I) в присутствии ДШ& (І0~® М) и аскорбата натрия (І0"3 М); 2) в присутствии феррц-цианида (ІСГ3 М). Б - I) без до-» бавок; 2) в присутствии феррициа-нида (І0Г3 М); 3) после температурной обработки до 44°С в течение 4 мин.

раствору ПЕПК РЦ ФС-І полностью подавляет послесвечение. И наоборот, добавление феррицзаянда к раствору ПЕПК РЦ ФС-2 приводит к многократному возрастанию интенсивности длительной люминесценции. Это явление, очевидно, можно объяснить окислением вторичных физиологических доноров в составе ПБЙК РЦ ФС-2 и ростом в результате этого концентрации фотоокис-ленного хлорофилла реакционного центра фотосистемы 2.

Таким образом, маяно предполагать, что физиологические доноры образует шесте с фотоактивным хлорофиллом Щ ФС-2» первичным акцептором и липовротенновкм носителем структуру, которая существенно ае нарушается при процедурах выделения комплексов. Химическая природа физиологических доноров, обнаруживаемых в составе изолированных комплексов фотосистемы 2, в настоящее время нам неизвестна.

Изучение фотоиндуцируеивх изменений каротиноидного

состава у пигмеат-белковолшшдннх комплексов фотосистемы I и фотосистемы 2 (Глава 4)

Исследование фотоиндуцируемих изменений каротиноидного состава у комплексов представляло интерес для изучения вопроса о месте локализации реакций " виолаксаатинового цикла" и функциональной роли каротияоидов в структуре ПИК.

Результат количественного анализа фотоиндуцируемых изменений каротиноидного состава комплексов представлены в сводной таблица 4. Можно видеть, что у ШК ФС-І протекает реакция накопления моноэпоксидного ксантофюиа - ангера-ксаятина, коррелирующая о убылью виолаксалтияа. Реакция ускорялась при увеличении концентрации ионов водорода в среде и достигала максимального значения в исходной сумме комплексов реакционных центров. Ваблодагщееся взаимопревращение кислородсодержащих каротиноидов у ПБЛК ФС-І и отсутствие такового у изолированных комплексов фотосистемы 2 свидетельствует о том, что местом локализации реакций "ви о— лаксантинового цикла" является, по-видимому, фотосистема X хлоропласта.

У" всех изолированных комплексов и особенно у комплексов фотосистемы 2 обнаруживается фотосенсибилизируемай хлорофиллом процесс выцветания каротиноидов (табл.4). Оа является, по-видииоиу, следствием окислительной фотодеструкнни желтых патентов, т.к. протекает только в присутствии акцепторов электрона - кислорода или ферридиашзда (в анаэробных условиях). Содержание хлорофилла в среде также является необходимым условием протекания указанного процесса. В отличии от истинного раствора желтых и зеленых

Таблица 4

Ф отоиндуцируемьіе изменения каротиноидного состава у изолированных дигмент-белковолипидных комплексов хлоропластов гороха (в % от исходного содержания соответствующего пигмента)

Каротин -5,1 -6,?

Виолаксантин -14,0 -16,5

Лютеин О -4,5

Антераксантин +20,0 +88,5

<Й55.2)

Неоксантин 0 +48,0

-11,0 -20,8 -60,1

-9,5 -9.7 -16,1

-8,0 -19,6 -46,0

-9,1 -43,0 -13,2

-7,2 -10,4 -42,4

пигментов, где в первую очередь согласно закону действия масс выцветают основные компоненты системы: каротин, лшеин и неоксантин, у комплексов процентное соотношение каротинои-дов до и после освещения сохранялось практически постоянным» Это указывает на сосредоточение желтых пигментов вокруг хло-рофшшов - центров локализации светового возбуждения»

У свежевыделенных препаратов ПЕШ наблвдается корреля--ция между интенсивностью фотоокисления хлорофиллов и кароти— лендов (рис.8), которая нарушается при длительном хранении комплексов. При этом интенсивность выцветания хлорофиллов резко увеличивается, а интенсивность выцветания каротиной— дов уменьшается (рис.9).

Рис.8, ФотоЕИцветанне кароти-ноидов (1,1') и хлорофиллов (2,2' ) у ПЫЖ ФС-2 в зависимости от длительности освещения в аэробных (А) и анаэробных (Б) условиях. Индексом отмечены кривые, полученные в присутствии феррищанида.

Рис.Э. Зависимость фотовыцветания хлорофил-лов и каротиноидов у ГЕДК ФС-2 от длительности хранении: I) - 2-Э дня; 2) - 10-12 дней; 3) - 45 дней. Освещение проводили в аэробных (А) и.анаэробных условиях (Б).

