Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Относительная биологическая эффективность альфа-облучения хлореллы при различных условиях культивирования клеток

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Относительная биологическая эффективность альфа-облучения хлореллы при различных условиях культивирования клеток"

На правах рукописи

Ляпунова Елена Романовна

Относительная биологическая эффективность альфа-облучения хлореллы при различных условиях культивирования клеток

Специальность 03.01.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005569281

I о МАЙ 2015

Обнинск - 2015 г.

005569281

Работа выполнена в Обнинском институте атомной энергетики - филиале федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Национальный Исследовательский Ядерный Университет «МИФИ»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Комарова Людмила Николаевна

Рубанович Александр Владимирович,

доктор биологических наук, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова (г. Москва), заведующий лабораторией экологической генетики

Козьмин Геннадий Васильевич,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии» (г. Обнинск), ведущий научный сотрудник лаборатории исследования действия неионизирующих излучений на агроценозы

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Защита состоится «18» июня 2015 г. в «15м» часов на заседании диссертационного совета Д 006.068.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии по адресу: 249032, Калужская обл., г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км, ГНУ ВНИИСХРАЭ, здание 1, к. 510. Факс: (48439) 680 66. Электронная почта: rirae70@gmail.com Сайт: http://www.riarae-raas.ru/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГНУ ВНИИСХРАЭ,

http://www.riarae-raas.ru/

Автореферат разослан « /¿Г» мая 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

/

Шубина Ольга Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования биологических эффектов различных видов ионизирующего излучения в широком диапазоне доз и определение особенностей структурных и функциональных нарушений в биологических системах связано с возрастающим в настоящее время негативным техногенным влиянием на различные экосистемы. Особенно актуально изучение действия редко- и плотноионизирующего излучения на биообъекты разной степени сложности, а также проблема относительной биологической эффективности (ОБЭ) ионизирующих излучений с разной линейной передачей энергии (ЛПЭ). В результате исследований действия излучений, различающихся по ЛПЭ на клетки про- и эукариот, начатых в конце 50-х годов XX в., был установлен сложный и неоднозначный характер зависимости ОБЭ от ЛПЭ, а также зависимость величины ОБЭ излучений не только от их физических характеристик, но и от свойств клеток восстанавливаться от лучевых повреждений. Хорошо известно повышение ОБЭ плотноионизирующих излучений в области малых доз. Однако биологическая эффективность плотноионизирующих излучений на единицу дозы является постоянной величиной, а возрастание ОБЭ обусловлено резким снижением эффективности редкоионизирующего излучения в области малых доз. Как правило, экспериментальные данные, подтверждающие эти выводы, получены на клетках, которые облучали в логарифмической стадии роста. Облучение клеток млекопитающих в стационарной стадии роста в эксперименте затруднено из-за значительного понижения эффективности роста клеток (5080%). Известно также, что эффективность роста культивируемых клеток растений мало зависит от стадии их роста.

Поэтому представляет интерес сравнительное изучение выживаемости клеток хлореллы, облучаемых в различных стадиях роста гамма-квантами 60Со, линейная потеря энергии (ЛПЭ) = 0,2 кэВ/мкм, и альфа-частицами 239Ри (ЛПЭ = 125 кэВ/мкм), а также изучение эффектов дорастания, определяющих генетическую нестабильность клеток.

Целью исследования являлось изучение некоторых закономерностей действия редко- и плотноионизирующего излучения на клетки хлореллы при различных условиях культивирования.

В связи с поставленной целью предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить зависимость эффективности роста клеток хлореллы от продолжительности их культивирования в питательной среде.

2. Получить кривые доза-эффекг клеток хлореллы, облученных гамма-квангами ®Сои альфа-частицами в логарифмической и стационарной стадиях роста.

3. Выявить и проанализировать разные формы гибели клеток хлореллы после облучения редко- и плотноионизирующим излучением.

4. Определить относительную биологическую эффективность альфа-излучения при различных условиях культивирования клеток.

5. Выявшъ способность клеток хлореллы к пострадиационному восстановлению.

6. Сравнить способность клеток хлореллы восстанавливаться на свету и при отсутствии света и количественно оценить параметры восстановления.

7. Оценить проявление генетической нестабильности по критерию позднего появления (дорастания) колоний клеток микроводоросли после воздействия, как гамма, так и альфа-излучения.

Научная новизна.

Обнаружены разные типы гибели клеток: как без деления, так и после первого или второго деления. Количественное соотношение типов инактивации менялось с увеличением дозы облучения. Впервые получены данные, демонстрирующие, что при облучении хлореллы альфа-частицами выход клеток, погибающих без деления, резко возрастает.

