Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кислородвыделяющий пигмент-белковолипидный комплекс фотосистемы 2 хлоропластов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кислородвыделяющий пигмент-белковолипидный комплекс фотосистемы 2 хлоропластов"

г ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.М. ЭМАНУЭЛЯ

на правах рукописи

ШУТИЛОВА Надежда Ивановна

КИСЛОРОДВЫДЕЛЯЮЩИЙ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВОЛИПИДНЫЙ КОМПЛЕКС ФОТОСИСТЕМЫ 2 ХЛОРОПЛАСТОВ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени докторе.биологических наук

МОСКВА - 1997

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН

■Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кондрашова М.Н. доктор химических наук, профессор Комиссаров Г.Г. доктор биологических наук, профессор Самуилов В.Д.

Ведущая организация: Институт биохимии им.-А.Н.Баха РАН

Зашита состоится "¿5" Опрел 1997 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета д 200.53.01 в Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля по адресу: Москва, ул.. Косыгина, д.4

С диссертацией нежно ознакомиться в библиотеке Института

химической физики РАН (Москва. уп.КЬсьитша. 4)

Автореферат разослан: "¿22' Л/сиргь 19ду г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук - Смотряева М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Кислородвыделяющий комплекс (КВК) фотосистемы 2- (ФС-2) хлоропластов растений - это надмолекулярный пиг-<ент-белковолипидный комплекс (ПБЛК), в фотохимически активном центре которого осуществляется отрыв электрона от воды и передача его в шектрон-транспортную цепь хлоропластов для образования первичных «остановленных продуктов фотосинтеза. Данный комплекс наряду с юмплексом ФС-1 и светособирающим комплексом входит в состав фото-:интезирующих мембран хлоропластов и являтся одной из центральных труктур, определяющих их свойства. Кислородвыделяющий комплекс моет рассматриваться как главная энергопреобразующая система фотосин-етического аппарата растений., стоящая у истоков биогенного потока ещества. Фотосинтетическое окисления воды и выделение кислорода, роисходящее в комплексе,' обусловлено уникальными особенностями над-олекулярной организации КВК и является одним из самых волнующих и эинственных процессов фотосинтеза. Глобальный масштаб этого процес-а ( 10 ООО т Ог за секунду) и его значимость в круговороте веществ природе трудно переоценить. Этим объясняется чрезвычайная актуаль-зсть изучения механизма фотоокисления воды и исключительно высокий зкал исследований, посвященных этой проблеме на протяжении десятков !Т во многих ведущих лабораториях мира.

Исследование кислородвыделяющего комплекса хлоропластов растений значительной мере было предподготовлено фундаментальными работами области структурно-функциональной организации фотосистем хлоропла-ов, осуществленных как в работах наших крупнейших отечественных еных, так и зарубежных исследователей, создателей школ и направле-й: Красновского А.А., Влюменфельда Л.А..Евстигнеева В.Б. Годнева Н., Шлыка A.A.,Литвина Ф.Ф., Мокроносова А. Т. .Рубина A.B., Тар-вского И.А., Шувалова В.А. .Сапохникова Д.И..Островской Л.К.,Кочу-й С.М., Арнона Д..Аллена Р. .Арнтцена Ч..Барбера Дж..Дейзенса Л., гга Т..Торнбера Дж, Андерсон Д.,, и др. Одним из основополагающих ;тижений начального этапа изучения механизма фотосинтетического деления воды стало открытие водного происхождения кислорода фото-«■еза [Виноградов и Тейсс,1941; Ruben et al.,1941], которое было ¡гверждено в результате установления идентичности изотопного со-ша кислорода воды кислороду, выделяющемуся в процессе фотосинтеза шоградов и Кутюрин,1862; Кутюрин и др.,19643. Дальнейшее изучение :анизма фотосинтетического окисления воды было связано с необходимые) выделения и исследования субмембранного пигмент-белковолипид-о комплекса ФС-2, являющегося центром протекания данного процесса лоропластах растений. При этом было чрезвычайно важным сохранить

- s -

функциональную активность ПБЖ 5С-2 in vitro, что давало возможное? для адекватной расиифровки молекулярной организации комплекса.

Наибольший успех в исследовании КВК был достигнут в результат разработки теоретической и методической базы его структурно-функцио нального исследования [обзоры: Satoh, 1985; Renger, 1987; Говинджи 1986; Miyao and Murata, 1987; Babcock, 1987; Шувалов и Климов, 1987 Hansson, Wydrzynski, 1990; Andersson and Stiring; 1991; Debus, 1992 Verraaas et al.,19933. Бри этом важнейшую роль в развитии представле ний о принципах надмолекулярной организации пигмент-белковолипидног комплекса '1С-2 и прежде всего его реакционного центра (РЦ) сыграл рентгено-структурные исследования трехмерных кристаллов комплекса F пурпурных бактерий, состоящего из белков, гомологичных белкам реан ционного центра ФС-2 [Delsenhofer et al., 1984; Trebst, 1986; Miche and Delsenhofer,19881. На их основе, учитывая высокую степень ки сервативности аминокислотной последовательности белков РЦ для шире кого класса фотосинтезирующих организмов от бактерий до высших рас тений [Satoh,1992], был осуществлен достаточно обоснованно с испол! зованием метода компьютерного моделирования анализ пространственно? расположения интегральных, пронизывающих мембрану, белков РЦ ФС-2 определены расстояния между молекулами пигментов, участвующими первичном процессе фотохимического разделения зарядов [Svensson ! al.,1991; 1992; Andersson, Styring, 19923. Методами направленно] мутагенеза определены возможные лиганды для связывания редокс-акти: ных хромофорных групп комплекса и Мп -кластера CDebus et al., 198! Seibert et al., 1989; Nilsson et al.,1990; Diner et al.,1991; Rogr* et al.,1991; Nixon and Diner, 1992; Eggers and Vermaas, 1993; Мог al.,1993; Vermaas,19933. На основании спектральных исследований оц нены константы скоростей переноса электрона и расстояния между пе вичными переносчиками электрона в ФС-2 [Wasielewski et al.,1989; D and Sauer, 1992; Rutherford and Boussac, 1992; Babcock, 19953.

Несмотря на существенные достижения, исследование вопроса структурно-функциональной организации пигмент-белковолипидного ком лекеа ФС-2 и механизма его функционирования в процессе фотосинтет ческого окисления воды и образования молекулярного кислорода продс жает оставаться далеким от разрешения. Анализ проблемы показывае что ключевая роль КВК в фотосинтезирующих организмах, сложность е организации по сравнению со структурой РЦ ФС-2, уникальность проз кающда в нем фотохимических реакций, высокая лабильность кислород! деляющей функции комплекса и участка, связанного с окислением ва определяют задачу расшифровки его надмолекулярной организации f одну из центральных проблем фотосинтеза.

Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в прове-(ении всестороннего изучения кислородвыделяющего комплекса ФС-2 хло-юпластов высших растений и расшифровке принципов его структурной эрганизации и функционирования в процессе фотосинтетического окисления воды. Решение проблемы потребовало выполнение следующих вадач:

Создать методическую базу для получения и исследования субмемб-эанных пигмент-белковолипидных комплексов, являющихся основными звеньями фотосинтетического аппарата растений (ПБЛК СЕС-2, ПБЛК ФС-1 i вспомогательного светособирающего комплекса -ВС-ПБЛК) в условиях, обеспечивающих сохранность их фотохимической активности.

Провести исследование структурно-функциональных характеристик колированного ПБЛК ФС-2 и сопоставить их с характеристиками комп-юкса ФС-1 и светособирающего комплекса - ВС-ПБЛК. Выявить специфику )рганизации и свойств комплекса ФС-2.

Определить факторы, влияющие на структурную стабильность системы жисдения воды и образования молекулярного кислорода.

Провести исследование изолированного комплекса ФС-2, сохраняюще-■о способность к фотосинтетическому окислению воды. Сопоставить шойства кислородвыделяющего комплекса ФС-2 in vitro и в нативном «стоянии.

расшифровать принципы структурной организации и функционирования иолородвыделяющего комплекса ФС-2 хлоропластов.

Основные положения, выносимые на защиту. Настоящая раоита явля-тся приоритетным комплексным исследованием кислородвыделяющего пиг-ент-белковолипидного комплекса ФС-2 ламелл хлоропластов высших рас-ений. Ее главные результаты, выносимые на защиту, следующие:

- Создание методической базы для выделения и исследования ПБЛК амелл хлоропластов. Осуществление ключевых разработок методов выде-ения субмембранных препаратов: ПБЛК ФС-2, ПБЛК ФС-1 и ВС-ПБЛК; омплекса ФС-2, сохраняющего способность к фотосинтетическому окис-ению воды и образованию молекулярного кислорода (КВК); комплекса, богащенного содержанием РЦ ФС-2; высокоочищенных субхлоропластных рагментов ФС-2 (ДТ-20).

- Исследование структурно-функциональных характеристик изолиро-анного ПВЛК ФС-2 и их сопоставление с характеристиками ПВЖ ФС-1 и >ПБЛК, в результате которого-впервые были получены данные, свиде-ельстумцие о функционировании редокс-активного феофитина в качестве эрвичного акцептора электронов в ФС-2; о способности ПБЛК ФС-2 к этоиндуцированному выделению протонов, выявлены закономерности про-экания фотоиндуцированных изменений каротиноидов, получены данные о зрактере распределения спектральных форм хлорофилла и о молярном

соотношении, входящих в состав ПВЛК соединений.

- Исследование факторов, влияющих на стабильность и реконстру* цию кислородвыделяющей функции комплека, изучение коррелятивной cm зи между скоростью выделения кислорода и содержанием МГДГ, а тага факторов, определяющих фотокаталитическую активность КВК in vitre позволившее выдвинуть предположение о ключевой роли гидрофобных взё имодействий в системе окисления воды комплекса.

- Сравнительное исследование температурных зависимостей функда выделения кислорода, устойчивости Mn-связи и структурных переходе системы окисления воды, выявляемых методом дифференциальной сканиру ющей микрокалориметрии у субхлоропдастных препаратов, различающие по структурной иерархии и гипотеза о механизме термоинактивации прс цесса выделения кислорода в ФС-2, основанная на предположении о тег ловой диссоциации, идущей с выбросом эндогенного Мп, и распада н; тивного димерного КВК до мономерной формы, неактивной в процессе вь деления кислорода.

- разработка новых представлений о принципах надмолекулярной о{ ганизации кислородвыдедяющего комплекса ФС-2 и модели его устройст! основанной на предположении о существовании экранированной облает гидрофобного взаимодействия Д1-Д1 полипептидов димерного КВК и обрг эовании гидрофобного окружения ("когда") в зоне фотохимически окисления води, в результат« чего создаются благоприятные термодит мические условия для протекания многозлектронного процесса окислен! воды при фотосинтезе.

- Разработка схемы и последовательности реакций фотосинтетиче! кого окисления воды и выделения кислорода в структуре КВК.

Научная новизна.

1. Впервые создана комплексная методическая база с разработка методов получения субмембранных пигмент-белковолипидных комплекс фотосистем хлорошастов и препаратов ФС-2, большая часть которых б; ла достигнута со значительным опережением зарубежных аналогов. С Впервые разработан метод выделения высокоактивных субхлоропластн фрагментов '1С-2, высокоочищенных от примеси ФС-1 (частицы "ДТ-20" (Б) Впервые разработан эффективный, количественный метод одновреме ного выделения всех трех типов субмембранных комплексов: ПБЛК ФС-ПВЛК ФС-2 и ВС-ПБЛК. (В) Впервые на основе использования мутант ячменя разработан метод выделения комплекса ФС-2, значительно обог щенного содержанием РЦ ФС-2. (Г) Разработан новый метод получен кислородвыдедяющего комплекса ФС-2 (КВК).

2. Впервые, на основании структурно-функциональных характерно! изолированных ПВЛК показано:

функционирование в составе ПБЛК ФС-2 (выделенных из разных объектов: хлоропластов гороха, шпината и Chlamydomonas reinhardii) структурно связанного редоке-активного феофитина, играющего роль юрвичного акцептора электронов в ФС-2;

способность изолированного ПБЛК ФС-2 к фотоиндуцированному выде-¡ению протонов в присутствии акцептора электронов (что позволило ¡ыдвинуть предположение о протекании реакции фотогидролиза соедине-!Ия эндогенного марганца как части процесса фотоокисления воды);

специфика распределения спектральных форм хлорофилла в составе ЕЛК In vitro;

фотоиндуцируемые изменения каротиноидного состава у изолированных ПБЖ, свидетельствующие о защитной роли желтых пигментов в ПБЛК С-2 и о протекании реакций виолаксантинового цикла в ПБЛК ФС-1;

3. Изучены факторы, влияющие на стабильность ПБЛК ФС-2 при его ыделении из мембран и выявлена корреляция между снижением скорости ыделения кислорода и гидролизом моногалактозилдиацилглицеридов, на сновании которых впервые выдвинуто предположение о ключевой роли истемы гидрофобных связей в стабилизации центра окисления воды.

4. Найдены условия эффективной реконструкции функции выделения ислорода и рассмотрена роль белка 33 кДа и ионов Са2+ в стабилизации истемы окисления воды изолированного КВК и в составе мембран;

5. На основании изучения' температурных зависимостей функции вы-еления кислорода, устойчивости Мп-связи и структурных переходов ВК выдвинута новая гипотеза о механизме термоинактивации процесса ыделения кислорода в ФС-2, основанная на предположении о тепловой иссоциации димерного КВК до мономерной формы, неактивной в процессе ыделения кислорода;

5. Сформирорваны новые представления о молекулярной организации ВК и разработана новая модель его устройства, основанная на предложении о существовании экранированной области гидрофобного взаи-эдействия Д1-Д1 полипептидов в димерном КВК с образованием гидро-эбного окружения ("котла") в зоне фотолиза воды, в результате чего эздаются благоприятные термодинимические условия для протекания ■югозлектронного процесса окисления воды при фотосинтезе;

?. Предложена схема реакций фотосинтетического окисления воды и 5разования молекулярного кислорода в структуре димерного КВК.

Научно-практическая значимость работы.