Выявленные закономерности можно объяснить защитной ролью желтых пигментов в составе изолированных комплексов. В ходе ее осуществления каротпшшда, действуя как антиокис- ' лит ели, сами подвергаются фотосенсибшшзируемому хлорофшшаї окислению, которое в условиях і» -тто становится необратимым. Однако и на таком уровне структурной организации, как изолированные ПЕПК, защитная функция каротиновдов может про* являться в различной степени. Так длительное хранение препаратов комплексов приводит к снятию защитного действия желтых пигментов, что происходит, вероятно, в результате нарушения, пространственной сопряженности системы хлорофилл-каротиноид.

ЗДКЯКЛЕНИЕ

Показано, что выделение и фракционирование трех видов пигмент-белковолигащшх комплексов фотосинтезируксщх мембран хлоропластов гороха (ПЕЛК ГЦ ФС-І, ПБИК РЦ ФС-2 и БС-ПЕДК) может быть эффективно осуществлено при помощи мягкой солюбилизации ламелл тритоном Х-100, .процессов избирательного высаливания и ионобменной' хроматографии комплексов на ДЭАЭ-целлшозе, т.е. в условиях, обеспечивающих хорошую сохранность надмолекулярной структуры я функциональной активности комплексов, простоту и небольшую длительность выделения, а также высокий количественный выход получаемых препаратов.

Идентификация комплексов осуществлена на основе анализа биохимического состава, фотохимической активности в окислительно-восстановительных реакциях и спектральных свойств.

£

Г

а*.

Ш фоговыцшанне хлорофшна о щотвіщівтанив котішиіаа

Установлено, что ПЕПК 1Ц ФС-2 отличается от тпэдк рц фС-1 типом катализируемых им окислительно-восстановительных реакций, термолабидьностью фотокаталитической функции, существенно' большим содержанием белка, доминирушдам содержанием коротковолновых дезагрегированных форм хлорофилла, присутствием ш-гохрока ъ-559 и длительным послесвечением, способным к значительной активации феррициаяидоы, Длл ПЕШ РЦ 5С-1 характерна значительная концентрация П700 и длинноволновых агрегированных фор) хлорофилла, присутствие цитохромсш г и Ь£, а также протекание реакций "виолаксантинового цикла". Длительная лпшнесценцяя 1ГВЛК РЦ ФС-1 полностью подавляется феррициаяидоы. БС-ПКПК в количественном отношении является основным комплексом фотосинтезирувдей мембраны; ов обогащен содержанием лшшдных компонентов и отличается отсутствием фотохимической активности в изученных реакциях. Приведенные характеристики служат несдоненнш доказательстве« структурной и функциональной индивидуальности каждого из этих комплексов*

Изучение электрон-эквивалентов окисленного хлорофилла комплексов в реакции фотовосстановления феррицианвда показало сохранность эндогенной электронно-донорной активности у комплексов ФС-2, обусловленной в основном за счет активности .физиологических доноров электрона, тесно связанных со струк-|турой реакционного центра ФС-2. Процесс фотосенсибилизиро-¿ванного окисления указанных доноров необратим и, по-видимому, является отражением способности ФС-2 к постепенному накопле-. нив окислительного эквивалента (с целью образования потенциала, достаточного для окисления воды) и может быть полезен для исследования механизма окисления вода.

Исследование особенностей фотоиндударуемых изменений каротиноидного состава у изолированных комплексов позволяет предположить, что каротиноиды играют важную функциональную роль в фотохимических реакциях комплексов* Так, в составе ВС-ПБЕК каротиноиды являются частью свет особирахщей антенны, в структуре ПБЛК РЦ ФС-1 ксантофиллы вовлечены в реакции "виолаксантинового цикла", в ПБЛК ГЦ ФС-2 каротиноиды осуществляют преимущественно защитную функцию. По существу многообразие роли желтых пигментов, по-видимому*

определяется их химической природой - наличием системы сопряженных связей а способностью обратимо присоединять кислород.

Научная новизна результатов. Разработан оригинальный метод выделения трех видов шгмеят-белководишэдных комплексов фотосинтезируицих мембран хлоропластов (ШЭДК РЦ ФС-1^ ПЕВК РЦ ФС-2 и ВС-ПЕЯК), с помощью которого достигнута высокая эффективность фракционирования и сравнительно большой выход получаемых препаратов. Достоинством метода являются простота, скорость и обеспечение хорошей сохранности надмолекулярной структуры и фотохимической активности комплексов в окислителько-восставовительных реакциях. Особый интерес представляет выделение и исследование наиболее лабильного и малоизученного комплекса - ЩЖ РЦ ФС-2.