Экспериментально изучена динамика пострадиационного восстановления клеток хлореллы после облучения. Впервые количественно оценены параметры восстановления (необратимый компонент лучевого поражения и константа восстановления).

Впервые изучен эффект позднего появления колоний характеризующий генетическую нестабильность популяции микроводоросли и выявлены дозы гамма- и альфа-облучения, индуцирующие субповреждения в наибольшей степени.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные экспериментальные данные о закономерностях восстановления и относительной биологической эффективности плотноионизирующих излучений для репродуктивной гибели Chlorella vulgaris и гибели клеток без деления, имеют важное фундаментальное значение для построения математических моделей в радиобиологии. Сформулированные в диссертации выводы могут иметь практическую значимость для прикладной радиобиологии и экологии. Результаты работы также имеют фундаментальное значение, поскольку дополняют современный уровень знания об относительной биологической эффективности плотноионизирующих излучений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Относительная биологическая эффективность альфа-излучения при облучении клеток хлореллы равна 3 и не зависит от стадии культивирования клеток.

2. Существуют разные типы инактивации клеток хлореллы ионизирующим излучением, их количественное соотношение меняется с увеличением дозы облучения и не зависит от стадии культивирования клеток водоросли.

3. Клетки хлореллы способны к пострадиационному восстановлению, как на свету, так и в темноте. Необратимый компонент, показывающий количество клеток не способных к восстановлению, с увеличением дозы облучения, неуклонно возрастает, а константа восстановления, характеризующая скорость восстановления повреждений в единицу времени, для всех исследованных доз облучения остается постоянной.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальности 03.01.01 «Радиобиология», охватывающей проблемы взаимодействия радиации с веществом, первичные и последующие механизмы лучевых нарушений, прямые и непрямые эффекты (п.2), действия излучений на ДНК, мембраны, клеточные органеллы; репарация лучевых повреждений и клеточная гибель; механизмы гормезиса (п.4), радиочувствительности биологических объектов (п. 5), стохастические и не стохастические эффекты, их особенности; зависимости: доза-эффект и время-эффект; лучевая болезнь; канцерогенез; радиобиологические основы лучевой терапии опухолей (п. 8), в диссертационном исследовании представлен анализ биологических эффектов острого редко- и плотноионизирующего облучения одноклеточной зеленой водоросли рода Chlorella.

Личный вклад диссертанта в работу.

Ляпунова ЕР. принимала непосредственное участие в планировании данной работы, осуществляла ее организацию, самостоятельно проводила экспериментальные исследования, выполняла обработку полученных результатов, в том числе статистическую, а также анализ и сопоставление с данными, имеющимися в литературе.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на: 15-ой, 16-ой и 17-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (2011, 2012, 2013 гг.), Международном молодежном научном форуме «Ядерное будущее» Голицыно, 2011, на VIII и X региональных научных конференциях "Техногенные системы и экологический риск" (Обнинск 2011, 2013 гг.), Научных сессиях МИФИ (2012, 2014, 2015 гг.), международной научно-практической конференции «Ольвшскиий форум» (Севастополь, 2012), Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика" (Москва, 2012), международной научно-практической конференции «Современные проблемы радиационной медицины: от теории к практике» (Гомель, 2013г.).

По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 102 страницах и состоит из введения; обзора литературы; описания материалов и методов; главы, содержащей результаты экспериментальных исследований; обсуждения результатов исследования; выводов и списка литературы, содержащего 144 источников, из которых 100 опубликованы на русском языке и 44 - на иностранном. Результаты работы снабжены 6 таблицами, 18 формулами и 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы исследования, ставятся цель и задачи, решаемые в диссертации, обсуждается их научная новизна, теоретическая и практическая значимость.

Глава I. Обзор литературы

На основе анализа отечественной и зарубежной литературы рассмотрены закономерности формирования радиобиологических эффектов у организмов, в частности растений, в т.ч. радиационно-индуцированной нестабильности генома. Описаны механизмы пострадиационного восстановления клеток, использования микроводорослей, как объекта исследования действия ионизирующих излучений, а также характеристики выбранного объекта исследований.

Глава II. Материалы и методы исследования

Объектом исследования выбрана одноклеточная водоросль хлорелла (Chlorella), которая является удобным объектом биологического мониторинга состояния природных экологических систем (Соколов, М.С., и др., 1998), поскольку имеет широкий ареал распространения и присутствует как в водоемах, так и на почвах. С использованием хлореллы получена уникальная информация о мутагенных и летальных эффектах высоких доз внешнего облучения, продуктов ядерного деления 235U разного возраста (Мазурик, В.К., 2001.), 232Th (Евсеева Т. И. и др. 2008) неорганических и органических соединений в модельных растворах (Wong, М.Н. 1980), компонентов природных и промышленных вод (Шевченко, В.А. 1979). Хлорелла -инструмент мониторинга состояния водных экосистем на предмет острой токсичности проб поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных вод, водных вытяжек из почвы, осадков сточных вод и отходов, загрязнения сточными водами, (РД 52.24.635-2002).

На одноклеточных водорослях рода Chlorella были проведены первые теоретические и экспериментальные исследования биорегенеративных систем. Детальное изучение хлореллы позволило выявить и решить ряд проблем, связанных со специфическими требованиями биологических систем жизнеобеспечения (БСЖО) человека. Общими усилиями советских ученых (Ничипорович и др., 1962; Семененко и др., 1962; Терсков и др., 1964) и зарубежных (Myers, Brown, 1961; Sorokin, Krauss, 1965 и др.) были решены вопросы получения высокой продуктивности водорослей и заложены основы создания высокопродуктивных реакторов, разработана технология непрерывного культивирования водорослей.

В экспериментах по хроническому облучению большого числа поколений одноклеточной водоросли хлореллы и высших растений была разработана математическая модель накопления и элиминации мутаций в облучаемых природных популяциях (Шевченко и др., 1976, 1985, 1992).

Культивирование водоросли велось на жидкой питательной среде Тамия.

Облучение гамма-квантами б0Со проводили на установке «Исследователь» с мощностью дозы 22 Гр/мин. Средняя энергия гамма-квантов б0Со ~ 1,2 МэВ; ЛПЭ ~ 0,2 кэВ/мкм. В качестве источника альфа-частиц использовали радиоактивный изотоп J9Pu с мощностью 25 Гр/мин, средняя энергия альфа-частиц J111Э ~ 125 кэВ/мкм.

После облучения каждый образец высеивался на слой голодного агара, нанесенного на покровное стекло. Для дальнейшего роста тестируемые объекты помещали под источник света. Регистрация изменений проводилась методом микроколоний с помощью светового микроскопа БИОМЕД-3 и машинки для подсчета колоний каждые сутки в течение 6 дней относительно контрольного образца.

Способность клеток к пострадиационному восстановлению определяли после однократного облучения заданной дозой выдерживанием в непитательной среде при комнатной температуре (метод В.И. Корогодина) с последующим высевом на голодный агар через разные промежутки времени (1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 48 и 72 ч.).

Количественно процессы восстановления оценивались с помощью необратимого компонента радиационного поражения клеток (К) и константы восстановления (Р) по формулам, (Корогодин В.И., 1966; Капульцевич Ю.Г., 1978):

K(f) =

А

Обозначая правую часть уравнения (2) через A(t), получаем

р_ МО

(1) (2)

(3)

Где D/ - первичная доза, D „>,/„ - соответствующее значение эффективной дозы.

Полученные результаты обработаны с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 и Sigma Plot 2011.

Глава III. Результаты

3.1 Сравнение выживаемости клеток на разных стадиях роста после действия ионизирующих излучений

Для сравнения влияния ионизирующего излучения на разных стадиях роста клеток был определен временной интервал, за который облученные и необлученные популяции хлореллы выходят на стационарную фазу роста (рис.1). Для необлученной суспензии он составил 8 суток. Поэтому при изучении действия гамма-лучей и альфа-частиц на культуру водоросли использовали клеточные суспензии после 4-х (логарифмическая стадия роста) и 7-и (стационарная стадия) суток культивирования.

Показано, что в облученной культуре клетки выходят на стационарную фазу с запозданием (относительно контроля) и меньшим набором массы из-за некоторого количества клеток, погибших без деления, а также из-за накопления субповреждений, которые приводят к более позднему сроку формирования колоний.

Продолжительность культивирования, сутки

Рис. 1 - Кривые роста Chlorella vulgaris в необлученной (1) и облученной (2) суспензиях.

Следующим этапом стало определение зависимости получаемых эффектов от стадии культивирования клеток. Для этого все эксперименты проводились параллельно с использованием клеток, как в логарифмической стадии роста, так и в стационарной. Исследовались эффекты гибели клеток после облучения и процессы восстановления после полученных радиоповреждений. На рис.2 представлены кривые зависимости выживаемости клеток хлореллы, облученных в логарифмической (А) и стационарной (Б) стадиях роста от дозы облучения гамма-квантами. Кривая 1 получена сразу после облучения, кривая 2 - через трое суток после облучения. Видно, что во втором случае выживаемость увеличилась на 5-10%, что свидетельствует о способности хлореллы к восстановлению от радиационных повреждений.

Доза, Гр Доза, Гр

А Б

Рис. 2 - Выживаемость клеток хлореллы, облученных у-квантами в логарифмической (А) и стационарной (Б) стадиях роста. Кривая 1 - сразу после облучения; кривая 2 - через трое суток после облучения.

При сравнении уровня выживаемости обнаружено, что выживаемость хлореллы не зависит от стадии роста.

3.2 Анализ форм гибели облученных клеток

В ходе исследования зафиксированы разные типы инактивации клеток (рис.3).

с

! \

' о' Ц

А Б

Рис. 3- А-Б. Вторая стадия некроза- набухание мембранных органоидов, лизис хроматина ядра (кариопизис) до деления клетки (А), после нескольких делений (Б). Увеличение 10x40

Цщ*

) .

( > Ч®7 _ аЧ

Ч*

*'•»;* , * У.

В Г

Рис. 3 - В-Г. Третья стадия апопггоза - фрагментация тела клетки на ряд апоптических телец после нескольких делений. Увеличение 10x40

Для облученных клеток хлореллы характерна гибель «под лучом», апоптотическая гибель после нескольких делений и некротическая гибель как до деления, так и после нескольких делений. Эти данные хорошо соотносятся с данными представленными другими учеными (Камчатова, И.Е. и др., 1975; Саакян Д.Л, 1987; Шевченко В.А., 1970), полученными после действия тяжелых металлов и некоторых химических препаратов на культуру водоросли. Однако подобных исследований по выявлению разных типов инактивации клеток после действия гамма- и альфа-излучения представлено не было.

Количественное соотношение типов инактивации менялось с увеличением дозы облучения. Так, при дозах от 10 до 200 Гр преобладала гибель после второго деления, а при дозах от 100 до 300 Гр - гибель клеток до деления. Это согласуется с данными, полученными ранее другими исследователями (Векшина, Л.К., Сакович, И.С., Шевченко, В.А., 1974; Петин, В.Г., Кабакова, Н.М., 1977), показавшими, что при облучении хлореллы редкоионизирующим излучением гибель после первой споруляции преобладала вплоть до дозы в 250 Гр.

На рис.4 представлены результаты, демонстрирующие выход клеток, погибших без деления, после действия гамма- и альфа-излучения на клетки хлореллы, находящихся на разных стадиях культивирования.

Рис. 4 - Зависимость поражения клеток хлореллы, облученных в логарифмической (А) и стационарной (Б) стадиях роста, от дозы различных видов ионизирующих излучений. Кривая 1 - после гамма-облучения, кривая 2 - после альфа-облучения.

Таким образом, показано, что гибель клеток хлореллы, облученных ионизирующим излучением разного качества, мало зависит от стадии роста.

рд I I I I I_|_|_|_|_|_|_и

0 50 100 150 200 250 300 Доза, Гр

А

0 50 100 150 200 250 300 Доза, Гр

Б

Количество клеток, погибающих без деления, при увеличении дозы облучения повышается, а количество клеток, способных образовывать колонии снижается. 3.3 Относительная биологическая эффективность альфа-облучения Ранее (Векшина Л.И., Коган И.Г., 1970) была выяснена относительная биологическая эффективность излучений разного качества на клетки хлореллы, облученные в логарифмической стадии роста, но аналогичных исследований на клетках хлореллы, облученных в стационарной фазе роста, никто не проводил. Поэтому представляло интерес выяснить какова же относительная биологическая эффективность альфа облучения и зависит ли она от стадии роста хлореллы. На рис.5 представлены кривые зависимости выживаемости клеток хлореллы, облученных в разных стадиях роста, от продолжительности облучения разными видами излучений (альфа-частицами и гамма-квантами).

Доза, Гр

п inn 11П ->nn -Kil inn A

Рис. 5A — Выживаемость клеток хлореллы после облучения гамма-квантами (кривая 1) и альфа-частицами (кривая 2) в логарифмической стадии роста.

Доза, Гр

Рис. 5Б — Выживаемость клеток хлореллы после облучения гамма-квантами (кривая 1) и альфа-частицами (кривая 2) в стационарной (Б) стадиях роста.

Кривая 1 получена после облучения клеток гамма-квантами, кривая 2 — после облучения альфа-частицами. Видно, что выживаемость хлореллы, облученной альфа-частицами, ниже, чем клеток, облученных такой же дозой гамма-квантов. Поскольку кривые выживаемости после обоих видов излучения были экспоненциальными, значение относительной биологической эффективности (ОБЭ), определяемое отношением изоэффективных доз на кривых выживаемости, не зависело от уровня выживаемости, для которого рассчитывалось. Расчет ОБЭ производился по формуле:

ОБЭ = В,Ю2 (4)

где /)/ — доза гамма-излучения, снижающая выживаемость хлореллы, В2 — изоэффективная доза альфа-излучения.

На рис. 5А расчет ОБЭ показан стрелками. ОБЭ альфа излучения для логарифмической и стационарной фаз равны 3 ± 0,12 и 2,67 ± 0,22 соответственно. Следовательно, относительная биологическая эффективность альфа-излучения практически не зависит от стадии роста облучаемой суспензии клеток хлореллы. 3.4 Восстановление клеток

Для изучения пострадиационного восстановления хлореллы использовали два подхода. Первая серия экспериментов была посвящена изучению процессов классического восстановления (Корогодин и др., 1962), когда клетки восстанавливаются в непитательной среде в темноте (для подавления процессов фотореактивации). На рис. 6 представлены кривые выживаемости клеток хлореллы (панель А) после облучения их гамма-квантами и кривые восстановления клеток в темноте (панель Б). Видно, что восстановление клеток наблюдается в первые 6-8 часов, затем кривые выходят на плато.

Доза, Гр

Продолжительность восстановления, ч

Рис. 6 - Кривые выживаемости (А) и восстановления (Б) клеток хлореллы после действия гамма-излучения 190 Гр (кривая 1), 280 Гр (кривая 2).

Вторая серия экспериментов учитывает факт необходимости для нормальной жизнедеятельности растений света, который запускает разнообразные процессы

обмена веществ в растениях, поэтому возник вопрос о протекании световой репарации у водоросли, и возможном изменении при этом скорости восстановления.

На рис. 7 представлены кривые выживаемости и восстановления клеток водоросли на свету. Так же как и в предыдущем случае наблюдается процесс восстановления, который завершается за 6 часов, но при этом объем восстановившихся клеток уменьшается.

Доза, Гр

100 200 300 400

S

л

а

su 1 | i i i i | i i i i | i i i i 1 - -• I

-Q _

( 2 -

А Б

- i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 1 , 1 , 1 , 1 г

£

й о

а

i л

в

10

О 2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Продолжительность восстановлення, ч

Рис. 7 — Кривая выживаемости (А) и восстановления на свету (Б) клеток хлореллы после действия гамма-излучения 190 Гр (кривая 1), 280 Гр (кривая 2).

С использованием формул (1-3), представленных в главе 2, нами были рассчитаны параметры восстановления клеток хлореллы после гамма-облучения. Результаты представлены в табл.1 и 2.

Таблица 1 - Количественная оценка параметров восстановления (в темноте)

Доза Облучения, Гр Время восстановления Необратимый компонент (К), отн.единицы Константа восстановления (Р), час"1

190 Гр 4 часа 0,81 ±0,06 0,17 ±0,002

6 часов 0,51 ±0,06 0,17 ±0,003

8 часов 0,45 ± 0,09 0,17 ±0,003

10 часов 0,30 ± 0,02 -

280 Гр 4 часа 0,75 ± 0,04 0,17 ±0,007

6 часов 0,72 ± 0,06 0,17 ±0,003

8 часов 0,70 ± 0,07 0,17 ±0,003

10 часов 0,60 ± 0,04 -

Таблица 2 — Количественная оценка параметров восстановления (на свету) клеток хлореллы__

Доза Облучения, Гр Время восстановления Необратимый компонент (К), отн.единицы Константа восстановления (ß), час"1

190 Гр 4 часа 0,85 ± 0,05 0,17 ±0,003

6 часов 0,80 ± 0,05 0,17 ±0,005

8 часов 0,53 ± 0,06 0,17 ±0,004

10 часов 0,38 ± 0,06 -

280 Гр 4 часа 0,88 ± 0,04 0,17 ±0,003

6 часов 0,76 ± 0,04 0,17 ±0,004

8 часов 0,71 ±0,03 0,17 ±0,003

10 часов 0,67 ± 0,06 -

Доля клеток не способных к восстановлению в темноте (табл.1) уменьшается с увеличением времени восстановления клеток и составляет 0,30 (при действии гамма-квантов в дозе 190 Гр) и 0,60 (доза 280 Гр). Это означает, что 30 и 60% клеток, соответственно, не способны к пострадиационному восстановлению. Константа восстановления для обеих доз составила 0,17 ч"', это означает, что скорость восстановления не изменяется и около 17% оставшихся репарируемых радиационных повреждений восстанавливается каждый час.

Необратимый компонент радиационного поражения для клеток, восстанавливающихся на свету (табл.2), составил 0,38 и 0,67, константа восстановления осталась неизменной и составила 0,17 ч"1. В следующем эксперименте использовались большие дозы облучения (560 Гр, 745 Гр). Клетки облучались так же, как и в предыдущем опыте в стационарной стадии роста, восстановление протекало в темноте и на свету. Результаты представлены на рис. 8-9.

Также как и в предыдущих случаях, восстановление наблюдается первые 46 часов, затем скорость восстановления снижается и кривая восстановления выходит на плато. Кроме того, не наблюдается разницы между скоростью восстановления при разных условиях культивирования клеток. Аналогично рассчитаны константа восстановления и необратимый компонент лучевого поражения (табл.3 и 4).

Доза, Гр

Продолжительность восстановления, ч

Рис. 8 - Кривые выживаемости и восстановления после облучения гамма-квантами (560 Гр). Темные точки - восстановление в темноте, светлые точки - восстановление на свету.

Доза, Гр

а

О 2 4 6 8 10 12 14 Продолжительность восстановления, ч

Рис. 9- Кривые выживаемости и восстановления после облучения гамма-квантами (740 Гр). Темные кружки - восстановление в темноте, светлые кружки - восстановление на свету

Как и в предыдущем случае, необратимый компонент лучевого поражения увеличивается с течением времени восстановления, т.е. уменьшается количество клеток способных к восстановлению. Так, необратимый компонент лучевого поражения для дозы 560 Гр составил 0,7, а для дозы в 745 Гр - 0,82. Другими словами, с увеличением дозы облучения увеличивается количество клеток не способных к восстановлению. Скорость же восстановления для всех изученных доз остается неизменной и составляет 0,17±0,12 час"1.

Таблица 3 - Количественная оценка параметров восстановления клеток хлореллы____

Доза облучения, Гр Время восстановления Необратимый компонент (К), отн. единицы Константа восстановления (Р), час"1

560 Гр 4 часа 0,84 ±0,11 0,17 ±0,12

6 часов 0,74 ± 0,08 0,17 ±0,12

10 часов 0,70 ± 0,07

745 Гр 4часа 0,91 ± 0,06 0,17 ±0,12

6 часов 0,85 ± 0,07 0,17 ±0,12

10 часов 0,82 ± 0,05

В табл. 4 представлены результаты количественной оценки параметров восстановления клеток хлореллы в зависимости от дозы облучения.

Таблица 4 — Количественная оценка параметров восстановления клеток хлореллы от дозы облучения__

Доза облучения, Гр Необратимый компонент (К), отн. единицы (в темноте) Необратимый компонент (К), отн. единицы (на свету)

190 Гр 0,30 ± 0,02 0,38 ±0,06

280 Гр 0,60 ± 0,04 0,67 ± 0,06

560 Гр 0,70 ± 0,07 0,70 ± 0,07

745 Гр 0,82 ± 0,05 0,82 ± 0,05

Видно, что с увеличением дозы необратимый компонент лучевого поражения возрастает, т.е. количество клеток способных к репарации повреждений уменьшается, константа восстановления, характеризующая вероятность восстановления в единицу времени остается неизменной.

3.5 Проявление генетической нестабильности

В качестве первичного теста на генетическую нестабильность использовали эффект дорастания клеток. Выжившими для репродуктивной формы гибели считали клетки, образовавшие микроколонии из 10 и более клеток. Для теста гибель клеток без деления - погибшими считали клетки, не поделившиеся ни одного раза, а выжившими - клетки, поделившиеся за сутки хотя бы один раз. Эффект оценивали как процент колоний, выросших в разное время после

облучения, относительно колоний, выросших при данной дозе за все время наблюдения. Подсчет выросших колоний производился, начиная с момента появления видимых колоний в контроле (36 часов) непосредственно после 24, 48, 72, 96, 120, 144 часов после облучения. Эффект дорастания клеток, характеризующий генетическую нестабильность проявляется как при действии редкоионизирующего, так и при действии плотноионизирующего излучения. При этом дозы, индуцирующие субповреждения в наибольшей степени, для них различны. Для гамма-излучения этот диапазон находится в пределах 50100 Гр, для альфа-излучения он смещен в меньшую сторону и составляет 20-50 Гр. Минимальное время, необходимое клеткам для восстановления, одинаково, и составляет около 48 часов. При этом плотноионизирующее излучение вносит больше повреждений на единицу дозы, поэтому клетки, способные восстановиться, дают колонии не позднее 48 часов после облучения (рис.10).

Рис. 10 - Зависимость эффекта дорастания клеток хлореллы от дозы гамма- (А) и альфа-облучения (Б). Кривая 1 - количество колоний, вырастающих после 36 часов; кривая 2 - после 48 часов; ]фивая 3 - после 96 часов.

Заключение: Проведенный в работе анализ действия ионизирующего излучения с различными ЛПЭ на культуру зеленой одноклеточной водоросли Chlorella vulgaris показал, что зависимость выживаемости клеток от дозы облучения экспоненциальна. Такой тип зависимости реализуется в том случае, когда в процессе репарации каждого возникающего повреждения в клетке при облучении остаются не восстановленные повреждения, подчиняющиеся пуассоновскому распределению. Угол наклона экспоненты, отражающий радиочувствительность клеток, соответствует в этом случае выходу не репарируемых повреждений ДНК. При этом облучение альфа-частицами вызывает значительно большую гибель клеток микроводоросли при условии облученных в одних и тех же дозах. Поскольку кривые выживаемости после обоих видов излучения были экспоненциальными, значение относительной биологической эффективности (ОБЭ), определяемое отношением изоэффективных доз на кривых выживаемости после гамма- и альфа-облучения, не зависело от уровня выживаемости, для которого оно рассчитывалось. ОБЭ альфа излучения равна 2,8 ± 0,12. Впервые обнаружены разные формы гибели клеток Chlorella vulgaris: гибель «под лучом», апоптотическая гибель после нескольких делений и некротическая гибель как до деления, так и после нескольких делений. Показано, что при изоэффективных дозах воздействия обоих видов излучения выход клеток погибших «под лучом» практически в 2 раза выше такового после действия гамма-квантов для клеток в логарифмической фазе роста и 1,5 раза - в стационарной.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что выживаемость хлореллы, облученной альфа-частицами, ниже, чем клеток, облученных такой же дозой гамма-квантов. ОБЭ альфа-излучения составила 2,8 ± 0,12 и не зависела от стадии культивирования клеток.

2. В ходе исследования обнаружены разные типы гибели клеток: как без деления, так и после первого или второго деления. Количественное соотношение типов инактивации менялось с увеличением дозы облучения.

3. Продемонстрировано, что при облучении хлореллы альфа-частицами выход клеток, погибающих без деления, резко возрастает, причем выход этих повреждений больше для плотноионизирующего, чем для редкоионизирующего излучения.

4. Выявлен эффект пострадиационного восстановления, как на свету, так и в темноте клеток микроводоросли после облучения ее гамма-квантами.

5. Установлено, что необратимый компонент лучевого поражения, демонстрирующий количество клеток не способных к восстановлению, с увеличением дозы облучения, неуклонно возрастает, а константа восстановления, характеризующая скорость восстановления повреждений в единицу времени, для всех исследованных доз облучения остается постоянной и составляет 0,17 ч"1 для всех доз.

6. Показано, что эффект позднего появления колоний (эффект дорастания клеток), характеризующий генетическую нестабильность, проявляется как при действии редкоионизирующего, так и при действии плотноионизирующего излучения.

7. Выявлено, что дозы, индуцирующие субповреждения в наибольшей степени, для разных типов излучения различны. Для гамма-излучения этот диапазон находится в пределах 50-100 Гр, для альфа-излучения он смещен в меньшую сторону и составляет 20-50 Гр.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Ляпунова Е.Р. Изучение генетической нестабильности популяции Chlorella vulgaris после действия ионизирующего излучения разного качества / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Медико-биологические проблемы жизнедеятельности. - 2013. - № 1 (9). - С. 77-82.

2. Ляпунова Е.Р. Действие редко- и плотноионизирующего излучения на популяцию Chlorella vulgaris / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Радиация и риск. - 2014. - вып.4. - стр. 52-58.

В сборниках статей и материалов конференций:

3. Ляпунова Е.Р. Закономерности гамма-облучения хлореллы при разных условиях культивирования / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Сборник тезисов 15-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" - Пущино, 2011. - С.136-137.

4. Ляпунова Е.Р. Закономерности действия гамма-излучения на клетки хлореллы в зависимости от дозы облучения / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Материалы конференции "Международный молодежный научный форум «Ядерное будущее» - Голицыно, 2011.

5. Ляпунова Е.Р. Влияние гамма-облучения на хлореллу в разных стадиях роста клеток / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Материалы докладов VIII Региональной научной конференции "Техногенные системы и экологический риск" - Обнинск, 2011 - С.49 - 52.

6. Ляпунова Е.Р. Некоторые количественные закономерности действия гамма-излучения на хлореллу / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Сборник научных работ лауреатов конкурса им. Е.Р.Дашковой. - Калуга, 2011. -вып.5. - С.45-50.

7. Ляпунова Е.Р. Закономерности гамма-облучения хлореллы в разных стадиях роста клеток / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Аннотации докладов Научной сессии НИЯУ МИФИ-2012 - Москва, 2012 - Т. 1. - С. 92.

8. Ляпунова Е.Р. Закономерности действия плотноионизирующего и редкоионизирующего излучений на одноклеточную водоросль Chlorella Vulgaris в разных стадиях роста клеток / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Сборник тезисов 16-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" - Пущино, 2012. - С. 321-322.

9. Ляпунова Е.Р. Некоторые количественные закономерности воздействия излучения разного качества на хлореллу / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Науков1 пращ - науково-методичный журнал -Севастополь, 2012 - вып.173.2012 - С.77 - 79.

10. Ляпунова Е.Р. Некоторые количественные закономерности действия излучения разного качества на хлореллу / Е.Р. Ляпунова, Л.Н.

Комарова // M ¡жду народ на науково-практична конференщя «Ольвшскиий форум» - Севастополь, 2012, сборник тезисов, С.40.

11. Ляпунова Е.Р. Зависимость действия плотноионизирующего излучения на клетки хлореллы от стадии роста / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Тезисы Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика 2012» - Путцино, 2012-С.116-117.

12. Ляпунова Е.Р. Закономерности действия некоторых химических веществ на культуру клеток Chlorella vulgaris / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова, У.А. Вежичанина // Сборник научных работ лауреатов конкурса им. Е.Р.Дашковой. - Калуга, 2012. - вып.6. - С.5-15.

13. Ляпунова Е.Р. Закономерности действия гамма- и альфа-облучения на культуру Chlorella vulgaris в разных стадиях роста клеток. // Материалы докладов X Региональной научной конференции 'Техногенные системы и экологический риск" - Обнинск, 2013 - С.68 - 72.

14. E.Sarapultseva, J.Igolkina, E.Lyapunova Low-dose non-targeted effects of ionizing radiation in daphnia // The abstracts book of the 40th Annual Meeting of the European Radiation Research Society (ERR2013). Dublin, Ireland, 1-5 sept. 2013, W-19

15. Сарапульцева Е.И., Иголкина Ю.В., Ляпунова E.P., Ускалова Д.В., Исследование эффектов гамма-облучения в малых дозах на нетрадиционных экспериментальных животных // Тез.докл. Международной XIII конференции «Безопасность АЭС и подготовка кадров». Обнинск, 2013. С. 141-143.

16. Сарапульцева Е.И., Иголкина Ю.В., Ляпунова Е.Р., Ускалова Д.В., Паукова О.Ю. Закономерности формирования немишенных эффектов острого и хронического низкодозового радиационного воздействия на нетрадиционных экспериментальных животных // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук — Калуга: АНО КНЦ, 2013. Вып. 18. - С. 254-258

17. Сарапульцева Е.И., Иголкина Ю.В., Ляпунова Е.Р., Паукова О.Ю., Ускалова Д.В. Закономерности формирования немишенных эффектов острого и хронического низкодозового радиационного воздействия на нетрадиционных экспериментальных животных. // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. Вып. 18. -Калуга: РНЦ им. А.В. Дерягина, 2013. С. 254-258.

18. Ляпунова Е.Р. Изучение генетической нестабильности популяции хлореллы после действия ионизирующего излучения разного качества / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Материалы международной научно-практической конференции «Современные проблемы радиационной медицины: от теории к практике» — Гомель, 2013 — С. 100-102.

19. Ляпунова Е.Р. Изучение действия ионизирующего излучения разного качества на генетическую нестабильность популяции хлореллы / Е.Р. Ляпунова, Л.Н. Комарова // Сборник тезисов 17-ой Международной

Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" - Пущино, 2013 - С.131-132.

20. Ляпунова Е.Р. Некоторые закономерности действия редкой плотноионизирующего излучения на популяцию Chlorella vulgaris // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук - Москва, 2013, №12-3, с. 45-48.

21. Сарапульцева Е.И., Иголкина Ю.В., Ляпунова Е.Р., Паукова О.Ю., Ускалова Д.В. Закономерности формирования немишенных эффектов острого и хронического низкодозового радиационного воздействия на нетрадиционных экспериментальных животных. Сообщение 2 // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. Вып.19. - Калуга: РНЦ им. A.B. Дерягина, 2014. С.

22. Ляпунова Е.Р. Проявление генетической нестабильности в популяции Chlorella vulgaris после действия редко- и плотноионизирующего излучения // Материалы докладов XI Региональной научной конференции "Техногенные системы и экологический риск" - Обнинск, 2014 - С. 163 - 164.

Заказ № 762 от 05.05.2015. Тираж 100 экз. Объём 1 п.л. Формат 60x84 Vi6. Печать офсетная.

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова,