Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вклад фотосистем II и I в реакции электронного транспорта в хлоропластах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Вклад фотосистем II и I в реакции электронного транспорта в хлоропластах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи КИТАШОВ Андрей Владимирович

УДК 577.355.3

ВКЛАД ФОТОСИСТЕМ II ИI

В РЕАКЦИИ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА В ХЛОРОПЛАСТАХ

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1998

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор В.Д.Самуилов

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук профессор А.Н.Тихонов

доктор биологических наук М.Д.Мамедов

Ведущая организация: Институт фундаментальных

проблем биологии РАН

Защита состоится [7_ октября 1998 г. в 15 ч 30 мин на заседании специализированного совета Д.053.05.32 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд. М1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан сентября 1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук * 1 М.В.Иванов

Актуальность проблемы. Перенос электронов при оксигеыном фотосинтезе от Н20 к NADP+ согласно общепринятой Z-схеме последовательно вовлекает фотосистему II, б^цитохромный комплекс и фотосистему I. Зависимость скорости нециклического переноса электронов от доступности конечного акцептора NADP+, то есть физиологического состояния клетки, могут in vivo снижать вероятность равномерного вклада фотосистемы П и фотосистемы I в реакции электронного транспорта. Существенное значение имеют также молярное соотношение комплексов фотосистем II и I, их латеральное распределение в тилакоидных мембранах, чувствительность к фотоингибированию. Мембранный фонд пластохипона играет в определенном смысле буферную роль, сглаживая последствия резких изменений физиологических условий, в зависимости от которых скорость оборота фотосистем может быть различной.

Отклонения электронного транспорта от Z-схемы могут иг-

Список сокращений и обозначений: БХл — бактериохлорофилл; ГХО- 2-//-гептш1-4-гадроксихшюлин-1Ч-оксид; диурон- 3-(3,4-дихлорфешщИ Д-диметилмочевина; ПХФ - пентахлорфенол; СОД -супероксиддисмутаза; ТТФБ- 4,5,6,7-тетрахлор-2-трифгорметил-бензимидазол; Фео- феофитин; ХКФ- л*-хлоркарбонилцианидфе-нилгидразон; Хл- хлорофилл; ADRY-реагешы - реагенты, ускоряющие дезактивацию системы окисления воды (Acceleration of Deactivation Reaction of Complex Y reagents); ANT2p- 2-(3-хлор-4-трифтор-метил)анилино-3,5-динитротиофен; DNP-INT - 2-йод-6-изо-пропил-3-метил-2',4,4'-тринигродифениловый эфир; FeCy- ферри-цианид калия; 15о -концентрация ингибитора, при которой наблюдается 50%-ное ингибирование процесса; (Мп)4 - марганцевый кластер системы окисления воды; Р680- реакционный центр фотосистемы П; Qa и Qb - первичный и вторичный хинонные акцепторы фотосистемы П; Qp - мембранный фонд пластохипона; SiMo - кремнемо-либдат натрия; Y¿~ остаток тирозина-161 белка DI фотосистемы П; Z- участок связывания Qp в б^цитохромном комплексе

рать существенную регуляторную и приспособительную роль, обеспечивая функциональную гибкость фотосинтетического аппарата, а также способствовать предотвращению фотоингибиро-вания путем переключения электронных потоков.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение функционирования фотосистемы II и фотосистемы I автономно, вне г-схемы.

В качестве основного объекта исследования были выбраны хлоропласты гороха, широко применяемые в исследовании фотосинтетического электронного транспорта. Основным методом работы был выбран ингибиторный анализ фотосшггетического транспорта электронов.

В задачи исследования вошло:

1. Изучение циклического и нециклического переноса электронов, индуцированного А1ЖУ-рсагентами, в фотосистеме II.

2. Исследование зависимости нециклического переноса электронов от фотосистемы II к фотосистеме I от интенсивности действующего света.

3. Изучение способности хинонов тушить флуоресценцию хлорофилла и бактериохлорофилла в природных и модельных системах.

Научная новизна работы. В присутствии АПЖУ-реагентов в фотосистеме II формируется искусственный циклический перенос электронов, опосредованный компонентами комплекса реакционного центра, пластохиноном мембранного фонда и АОКУ-реагентом, что приводит к подавлению фотосинтетического выделения кислорода. Повышение интенсивности света приводит к снижению ингибирования фотосинтетического выделения ки-

слорода МЖУ-реагентами. Эффективность диурона и ГХО как ингибиторов фотосинтетического выделения кислорода не зависит от интенсивности света. Ипгибирующее действие БЫР-ГЫТ на фотосингетическое выделение кислорода уменьшается со снижением интенсивности света, что обусловлено большим вкладом фотосистемы П в фотосинтетический перенос электронов при меньшей интенсивности света.