Исследование имеет большое научно-практическое значение в изуче-ш фотосинтетического аппарата растений, механизма первичных про-5ССОЕ фотосинтеза и устройства системы фотосинтетического окисления зды. На основе ключевых разработок методов выделения субхлоропласт-

- б -

ных препаратов ФС-2 и субмембранных ПВЛК осуществлено широкое их использование в практических научно-исследовательских работах и совместных исследованиях. Это значительно продвинуло отечественные исследования в области фотосинтеза и способствовало прорыву в получение знаний об организации и функционировании ФС-2 хлоропластов растений. Так, на изолированных ПВЛК были получены первые основополагающие доказательства функционирования в РЦ ФС-2 редокс-активного феофитина i качестве первичного акцептора электронов и показана специфическа! принадлежность данной функции ФС-2 хлоропластов; определено значение равновесного окислительно-восстановительного потенциала Л680; оценено содержание прочносвязанного Мп и т.д. Одним из главных итого] этих исследований стало присуждение группе отечественных ученых Государственной премии.

В результате проведенных нами комплексных исследований по изуче нию сравнительных структурно-функциональных характеристик изолиро ванных комплексов разработаны новые представления о надмолекулярно организации КВК,- раскрывающие по новому принцип устройства и работ системы окисления воды. Предложенная модель организации нативног КВК получила идейное подтверждение в независимых работах зарубежны коллег. На ее основе нами создана гипотеза о механизме термоинакти вации функции выделения кислорода, позволившая объяснить причину вы сокой термолабильности системы окисления воды хлоропластов, пробле ма, которая давно интересовала ученых. Можно также предположить, чт разработка гипотетической схемы реакций фотосинтетического окислени воды и образования молекулярного кислорода послужит дальнейшему пол ному раскрытию механизма этого процесса..

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и оС суждены на многих международных и всесоюзных съездах, симпозиумах конференциях и совещаниях: II Всесоюзный биохимический съезд (Тал кент,1969); Всесоюзная конференция "Биология и научно-техничесю прогресс" (Пущино,1971); Всесоюзная конференция "Итоги исследован! механизма фотосинтеза" (Пущино,1974); Всесоюзное совещание "Физиода го-биохимические аспекты устойчивости растений к неблагоприятш факторам внешней среды" (Иркутск,1976); Всесоюзное совещание "Эвсш ционная биохимия и происхождение жизни" (Ереван,1978); Symposium t the problem "Structure and Function of the Photosynthetlc Apparatu (Берлин,1979); Symposium on the Solar Energy Conversion and Storag (Варшава, 1980); Международное совещание стран членов СЕВ "Исследов ние биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата связи с преобразованием солнечной энергии" (Пловдив,1981); Всесою ная конференция "Кинетика и механизм электронного переноса в белк

вых системах и их моделях" (Вильнюс,1985) ; Всесоюзная конференция "Фотосинтетическое выделение кислорода" (Пушино.1985); V Советско-швейцарский симпозиум "Biological membranes: Structure and Function" (Рига, 1988); Всесоюзная конференция "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" (Пущино,1989); Международная конференция "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущи-но.1991); Международный семинар "Фотосинтетическое окисление воды" (Пущино,1992); Всесоюзная конференция "Успехи исследования фотосинтеза" (Пущино.1994); Международная конференция "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино,1996); Объединенный семинар кафедры биофизики био-ногического факультета МГУ (1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 научных забот в ведущих отечественных и зарубежных журналах и сборниках; поручено 3 авторских свидетельства на изобретения.

Методические аспекты работы. Для выделения комплексов и субхло-гапластных препаратов. ФС-2 в качестве исходных объектов служили хло-зопласты растений гороха, шпината, пшеницы, ячменя, мутантов и гиб-зидов гороха и мутантов ячменя, а также культура водоросли Chiamydo-nonas reinchardli. Использован широкий набор методов исследования:

Метода анализа химического состава: спектрофотометрическое опре-1еление хлорофиллов, тонкослойная хроматография'каротиноидов, грави-(етрический анализ липидов, анализ цитохромов и концентрации РЦ ме-'одом разностной спектрофотометрии. Применяли следующие методы фрак-даонирования белковой химии: гельфильтрацию, ионобменную хроматографию, электрофорез, дифференциальное центрифугирование.

№шдн определения фопгокаталитческой аштвпоегш изолированных юмплексов, хлоропластов и субхлоропластных фрагментов определяли по :корости выделения молекулярного кислорода, измеряемой полярографи-:еским методом, по скорости выделения протонов (методом высокочув-таительной рН-метрии), по скорости фотовосстановления экзогенных [кцепторов электрона, измеряемой спектрофотометрически, при этом 1ыстрые фотоиндуцируемые изменения поглощения и флуоресценции изме-1яли на специальной установке с фосфороскопом [Каралетян и др,19731.

Спектральные исследования и методы физико-химического анализа: зучали спектры поглощения комплексов, хеми- и фотоиндуцированные пектры поглощения реакционных центров, спектры второй производной огдощения, спектры низкотемпературной флуоресценции, проводили томно-абсорбционный анализ содержания металлов, исследовали темпе-атурную зависимость теплопоглощения комплексов методом дифференци-льной сканирующей микрокалориметрии, использовали электронную мик-оскопию.

- з -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Разработка методов выделения пигыент-белковадипидашх комплексов фотосинтезирующих мембран хлоропластав

Метод выделения субхлороплкзглых фрагментов ФС-2, високоочищея-иых ж примеси ФС-1 (частеш "ДТ-20"). Получение субхлорапластных фрагментов, обогащенных содержанием SC-2, достигавшееся в результате солюбилизации тилакоидов поверхностно-активными веществами и последующем отделении "тяжелой" фракции дифференциальным центрифугированием [Anderson and Boardman,1966; Thornber and Gregory, 196?; Wessels, 19683, упиралось в проблему достижения максимально полного отделения примеси ФС-1. Разработка метода выделения высокоочищенньи субхлоропластных фрагментов ФС-2 была нами сделана в результате выявления условий полной и мягкой экстракции комплекса ФС-1 из ламели хлоропластов. Сущность метода была в следующем. Тидакоиды хлороплас-тов подвергали сначала мягкой обработке ультразвуком и 0.4Z дигито-нином в присутствии 2% NaCI в сахарозо-фосфатном буфере при концентрации хлорофилла 0,15-0,20 мг/мл (40 мин), а затем выделяемую дифференциальным центрифугированием фракцию фрагментов 4 Tuc.g., обрабатывали 0,15% тритоном Х-100 и осаэдали при 20 тыс. g-, Полученный осадок дигитонин-тритон-солюбилизированных частиц ("ДТ-20") представля. собой субхлоропластные фрагменты, практически полностью очищенные о1 комплекса ФС-1. Их спектральная характеристика дана на рис.1. Части цы ДТ-20 характеризовались отсутствием полосы флуоресценции при 73 нм, излучаемой длинноволновыми формами хлорофилла (Хд), типичным для ФС-1, тогда как в хлоропластах и частицах Д-20, где присутствуе ФС-1, имела место эффективная миграция световой энергии на длинно волновые формы Хд с последующим излучением при 735 нм. Отсутстви примеси ФС-1 подтверждалось крайне незначительным содержанием Л700 скорости реакции фотоокисления ДХФЙФ.На (табл 1), специфичной дл ФС-1. Сохранность функциональной активности ФС-2 тестировалась п способности к световой индукции флуоресценции (ДФ>) и скорости реак шш фотоокисления воды с выделением кислорода. Полученные фрагмент нашли широкое применение для изучения механизмов фотореакций ФС-2.

Метод выделения пигмент-белковолтиддых комплексов ИС-1, ФС-2 свевюсобиращего комплекса хлоропласта» высших растений. Сложное! биохимической задачи выделения пигмент-белковолипидных комплексе фотосинтезирувдих мембран хлоропластов была обусловлена гетерога ностыо состава ПБЛК, водонерастворимостью, их включением в структу{ мембран , а также отсутствием ясной и полной информации об их свойс

Таблица 1

Характеристика пигментного состава,- фотохимической активности и способности к ДФ высокоочищенных фрагментов ФС-2 (ДТ-20) до сравнению с исходными хлоропластами, обычными фрагментами Д-20 и комплексом СС-1. Скорость фотоокисления 1Г700 и ДХФИФ. Нг измеряли в одинаковых условиях в присутствии 25 мкМ ДХФИФ, 30 мкМ аскорбата натрия, 100 мкМ метшшиологека и 10 мкМ диурона.

-1-1-1-1 I—

II I I I

5разец | Хд а | ДО при 700 нм |Фотоокисление ДХФИФ. Н21 Ф |ДФ | Ха б | ед.о.пл.х Ю3 | мкмоль /мг Хл .час | | . | |нА 30 мкг Хл/мл| I |

_I_I_I_|-1—

горо-

1асты 2.4 8.5 142 12 62

■-20 1.4 0,21 0.6 22 47

-20 2.1 3,2 15 16 45

!ЛК ФС-1 7.8 31 96 3 0,1

1,отн.ед.

8 -

4 -

2 -

Рис.1.

Спектры низкотемпературной ( - 196°С ) флуоресценции хлоропластов (1), субхло-ропластных фрагментов Д-20 (2),- выделяемых по методу [ Anderson and Boardman, 19663 и спектр флуоресценции высокоочищенных суб-хлоропластных фрагментов "ДТ-20" (3)

660

700

740

780 К

6

твах. Методическая трудность состояла не только в том, чтобы разде лить комплексы, но и в том, чтобы не допустить.их-денатурации пр выделении, сохранить присущую им структуру и свойства. Используемы приемы выделения были основаны на применении солюбилизации детерген тами, центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, ионобменно хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле [Vernon е al.,1972; Wessels et al.,1973; Thoraber,19753. Наиболее существенны успех был достигнут нами в результате отработки условий хроматогра фического разделения комплексов на ДЗАЭ-целлюлозе и повышения эффек тивности очистки препаратов ПБЛК на основе введения стадии предвари тельного отделения светос-обирающего комплекса, основного в количест венном отношении комплекса мембран (содержит > 70% всего хлорофилл и > 40%. всего белка мембран хлоропластов).

.Схема разработанного нами метода выделения субмембранных пиг мент-белковолипидных комплексов была следующая. Первая стадия состо яла в получении лизированных хлоропластов, отмытых от водораствори мых белков стромы и белков АТФ-азного комплекса, и их солюбилизаци 3,3%-ным тритоном Х-100 при соотношении тритон/хлорофилл (Т/Хл) равном 50:1 мг/мг, в среде 0,4 М сахарозы, 5 мМ трис-HCI буфера (р 8,0), 5 мМ MgCI2 и 1 мМ аскорбата в течении 1 часа при 0°С. Дале несолюбилизированный материал отделяли центрифугированием и наслаи вали супернатант на колонку ДЭАЭ-целлюлозы. Сорбированные на колони комплексы промывали от избытка тритона Х-100 и солюбилизированны пигментов уравновешивающим буфером, содержавшим 0,05% тритон и 5 ы трис-HCI буфер, pH 8,0, и затем злюировали 0,3 М NaCl.

Ключевой стадией процесса выделения комплексов была процедур отделения ВС-ПВЛК, основанная на его преципитации в присутствии О, М NaCI из раствора суммы солюбилизированных комплексов при снижен» концентрации тритона до критической концентрации мицеллообразования Эффективность и полнота отделения светособирающего комплекса бш. достигнуты вследствие использования таких свойств ВС-ПБЛК как высс кая насыщенность его компонентами гидрофобной природы: пигментам} липи^ами и гидрофобными белками (см. гл.2). В свою очередь полнот отделения ВС-ПБЛК имела решающее значение для последующего раздел« ния комплексов ФС-1 и ФС-2 на заключительной хроматографической ст; дии процесса - их очистке и дробной злюции 75 и 200 мМ NaCI на ДЭА' целлхшозе.

Разработанный хроматографический метод выделения субмембранш комплексов был первый количественный метод их получения, позволявнп выделять одновременно все три вида препаратов субмембранных комлле> сов: ПБЛК ФС-1, ПБЛК ФС-2 и ВС-ПБЛК. Существенно важным было и :

)бстоятельство, что в методе, было реализовано эффективное разделение ■омплексов от взаимозагрязняющих примесей при хорошей сохранности функциональной активности комплексов ФС-1 и ФС-2 (см. гл.II). Кроме гого, в данном методе был впервые достигнут высокий количественный зыход получаемых препаратов комплексов: для светособирающего комп-чекса он составлял 25-30Z, а для комплексов <10-1 и ФС-2 - 5-7% (по (лорофиллу), пропорционально их содержанию в исходных мембранах'. Эффективность метода обусловила его широкое распространение. Не слу-1айно, что наиболее важные достижения этого периода, включая установление природы первичного акцептора электронов в ФС-2, определение тнимально необходимого числа связанных атомов Мп в реакционном ¡ентре ФС-2, измерение редокс-потенциала П680, спектральных форм ¡лорофилла и другие работы были выполнены с использованием данных ¡репарагов ПБЛК [Klimov et al al.,1977; Клеваник и др.,1977; Климов ! др.,1979-1982; Вершинин ,1988; Zakrzhevski et al.,1979; Щербакова [ др.,1980; Кадошникова и др.,1985; Стадничук,19953.

Метод выделения комплекса ФС-2, обогащенного содержанием реаяци-тного центра. Для решения данной задачи мы использовали хлоропласта |утантов ячменя, лишенных Хл б, отсутствие которого свидетельствова-ю о нарушении светособирающей антенны у этих растений. Эксперимен-■альные исследования показали, что при солюбилизации ламелл мутантов [чменя и последующем хроматографическом разделении комплексов на ДЗ-.Э-целлюлозе увеличивается выход фракции солюбилизированных пигмен-■ов, повышается эффективность разделения комплексов ФС-1 и ФС-2. При том выделяемые препараты комплекса ФС-2 содержат меньше антенного S и обогащены содержанием фотоактивного феофитина (Хл/Фео = 300). В ряде экспериментов в условиях более длительной промывки комп-:ексов, адсорбированных на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешивающим буфером, ыли получены препараты комплекса ФС-2, характеризующиеся соотноше-ием Хл/Фео, равным 19-20. Данный прием, введения длительной очистки БЛК In situ на поверхности гранул ионобменника, был использован при азработке метода выделения РД ФС-2 [Nanba and Satoh,19873.