Впервые показана сохранность в составе изолированных комплексов фотосистемы 2 физиологических доноров электрона, по-видимому, связанных о окислительной стороной фотосистемы 2. Получены ноше экспериментальные данные по выяснению функциональной роли кароткноидов» входящих в состав выделенных комплексов.

В и В О Д Ы

I. С использованием солюбилизируицего действия тритона Х-100, процессов избирательного высаливания и ионобыенной хроматографии на ДЭАЭ-целлшозе разработан метод одновремен-', ного выделения трех видов дигыент-белковолишщныу комплексов (ПЕВК) фотосинтезируших мембран хлоропластов гороха:: кшплекса, обогащенного содержанием реакционного центра фотосистемы X (ПБПКГЦФС-1), комплекса, обогащенного содержанием реакционного центра фотосистемы 2 (ПЕИК ГЦ ФС-2) и вспомогательного светособирающего комплекса (БС-ПБЛК). Характерными особенностями метода являются скорость, простота и эффективность разделения комплексов, которые достигат-ются в результате использования наиболее отличительных признаков 11ЕПК — разницы в величине отрицательного заряда и гидрофобных свойств.

2. Разработан вариант метода виде лети ГГЕЛК РЦ ФС-2 л ВС-ПЕЛК, вклшашщй отадиа предварительного удаления фотосистемы I, Найден способ быстрого получения субхяоропяастных Фрагментов фотосистемы более чем в 10-15 раз очищенных от примеси фотосистемы I (по сравнению с обычными "тяжелыми" фрагментами фотосистемы 2) и сохраняющих активность в окислительно-восстановительных реакциях фотосистемы 2 хлоропласта И способность К фотошщуцированному изменению флуоресценции..

3* Проведено исследование компонентного состава, фотохимических и спектральных свойств изолированных ПБПК РЦ ФС-І, ПЕЛК РЦ ФС-2 и ВС-ПБЛК, которое подтвердило их происхождение из соответствующих пигаентных систем, а также структурную и функциональную индивидуальность.

4. Показано, что комплексы ІШДК ЕЦ ФС-І и ПЕЛК РЦ ФС-2 la vitro наряду с первичными фотореакциями активного хлорофилла реакционного центра проявляют способность к фотоинду-цированному переносу электрона в окислительно-восстановительных реакциях, свойственных пигментной системе I и системе 2 хлоропласта соответственно. Это свидетельствует о сохранности надмолекулярной структуры комплексов.

5» Осуществлено более детальное исследование свойств и особенностей состава вспомогательного светособираицего комплекса, наиболее широко представленного в фотосинт езирущих мембранах хяоропластов. На основании подученных данных предполагается его возможная роль в качестве структурообразующего фактора фотосинтезирующей мембраны.

6. В составе изолированных комплексов фотосистемы 2 сохраняются активные физиологические доноры электронов. Это позволяет предположить, что указанные доноры образуют вместе с фотоактивным хлорофиллом реакционного центра фотосистемы 2, первичным акцептором д лапопротеиновым носителем единую структуру, которая существенно не нарушается при процедурах выделения комплексов.

7. Обнаруженный процесс фотосенсибилизированвого окисления физиологических доноров в составе пигмент-белковоли-ттдиит комплексов фотосистемы 2, по-видимому, является отражением наблвдапцейся in vivo способности фотосистемы 2 к

постепенной аккумуляции окислительного эквивалента (с целью образования потенциала, достаточного для окисления конечного донора электронов в процессе фотосинтеза - вода) и может быть полезен душ изучения механизма окисления води.

8. Выявлено протекание световой реакции накопления антераксантина, коррелирующей с убылью виолаксантща, у комплекса фотосистемы X и отсутствие взаимопревращений ксантофиллов у изолированных комплексов фотосистемы 2. Это подтверждает точку зрения о возможной локализации реакций "виолаксантинового цикла" в фотосистеме I ln vivo и свидетельствует против предполагаемого участия каротиноидов в механизме окисления воды.

9. В результате выявления црояесса фотоокждапгедьного обесцвечивания желтых пигментов в составе изолированных литоент-белковолипидных комплексов и изучения его закономерностей показано, что, по-видимому, важнейшей ролью каротиноидов в данных структурных образованиях является выполнение ими защитной функции, направленной на предотвращение фото-сенсибилиэированного окисления других компонентов системы.

Материалы диссертация опубликованы в следующих раоогах:

1. Улубекова М.В., Путилова Н.И., Кашкарова Т.Н., Ку-тюрин В.М.К вопросу о роли каталазы в хлоролластах, Физиология растений, 15, 267-271, 1968.