Хиноны вызывают тушение флуоресценции хлорофилла а в природных и модельных системах. Из испытанных хинонов максимальным эффектом обладает менадион. Эффект менадиона как тушителя электронно-возбужденного состояния не может быть обусловлен его свойствами в качестве акцептора электронов в реакции Хилла. Тушение флуоресценции хлорофилла (бактерио-хлорофилла) менадионом в природных системах относится к нефотохимическому тушению.

В целом, полученные результаты позволяют сделать заключение о фотосинтетической цепи переноса электронов в хлоро-пластах как динамичной системе, способной к переключению с одного режима работы на другой.

Практическое значение работы. Полученные в работе данные могут быть использованы в лекциях и семинарских занятиях по биоэнергетике, биохимии, физиологии растений и микробиологии.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на международном семинаре «Мембранная биоэнергетика» (Москва, 1995); международной конференции памяти Е.Н.Кондратьевой «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 1996); международной конференции «Биоэнергетика фотосинтеза» (Пущино, 1996);

международной летней школе Европейского научного фонда (HSF) по проблемам биофизики мембран I! (Лондон. 1997); заседании каф. клеточной физиологии и иммунологии МГУ (Москва, 1997); Всероссийском съезде фотобиологов (Пущино, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 151 странице, иллюстрирована 22 рисунками и 8 таблицами.

В обзоре литературы изложены современные представления о структурно-функциональной организации фотосинтетической электронтранспортной цепи высших растений и регуляции ее действия. Рассмотрены основные искусственные доноры, акцепторы электронов и ингибиторы фотосинтетического переноса электронов.

Список литературы содержит 289 источников.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили хлоропласты гороха1, хро-матофоры пурпурных бактерий Rhodospirillum rubrum и Rhodo-bacter sphaeroides2, липосомы и мицеллы тритона Х-100. Для получения лшюсом 400 мкл смеси из 5 мкмоль L-а-фосфата дилхо-лина, 1,44 мкмоль диацетилфосфата (или стеариламина) и 0,72 мкмоль холестерина (Sigma, США), дополненной 5 мкг хло-

рофилла а (Р1ика, Швейцария), эмульгировали в 3 мл 20 мМ Тпсте-ЫаОН, рН 7,5. Для получения мицелл к 0,1%-пому раствору тритона Х-100 в 20 мМ Тпсте-КаОН, рН 7,5, добавляли раствор хлорофилла а в этаноле в концентрации 0,5-1,0 мкг/ мл.

Скорость фотосинтетического выделения кислорода измеряли полярографически, используя закрытый И-электрод Кларка. Насыщающая интенсивность света составляла -0,1 Втхсм2. При необходимости интенсивность света меняли с помощью диафрагмы фотокамеры и набора металлических сеток — оптически нейтральных фильтров.

Скорость изменения концентрации кислорода в исследуемом образце измеряли с помощью системы, состоящей из анало-гово-цифрового преобразователя Л1ЮА-14 НРС-0113 (США) и 1ВМ АТ-совместимого персонального компьютера.

Скорость фотовосстановления феррицианида при освещении насыщающим красным светом (А>600 им) измеряли фотометрически при 420 нм. Фотовосстановление кремнемолибдата измеряли по образованию ферроцианида в реакции4: 81Мовоссг+ РеСуок-> 81Моок+ РеСувосст

Совокупность данных об изменении концентрации кислорода, феррицианида или кремнемолибдата во времени подвергали регрессионному анализу, и величину скорости выделения кислорода или скорости восстановления феррицианида или кремнемолибдата принимали равпой достоверному (а=0,05) значению коэффициента линейной регрессии.

Опыты с кремнемолибдатом проводили в присутствии диу-

рона.

Относительный квантовый выход флуоресценции бактерио-хлорофилла а в хроматофорах измеряли на спектрофотометре

75

Алнпсо Воитап #100 (США) при 906 им, длина волны для возбуждения флуоресценции — 450 нм. Выход флуоресценции хлорофилла а в хлоронластах, мицеллах тритона Х-100 и этанольном растворе измеряли, соответственно, при 680, 670 и 672 нм на спектроф- Рис. 1 луориметрс

о £

1Л

щ

5 X V

о

X

е

£ в X

с

О

ш

X X о

5

с!