Выделение нашивного (предположительно мшерного) комплекса ФС-2, охраняющего способность к фотосинтепыческону окислению воды с виде-ением кислорода (KBKJ. Анализ ПБЛК ФС-2 на кислородвыделяюшую ак-ивность длительное время не давал положительного результата. Было ыдвинуто предположение (см. гл.У,V1) о возможной диссоциации натив-ого комплекса в процессе его выделения. В результате такой диссоци-ции мог происходить распад исходного лабильного димера КВК и обра-ование мономерного комплекса ФС-2, сопровождавшееся потерей его ислородвыделяющей активности, но при этом мономерный комплекс сох-

ранял устойчивое структурно-функциональное ядро и высокореакциош состояние РЦ. Исходя из предположения о диссоциации КВК, мы прове подбор условий солюбшшзации,' препятствующих протеканию данного щ цесса. Это позволило нам получить комплекс ФС-2, сохраняющий фунга. выделения кислорода, и провести его исследование (гл.У). Изучен закономерностей термоингибирования функции ввдедения кислорода иг лированного КВК по сравнению его состоянием в мембранах стало кт\ к пониманию принципов молекулярной организиции КВК ln vivo и его í мерной структуры (гл.VI,VI]).

Таким образом, в результате длительных экспериментальных noi ков, проведенных нами в период 1970-1990 гг., были осуществлены kj чевые разработки методов выделения субхлоропластных препаратов неширокое использование получаемых препаратов комплексов наряда внедрением разработанных методов в практику научных исследова! имело решающее значение в осуществлении значительного, опережающ« прорыва отечественных исследований в области изучения структ] но-функциональной организации ФС-2 хлоропластов.

II. Исследование структурно-функдиональних характеристик изолировании* ПБЛК

Первичное фоторазделение зарядов в реакционном центре ПБЖ ОС Доказательство функционирования феофитша в качестве первичного , цеплюра электронов. В реакционном центре изолированного компле ФС-2 осуществляется эффективный процесс трансформации энергии пог щенного кванта света в химическую энергию разделенных зарядов с разованием первичной пары (П680+ Фео~), где молекула фотовозбужд ного хлорофилла П680 становится первичным донором электрона, а мо кула фотоактивного феофитина - первичным акцептором электрона, открытии и исследовании механизма этого процесса большую роль сыг ли работы, которые впервые были выполнены на изолированных н комплексах [Klimov et al,1977; Клеваник и др,19773.

Спектральные доказательства первичного переноса электрона в ФС-2 изолированного комплекса ФС-2 были получены в результате изу ния фотоиндуцируемых изменений поглощения в восстановительных окислительных условиях. В присутствии дитионита, когда затрудняе отток электронов на пластохиноновый пул и Од предварительно восс новлен в темноте, наблюдается накопление фотовосстановленного Фес характерной полосой выцветания при 685 нм, в то время как'в прис} твии окислителя феррицианида, когда затруднена подача электроно!

),4. Дифференциальные спектры поглощения (свет минус темнота) К ФС-2 при Eh = -490 мВ (А) и при Eh =+520 мВ (Б) в присутствии жшита или феррицианида, соответственно. В - сумма спектров А и Г - ПБЛК из мутанта А-55 Chi. relnhardii. дефицитного по ФС-1.

окисленный Б680 наблюдается сигнал фотовыцветания данного пигменгс (рис.2,3). В темноте система возвращается в исходное состояние. Дифференциальный спектр фотоиндуцируемых изменений поглощения в обласп 400-800 нм представлен на рис 2. В восстановительных условиях наблюдается выцветание полос при 415, 430, 515 и 540 и появление полос при 450-500 нм 570 нм. Эти изменения поглощения практически совпадают с дифференциальным спектром поглощения, вычисленным как сумма спектров П680 и фотовосстановления Фео (рис.2).

Проведенные нами исследования показали, что фотоактивный феофи-тин структурно связан с РЦ ФС-2 и присутствует в препаратах ПБ® ФС-2, выделяемого как из высших растений, так и из водорослей. Для доказательства функционирования Фео в ФС-2 были проведены параллельные исследования на изолированных комплексах ПБЛК ФС-1 и ВС-ПБЛК. Е результате измерений фотоиндуцированного сигнала Фео- у этих препаратов обнаружено не было, что доказывало исключительную принадлежность редокс-активного феофитина реакционному центру ФС-2.

Для проверки предположения, что феофитж может образовываться из хлорофилла npi действии детергента, мы провели изучение влияния детергента на величину спектралз ных эффектов (ДА), связанных с восстанс влением феофитина. Исследования.показал] что величина ДА не только не возрастал; при действии детергента, но даже снижалась на 15- 20%. Полученные данные показывали, что фотовосстановление Фео представляет собой фотореакцию, характерную для функционально активных РЦ ФС-2.

Рис. 3. Кинетика фотоиндуцированных из менений поглощения ПВЛК ФС-2: Mees ~ фотовосстановление Фео в присут ствии 2 мг дитионита натрия и 5 мкМ ме тилвиологена: ДАбво - фотоокисление П68 в присутствии 1 мМ феррицианида. Сверху - свежевыделенный препарат комплекса по еле гельфильтрации на сефадексе; снизу соответствующие изменения после 3 дне хранения при 5°С.

ДАЭД5 ДАеда

I 1 I

L

10s

( !

г

t t

Реакции электронного транспорта. Благодаря первичному фотохимическому разделению зарядов изолированный пигмент-белковолипидный комплекс ас-2, как и комплекс ФС-1, способен фотокатализировать пе-эенос электрона от искусственного донора электрона к искусственному акцептору. Строго специфическим экзогенным донором электронов для СС-2, как было показано [Vernon et al.,1971,1972], является дифенил-*арбазид (ДФК) и реакция фотовосстановления дихлорфенолиндофенола от ;ифенилкарбазида является функцией, присущей только изолированному комплексу ФС-2. Эта реакция широко использовалась нами для обнаруже-шя и оценки фотокаталитической активности комплекса ФС-2. Исследование полученных нами препаратов ПБЛК ФС-2, выделенных как из хло-юпластов, так и из субхлоропластных фрагментов 'Ю-2, показало их шсокую активность в данной реакции (табл.2). При этом существенно ¡ажным был тот факт, что изолированный комплекс ФС-1 такой актив-гостью не обладал. Это свидетельствовало о хорошем разделении комп-1ексов ФС-1 и ФС-2, достигнутом в результате разработки изложенного ¡ыше метода их получения. Среди других акцепторов электрона в реак-(иях, катализируемых изолированный ПБЛК ЗС-2, эффективными также бы-ш феррицианид, силикомолибдат, фенил-п-бензохинон и дихлор-бензохи-юн. Для комплекса ФС-1 была характерна реакция фотовосстановления !АДФ+ в присутствии белков переносчиков электрона: пластоцианина, :ерредоксина и НАДФ-редуктазы. ВС-ПБЛК фотохимической активностью в «ислителльно-восстановительных реакциях не обладал.

Фотоиндуцированное выделение протонов. Не смотря на то, что кис-ородвыделяющей активности у изолированного комплекса <КЗ-2 обнаруже-о не было, нам удалось впервые выявить (рис.4.) способность ПБЛК С-2 к фотоиндуцированному выделению протонов в присутствии акцепто-а электронов феррицианида. Этот процесс усиливался экзогенным МпС1г подавлялся при повышении температуры от 35 до 42°С (рис.5). Важной инетической особенностью фотоиндуцированного выделения протонов омплексом ФС-2 было существование быстрой и медленной фазы их выхо-а в среду. Быстрая фаза отсутствовала при повторном освещении комп-екса. Кроме того, характерной особенностью быстрой фазы выделения ротонов была ее более высокая чувствительность к действию повышен-эй температуры в отличии от медленной фазы. Параллельное исследова-ие на изолированных комплексах ФС-1 и ВС-ПБЛК, проведенное в анало-лчных условиях, показало, что фотоиндуцированное выделение протонов этих комплексов полностью отсутствовало.

Выявление данной функции у комплекса ФС-2 позволило предполо-ш>, что эндогенным источником протонов в этом процессе могли быть элекулы воды, структурно связанные [Кутюрин,19793 с фотолитическим

Таблица 2

Фотохимическая активность пигмент-белковолипидных . комплексов хлоропластов, мкмоль /мг Хл.час

комплекс 1 I Фотовосстановление ДХФИФ | эндогенное | от ДФК ■ 1 1 ! Фотовосстановление I НАДФ+ от ДХФИФ.Нг I

ПБЛК ФС-1 \ о 0 36

ПБЛК1ФС-2 I 12,6 +0,5 95 -

ПБЯК2ФС-2 1 4.8 +0,5 53 -

ВС-ПБЛК 1 0 | 0 0

рн V

1,9

6.3

7,0

О /

Время, мин

1Н*втм. ед. 100

- В.60

- В. ВО

27 30

40 50г Температура, С

г 3

■Время, мин

Рис. 4-А. Фотоиндударованное выделение протонов лизированными хло-ропластами гороха. Рис. 4-Б. Фотоиндуцированное выделение протонов комплексом ФС-2 (а) и влияние добавок экзогенного МпСНг (0,18 мМ) на этот процесс.

—Рис. 5. Термоинактивация фотоин-дуцированного выделения протонов лизировалными хлоропластами (1) и ПЕЛК ФС-2: 2 - общее ингибирование процесса; 3 -то же +0,18 мМ МпС1г; 4 - ингибирование быстрой фазы выделения протонов без МпСПг.

омплексом ФС-2. При этом под действием света, по-видимому, происхо-ит фотосенсйбилизированное окисление катионов Мп2+, эндогенно свя-анных с лигандными группами РЦ ФС-2. Образующийся Мп+3 присоединяет идроксил воды с образованием гидроксида трехвалентного марганца и ри этом происходит подкисление среды за счет не связанного протона оды. Таким образом, протекающий по нашему предположению фотогидро-из соединения марганца в структуре комплекса ас-2, является одной з причин наблюдающегося фотоиндуцированного выделения протонов. При обавлении экзогенного раствора MnCI2.наблюдалось многократное уси-ение сигнала изменения рН. Частичное поглощение протонов после вык-ючения света могло быть связано с протонированием.ионогенных групп омплекса.

Анализируя полученные результаты, можно было предположить, что золированный комплекс '1С-2, утративший при солюбилизации и выделе-ии из мембран функцию образования кислорода, однако сохраняющий эн-эгенный структурно связанный Мп, обнаруживает протекание первой гадии процесса, ведущего к фотолизу воды, а именно фотогидролиз сочинения эндогенно связанного марганца.

Исследование спектрально-флуоресцентных характеристик. Хлорофилл его спектральные формы. В результате анализа компонентного состава золированных комплексов (табл.3) была сделана оценка молярного со-эржания основных соединений (хлорофилла, каротиноидов, цитохромов, элков и липидов), входящих в состав ПБЛК ФС-1, ПБЛК ФС-2, выделяе-jx из ламелл хлоропластов и фрагментов, и в состав ВС-ПБЛК. Можно вдеть, что комплексы, обогащенные реакционными центрами, характери-эвались по пигментному набору преимущественным содержанием Хл а 5-7 кратным) по сравнению с Хл б, в то время как величина соотноше--ая Хл а/Хл б светособирающего комплекса имела значение 1,2. В фун-зментальных работах Красновского и др. [1952-1962], Литвина и др. 1964-1975] и Гуляева и др. [1967-1990] было выдвинуто и обосновано эедположение о существовании в клетках фотосинтезирующих организмов гскольких состояний (форм) хлорофилла. Исследование спектров погло-зния (рис.6) и низкотемпературных спектров второй производной пог-эщения и флуореценции комплексов ФС-1, ФС-2 и светособирающего эмплекса (рис.7-9) выявило существенные различия между комплексами з набору спектральных форм хлорофилла, входящего в их состав. Это прмы с максимумом поглощения при 670, 679, 688 и 696 нм для ПБЛК >1 с соответствующим максимумом низкотемпературной флуоресценции )И 725 нм; формы с максимумом поглощения при 670, 679 и 682 нм для ЗЛК ФС-2 с соответствующим максимумом низкотемпературной флуорес-гнции при 685 нм и плечом при 696; и наиболее коротковолновые формы

Таблица 4

Компонентный состав изолированных пигмент-белковолипидных комплексов хлоропластов гороха, кмоль/100 нмоль Хл

1 компонент | 1 _ _ - —,-ПВЛК ЗС-11 1 ПБЛК1ФС-21 | 1 ПБЖ24С-2| I ВС-ПБЛК

1 Хлорофилл а | 88,80 82,80 77,30 54,60

Хлорофилл б | 11,20 17,20 22,70 45,40

Хл а /Хл б | 7,9 4,8 3,4 1.2

й- .лротин | 10,60 7,38 7,56 2,28

Виолаксантин | 0,58 0.80 1,00 1,69

Лютеин | 0,70 3,80 4,17 8,20

Антераксантин | 0,33 0,82 0,98 2,05

Неоксантин | 0,42 0,33 0,50 4,24

Каротин/сумма |

ксантофиллов | 5,21 1,27 1,15 0,14

Цитохром í | 0,60 0,07 0,08 0

Дитохром Ьб 1 0,91 0 0 0

Цитохром №59 | 0 3,4 2,0 0

Общее содержа- |

ние липидов.мг | 0,09 0,38 0,41 0,29

Белок, мг | 0,45 2.10, 1,90 0,21

Хлорофилл/11700 | 1 60 - - -

Рис. 6 Спектры поглощения пигмент-белковолипидных комплексов, изолированных из хлоропластов гороха: 1 - ПБЛК ФС-1, 2 - ПБЖ •ХС-2, 3 - светособирающий комплекс, ВС-ПВЛК.

А.отн.ед.

650

Г.отн.ед.