2. Кутюрин В.М., Улубекова М.В., Матвеева И.В, .^Щути-лова Н.И., Розонова Л.Н. Соотношение между скоростью переноса электрона и скоростью выделения кислорода хлоропласта^ мн в реакции Хщгла, Физиология растений, 181-186, 1969,

3. Улубекова М.В., Розонова Л.В., Щутилова Н.И* Изменения между скоростями переноса электрона и выделения кислорода хлоропластами в реакции Хилла. Тезисы докладов на II Всесоюзном биохимическом съезде, Ташкент, 19'69», стр.115-116.

4* Щутилова Н.И. О выделении и некоторых свойствах пигмент-белкового, комплекса высших растений, В сб. "Биология и научно-технический прогресс", Тезисы докладов конференции молодых ученых г.Пущино, Пущино-на-Оке, 1971,.стр.130-132.

5. Мошков Д.А», Мопкова З.Г,, Щутилова Н.И. Мембраны хлоропластоз, анализ влияния обработки детергентсяа,. В сб. "Биофизика живой клетки", Пукино, т.З, 1972, стр.44-55.

6. Кутюрин В.М., Щутилова Н.И. Электронно-докорные свойства пигмент-белковолипидного комплекса хлоропластов. Биохимия, 39, 102-110, 1974.

7. Шкуропатов А.Я., Путилова Н.И., СтоловицкиЙ Ю.М., Евстигнеев В.Б. Исследование фотохимического взаимодействия пигмент-б елковолипидного комплекса фотосистемы I с п-бензо-хиноном потенциометрическим методом. Докл.АН СССР, 214. 1214-1217, 1974*

8. Щутилова Н.И., Жигальцова З.В., Кутюрин В.М. Сравнительное исследование окислительно-восстановительных свойств изолированных ПБЛК ФС-1 и ПБДК ФС-2 хлоропластов гороха,

В сб."Итоги исследования механизма фотосинтеза", Цущино, 1974, стр.130-141.

9. Щутилова Н.И., Кутюрин В.М. К вопросу о методе выделения фотохимически активных пигмент-белковолшщдных комплексов хлоропластов, Биофизика, 20, 246-249, 1975.

..-;■/ . ' "■>, - 27 - : -л" ; Л' ; ■

10. Шутилова Н.И., Климов В.В., Шувалов В. А., Кутю-рин В.М. Исследование фотохимических и спектральных свойств субхлоропластных фрагментов .ФС-2, внсокоочищснных от приме-' си.ФС-І. ' Биофизика.20,844-847, 1975. ■ --л. .■.-/,■.''.

II* Щутилова Н.И;, Цутдрин B~,M.j Выделение ж исследова-

ние трех медов, пигыент-белковолиттидшх комплексов (ДБПК) хлоропластов: ІШЖ, ,содержащего реакционный центр ФС-І ПЕЖ, содеряіащего реакционный центр' ФС-2 и вспомогательного светособираюцего комплекса, Физиология растений, 23. 43-49. V ,

1976. ' . . ' . W. ■": "" . ■■■■'' ,'

І2..Щутилова Н.И., Жигальцова З.В;, |Кутюрин вЖ| Йссле^ : ; : у

дование фотоиндуциру емых изменений каротиноидного состава у изолированных пигмент-белковолипидных комплексов ФС-І и : v 'Î ' ■ ФС-2 хлоропластов гороха, Физиология растений, 2g, 452-459^ 1976. : ' : ' • • '

13. Гольдфелъд М.Г., Цапии А.И.', ¡Путилова Н.И., Ханіу- ; ' лов С.В.06 .оптическом поглощении при 700 нм и спектрах ЭПР хлоропластов : и субхлоропластных частиц, Биофизика, 2XL,, - ^ х 183-185,. 1976. ■" 'Л/ / V .. ,V--.

: ■ АдЬобашя работы. '¡¿атериады.диссертации докладывались на; конференции' молодых ученых Института фотосинтеза ; АН СССР У -, в 1971 г., на наумоЙ конферешіш Инсгатута фотосинтеза : АН СССР-в 1975 г.' Исследования по фотоиндуцарованным иэмене- _, нияи каротиноидногосостава у.изолированных комплексов; отра-; -жены в дшшдаяой работе,-удостоенной золотой медали на Все- сошном конкурсе дипломных работ 1974 года. ; : ■ : ' : ; ^ ■

; : :, ' т'Д ^Подкисаі:о к печати 23.CJ4.TC г. ' ГЗсКеэ 3-їІ7Р 'Лфат. ІЄ0 вкэ,7

О; "'■-'■ v "і'1-1 : ;Отпечатано в С1ГГ.1 щпГ.' ■ v ' ' '.