50

25 -

□

О 6

6 А

□

О

д

о

о

□

□

□ А

0,01 0,1 1 10 Концентрация ТТФБ, мкМ

100

Влияние ТТФБ на скорость выдс-ления кислорода в реакции Хилла с ферри-цианидом (□) и кремнемолибдатом (Д) как ГР-550 (Яло1П1я), акцептором электронов и на фотовосста-длина волны для воз- новление кремнемолибдата (О) в хлоропла-

буждсния флуорес- отах гороха- 100%-ные СК0Р0С1ТИ »"Деления 1 кислорода и восстановления феррицианида ценции — 436 нм. в реакции переноса электронов Н20 Время жшни флуо- ^¡Мо + РсСу составили, соответственно,

~ 105 и 400 мкмоль/мг хлорофилла в час

ресценции хлорофилла а в хлоронластах и модельных системах в сочетании с выходом флуоресценции измеряли на фазовом флуорометре5.

Результаты исследования

Циклический и нециклический перенос электронов с участием Л1ШУ-реагентов в фотосистеме П. Исследование автономного, вне /-схемы, функционирования фотосистемы II предпринято в первой части работы. В числе ингибиторов фотосистемы

II использовали диурон, ГХО и А1ЖУ-реагенты: ТТФБ, А№Т2р, ХКФ, ПХФ.

Данные рис. 1 показывают, что ТТФБ ипгибирует перенос электронов от воды к феррицианиду (150 -0,15 мкМ). В более высоких концентрациях ТТФБ подавляет нечувствительное к диурону выделение кислорода в присутствии кремнемолибдата. В то же время, ТТФБ вплоть до концентрации 10 мкМ практически не влияет на фотовосстановление кремнемолибдата. Сходные данные получены с другими АЕЖУ-реагентами. Как показывают данные табл. 1, величины 150 для ТТФБ, АЫТ2р, ХКФ и ПХФ в реакции Н20 81Мо в 7-20 раз превышают таковые для реакции Н20 -> ГеСу.

Табл. 1. Величины 150 для ТТФБ, АОТ2р, ХКФ и ПХФ в реакциях Н20 -> РеСу и Н20 -> 81Мо в хлоропластах гороха

Добавленный агент 150 (мкМ) для

фотовосстановления РеСу (Н20 РеСу) фотосинтетического выделения О2 (Н20 81Мо)

ТТФБ 0,15 3

АЭТ2р 1,0 17

ХКФ 2,0 20

ПХФ 6,2 45

Ранее было предположение о том, что взаимодействие А1ЖУ-реагентов с электрондонорной ветвью фотосистемы II может вести к образованию пероксида водорода6. Опубликованы данные об образовании Н202 препаратами фотосистемы II в отсутствие АОКУ-реагентов7, которое регистрировали по усилению выделения кислорода в ответ на добавку каталазы. Имеются свидетельства образования Н202 в электрондонорной ветви фо-

8 ' "

тосистемы II8'9. Свстоиндуцировашюе образование супероксидного анион-радикала в электронакцепторной ветви фотосистемы II также ведет к образованию Н2О210. Образующемуся Н202 отводят роль в фотоингибировашш реакционных центров фотосистемы П. Добавка катал азы к тилакоидам снижала уровень фотоин-гибирования11.

Табл. 2 показывает, что уровень подавления выделения кислорода при переносе электронов Н20 -> БМо посредством ХКФ не меняется при добавлении сулероксиддисмутазы, катала-зы или их комбинации. Таким образом, образование Н202 или 02" представляется малоубедительным для объяснения подавления АГЖУ-реагентами фотосинтетического выделения 02.

Табл. 2. Эффект ХКФ, каталазы и Си2п-супероксиддисмугазы на выделение кислорода в реакции Хилла с кремнемолибдатом как акцептором электронов в присутствии феррицианида в хлоропластах гороха. Концентрации ХКФ, СОД и каталазы составляли 50 мкМ, 200 и 100 мкг/мл, соответственно__

Добавка Скорость выделения кислорода, %

— 100

ХКФ 21

ХКФ, каталаза 19

ХКФ, СОД 19

ХКФ, СОД, каталаза 18

Специфику А ОЯУ-реагентов в их окислительно-восстановительном взаимодействии с фотосинтетической элек-тронтранспортной цепью определяет окисление при одном потенциале и восстановление при другом, менее положительном, потенциале. В огличис от других доноров электронов, окисленные системой окисления воды А1ЖУ-реагеты вновь восставав-

ливаются другим донором — Ор. Полученные результаты показывают, что АВ11У-реагенты служат донорами электронов в реакции Хилла с кремнемолибдатом как акцептором электронов, не сопровождающейся выделением кислорода.