676 679

< / 725

/ г А

669/ 1 I

К 688 / 1

к696 / 1

3 \

1 ... . 1 . . -1—|—1—■ 1 1 1 1 1 1 1 1 , 1

700

650

700

750 нм

Рис.7 Спектральная характеристика ПБЛК

ФС-1 при 77 К:

1-

.-спектр поглощения, £ - спектр второй производной поглощения и 3 - спектр Флуоресценции

А,отн.ед.

Р,отн.ед.

Рис.8. Спектральная характеристика све-тособкрающего комплекса ВС-ПБЖ при 77°К: 1 -спектр поглощения, 2 -спектр второй производной поглощения, 3 -спектры флуоресценции.

650

700

650

700 750 нм

А.отн.ед.

F.oth.e.rt.

650 701) 650 700 750 нм Рис..9 Спектральная характеристика ПВЛК ФС-2 при 77°К: 1 - спектр поглощения, 2,3 - спектры второй производной поглощения (3 - после дополнительной очистки от ВС-ПВЛК с помощью высаливания) и 4 - спектр флуоресценции

I

2

С

540 ¡10 МО ¡40 НО ¡30 ¡40 ¡50 ¡ВОни

Рис. Ю Электрофорез полипептидов субхлоропластных фрагментов (1) и ПБЛК ФС-2 (2) в присутствии LiDS

Рис.11. Темновые разностные (восстановленный минус окисленный) спектры поглощения цитохромов, входящих в состав изолированных комплексов: А - ПВЛК ФС-1, Б - ПВЛК ФС-2 и В - ВС-ПВЛК при комнатной температуре. Пунктирной линией обозначены спектры аскорбат минус феррицианид, сплошной линией - дитионит минус Феррицианид. Концентрация хлорофилла - 40 мкг/мл

были характерны для светособирающего комплекса - с максимумом поглощения при 648, 660, 669 и 676 нм. Методом ингибиторного анализа при действии циклогексимида и хлорамфеникола было показано, что образование длинноволновых форм хлорофилла связано с процессом биосинтеза белка, контролируемого геномом хлоропласта, в то время как образование коротковолновых форм хлорофилла связано с биосинтезом белка, контролируемого ядерной ДНК. Полученные результаты были подтверждены литературными данными CMiayo and Murata, 19871.

Фотоиндуццруемые превратная каротпаидов. Для комплексов ФС-1 и ФС-2 было характерным существенное, 2-5 кратное, преимущество молярного содержания Б-каротина по сравнению с ксантофиллами (табл.3). При этом, в составе ВС-ПБЛК содержание ксантофиллов почти в 10 раз превосходило содержание в-каротина. Благодаря количественному методу выделения комплексов нам удалось провести прямое исследование фото-индуцируемых изменений их каротиноидного состава. Было показано, что в комплексе ФС-2 каротиноиды подвергаются фотодинамическому выцветанию, связывая активные формы кислорода, и тем самым защищают другие структурные компоненты комплекса от фотодеструкции. Схема механизмов, посредством которых каротиноиды выполняют защитную роль, предполагает их участие в инактивации триплетных форм хлорофилла, образующихся на свету и вызывавших образование синглетного высокореакционного кислорода [Krlnsky,19713. Сравнение закономерностей процессов фотодеструкции зеленых и желтых пигментов в структуре комплекса и в ацетоновом растворе тех же пигментов, где их выцветание подчиняется закону действия масс, показало важную роль пространственного сопряжения каротиноидов и хлорофиллов в составе комплекса ФС-2 для проявления их защитного действия. Параллельное исследование функций каротиноидов в составе изолированного комплекса ФС-1 выявило протекание в нем реакций виолаксантинового цикла. При этом на свету протекает реакция дезэпоксидации виолаксантина с образованием моноэпоксидного ксантофилла - антераксантина. Обнаруженные закономерности свидетельствуют об активном участии каротиноидов комплексов ФС-1 и ФС-2 в процессах, сопровождающихся связыванием активных форм кислорода хло-юпластов.

Полтептдиш состав. Сравнительное исследование изолированного юмплекса ФС-2 и субхлоропластных фрагментов ФС-2 показало (рис.10), ito полипептидный состав ПБЛК ФС-2 представлен белками с молекуляр-юй массой 47, 43, 33, 32, 30, 9 и 4 кДа. Полипептиды 47 и 43 кДа ^ответствуют белкам внутренней светофокусирующей антенны комплекса С-2 (СР47 и СР43); белки 32, 30, 9 и 4,5 кДа соответствуют белкам Ц ФС-2 CNanba and Satoh,1987; Barber and Chapman,1987]; белок с мо-

лекулярной массой 33 кДа - это наружный гидрофильный белок, участвующий в стабилизации системы окисления воды кислородвыделяющего комплекса хлоропласте® ÍHansson, Wydrzynsky,1990]. Для субхлоропластных фрагментов ФС-2 в отличии от комплекса ФС-2 было характерным высокое содержание полипептидов входящего в их состав ВС-ПБЛК с молекулярной массой 24-29 кДа. Белковый состав комплекса ФС-2, выделяемого нами с помощью тритона Х-100, был идентичен белковому составу соге-комплек-са, выделяемому с помощью октил-в-Б-глюкозида [Ghanotakis, Yo-cum,1986; Ikeguch, Inoue,1985;), дигитонина [Tang, Satoh,19851 или додецил-ц-D- мальтозида [Irrgang et al.,19881.

Цшюхром 6559. Наиболее характерным признаком выделяемого комп-лекса'ФС-2 являлось присутствие в его составе цитохрома Ь559, содержание которого в комплексе достигало 3-4 нмоль на 100 нмоль Хл. Онс оценивалось на основе разностных (восстановленный минус окисленный) спектров поглощения комплекса <ЗС-2 (рис.11). В присутствии дитионите выявлялась низкопотенциальная форма цит.Ь559, а в присутствии аскор-бата-йа его высокопотенциальная форма, составлявшие 80Z и 20Z, соответственно. В комплексе ФС-1 и ВС-ПБЛК этот цитохром полностью отсутствовал.

Липиды. Общее весовое содержание липидов в составе изолированны: комплексов (табл.3) определялось гравиметрическим способом при анализе их хлороформ-метанольных экстрактов. Были установлены следующи закономерности: относительное содержание непигментных липидов в расчете на 100 нмоль хлорофилла было максимальным в комплексе ФС-2, , именно в 4 раза выше, чем в комплексе ФС-1 и в 1,2 раза выше, чем светособирающем комплексе. Однако, расчет величины относительног содержаниия липидов на 1 мг белка давал примерно равные величины дл комплекса ФС-1 и ФС-2 (около 0,2), в то время как у светособирающег комплекса данная величина была равна 1,5. Это свидетельствовало преобладающем вкладе липидных компонентов в состав светособирающег комплекса и было использовано нами при разработке способа его зффен тивного отделения (гл.1). Хроматографический анализ липидов ПШ ФС-2 показал преимущественное содержание МГДР и ДГДГ в составе комг лекса. Это соответствовало данным и ряда других исследователей, вы? вивщих обогащенность core-комплекса содержанием данных липидов [Mi rata et al.,1990; Bassi and Dainese, 19921 и показавших, что гала! толипиды преимущественно локализуются в составе СР4? и СР43. Инт< ресно, что хлорофилл-белок СР47 главным образом содержит МГДГ, об< гащенный насыщенными жирнокислотными остатками СTremolieres i al.,19941. Это предполагает его важную роль в поддержании конформ. ционной стабильности ядра комплекса ФС-2.

Концентрация реакционного центра в комплексе ФС-1 оценивалась по содержанию П700 и составляла 1 молекулу П700 на 60 молекул хлорофилла. Эта величина была первоначально получена на основе измерений ДА хемииндуцированных разностных (окисленный- минус- восстановленный) спектров поглощения комплекса ФС-1 и затем подтверждена измерением фотоиндуцированного сигнала 11700. В комплексе ЗС-2 содержание реакционного центра, оцениваемое по концентрации фотоактивного феофити-на, определяли по величине ДА сигнала "свет- минус- темнота" в присутствии сильного восстановителя дитионига (рис. 3). Оно составляло 1 моль на 40-50 моль хлорофилла.

Концентращя эндогенно связанного марганца в составе изолированного комплекса ФС-2, оцениваемая нами методом атомно-абсорбционного анализа, составляла 2-3 атома марганца на 100 моль Хл. То обстоятельство, что часть атомов марганца остается связанной со структурой изолированного ЛБЛК ФС-2 после действия детергента поддерживает полученные ранее данные о гетерогенности пула марганцевого кластера и о существовании фракции прочносвязанного Мп [КНпгоу е1 а1.,1982; Ал-лахвердиев и др., 1983]. Чем обусловлена эта гетерогенность? Можно предположить, что помимо возможной связи с карбоксильными группами Аэр-170 и в1и-189, локализующимися в гидрофильной петле Д1-полипеп-тида, и связи с гистидинами его С-конца [Уегтааэ е1. а1.,1993] существуют координационные связи у некоторых атомов Мп с гидроксильной группой Туг-161 и карбонильной группой циклопентанонового кольца И680, которая и обеспечивает прочность их связи с ядром комплекса.

Таким образом, в результате исследования структурно-функциональных характеристик ПБЛК ФС-2 в сопоставлении с комплексом ФС-1 и све-гособирающим комплексом были заложены базовые представления об орга-яизации комплекса ФС-2. При этом значительная часть результатов, та-ж как доказательство функционирования первичного акцептора элект-эонов феофитина в препаратах комплекса ФС-2, выделяемых из разных эастений, обнаружение фотоиндуцированного выделения протонов, изучение фотоиндуцированных превращений каротиноидов на изолированных сомплексах была получена нами впервые.

III. Факторы, влияющие на устойчивость структуры комплекса $С-2

Выделение комплексов с активно функционирующими реакционными центрами продвинуло нас в достижении поставленной цели, но главная за-1ача - выделение комплекса ФС-2, сохраняющего способность окислять юду и образовывать молекулярный кислород, решена не была. Комплекс утрачивал эту функцию в процессе выделения из мембран и предстояло

разобраться, какие факторы влияли на структуру и функцию ПВЛК.

Исследование устойчивости структура комплексов к действию не'ион-' ного детергента тритона Х-100 проводили по оценке . количественного выхода и фотохимической активности комплексов'при изменении глубины солюбилизирующего действия тритона Х-ЮО, которую варьировали изменением относительной концентрации тритона Х-100 (Т/Хл) и времени его действия. Было установлено (табл.4), что и увеличение концентрации детергента, и увеличение длительности солюбилизации в данном диапазоне значений ТУХл приводило только к диссоциации ВС-ПВЛК. Бри этом, динамика уменьшения выхода светособирающего комплекса коррелировала

Таблица 4

Выход (% по хлорофиллу) и фотохимическая активность пигмент-белковолипидных комплексов в зависимости от условий воздействия тритона Х-100 на тилакоидные мембраны хлоропластов

Условия Выход фракций Фотохимическая активность,

солюбилизации ВС-ПБЛК ПБЛК.РЦ Солюби- Скорость фотовосстановления, Т/Хл время, лизиро- мкмоль на мг Хл в 1 час

мг/мг ч ванный НАДФ+ от ' ДХФИФ от- •

в 1 мл Хл ДХФИФ. Нг ДФК

(ПВЛК ФС-1) (ПБЛК ФС-2)

Роль относительной концентрации тритона Х-100 (Т/Хл)

25 1 29,4 19,6 ' 6,4 40,9 97,0

50 1 26,0 21,8 .11,0 - 43,8 106,1

80 1 21,2 22,3 20,8 45,7 .115,0

120 1 16,4 22,1 29,0 45,2 .130,0

180 1 7,9 23,8 36,1 41.7 84,5

240 1 . 3,0 18,4 39,5 ■ 38,0 62,3

Влияние длительности солюбилизации

80 1 21,2 22,3 20,6 45,7 115,0

80 3. 20,0 24,0 22,5 42,1 120,3

80 5 19,2 25,0 22,8 44,3 148,1

80 7 18,2 23,7 24,4 40,8 203,0

80 10 16,5 18,7 28,0 31,9 191,8

80 24 12,0 16,5 32,7 5,1 76,0

с динамикой роста выхода фракции солюбилизированных пигментов (рис.12): Что касалось комплексов ФС-1 и ФС-2, то количественный выход и фотохимическая активность данных ПБЛК существенно не изменялись. Некоторый рост активности у ПБЛК ФС-2 в реакции фотовосстановления ДХФИФ от дифенилкарбазида при соотношении Т/Хл = 80-120, мог быть связан с улучшением разделения фотосистем.

Влияния концентрации ионов водорода в среде на активность комплекса ФС-2. Максимальный сигнал Фео наблюдался у ПБЛК ФС-2, когда выделение проводилось в буфере при pH 6,0-6,5 (рис.13). В экспериментах отмечалось, что при этих условиях наблюдалось изменение элю-ционного параметра ВС-1ШК и происходила его созлюция с комплексом ФС-2 (рис.14), что свидетельствовало о возможном усилении взаимодействия между ними. И наоборот, при pH 8,5-0,0 усиливалось взаимодействие между ВС-ПБЛК и комплексом ФС-1. Можно было предположить, что концентрация ионов водорода в среде является регулятором степени сродства светособирающего комплекса с ПБЛК ФС-1 и' ФС-2. В последнем случае при усилении взаимодействия с ВС-ПБЛК в области pH 6,0-6,5, по-видимому, увеличивалась стабильность структуры комплекса'ФС-2, в результате чего возрастала его фотохимической активность.

Роль гидрофобных взаимодействий в системе окисления воды. Полученные результаты позволяли предположить, что солюбилизирующее действие неионного детергента тритона Х-100 направлено на гидрофобные связи, т.к., по-видимому, именно их разрушение приводило к диссоциации ВС-ПБЛК, состоящего преимущественно из гидрофобных компонентов. Предварительный вывод, который нами был сделан, состоял в том, что как' в комплексе ФС-1, так и в комплексе ФС-2 существует устойчивое полипептидное ядро, стабилизированное системой ионных связей. Именно с этим ядром связаны хромофорные группы, обеспечивающие' функциональную активность комлексов. Однако то обстоятельство, что кислородвы-деляющая активность ПБЛК ФС-2'утрачивалась при выделении из мембран, побуждало понять, почему салюбилизирующий детергент не.влиял на активность комплекса в 'реакции фотосенсибилизированного переноса электрона от искуственно?о донорам искусственному акцептору и в то же время, по-видимому, разрушал природную йлектроно-донорную систему комплекса, систему окисления воды и выделения кислорода. Опыты, проведенные нами на изолированных хлоропластах, подвергавшихся различным срокам'хранения, показали, что постепённое снижение их кислород-выделеляющей активности до нуля на 9 сутки (рис.'15-A), коррелировало с гидролизом моногалактозилдиацилглицерида до полного, исчезновения его полосы на тонкослойной хроматограмме (рис.15-Б). При этом количественное содержание ДГДГ изменялось незначительно. Полученные нами результаты указывали на -важную.роль МГДГ в системе окисления воды КВК и согласовывались с данными [Tremolleres et al.,19943, показавшими высокую обогащенность. субъединиц комплекса ФС-2 (СР4? и СР43) данным глииеридом.

На основании анализа совокупности полученных экспериментальных результатов нами был сделан предварительный вывод, что система окис-

Рис. 12. Содержание хлорофилла во фракции солюбшшзированных пигментов (1) и выход комплекса ВС-ПБЛК (2) в зависимости от соотношения концентраций тритона Х-100 и хлорофилла при солюбилизации (А) и длительности инкубации (Б).

П700 х Ю3 фе0 х !°2

Рис. 13 . Содержание фотохимически активного феофитина (2) и примеси П700 (1) в составе ПБЖ ФС-2 ( в расчете на 1 нмоль Хл) в зависимости от рН среды фракционирования комплексов 2С-1 и ФС-2 на ДЭАЭ- целлюлозе в присутствии ВС-ПБЛК.

6,1

V

7,0

V

7,5 1,0 1,3

жл шя тт

шж щж

V V V

9,0

1

Рис. 14 . Схема разделения ПБЛК в зависимости от значения рН среды фракционирования комплексов ФС-1 и ФС-2 на ДЭАЭ-целлюлозе в присутствии ВС-ПБЛК: 1 - исходная стартовая зона адсорбированных комплексов; 2 - зона ПБЛК ФС-2; 3 - зона комплекса ФС-1, элюируемого раствором 75 мМ N301 в уравновешивающем буфере.

дения воды, по-видимому, также, как и 8С-ПБЛК, стабилизируется гидрофобными связями и вследствие этого разрушается при действии тритона Х-100. Эти наблюдения стали основой для последующего предположения, что комплекс ФС-2 может существовать в двух разных формах, как мономерный комплекс, ■ который мы обычно выделяем, и как нативный ди-мерный комплекс, в котором существует гидрофобная зона стыковки двух мономерных комплексов, наличие которой определяет кислородвыделяюшую активность комплекса. Тритон Х-100, действующий, как было показано в данном исследовании, преимущественно на систему гидрофобных связей, по-видимому, приводит к диссоциации димера вследствие их разрушения, в результате чего функция выделения кислорода ПБЛК подавляется. Это позволяло предположить, что стабилизация гидрофобных связей, обеспечивающих функционирование системы окисления воды комплекса, может быть достигнута при подборе условий его выделения.

МГДГ

ДГДГ

Время хранения¡сут

Рис.15-А. Относительная скорость выделения кислорода хлоропластами гороха в процессе хранения при 4°С в 30 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. На вревке показана скорость выделения кислорода свежими хлоропластами.

Рис.'15-Б. Тонкослойная хроматография липидов гороха, экстрагированных из свежих хлоропластов (а) и из хлоропластов, хранившихся при 4°С 5 суток (б), 6 суток (в), и 9 суток (г). Наблюдается исчезновение полосы МГДГ и образование полосы неполярных липидов (ШГ), являющихся, по-видимому, продуктами гидролиза МГДГ.

IV. реконструкция функции выделения кислорода.

Особое место . в этой проблеме отводилось белкам с молекулярной массой 16, 23 и 33 кДа. Было показано, что эти белки являются наружными, не встроенными в мембрану полипептидами и что они ассоциированы с ФС-2 со стороны люмена и играют важную роль в поддержании кис-лородвыделяющей активности системы окисления воды [Akerlund, Jans-son, 1981; Yamamoto et al.,1982; Kuwabara, Murata, 1982; Ono, Ino-ue,19831. Показано, что экстракция белков 16 и 23 кДа приводит к подавлению выделения кислорода на 60-70%, а редобавление этих белков (или, как было показано позднее [Anderson et al.,1984; Ghanotakls et al.., 19841), даже просто ионов Ca2+ и CI")-к отмытым мембранам полностью восстанавливало их способность выделять кислород. Более глубокая инактивация обработанных фрагментов (до 90-100%) наблюдалась, при удалении всех трех'полиПептидов 16, 23 и 33 кДа. Предполагалось, что 33 белок содержит Мп в качестве простетической группы. ■ Однако • на основании данных ряда исследователей [Ono et al.,1984; Kuwabara et al.,19851 данная точка зрения'была опровергнута в результате выявления возможности ' удаления 33 белка без потери Мп у обработанных фрагментов и реактивации функции выделения кислорода раствором СаС1г.

Наши исследования, которые были выполнены одновременно изложенным выше, показали, что экстрагирующие обработки субхлоропластных фрагментов ФС-2 растворами солей 1 М СаС1г, 1 М MgCl2, и 0,8 М • трис-HCl-буфером (рН 9,0), а также 2 мМ ЭДТА приводят к эффективному удалению водорастворимых ' белков с молекулярной массой 16, 23 и 33 кДа (рис.16-А). В результате чего у обработанных фрагментов подавляется кислородвыделяющая активность (рис.16-В). Ее реактивацию проводили при редобавлении 33 белка. Она имела следующие закономерности: 1) Способность к реактивации наблюдалась только у СаС ^-обработанных фрагментов, у которых сохраняется эндогенный марганец, и полностью утрачивалась при обработках трис-HCI-буфером и ЭДТА, экстрагирующими марганец. Эти результаты согласовывались с приведенными выше данными литературы. 2) Максимальная скорость реактивации белком 33 кДа ( до 45%) достигалась только в первый после их обработки период хранения фрагментов (рис.17), а затем способность к реактивации практически полностью утрачивалась. Это, по-видимому, было связано с постепенным вымыванием ионов Мп2+ в среду, на что, в частности, указывали аналогичные эксперименты [Isogai et al.,19851, в которых было отмечено снижение содержания атомов Мп от 4 до 2 атомов на реакционный центр в течение 2 часов хранения СаС1г-обработанных фрагментов. 3) Реактивация могла быть достигнута и в отсутствие белка 33 кДа с помощью

0,15-0.20 мМ СаС1г. При этом скорость выделения кислорода достигала 28% от исходной. Полученные результаты свидетельствовали о том, что белок 33 кДа не является необходимым для процесса выделения кислорода и его роль, по-видимому, состоит в поддержании нативной конформа-ции центра окисления воды и в сохранении структурно-связанного Мп, т.к. в его отсутствие система переходит в неустойчивое, метастабиль-ное состояние. Ионы Са2+ также стабилизирует систему окисления воды от инактивации даже при экстракции всех трех наружных, прилегающих к '1С-2 со стороны люмена белков с молекулярной массой 16, 23 и 33 кДа.

л^.

-Лл_■

0

Рис.15. Денситограммы разделения полипептидов субхлоропластных фрагментов ФС-2: 1- исходные фрагмента ФС-2; 2- фрагменты после удаления белков 33, 23 и 16 кДа обработкой 1М СаС1<>; 3- экстракт белков в 1М МаС1; 4- экстракт белков в 1 М СаС1г; 5- белки-стандарты: лизо-цим (14,3 кДа), 8-лактоглобулин (18,4), трипсиноген (24), пепсин (34,7), яичный альбумин (45) и бычий альбумин (66)

Рис.16. Скорость выделения кислорода у исходных фрагментов ФС-2 (1) и СаС12-обработанных фроагментов ФС-2 (2). Реактивация выделения кислорода белком 33 кДа (3). 4,5- отсутствие реактивации у прогретых фрагментов при 37 и 50°С.

Рис. 17. Относительная.скорость выделения кислорода (отн.ед.Л) у .СаС1г - обработанных фрагментов 4С-2 в зависимости от длительности их инкубации. 1 - инкубация в среде 300 Ш сахарозы. 25 мМ НЕРЕБ-буфера, рН 6,5; 2 -степень реактивации их кислородвыделяодей функции белком с молекулярной массой 33 кДа; 3 - степень реактивации раствором 16 ММ СаС1г.

V. Характеристика кислородвыделящего комплекса ФС-2.

Изучение факторов, влияющих на стабильность комплекса ЗС-2 при его выделении, помогло составить программу условий солюбилизации мембран и выделения комплекса ФС-2, сохраняющего способность к фотосинтетическому окислению воды и выделению молекулярного кислорода. ТА, если ранее его выделение было проведено с помощью доде-цил-¡3-0-мазьтозща или октил-й-В-глюкозада, а также дигитонина £Ба-еЬ а1., 1985; 1кеисМ еЬ а1.,1985; 6Ьапо1ак1Б, Уосит,1986], то в нашем исследовании был использован широко доступный детергент тритон Х-100. При >>том для успешного решения задачи выделения нативного кислородвыт;еляющего комплекса представлялось важным использование слабокислых условий среды, что должно было способствовать усилению взаимодействия между комплексом <1€-2 и светособирающим комплексом в процессе выделения (см.гл.III) и тем самым стабилизировать структуру КВК и предотвратить его инактивацию. С этой же целью было необходимым ввести в среду солюбилизации 1М сахарозу, которая является сильным дегидратирующим агентом и должна была способствовать усилению внутрикошлексных гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих, по нашему предположению, систему окисления воды.

В качестве исходных объектов были взяты субхлоропластные фрагменты ФС-2, очищенные от ФС-1, белков стромы и АТФ-азного комплекса и отмытые от водорастворимых белков 16 и 23 кДа раствором 2 М №01. Полученные фрагменты солюбилизировали тритоном Х-100 при весовом со-

отношении тритон/Хл = 20:1 в среде 50 мМ Mes-буфера, рН 6,0-6,5, в присутствии 1 M сахарозы, 5 мМ MgCIe и 1 мМ аскорбата-Иа в течение 40 мин. Далее процедуру выделения вели в соответствии со схемой (гл.1), сохраняя значения рН, равным 6,0-6,5. После преципитации светособирающего комплекса его тщательно отделяли центрифугированием при 20 тыс.g. В супернатанте получали кислородвыделяющий комплекс. Его молекулярная масса, оцениваемая методом гельфильтрации, составляла величину 450-500 кДа, которая в два раза превышала ее расчетное значение, определенное на основании стехиометрического соотношения компонентов. Это служило одним из подтверждений нашего предположения о димерной структуре КВК. Спектр поглощения комплекса характеризовался максимумом при 675 нм и отсутствием полосы поглощения Хл б. Плечо' при 460-490 нм было обусловлено поглощением 8-каротина (рис. '18-A). Содержание фотоактивного феофитина (рис.18-В) в составе кислородвыделяющего комплекса, как и в core-комплекса ФС-2 составляло 1 молекулу Фео на 40-50 молекул хлорофилла. Полипептидный состав кислородвыделяющего комплекса соответствовал полипептидному составу core-комплекса'1С-2 (рис.19).

Скорость реакции выделения кислорода комплексом (рис.20-А) была максимальна в первый период освещения и составляла 270-300. мкмоль Ог/мг Хл.час. Особенностью данного процесса была его.зависимость от концентрации ионов Са2+. Каталитическая активность ионов кальция на процесс выделения молекулярного кислорода у комплекса была отмечена и ранее [Ikeuchi et al.,1985; Ghanotakis, Yocum,1986; Irrgang et al.,19883. Скорость выделения кислорода возрастала с ростом концентрации СаС1г и достигала максимального значения при 40-50 мМ (рис.20-В). Исследуя причину этого явления, мы провели электронно-микроскопический анализ раствора комплекса при добавлении 50 мМ СаС12 и обнаружили присутствие в растворе олигомерных агрегатов коллоидных мицелл комплекса по сравнению с образцами контроля. Это позволило нам предположить, что именно данный процесс ассоциативного контакта между комплексами, инициируемый ионами кальция, служит причиной к началу активного выделения кислорода. По-видимому, СаС1г, для которого характерно высокое координационное число гидратации и способность образовывать как первичную, так и вторичную гидратные оболочки [Мищенко и Сухотин, 19533, снижает растворимость коллоидных мицелл комплекса и способствует их агрегации. Можно предположить, что в таких ассоциатах, очевидно, создаются благоприятные термодинамические условия для протекания фотолиза воды и выделения молекулярного кислорода.

Таким образом, изолированный кислородвыделяющий комплекс был

0,6

0,4

0,2

435

со

I

О' ы

СГ)

II

350 400

500 600 700

Рис. ?8-А. Спектр поглощения кислородвыделявдего пигмент-белково-липидного комплекса 2С-2, солюбилизированного тритоном Х-100.

Рис. 18-Б. Кинетика фотоиндуцированных изменений поглощения при 685 нм у изолированного КВК, свидетельствующая о протекании процесса фотовосстановления феофитина. Показано (стрелками) включение и выключение света.

Рис.19. Электрофорез в присутствии LIDS полипептидов кислородввделяюще-го комплекса ФС-2. 1 - белки-маркеры: 1юсфорилаза b (94 кДа), альбумин (67 КДа), овальбумин (43 кДа), карбоан-гидраза (30 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа) и ск-лактальбумин (14,4 кДа).

■ЧЛ

А

идентичен по составу, фотохимическим и спектральный свойствам соге--комплексу ФС-2, который в процессе его выделения из мембран утрачивал функцию образования кислорода (гл.II). При этом КВК характеризовался молекулярной массой вдвое превышавшей ее расчетное значение. Это указывало на возможную роль димерной организации КВК в проявлении им функдаи выделения кислорода.

Рис.20. А - Скорость выделения кислорода у изолированного КВК в присутствии 40 мМ СаС1г (1) или в его отсутствии (2) в зависимости от длительности освещения.

Рис. 21. Б - Зависимость скорости выделения кислорода комплексом от концентрации СаС1г в реакционной среде.