Рис. 2 иллюстрирует действие АЕЖУ-реагентов ТТФБ, ПХФ, ХКФ и ингибиторов переноса электронов диурона и ГХО на перенос электронов Н20 РеСу. Видно, что величины 150 зависят от интенсивности света. По мере увеличения интенсивности света величины 150 для диурона и ГХО не меняются, тогда как величины 150 для А1ЖУ-реагентов возрастают и пригашают максимальное значение, сохраняющееся неизменным в условиях светового насыщения.

Таким образом, АЕЖУ-реагенты могут поддерживать как нециклический, так и циклический перенос электронов в фотосистеме II (рис. 3): зависимая от АВЯУ-реагента реакция Хилла с кремнемолибдатом является проявлением нециклического переноса электронов, а зависимое от АЕЖУ-реагента ингабирова-

о* 120

1 о. 100

5

80

|

Ш 60

Оо

Ч ай

а ш 40 А

л ь ■ •

8. о 20 □ д

и 0

э

□ д

о

а

* в

120 100 80 60 £ 40 ь? 20

20 40 60 80

100 120 Интенсивность света, ото. ед.

Рис. 2. Влияние интенсивности света на Реакции ^^ с скорость выделения кислорода (д) в реак- феррицианидом — ции Хилла с феррицианидом и на величины Гя для диурона (а), ГХО (о), ХКФ (□), 1ТФБ (■) и ПХФ (•) в хлоропласгах гороха

проявлением циклического переноса

SiMo FeCy

r r

НгО->(Мп)4—>Yz—>P680—>Фео->Од—>Qb~>Qp—>Z ~ '—- ADRY-реагент

Рис. 3. Схема зависимого от фотосистемы П циклического и нециклического переноса электронов с участием ADRY-реагента

электронов. Фонд пластохипона при этом распределяет электроны между циклическим и нециклическим путями переноса элек-'Тронов.

Пероксид водорода как возможный природный аналог ADRY-реагентов, способный взаимодействовать с системой окисления воды, вызывает особый интерес12. При одноэлектрон-пом восстановлении кислорода компонентами электронакцеп-торных ветвей фотосистемы П и фотосистемы I образуется 02", комплексы фотосистемы II обладают высокой активностью СОД10.

Окисление Н202 может происходить при его взаимодействии с системой окисления воды12. Так, в фотосистеме II in vivo могут одновременно протекать реакции образования и разложения Н2О2, т. е. можно предположить существование циклического переноса электронов с участием фотосистемы II, опосредованного пероксидом водорода, действующим подобно ADRY-реагенту.

Исходя из этого можно предположить, что циклический перенос электронов с участием природных аналогов ADRY-реагентов, таких как пероксид водорода, может служить предот-

вращению фотоингибирования переноса электронов при избыточной интенсивности света.

Влияние 1ЖР-ШТ на скорость выделения кислорода хлоро-пластами гороха в зависимости от интенсивности света. Известно, что подобно большинству искусственных акцепторов электронов, применяемых при исследовании реакций электронного транспорта при фотосинтезе, феррицианид может восстанавливаться не одним компонентом электронтранспортной цепи. С одной стороны, феррицианид восстанавливается компонентами фотосистемы П и пластохинолом мембранного фонда, с другой стороны, феррицианид способен восстанавливаться компонентами фотосистемы I13. В рамках представлений о последовательном участии фотосистемы П, б^цитохромного комплекса и фотосистемы I в нециклическом переносе электрона применение такого агента как СЫР-ЮТ, ингибитора ¿¿/-цитохромного комплекса на уровне окисления пластохинола <ЗгН214, совместно с феррицианидом, позволяет уточнить представления об относительном вкладе фотосистемы П и фотосистемы I в электрон-транспортные реакции при оксигенном фотосинтезе.

Данные рис. 4 показывают, что ингибирующее действие ЭИР-ШТ на выделение кислорода хлоропластами гороха в реакции Хилла с феррицианидом в качестве акцептора электронов сильнее при насыщающей, чем при ненасыщающей интенсивности света. Из данных рис. 2 и 4 видпо, что испытанные ингибиторы можно разделить на три группы по зависимости величин 150 от интенсивности света:

- ингибирующее действие диурона и ГХО от интенсивности света не зависит;

- иншбирующее действие АГЖУ-реагснтов снижается с увеличением интенсивности света;

- ингибирующее действие ОКР-ШТ увеличивается с ростом интенсивности действующего света.

Можно было предположить, что в условиях наших опытов зависимый от фотосистемы I циклический перенос электронов конкурировал за общие компоненты редокс-цепи с зависимым от фотосистемы II и фотосистемы I восстановлением феррициани-

да. В таком случае

100]

10 20 30 40 Концентрация DNP-INT, мкМ

конкуренция циклического переноса электронов и фотовосстановления фер-рицианида в большей степени могла бы проявиться в условиях высокой освещенности, чем в условиях низкой освещенности, при которой ферри-цианид предпочтительнее восстанавли-

Рис. 4. Концентрационная зависимость ин-1 гибирующего действия DNP-INT на фотосинтетическое выделение кислорода хлоро- вается фотопластами гороха в реакции Хилла с ферри- системой II (рис. 4). цианидом при насыщающей (•) и ненасыщающей (О) интенсивности света. Концен- В этои связи на~ трация феррицианида составляла 3 мМ, ми было испытано 100%-ные скорости выделения кислорода дейСтвие антимици-составляли 150 при насыщающей и

40 мкмоль/ч на 1 мг хлорофилла при нена- на А, ингибитора за-сыщающей интенсивности света

висимого от фотосистемы I циклического переноса электронов15, на ингибирующее действие БЫР-МГ. Антимицин А практически не оказывал влияния на ингибирующее действие БЫР-ЮТ как при насыщающей, так и при ненасыщающей интенсивности света (рис. 5).

Таким образом, зависимый от фотосистемы I циклический перенос электронов не является фактором, определяющим скорость фотовосстановления феррицианида.

Скорость выделения кислорода освещенными хлоропласта-ми возрастает на 20-25% при увеличении концентрации феррите

X

а) с; си

л „

Ё"

у сг

§2

§§

ЩХ з: а: х

V с; т

яз §

С

Концентрация ОМР-11\ГГ, мкМ

Рис. 5. Зависимость ингибирующего действия БОТ-ШТ на выделение кислорода хлоропластами гороха, инкубируемыми с антимици-ном А (•), и в контроле (О) в реакции Хилла с феррицианидом при насыщающей (А) и ненасыщающей (Б) интенсивности света. 100%-ные скорости выделения кислорода составляли 130 в контроле и 28 мкмоль/ч на 1 мг хлорофилла в присутствии БОТ-ШТ. Концентрация антимицина А составляла 4 мкМ. Другие условия, как на рис. 4

цианида от 50 мкМ до 3 мМ и не меняется при дальнейшем уве-личешш концентрации феррицианида. В хлоропластах, инкубируемых с ЭЫР-ГЫТ, скорость выделения кислорода с увеличением концентрации феррицианида возрастает в 3,5-4 раза, т.е. уровень ингибирующего действия ЭИР-ШТ на перенос электронов от воды на феррицианид снижается при увеличении концентрации феррицианида. Из этих данных следует, что доля участия фотосистемы II в восстановлении феррицианида возрастает по мере увеличения концентрации феррицианида в среде инкубации хлорошшстов, что, по-видимому, отражает особенности пространственного расположения фотосистемы II и фотосистемы I в тилакоидных мембранах хлоропластов.

Приведенные данные ингибиторного анализа свидетельствуют о возможности автономного режима работы фотосистемы II. Такой режим должен иметь важный физиологический смысл, поскольку в условиях несбалансированного функционирования фотосистем возникает угроза фотоингибирования фотосинтеза, что усугубляется гетерогенностью в латеральном распределении комплексов фотосистемы П и фотосистемы I в тила-коидах гран.

Однако возможностей подобных механизмов может оказаться недостаточно для предотвращения фотоингибирования в условиях высоких интенсивностей света, поскольку скорости оборота реакционных центров как фотокаталитических систем на несколько порядков превышают скорости оборота темповых ферментативных систем, которые в силу этого не могут противостоять избыточному фотоэлектронному давлению. Поэтому естественно предполагать существование дополнительных, физических, механизмов нефотохимического тушения электронного

Табл. 3. Действие различных хинонов на относительный квантовый выход флуоресценции хлорофилла а в хлоропластах гороха и мицеллах тритона Х-100. Концентрация хлорофилла а в суспензии хлоро-пластов составляла 2 мкг/ мл, в мицеллах тритона Х-100 — 0,5 мкг/ мл

Выход флуоресценции

Добавленный Концентрация, хлорофилла а, %

хинон мМ в хлоропластах в мицеллах тритона Х-100

и-Бснзохинон 0,1 1,0 95 86 97 93

Убихипон-10 0,1 1,0 не определяли 98 87

Дурохипон 0,1 1,0 50 10 98 65

Менадион од 1,0 38 2 97 50

возбуждения хлорофилла, снимающих излишнюю нагрузку с фотохимических реакционных центров.

Тушение флуоресценции хлорофилла хинонами. Нами испытан ряд хинонов как тушителей флуоресценции в природных и модельных системах (табл. 3). Полученные данные показывают, что испытанные хиноны различаются по эффективности тушения флуоресценции хлорофилла а в природных и модельных системах. Из испытанных хинонов наиболее эффективен менадион.

Эффективность тушешм флуоресценции хинонами различна в природных и модельных системах (рис. 6). Тушение флуоресценции выражено сильнее в хлоропластах гороха и хромато-форах из пурпурных бактерий, чем в мицеллах детергента: менадион, добавленный в концентрации 1 мМ, тушит флуоресценцию хлорофилла а в мицеллах тритона Х-100 в 2 раза, а в суспензии хлоропластов — в 50 раз. Эффективность менадиона как туши-

теля снижается в -10 раз и более в ряду: природные или искусственные мембраны — мицеллы детергента — этанолышй раствор хлорофилла.

Диурон, ингибирующий фотосшггетическш! перенос электронов между первичным и вторичным пластохинонами, не влиял на эффект менадиона как тушителя флуоресцепции хлорофилла в хлоропластах гороха. Таким образом, эффект менадиона как тушителя электронно-возбужденного состояния не может быть обусловлен его свойствами в качестве акцептора электронов в реакции Хилла, поскольку диурон подавляет эту реакцию, но не влияет на тушение флуоресценции хлорофилла менадио-ном.

Рис. 7 А показы-

1оот вает, что менадион

вызывает параллельное снижение и выхода, и времени жизни флуоресценции хлорофилла в хлоропластах.

Выход флуорес-loo цешцш хлорофилла в липосомах (рис. 7Б)

Рнс. 6. Действие менадиона на относитель- снижается по мере

ный квантовый выход флуоресценции бак- чения к01щсн-териохлорофилла а в хроматофорах Rhoao-

spirillum rubrum (д), Rhodobacter sphaeroides тращга менадиона в

хлорофилла а в хлоропластах гороха (□), большей степени, чем в липосомах (ш), мицеллах тритона Х-100 (о)

г? •

I «

X X (О

Pt

11°50 tag

er о о

f 5 §.

CD Ё

Л >

i.

Д* I

0,01

0,1 1 10 Концентрация менадиона, мМ

и этаноле (•)

время жизни флуо-

ресценции. Разрыв в действии менадиона на выход и время жизни флуоресценции хлорофилла значительно возрастает в мицеллах тритона Х-100 (рис. 7В).

Нечувствительность тушащего эффекта менадиона к диурону в хлоро-пластах и сходство в характере тушения в хло-ропластах и линосомах (рис. 7 А, Б) показывают, что менадион как тушитель взаимодействует в хлоропластах с антенным хлорофиллом, т.е. в хлоропластах имеет место нефотохимическое туше-

Рис. 7. Действие менадиона на относительный квантовый выход (•) и время жизни флуоресцен-; ции хлорофилла а (о) в хлоропластах гороха (Л), лнпосомах (Б) и мицеллах тритона Х-100 (В). Время жизни флуоресценции в отсутствие менадиона составляло 0,95 (Л), 5,8 (Б) и 5,2 (В) не. Концетрация хлорофилла с&Ь составила 5 (Л), 1,5 (Б) и 1 (В) мкг/мл

I 0,10 1,00

Концентрация менадиона, мМ

ние флуоресценции.

При этом в природных мембранах с упорядоченным расположением пигмента, максимально благоприятствующим миграции энергии электронного возбуждения от одной молекулы пигмента к другой (хлоропласта, хроматофоры), и в липосомах, в которых происходит концентрирование пигмента, тоже способствующее миграции энергии, менадион как тушитель флуоресценции проявляет практически одинаковую эффективность.

Концентрирование хлорофилла в мицеллах тритона Х-100, безусловно, должно быть ограниченным, поскольку лимитируется размерами мицелл. В мембранных препаратах значения выхода и времени жизни флуоресценции хлорофилла уменьшаются параллельпо по мере роста концентрации менадиона (рис. 7 А, Б). Сходные зависимости этих параметров были отмечены ранее у ряда фотосинтезирующих объектов при изучении тушения флуоресценции антенных хлорофиллов активными реакционными центрами16. Такой тип тушения (тушение второго рода) реализуется, если соответствующая константа скорости пропорциональна концентрации тушащих центров (тушение по Штерну-Фольмеру). Альтернативный тип тушения (тушение первого рода) реализуется в системах, в которых отдельная молекула может потушить одну, находящуюся в непосредственной близости молекулу возбужденного красителя. В этом случае появляются, по меньшей мере, две фракции красителя: потушенная и непоту-шенная, и, соответственно, нет пропорциональности между значениями выхода и времени жизни флуоресценции хлорофилла.

Пропорциональное падение времени жизни и выхода флуоресценции хлорофилла в хлоропластах с увеличением концентрации добавленного менадиона (рис. 7А) свидетельствует об

. . 19

эффективной миграции энергии электронно-возбужденного состояния от хлорофилла к центрам тушения, молекулам менадио-на, что позволяет отнести тушение флуоресценции менадионом в хлоропластах к тушению второго рода. Тушение флуоресценции в мицеллах может быть отнесено к тушению первого рода, туше, ние в липосомах — к промежуточному типу тушения, при котором часть молекул хлорофилла взаимосвязана, а другая часть не связана на уровне миграции энергии электронно-возбужденного состояния.

Выводы

1. Разобщители фотосинтетического и окислительного фос-форилирования ХКФ, ТТФБ и ПХФ, известные как АЕЖУ-реагешы, пригодны в качестве доноров электронов для фотовосстановления кремнемолибдата при участии фотосистемы II в хлоропластах гороха Они ингибируют фотосинтетическое выделение кислорода. Ингибирующее действие АШ1У-реагентов на выделение кислорода с феррицианидом в качестве акцептора электронов возрастает при снижении шггенсивностй света и не сопровождается образованием пероксида водорода. Зависимая от АБ11У-реагепта реакция Хилла с кремнемолибдатом является проявлением нециклического, а зависимое от А1ЖУ-реагента ингибировапие реакции Хилла с феррицианидом — проявлением циклического переноса электронов в фотосистеме II.

2. Ингибитор б^цитохромного комплекса ОЫР-ГЫТ тормозит выделение кислорода хлороштастами гороха в реакции Хилла с феррицианидом как акцептором электронов. Его действие усиливается с увеличением интенсивности света и уменьшением

концентрации акцептора. Антимицин А не влияет на ингиби-рующее действие БЫР-ШТ при разных интенсивностях света. Это указывает на то, что вклад фотосистемы I в циклический перенос электронов при оксигенном фотосинтезе незначителен. Относительный вклад фотосистемы I в нециклический перенос электронов от Н20 на феррицианид возрастает при увеличении интенсивности света и снижается при повышении концентрации феррицианида.

3. Хиноны вызывают тушение флуоресценции хлорофилла а в природных и модельных системах. Из испытанных хинонов максимальным эффектом обладает менадион. Пропорциональное падение времени жизни и выхода флуоресценции хлорофилла в хлоропластах с увеличением концентрации менадиона свидетельствует об эффективной миграции энергии электронно-возбужденного состояния от хлорофилла к центрам тушения флуоресценции, молекулам менадиона. Близкое к пропорциональному снижение времени жизни и выхода флуоресценции хлорофилла менадионом наблюдается в липосомах, но не в мицеллах детергента. Нечувствительность тушащего эффекта менадиона к диу-рону в хлоропластах и сходство в характере тушения в хлоропластах и липосомах показывают, что менадион как тушитель взаимодействует в хлоропластах с антенным хлорофиллом, т. е. в хлоропластах имеет место нефотохимическое тушение флуоресценции.

4. Данные о действии ЛЕЖУ-реагснтов и БИР-ЮТ показывают, что распределение восстановительных эквивалентов между циклическим и нециклическим путями переноса электронов с участием фотосистемы II осуществляется на уровне пластохино-на Ор. Эти результаты в совокупности с данными о тушении

флуоресценции хлорофилла хинонами согласуются с представлением о регуляции состояния фотосинтетического аппарата мембранным фондом пластохшюна. В целом, полученные результаты позволяют сделать заключение о фотосинтетической цепи переноса электронов в хлоропластах как динамичной системе, способной к переключению с одного режима работы, на другой.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Samuilov, V. D., Barsky, Е. L. and Kitashov, А. V. ADRY Agent-induced cyclic and non-cyclic electron transfer around photosystem II // In: P. Mathis (ed.), Photosynthesis: from Light to Biosphere, Vol: II, 267-270. (1995) Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.

2. Самуилов В.Д., Киташов A.B. Торможение фотосинтетического окисления воды и переноса электронов при дыхапии протонофорными разобщителями // Биохимия, 1996, 61 (3), 299-304.

3. Киташов А.В., Самуилов В.Д. Взаимодействие ADRY-агентов с системой фотосинтетического окисления воды и дыхательной цепыо переноса электронов // Тезисы конференции "Автотрофные микроорганизмы". М.: «Диалог-МГУ», 1996, 61.

4. Киташов А.В., Барский Е.Л., Самуилов В.Д., Соотношение циклического и нециклического переноса электронов в фотосистеме II в зависимости от концентрации ADRY-агентов в среде // Тезисы конференции "Биоэнергетика фотосинтеза".

Пущино: ИГ1ФС, 1996, 33.

5. Самуилов В.Д., Барский Е.Л., Киташов А.В. Реакгщя Хилла в хлоропласта* гороха: вклад фотосистем II и I в восстановление феррицианида // Биохимия, 1997,62 (8), 1060-1065.

6. Samuilov, V. D., Borisov, A. Yu., Barsky, Е. L., Borisova, O. F., Kitashov, A. V. Quenching of chlorophyll fluorescence by quillones. Biochem. Mol. Biol. Int. In press.

1 Хлоропласты гороха выделяли, как описано в работе: Барский Е. Л., Губанова О. IL, Самуилов, В. Д. //Биохимия, 1991, 56, вып. 3,434-438.

2

Хроматофоры пурпурных бактерий выделяли, как описано в работе: Isaev, P. L, Libcrman, Е. А_, Samuilov, D., Skulacliev, P., Tsofina, L. M. // Biochim. Biophys. Acta, 1970,216,22-29.

3

Дифференциальный вход ±8 В, 14 бит, время преобразования менее 50 мкс.

4 Samuilov, D., Barsky, Е. L., Gubanova, О. N., Klimov, V., Kozlov, Yu. N. // FEBS Lett., 1995b, 357, 55-57.

5 fl'ina, M. D., Kotova, E. A., Borisov, A. Yu. // Biochim. Biophys. Acta, 1981, 636, 193-200.

6 Sayre, R. Т., Homann, P. H. // Arch. Biochem. Biophys., 1979, 196, 525-533.

7 Wydrzynski, T. Angstrom, J., VanngJrd, T. //Biochim. Biophys. Acta, 1989,973, 23-28. g

Ananyev, G. M, Wydrzynski, Т., Renger, G., Klimov, V. V. // Biochim. Biophys. Acta, 1992,1100,303-311.

9

Klimov, V., Ananyev, G., Zastiyzhnaya, O., Wydrzynski, Т., Renger, G. // Photosynth. Res., 1993,38,409-416.

10 Ananyev, G„ Renger, G„ Wacker, U„ Klimov, V. V. // Photosynth. Res., 1994, 41, 327338.

11 Bradley, R. L., Long, К. M., Frash, W. D. // FEBS Lett., 1991, 286,209-213.

12 Самуилов В.Д. // Биохимия, 1997, 62, № 5, 531-534.

13

Izawa, S. // In: Methods in Enzymology (A. San Pietro ed.), New York : Academic Press, 1980,69,414-434.

14 Maltón, R. // FEBS Lett., 1986, 208, 317-320.

15 Bendall, D. S., Manasse, R. S. // Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1229,23-38.

^ Тумерман Л. А., Сорокин Е. М. И Молекулярная биология, 1967,1,628-637.