VI. Термоиндуцируемые структурные переходы

системы окисления воды КВК

Чрезвычайно важной особенностью функции выделения кислорода у изолированного комплекса <1С-2 - являлась ее высокая чувствительность к действию повышенных температур, приводящих к подавлению процесса. Ранее работами, выполненными на хлоропластах, было показано [ Katoh and San Pietro,1967; Homann,1968; Krause, Santarius, 1975; Mohanty et al.,19873, что термоингибирование системы окисления воды происходит при более низких температурах, чем термоингибирование процессов электронного транспорта. Так, для системы окисления воды -это температурный диапазон 37-40°С, а для системы электронного транспорта -это диапазон 50- 55°С. Можно было предположить, что чрезвычайная термолабильность системы окисления воды и выделения кислорода обусловлена особенностями ее молекулярной организации. В связи с этим исследование термолабильности функции выделения кислорода у субхло-

ропластных препаратов, различающихся по структурной иерархии, в плане сравнения устойчивости системы окисления воды у кислородвыделяю-щего комплекса, включенного в-мембрану, и у комплекса in vit.ro, представляло особый интерес. На рис. 22 представлена скорость процесса термоингибирования у препаратов изолированного комплекса, ли-зированных хлоршластов и субхлоропластных фрагментов ФС-2 в диапазоне температур от 30 до 55°С. Можно видеть,что температура полуинактивации функции выделения кислорода составляла для комплекса 34°С, для лизированных хлоропластов 40°С и для фрагментов 44°С. Возрастание температурной устойчивости в ряду перечисленных препаратов могло быть обусловлено защитным действием светособирающего комплекса, ассоциированного с кислородвыделяющим комплексом в ламеллах и фрагментах. При этом существенно более высокое содержание светособирающего комплекса во фрагментах по сравнению с ламеллами, как следует из соотношения Хл а/Хл б у этих препаратов ( величины 1,2 и 3,0 соответственно), по-зидю^му, было главной причиной возрастания термоустойчивости функции выделения кислорода у фрагментов ФС-2. Было установлено, что подавление функции выделения кислорода у исследуемых препаратов является необратимым и сопровождается выходом эндогенных ионов марганца в среду (рис.22). Наблюдавшийся выход ионов марганца носил скачкообразный характер и протекал при температурах, соответствующих инактивации функции выделения кислорода у каждого из исследуемых препаратов. Это указывало на необратимые термоиндуцируе-мые изменения в структуре кислородвыделяющего комплекса.

В табл.5 представлены данные фотохимической активности изолированного комплекса ФС-2. исходных ламелл и субхлоропластных фрагментов ФС-2 в зависимости от химической природы акцептора электронов. Можно видеть, что изолированный комплекс, утративший "шубу" светособирающего комплекса становится более реакционным с гидрофильными акцепторами, чем субхлоропластные фрагменты, для которых наиболее эффективны акцепторы гидрофобной природы.

Д«я выявления структурных переходов мы провели изучение температурной зависимости теллопоглощения растворов и суспензий препаратов ФС-2 методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. На рис. 23 представлены кривые теплопоглощения растворов солюбилизированного комплекса, суспензии субхлоропластных фрагментов и раствора солюбилизированного светособирающего комплекса. Можно видеть, что субхлоропластные фрагменты характеризуются четырьмя эндотермическими структурными переходами, которые наблюдаются при 48° ( А-переход, соответствующий подавлению выделения кислорода), при температуре 54° ( B-переход, соответствующий подавлению электронного транспорта ),

Температура обработки, "С

Рис. 22 Действие 5-минутной тепловой обработки на Функцию выделения кислорода (1) и прочность связывания эндогенного Мп (2) у субхлоропластных препаратов: а - изолированный кислородвыделяющий комплекс; б - тилакоиды гран хлоропластов; в -субхлоропластные фрагменты 5С-2

при 59- 60° (С-переход, соответствующий плавлению белков реакционного центра) и при 6б°С С Д-переход). (Функциональное соответствие выявленных переходов было установлено в работах [Thompson et al.,1989] на препаратах, аналогичных нашим). Исследование КВК обнаружило наличие широкого структурного А-перехода, в диапазоне 30-40°С, а также двух других переходов при 46-50 °С и при 57-59°С, соотвествующих В-и С-переходам.' Свегособирающий комплекс характеризовался одним максимумом на кривой теплопоглощения при 63°С. Таким образом, первые три перехода на кривой теплопоглощения фрагментов были обусловлены структурными переходами, происходящими в ядре ФС-2, т.к. они были характерны и для изолированного комплекса, тогда как Д-переход, по-видимому, был обусловлен плавлением белков ВС-ПБЛК. Можно видеть, что температурный диапазон, при котором наблюдается структурный А-переход кислородвыделяющего комплекса in vitro и в составе мембран фрагментов соответствует области термоинакгивации функции выделения кислорода данных препаратов. На основании термогель-анализа [Thompson et al.,1990] было показано, что А-переходы не сопровождаются де-нарурацией белков, тогда как для В и С-переходов характерно плавление белков 47, 43 кДа и Dl, D2 белков, соответственно.

Электронно-микроскопическое исследование EFS поверхностей сколов (рис.24) мембран субхлоропластных фрагментов ФС-2, подвергавшихся тепловой обработке, и сколов исходных фрагментов, позволило выявить следующие отличительные особенности. Субмембранные частицы, выступающие на этой поверхности и идентифицированные CStaehlin et al.,1986) как комплексы <2С-2, при нагревании уменьшались в размерах. У исходных фрагментов содержание крупных частиц ( от 14 до 20 нм) составляло 85%, а у термообработанных фрагментов - 42%.

Таким образом, была выявлена следующая совокупность экспериментальных данных: 1. Функция выделения кислорода системы окисления воды в исследуемых препаратах сопровождалась безденатурационным структурным переходом и скачкообразным.выбросом эндогенного Мп в среду. 2. При этом наблюдалось двукратное уменьшение размеров частиц на EFS поверхности сколов термообработанных фрагментов ФС-2. 3. Выявлено снижение термоустойчивости комплекса в состоянии in vitro и защитная роль окружающего его светособирающего комплекса в мембранах хлоропласта. 4. Выявлено вдвое большее значение экспериментальной величины кажущейся молекулярной массы кислородвыделяющего комплекса по сравнению с ее расчетным значением, получаемым на основании стехиометрии компонентного состава. 5. Установлена идентичность полипептидного состава, фотохимических и спектральных свойств КВК комплексу ФС-2, который выделяется в более жестких условиях солюбилизации тритоном

*

Таблица 5

Кислородвыделяющая активность изолированного КВК, субхлоропластных фрагментов ФС-2 и тилакоидов гран хлоропластов шпината в зависимости от химической природы акцептора электронов

Акцепторы Скорость выделения кислорода (мкМ Ог/мг Хл.час)

КВК тилакоиды гран фрагменты «1С-2

Феррицианид,

ФЦ (1 ММ) 350 ± 30 230 ± 18 120 + 11

Фенил-р-бензо-хинон, Ф<3

(0,3 мМ) 140 ± 16 165 ± 14 580 ± 27

Феррицианид (1 мМ) + фенил-

р-бензохинон 260 ±21 180 ± 20 430 ± 32

(0,3 мМ)

Рис. 23. Температурная зависимость теплопоглощения: 1 - раствора солюбилиэированного детергентом тритоном Х-100 кислородвыделяющего пигмент-бедковолипидного комплекса; 2 - суспензии субхлоропластных фрагментов ФС-2 и 3 - светособирающего комплекса.

Х-100, когда утрачивается его способность к фотосинтетическому окислению воды. Анализ полученных данных позволил Нам выдвинуть гипотезу, что нативная структура КВК - это димер двух мономерных со-ге-комплексов и что центр окисления воды локализован в зоне контакта этих комплексов, которая, по нашему предположению, стабилизируется за счет гидрофобных взаимодействии (гл.III). Тогда причиной термоинактивации функции выделения кислорода может быть диссоциация данного димерного комплекса, сопряженная с обнажением участников реакции окисления воды и выводом ионов марганца в среду, что объясняет необратимый характер процесса теплового подавления функции выделения кислорода. Предположение о существовании димеров 5С-2 в нативных ла-меллах хлоропластов высказывалось ранее [Rogner et al., 1987; Dekker et a].,1988; Бойченко и др.,1989; Peter and Thornber, 1991,1993; Da-inese at al.,1992; Boekema et al., 19941, однако идея, что димер детерминирует функцию выделения кислорода, послужила основой для создания модели молекулярной организации КВК, предложенной нами впервые.

VII. Модель молекулярной организации

кисдородввделящего комплекса ФС-2

Обоснование модели. Принципиальной частью предложенной нами модели (рис.25) является предположение о необходимости гидрофобного взаимодействия между D1/D2 гетеродимерами двух мономерных соге-комп-лексов с образованием в зоне контакта между ними экранированного не-полрными соединениями гидрофобного локуса или "котла", в результате чего имеет место сближение участников реакции фотоокисления воды и зашита образующихся высокоактивных окисленных интермедиатов от дезактивации. Можно предположить, что "сшивка" гетеродимеров со-ге-комплексов осуществляется ионами Са2+ по расположенному в крайней гидрофильной петле Slu-69 Д2 белка, т.к. методом направленного мутагенеза было показано, что данная аминокислота необходима для сборки комплекса и выделения кислорода CVermaas et al.,1993]. Белки с молекулярной массой 33, 23 и 16 кДа, активирующие выделение кислорода, замыкают гидрофобный локус со стороны внутреннего тилакоидного пространства. Образование области гидрофобного контакта существенно важно между С и D а-спиральными участками Dl- Dl белков в области связи Мп-кластера с двумя тирозиновыми остатками D1-белков, Туг-161, Z-донора, ответственного за быстрообратимую компоненту ЭПР-сигнала [Babcock, 1986; Debus et al.,1988; 19921 и двумя тирозиновыми остатками 02-белков, Туг-160 (Д-донора, ответственного за медленную ком-

Й2' »2

стадия фотогидролиза: -е ¡?1 _

Мп2+ + н20

Мп2+ + Н20

Ьи !?г' -е 1?1.

(Мп3+) -ОН"

(Мп'3+) -ОН"

Ьи Р-2 диспропорционироваиие:

1то,-е

+ Н+

+ Н*

-e.hu

¡?1 ¡?1 „ )Мп2+ + + 02 + 2Н+

1?2 1?2

1?1 1321

МП4* : 0 : Н" Мп4+ : 0 !• Н"

Схема реакций фотосинтетического окисления воды в димерном кислородвыделяющем комплексе «1С-2 хлоропластов

( 23 23 )

( 16 16 )

Рис. 25. Схематическая модель молекулярной организации кислородвы-деляющего комплекса фотосистемы 2 хлоропластов (димерная форма). Д1, Д2, цитЬ559 - белки РЦ ФС-2. СР47 и СР43 - хлорофилл-белки внутренней светособирающей антенны. Белки с молекулярной массой 33, 23 и 16 кДа - наружные (не встроенные в мембрану) белки ФС-2. ЬНС -светособирающий ПБЖ. Заштрихованная область - гидрофобный "котел" системы окисления воды. Остальные пояснения в тексте.

поненту ЭПР-сигнала). Благодаря этому осуществляется сближение участников реакции фотоокисления воды на расстояние вандерваальсово-го взаимодействия. При этом основными участниками процесса окисления воды, по-видимому, являются: две молекулы П680 (по одной молекуле от каждого мономерного комплекса), два аминокислотных остатка Dl-белков Туг-161 (Z-донора), и четыре атома Мп, образующие четырехядерный кластер по два атома на каждый РЦ мономерного комплекса. Белки РЦ окружены Хл-белками СР43 и СР47 кДа, которые являются носителями хлорофилла внутренней антенны комплекса. Ближе к периферии, по-видимому, расположен СР43, который легче отделяется при обработках ок-тилглюкозидом [Nakatanl et al.,1384; Ghanotakls et al., 1989). CP47, по-видимому, расположен в центре димера, т.к. методом поперечных сшивок показано его взаимодействие с Д2 белком IMoskalenko et al.,19922. Ассоциированные с донорной стороной ФС-2 наружные белки с молекулярной массой 33, 23 и 16 кДа, связаны с гидрофильной областью Д1 и Д2 белков [Vermaas et al.,19933 и могут образовывать в зоне контакта друг с другом ионный канал и тем самым играть регуляторную роль в проницаемости ионов CI" и Са2+ к центру окисления воды. Ци-тохром Ь559, входящий в состав РД ФС-2, возможно, функционирует во внутреннем циклическом транспорте электронов при нарушении или замедлении оттока электронов через пластохиноновый пул в электрон-транспортную цепь хлоропласта. Схема его участия в этих процессах в настоящее время подробно рассмотрена в литературе [Barber et al., 19953. И, наконец, согласно предложенной нами модели, структура » КВК стабилизируется окружающим светособирающим комплексом.

Логической поддержкой предложенной нами модели является термоди-нимическая целесообразность существования гидрофобного "котла" в зоне фотолиза воды, т.к. это способствует снижению энергии активации участников реакции окисления воды в результате их сближения, а также способствует уменьшению диэлектрической постоянной и энергии реорганизации среды - факторов, которые согласно термодинамическому обоснованию [Волков,19863, являются определяющими для протекания многоэлектронных окислительно-восстановительных реакций, к каковым относится процесс фотосинтетического окисления воды и выделения молекулярного кислорода.

VIII. Гипотетическая схема реакций

фотосинтетического окисления воды.

Предложенная модель структурной организации комплекса позволяет объяснить четырех-квантовый механизм фотоокисления воды, который

свидетельствует о существовании четырех фотохимических стадий накопления промежуточных фотоокисленных продуктов, предшествующих формированию молекулярного кислорода на заключительном этапе процесса [Кок et а1.,19701. Для их стабилизации исключительно важную роль может играть фактор структурного сближения интермедиатов. Ранее нами показано (гл.II), что изолированный комплекс <К-2, характеризуется особым свойством - способностью к фотоиндуцированному выделению протонов в присутствии акцептора электронов. Можно предложить следующее объяснение этому процессу. При действии света происходит фотосенси-Силизированное окисление эндогенного Мп2+ до Мп3+, что сопровождается его взаимодействием с противоионом 0Н~ диссоциированных молекул воды. При этом происходит подкисление среды и в целом процесс можно охарактеризовать как фотогидролиз вновь образующегося соединения трехвалентного марганца. Эту стадию можно рассматривать как первый этап включения гидроксила воды в структурный центр ее последующего фотохимического окисления. При этом происходит образование гидрокси-дов марганца, как показано на схеме реакций. При действии СаС1г усиливается гидрофобная ассоциация комплексов и, по-видимому, участники реакции окисления воды оказываются пространственно сближенными. По нашему предположению степень этого сближения обусловливает вероятность последующей реакции фотоокисления воды с выделением молекулярного кислорода. Выделение 0г, по-видимому, происходит в результате отрыва электронов при поглощении третьего и четвертого кванта света димером КВК. Совокупность происходящих процессов можно пояснить следующей схемой (1), где ??1 -это ОН-группа Туг-161 (01 -белка), а роль 1?2 возможно играет ОН-группа енольной формы [Кутюрин,1970] циклопен-танового кольца хлорофилла П680, образующие координационные связи с атомами Мп.

Согласно приведенной схемы при поглощении первых двух квантов, света реакционными центрами '1С-2 димерного комплекса происходит фо-тосенсибилизированное окисление этих двух атомов Мп2+. Образующиеся на свету ионы Мп3+ вызывают гидролиз двух молекул воды, что сопровождается фотоиндуцированным выделением протонов и образованием гид-роксидов Мгг>+. В случае димерной структуры данные гидроксиды оказываются сближенными, т.к. находятся в области Ш-Б! контакта единого структурного комплекса димерного КВК. Это создает предпосылки для протекания второй ключевой стадии процесса фотолиза воды - стадии диспропориионирбЪания электронов между атомами кислорода и марганца в этом дигидроксидном ассоциате. Процесс диспропорционирования инициируется фотохимическим окислением двух катионов Мп3+ до Мп4+ молекулами П680, окисляемыми при поглощении третьего и четвертого кванта

света в димерном КВК. При этом образующиеся катионы Мп4+ тут же ре-восстанавливаются за счет электронов связанных гидроксильных групп с образованием исходных двух катионов Мп2+, молекулы кислорода и двух протонов, т.е. происходит синхронное четырехэлектронное окисление двух молекул воды. Предполагается, что процесс диспропорционирования катализируется ионами С1~( иди С0з2~, Р043~), которые вследствие то-похимических свойств марганца могут легко вытеснять гидроксильные группы, способствуя формированию молекулярного кислорода.

Однако, изложенная схема процесса фотолиза воды не может претендовать на исчерпывающее объяснение всех имеющихся экспериментальных данных. Для окончательного выяснения механизма этого процесса требуются дальнейшие исследования.

Заключение

Прогресс в изучении механизма фотоокисления воды и образования кислорода при фотосинтезе зависит от нашего знания молекулярной организации и механизма функционирования нативного пигмент-белковоли-пидного комплекса ФС-2, в котором этот процесс осуществляется in vivo. Автор посвятил изучению этой проблемы более 30 лет, пройдя путь от разработок методов выделения ПБЛК, исследования структуры и функции комплексов в плане сравнительного сопоставления ПБЛК <Ю-1, ПБЛК ФС-2 и ВС-ПВЛК, в результате которого были определены характерные свойства комплекса »Ю-2, до расшифровки принципов устройства кисло-родвыделяющего комплекса и протекающих в нем реакций фотоокисления воды и образования молекулярного кислорода.

На основании полученных экспериментальных данных и их анализа создана молекулярная модель структурной организации кислородвыделяю-щего комплекса '1С-2 хлоропластов и рассмотрено его функционирование в процессе фотосинтетического окисления воды. Надмолекулярная структура КВК обусловливает появление его уникальных свойств- способности к фотолизу воды и выделению молекулярного кислорода. Она определяется структурой ядра (core') комплекса ФС-2, которое включает реакционный центр ФС-2 (аналогичный бактериальному), надстройку хлорофилл-белков светофокусирующей антенны и определенным образом устроенную систему окисления воды. В предложенной нами модели предполагается существование гидрофобного локуса ("котла"), «в зоне протекания реакций, ведущих к фотоокислению воды. Это обусловливает термодинамически благоприятные условия для фотосинтетического окисления водь и выделения кислорода, являющегося синхронным многоэлектронным про-

цессом, и защищает высокоактивные интермедиаты реакции окисления воды от дезактивации. Предполагается, что первой стадией процесса фотолиза воды являются две последовательно протекающие реакции фотогидролиза соединений эндогенно связанных атомов марганца, каждая из которых протекает сопряженно с фотохимическим окислением Мп в цепи П680-Туг161-Мп с образованием Мп3+ в каждой цепи. Третий квант света отрывает электрон от Мп3+ в дигидроксидном комплексе, а в результате поглощения четвертого кванта света и отрыва электрона от второго Мп3+ происходит диспропорционирование электронной плотности в дигидроксидном комплексе ФС-2. При этом выделяется молекулярный кислород, протоны и высвобождаются исходные два атома двухвалентного марганца.

Разработанная нами модель молекулярной организации КВК, предполагает существование в нативном димерном комплексе контакта между Д1-Д1 полипептидами, закрепленного гидрофобными связями между ними. Образование специфического гидрофобного локуса или экранированного "котла", обеспечивает близкое, на расстояние вандерваальсового взаимодействия» межмолекулярное расположение участников реакции фотоокисления воды. Можно предположить, что кислородвыделяющий димерный комплекс ФС-2 возник в результате эволюционного развития знергозапа-сающего аппарата фотосинтезируклвдх организмов, когда возникновение димеров, обусловившее формирование гидрофобного локуса, по-видимому, определило эффективное протекание реакции фотоокисления воды. Это дало новый неисчерпаемый источник электронов для процессов фотосинтеза органических молекул, что способствовало эволюционному закреплению новых фотоавтотрофных фотосинтезирующих организмов.

ВЫВОДЫ

Работа является комплексным и приоритетным исследованием кисло-родвыделяющего пигмент-белковолипидного комплекса ФС-2 хлоропластов, в результате которого была создана методическая база выделения субмембранных ПБЛК и проведено исследование структурно-функциональных характеристик комплекса ФС-2 в сопоставлении с комплексами ФС-1 и ВС-ПВЛК. Сформированы новые представления о молекулярной организации КВК и принципах его функционирования.

1. Для исследования ПБЛК ФС-2 разработан комплекс методов выделения препаратов <Ю-2 хлоропластов: (А) разработан эффективный количественный метод выделения субламеллярных комплексов: ПБЛК '1С-2,

ПБЛК ФС-1 и ВС-ПВЛК. в котором достигнут высокий количественный выход препаратов и сохранность фотохимической активности изолированных ПВЛК, что являлось существенно важным для проведения их сравнительного исследования. (Б). Впервые предложен (и получил широкое внедрение) способ полного отделения комплекса светособирающей антенны (ВС-ПБЛК), который является основным в количественном отношении комплексом мембран хлоропластов. (В). Предложен способ выделения комплекса, обогащенного содержанием РЦ ФС-2, на основе использования лишенных Хл б мутантов ячменя. (Г). Разработан новый, основанный на солюбилизации детергентом тритоном Х-10О, метод выделения нативного (предположительно димерного) комплекса ФС-2, сохраняющего способность к фотосинтетическому окислению .воды и выделению кислорода. (Д). Разработан впервые (и получил широкое внедрение) метод выделения субхлоропластных фрагментов ФС-2, высокоочиценных от примеси ФС-1 (ДТ-20) и сохраняющих активность близкую к нативной.

2. Проведено сравнительное исследование структурно-функциональных характеристик изолированных комплексов, в результате которого: (А) Осуществлено доказательство фотовосстановления феофитина на препаратах комплекса ®>2 из хлоропластов гороха, шпината и СМатудотпав ге1пЬагс)П, подтвердившее предположение о функционировании в РЦ ФС-2 структурно-связанного фотоактивного феофитина, играющего роль первичного акцептора электронов. Отсутствие сигнала Фео у ПБЛК ФС-1 и ВС-ПВЛК подтвердило специфическую принадлежность данной функции ФС-2. (Б) Обнаружена способность изолированного комплекса ФС-2 к фо-тоиндуцированному выделению протонов в присутствии экзогенного акцептора электронов. Показано, что данная функция не наблюдается у ПБЛК ФС-1 и ВС-ПВЛК. На основании проведенного анализа выдвинуто предположение о существовании стадии фогогидролиза соединения марганца в процессе фотосинтетического окисления воды. (В) Изучено распределение спектральных форм Хл у изолированных комплексов. Установлено- для ПВЛК ФС-1 наличие специфических форм Хл с максимумом поглощения при 688 и 696 нм, для ПВЛК ФС-2 - при 682 нм, а для ВС-ПВЛК - при 648 и 660 нм, в то время как формы с максимумом поглощения при 669 (670) и 679 присутствовали в составе каждого из комплексов.

3. Изучено содержание и рассмотрена функциональная роль основных соединений, входящих в состав изолированных ПБЛК ФС-2, ПБЛК ФС-1 и ВС-ПВЛК: (А) Показано, что ПБЛК ФС-2 высоко обогащен содержанием ци-тохрома Ь559, который отсутствует в составе других комплексов. Оценено соотношение высокопотенциальной и низкопотенциальной формы этого цитохрома. (В) Проведено исследование фотоиндуцируемых изменений

каротиноидов в ПВЛК ФС-1 и ФС-2. Выявлена защитная роль каротиноидов в ПВЛК ФС-2 в процессах связывания активных форм кислорода и протекание реакции дезэпоксидации виолаксантина с образование антераксан-тана в ПБЛК ФС-1. (В) Исследован полипептидный состав комплекса ФС-2 и субхлоропластных фрагментов ДТ-20. Анализ показал присутствие белков с молекулярной массой 47, 43, 32, 30, 9 и 4,5 кДа, характерных для структурной основы ядра комплекса ФС-2, и белка с молекулярной массой 33 кДа, ассоциированного с системой окисления воды изолированного комплекса. Доминирующими полипептидами субхлоропластных фрагментов являются белки с молекулярной массой 24-29 кДа. (Г) Оценено содержание липидов и марганца в составе ПБЛК.

4. Изучены факторы, влияющие на стабильность ПБЛК ФС-2 при его выделении из мембран. Изучены параметры рН-зависимости хроматографи-ческого разделения комплексов и их фотохимической активности. Выявлена корреляция между снижением скорости выделения кислорода при хранении хлоропласгов и гидролизом моногалактозилдиацилглицеридов. На основании полученных результатов выдвинуто предположение, что сохранность функции выделения кислорода у изолируемого комплекса 'ФС-2 зависит от нативности системы его гидрофобных связей, играющих, по-видимому, ключевую роль в стабилизации .центра окисления воды комплекса.

5. Осуществлена реконструкция функции выделения кислорода у субхлоропластных фрагментов ФС-2 после подавления их активности белок- экстрагирующими обработками. Показано, что белок 33 кДа не принимает непосредственного участия в процессе выделения кислорода но, по-видимому, стабилизирует Mn-кластер системы окислении воды.

6. Проведено исследование нативного (предположительно димерного) комплекса ФС-2, сохраняющего способность к фотосинтетическому окис-' лению воды и выделению кислорода in vitro. Показана идентичность полипептидного состава КВК и комплекса 'ФС-2, не сохраняющего функцию образования молекулярного кислорода. При этом содержание фотоактивного феофитина комплексов было одинаковым: 40-50 моль Хл на 1 моль Фео. Оценка молекулярной массы КВК давала величину вдвое выше расчетной. Была изучена динамика реактивирующего воздействия ионов кальция на функцию выделения кислорода комплексом и получены новые данные о Са-индуцируемой гидрофобной ассоциации мицелл комплекса ФС-2, которая сопровождалась активацией его функции выделения кислорода. Полученные результаты легли в основу представлений о димерной организации кислородвыделяющего комплекса.

7. Проведено сравнительное исследование термостабильности кисло-родвыделяющей функции, устойчивости Mn-связи и термоиндуцируемых

структурных переходов в молекулярной организации КВК, выявляемых методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии у субхлороп-ластных фрагментов ФС-2» исходных ламелл гран и изолированного КВК. Выдвинута гипотеза о механизме термоинактивации. Гипотеза основана на предположении о тепловой диссоциации нативной димерной формы кис-лородвыделяющего комплекса до мономерной формы, не сохраняющей способности к фотосинтетическому окислению воды и образованию молекулярного кислорода.

8. На основе интерпретации полученных экспериментальных результатов и анализа литературных данных разработана модель молекулярной организации кислородвыделяющего комплекса «1С-2 и рассмотрены принципы его функционирования. Центральной частью модели является предположение о существовании гидрофобного взаимодействия между D1-D1 белками гетеродимеров РЦ двух соге-комплексов и образование экранированного гидрофобного локуса ("котла") в зоне локализации Мп-кластера, защищенного со стороны люмена наружными белками 33, 23 и 16 кДа. Главным назначением данного "котла" является сближение участников реакции фотоокисления воды, предотвращение дезактивации образующихся высокоактивных интермедиатов и их выхода в среду. Стабильность ди-мерного комплекса поддерживается ближайшим окружением светособираю-щего комплекса, что характерно для КВК in vivo.

9. Предложена гипотетическая схема реакций фотолиза воды, протекающих в кислородвыделяющем комплексе ФС-2 хлоропластов при фотосинтезе. В схеме предполагается первичное протекание реакций фотогидролиза соединений марганца в димерном комплексе на первую и вторую вспышку света, а в результате двух последующих реакций фотохимического окисления трехвалентного марганца происходит диспропорциониро-вание электронов в образующемся дигидроксидном комплексе между двумя атомами четырехвалентного марганца и гидроксилами воды с выбросом протонов и образованием молекулярного кислорода.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Улубекова М.В., ¡Путилова Н.И., Кашкарова Т. И, Кутрин В.М. К вопросу о роли каталазы в хлоропластах/УФизиол. растений.1968. Т. 15. С. 2&7-Z71.

2. Кутрин В.М., Улубекова М.В., Шутилова Н.И., Матвеева И.В. .Розанова Л.Н. Соотношение между скоростью переноса электрона и скоростью выделения кислорода хлоропластами в реакции Хилла // Физиол. растений. 1969. Т.16. С. 181-186.

3.

4.

5.

6.

7.

a.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

Улубекова M.B., ¡Путилова H. И., Розонова Л. И. Изменения между скоростями переноса электрона и выделения кислорода в реакции Хилла//11 Всесоюзн. биохим.съезд. Тез.докл. Ташкент.3969.С.115 Путилова Н.И. О выделении и некоторых свойствах тгмент-белко-вого комплекса хлоропластв высших растений.//Сб. "Биология и научно-технический прогресс". Пущино. 1971. С. 130-132. Мошков Д. А. .Мошкова З.Г., Путилова Н.И. Мембраны хлоропластв, анализ влияния обработки детергенты // Сб. "Биофизика живой клетки" Птино. 1972. Т. 3. С. 44-55.

Шкуропатов А.Я. .Шумилова Н.И. ,Столовицкий Ю.М., Евстигнеев В.Б. исследование фотохимического взаимодействия пигмент-белковоли-пидного комплекса фотосистемы 1 с п-бензохиноном потенциомет-рическим методом // Докл. АН СССР. 1974. Т. 214. С. 1214-1217. Кутюрин В.U., ¡Путилова H.H. Электроно-донорные свойства пигмент- бежоволипидного комплекса хлоропластов // Биохимия.

1974. Т. 39. С. 102-110.

Путилова H.H., Жигалъцова З.В., Кутюрин В.М. Сравнительные исследования окислительно-восстановительных свойств изолированных ПБЖ ФС-1 и ПБЛК ФС-2 хлоропластов гороха // Сб. "Итоги исследования механизма фотосинтеза" Пущино. 1974. С 130-141. KvmopuH В.М., Путилова Н.И. К вопросу о методе выделения фотохимически активных пигмент-белковолипидных комплексов хлоропластов // Биофизика. 1975. Т. 20.С. 246-249. ¡Путилова Н.И., Климов В.В., Шувалов В. А., Кутюрин В.М. Исследование фотохимических и спектральных свойств субхлоропластных фрагментов ФС-2, высокоочищенных от примеси <К-1 // Биофизика.

1975. T. 2Û. С. 844-847.

¡Путилова H.H., Кутюрин В.М. Выделение и исследование трех видов пигмент-белковолипидных комплексов хлоропластов: комплекса, содержащего реакционный центр ФС-1, комплекса, содержащего реакционный центр ФС-2 и светособиракщий комплекса // Физиология растений. 1976. Т. 23. С. 43-49.

¡Путилова Н. И., Жигальцова 3. В., Кутюрин В. М. Исследование фо-люиндуцируемых изменений каротиноидного состава у изолированных пигмент-белковолипидных комплексов <№-1 и ФС-2 хлоропластов гороха // Физиол. растений. 1976. Т. 23. 452-459. Гольдфельд М.Г., Папин А.И.. ¡Путилова Н.И.,Хангулов C.B. Об оптическом поглощении при 700 нм спектрах ЭПР хлоропластов и субхлоропластных частиц // Биофизика. 1976. XXI. С. 183-185. ¡Путилова Н.И., Незнайко Н.Ф. Исследование устойчивости изолированных пигмент-белковолипидных комплексов к действию повышенной температуры//Тез.докл. всесоюзн.конф. "Физиолого-биохими-ческие и экологические аспект устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды" Иркутск. 1976. С. 122-123. ГиллерЮ.Е., Щербакова И.Ю., МайстерА., ¡Путилова Н.И., Кадош-никова И. Г. О связи образования на/пивных форм хлорофилла с биосинтезом РНК и белка //Докл.АН Тадх.ССР. 1978. T.XXI.С.52-56. Гиллер ¡O.E., Щербакова И.Ю., ¡Путилова Н.И., Кадошникова И.Г. О связи образования наливных форм хлорофилла с процессами трансляции в хлоропластах и цитоплазме //ДАН 1979. Т.244 С.739-742. ¡Путилова Н.И., Закржевский Д.А. Роль надмолекулярных пигмент-белковолипидных комплексов в эволюции структуры и функциональной активности фотосинтетческого аппарата зеленых растений // Тезисы докл.всесоюзн.совещания"Эволюционная биохимия и происхождение жизни" Ереван. 1978. С. 56.

¡Путилова Н. И.. Кадошникова И. Г., Козловская Н. Г., Клеваник A.B. Закржевский Д.А. Оптимизация условий выделения трех типов пигмент-белковолипидных комплексов хлоропластов гороха при со-любилизации с помощью тритона Х-100 // Биохимия. 1979. Т. 44. С. 1160-1171.

ZäkrzTievskl D.A.Ananlev в.M..Shut!lova N.I. Amperometrlc Investigation of pigment-protein-lipid complexes of photosystem

2 in connection with the problem of photosynthetical water de-compositlon//Abst. 17-th Symposium on the problem"Structure and Function of the photosynthetic Apparatus" Berlln\1979. P.47..

3D. Вершинин A.B., ¡Путилова H.Я. Исследование пигмент-белковолипидных комплексов в модели моногибридного гетерозиса, полученного на основе хлорофильного мутант гороха. Сообщение 1. Хло-рофиллбелковый состав и спектральные свойства //Генетика. 1980. Т.XVI С. 667-676.

21. ¡Путилова И.И., Ананьев Г.Ы, Закржевский Д. А. Фотоиндуцирован-ное выделение протонов пигмент-белковолипидным комплексом фотосистемы 2 в присутствии феррицианида //Докл. АН. СССР. 1980. Т. 253 С. 1263- 1266.

22. Shutllova N.J.. Zakrzhevskl D.A. Isolation of functinal-active pigment-protein-llpid complexes from photosynthetizlng membrane pea chloroplasts and investigation //Abst. of the Symposium on the Solar Energy Conversion and Storage. Warszawa. 1980.P. 47

23. Климов В. В., Аллахвердиев С.И., Шумилова H.H., Красновский A.A. Исследование фотовосстановления феофипына и фотоокисления хлорофилла П680 на препаратах фотосистемы II из хлороплаоюв гороха и Chlamvdomonas relnhardil //Физиол. растений.1980. Т. £7. N 2. С. 315- 326.

24. Вершинин A.B., ¡Путилова Н.И. Исследование пигмент-белковоли-пидных комплексов в модели моногибридного гетерозиса, полученного на основе хлорофильного мутанта гороха. Сообщение П. Фотохимическая активность. //Генетика. 1980. Т. XVI. С.692-702.

25. Kadoshnlcova I.G.. Shutllova N. I., Zakrzhevskl D.A. Optical properties of high purified plgment-proteln-llpld complexes Isolated from pea chloroplasts /V Abstracts of the Symposium on the Photosynthetic Solar Energy Conversion and Storage. Warszawa. 1980. P. 24.

26. Стдничук И.И., ¡Путилова H.H. Структура спектров поглощения и флуоресценции и пигментная организация комплекса хлорофилл-антенны высших растений // Биофизика. 1980. J. XXV. С. 781-786.

27. Щербакова И.Ю., ¡Путилова H.H..Кадошникова И.Г.,Гиллер ¡O.E. Изучение действия специфических ингибиторов трансляции на образование нашивных форм хлорофилла в пигмент-белковолипидных комплексах хлоропластов гороха// Молекулярная биология. 1980. Т. 14. С. 881-890.

28. ¡Путилова H.H., Закржевский Д.А. Особенности функциональной активности изолированного хлорофилл а-белковолипидного комплекса хлоропластов // Тезисы докл.совещания "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарат в связи с преобразованием солнечной энергии" Пловдив. 1981. С. 72.

29. ¡Путилова Н.И.,Кадошникова И.Г. .Климов В.В., Фалуди-Даниель А., Демидова Л.Н..Закржевский Д.А. Дальнейшее развитие метода выделения хлорофилл а-белковолипидного комплекса хлоропластов //Тезисы докл.совещания "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарат в связи спреобразованием солнечной энергии" Пловдив. 1981. С. 98.

30. ¡Путилова Н.И., Демидова Л.Н., Кадошникова И.Г. .Климов В.В., Закржевский Д.А. Исследование эффективности хроматографическо-го разделения пигмент-белковолипидных комплексов реакционных центров фотосистемы 1 и фотосистемы 2 хлоропластов гороха на ЛЗАЭ-целлюлозе // Биохимия. 1982. Т.47. С. 317-322.

31. Закржевский Д.А., ¡Путилова Н.И..Кадошникова И.Г..Калашников ¡O.E., Кадошников С.И.. Ананьев Г.М.. Балахнина Т.И. Изучение структуры и функции изолированного пигмент-белковолипидного комплекса НС-2 //Тезисы докл. совещания стран-СЭВ " Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарат связи с преобразованием солнечной анергии" Пловдив 1981. С. 124.

. Shutilova N. IFaludl-Daniel A., Klimov V.V. A rapld procédure for Isolatlng the photosystem II reaction centers In a hlghlv enriched form //FEBS Le t ter s. 1982. V.138. P. 265-257.

. ¡Путилова H.П., Каданникова И.Г., Закржевский Д.А. Спектральные формы хлорофилла v изолированных пигмент-бедковолипидных комплексов хлоропластов гороха /У Биофиаика. i984. T. XXIX. С. 844.

. ¡Путилова Н. И., Кадошникова И.Г..Смолова Т.Н., Климов В.В. О подавлении функции выделения кислорода у субхжоропвастых фрагментов фотосистемы 2 с помощью белок-экстрагирующих обработок и ее реконструкции белком 33 кДа // Тезисы "докл.всесо-юзн.конференции "Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях" Вильнюс. 1985. С. 108.

. 1Путилова Н.И., Кадочникова И.Г. Проблемы выделения и исследования пигмент-белковолипидного комплекса реакционного центра фотосистемы 2 мембран хлоропластов /У Тезисы докл. всесоюзн. конф "Фотосинтетическое выделение кислорода" Пушино.1985. С.22

. ¡Путилова Н. И., Кадошникова И. Г., Демидова Л.Н., Климов В. В., Закржевский Д. А.Способ выделения пигмент-белковолипидных комплексов из хлоропластов. Авторское свидетельство N 1060025.1983

. Путилова Н. И., Кадошникова И. Г., Смолова Т.Н., Климов В. В. Реактивация функции выделения кислорода у субхлоропластных фрагментов фотосистемы 2, отмыпых от белков с молекулярной массой 1?, 23 и 33 кДа // Биохимия. 198?. Т. 526. С. 1958-1964.

. ¡Путилова Н.М:, Климов В.В., Аллахвердиев С.И. Способ получения кислородвыделящих субхлоропластных фрагментов фотосистемы 2 растений. Авторское свидетельство N 1330769. 1987.

.Shutilova N.I., Strlzhova V.P., Chrlstln M.S., Klimov У.У. Oxvgen-evolvlng pigment-11 poprotein complex of photosystem II оf pea chloroplast membranes. V Sovet- Svltzerland Symposium "Blologlcal menbranes: structurte and functlons"f?lga. 1988.P105.

. ¡Путилова H.И., Шафиев M.A., Климов В.В. Способ выделения кис-лородвыделящего пигмент-бедковолипидного комплекса <IC-Z хлоропластов растений. Авторское свидетельство N 1439944. 1988.

. ¡Путилова Н.И., Климов В. В. О роли нефизиологических концентраций ионов Са2+ в процессе фотоокисления воды изолированным комплексом ядра фотосистемы 2. Всесоюзная конференция "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" Тезисы докл. Путно. 1989. С. 115.

. ¡Путилова И.И., Стрижова В.П.. Христин М.С., Антропова Т.М.,Климов В.В. Выделение, стабилизация и исследование кисло-родвыделятего пигмент- бедковолипидного комплекса фотосистемы 2 мембран хлоропластов. Виол, мембраны.1990. Т.?. С.359-367.

. ¡Путилова Н. И., Климов В. В., Антропова Т. М., Шныров В.Л. Особенности термоинактивации кислородвыделятей функции изолированного пигмент- бедковолипидного комплекса функционального ядра фотосистемы 2., Ыеждунар. конф."Фотосинтез и фотобиотехнология". Тезисы докл. Пущино. 1991. С. 39.

. ¡Путилова И.И., Климов В.В., Антропова Т.Н., Шныров В.Л. О механизме термоинактивации кислородвыдедякщего комплекса функционального ядра фотосистемы 2 хлоропластов. // Биохимия. 1992. Т. 57. С. 1508-1518

. Shutïlova N.I.,Klimov V.V. Heat-lnactlvatlon of oxygen-evol-vlng functlon of photosystem 2 subchloroplast préparations. SovetGermany conférence. Pushchlno. 1993. P. 10.

. ¡Путилова H. И. Кислородвыделяющий комплекс фотосистемы 2 хлоропластов растений. Междунар. конф. " Успехи исследования фото- ~ синтеза". Пущино. 1994. С 18.

. Shutilova N.l., Semenova G. А.,Klimov V'.V., Snyrov V.L. Temperature Induced structural and functlnal transitions in the oxygen -evolvlng complex of photosystem 2 subchloroplast pre-oaratlons // Blochemlstry and Molecular Blology International.

1995. V. 17 Р. 1205-1216.

48. Семенова Г.А., Шумилова H.H.Влияние хранения при низких поло жительных температурах на структуру, функциналъную активност и изменения липидного состава хлоропластов// Биол. мембраны 1998. Т.13. С.138-145.

49. Шутилова Н.И., Пинский Д.Л., Васильева Г.В. и др. Исследование соотношения фотоавтотрофной и гетеротрофной знергозапасащи. систем клеток растений для оценки воздействия стрессовых факторов //Прикладн. биохимия. 193? .

50.. ¡Путилова Н.И.Модель структурной организации кислородвыделяще го комплекса фотосистемы 2 хлоропластов. Междунар. ковф. "Би< энергетика фотосинтеза. Пущино. 1996. С. 28.

20.03.97 г. Зак.7462Р. Тир.125 экз. Усл.печ.л. 3,125

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН