Метаболизм молекулярного водорода у одноклеточных цианобактерий

Шереметьева, Марина Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболизм молекулярного водорода у одноклеточных цианобактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм молекулярного водорода у одноклеточных цианобактерий"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

на правах рукописи

ШЕРЕМЕТЬЕВА Марина Евгеньевна

МЕТАБОЛИЗМ МОЛЕКУЛЯРНОГО ВОДОРОДА У ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

Специальность: 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени ' кандидата биологических наук

Москва, 2003 г.

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии фототрофных микроорганизмов Института фундаментальных проблем биологии РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Л. Т. Серебрякова.

Научный консультант:

доктор биологических наук А. А. Цыганков.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л. М. Герасименко,

кандидат биологических наук Л. Е. Михеева.

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии ' а ^ микроорганизмов РАН.

Защита состоится 18 сентября 2003 года в 15 часов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, корп. 12, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета

МГУ.

Автореферат разослан 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

и 355

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способность к поглощению и выделению молекулярного водорода обнаружена у микроорганизмов различных таксономических групп- Метаболические пути, в которых участвует Н2, очень разнообразны, так же, как его функции в жизнедеятельности клеток. В последние годы, в связи с поиском альтернативных источников энергии, резко увеличилось количество исследований, посвященных метаболизму водорода. Н2 - один из наиболее перспективных кандидатов на роль экологически чистого и возобновляемого топлива будущего. Во многих странах разрабатываются методы синтеза водорода с помощью биосистем.

Метаболизм молекулярного водорода включает процессы восстановления ЬГ и окисления Н2 в соответствии с простейшей химической реакцией:

2Н* + 2е~ ±5 Н2.

В большинстве случаев она катализируется специфическими ферментами -гидрогеназами. Это очень древняя группа ферментов, сложность организации и функционирования которых контрастирует с внешней простотой осуществляемой ими реакции. Последняя рассматривается как прототип всех реакций, катализируемых металлоферментами. Таким образом, изучение гидрогеназ обладает не только прикладным, но и фундаментальным значением, поскольку помогает понять общие принципы ферментативного катализа и эволюции метаболических процессов.

Использование цианобактерий как возможных продуцентов Н2 особенно заманчиво, поскольку они образуют водород за счёт конверсии солнечной энергии и не требуют сложных дорогостоящих питательных сред. Цианобактерии располагают, по меньшей мере, тремя ферментами, ответственными за окисление Н2 и/или восстановление протонов - нитрогеназой и двумя железо-никель-содержащими гидрогеназами. Нитрогеназа катализирует образование водорода как побочного продукта при восстановлении N2. Поглощающая гидрогеназа ре-утилизирует Н2, выделяющийся в клетках с активной нитрогеназой. Это мем-браносвязанная гидрогеназа, которую кодируют гены ИирБЬ - гидрогеназа Нир-типа. Электроны от поглощающей гидрогеназы через цитохром передаются в пластохиноновый пул. Гидрогеназа, представляющая собой мультимерный фермент, который кодируют гены ИохЕШУН - гидрогеназа Нох-типа. Она не имеет отношения к фиксации азота. У изученных штаммов она катализирует и образование, и поглощение Н2, поэтому названа обратимой. Данных о её каталитических и биохимических свойствах немного; не вполне понятно, с какими естественными донорами/акцепторами электронов она взаимодействует. Анализ последовательностей Лох-генов позволил предположить, что это пиридин-нуклеотиды. Существует гипотеза, согласно которой обратимая гидрогеназа ассоциирована с дыхательным комплексом I и передаёт ему электроны. Вопрос о

том, каково значение этого фермента в жизнедеятельности цианобактерий, до сих пор остаётся открытым.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - сравнительная характеристика водородного метаболизма, участвующих в нём гидрогеназ и его физиологического значения у одноклеточных неазотфиксирующих цианобактерий Gloeocapsa alpicola и Chroococcidiopsis thermal is. Задачи работы состояли в следующем:

1) выявить физиологические факторы, влияющие на гидрогеназную активность клеток G. alpicola и С. thermalis, и определить условия, оптимальные для её проявления;

2) идентифицировать и охарактеризовать гены, кодирующие гидрогеназы G. alpicola и С. thermalis;

3) исследовать регуляцию синтеза гидрогеназы G. alpicola на уровне транскрипции в условиях, благоприятных для развития гидрогеназной активности;

4) изучить каталитические свойства очищенной гидрогеназы G. alpicola с целью определения её первичных физиологических доноров/акцепторов электронов.

Научная новизна работы. Данное исследование расширяет наши знания о метаболизме водорода у неазотфиксирующих цианобактерий и о свойствах цианобактериальной обратимой гидрогеназы. Как выяснилось, именно она ответственна за наблюдаемые реакции образования и поглощения Н2 у обоих изученных штаммов, поскольку в геномах последних найдены полные кластеры hox-генов, но не гены hup. Однако по характеру проявления и уровню гидрогеназной активности G. alpicola и С. thermalis значительно различаются.

На примере С. thermalis впервые показано, что обратимая гидрогеназа может служить, главным образом, для окисления Н2 - клетки данной цианобакте-рии поглощают водород на свету, используя 02 как акцептор электронов. Гид-рогеназная активность, измеренная по образованию Н2 с искусственными переносчиками электронов, крайне низка и не зависит от таких факторов, как содержание кислорода в среде и обеспеченность культуры азотом.

G. alpicola проявляет высокий уровень гидрогеназной активности в реакции образования Н2 in vitro. В отличие от гетероцистных цианобактерий, активность обратимой гидрогеназы G. alpicola не увеличивается при росте клеток в микроаэробных условиях, но возрастает при лимитировании роста культуры светом и, в большей степени, нитратом. Показано, что при переходе в состояние азотного голодания в клетках G. alpicola осуществляется ряд адаптивных изменений, следствием которых становится снижение окислительно-восстановительного потенциала внутри клеток. Выдвинуто предположение о том, что внутриклеточный Еь является тем фактором, который прямо или опосредованно контролирует активность обратимой гидрогеназы G. alpicola. Получены оригинальные данные, показывающие, что механизмы регуляции фермента у G. alpi-

cola отличаются от таковых у гетероцистных форм: у Anabaena variabilis синтез обратимой гидрогеназы регулируется и на транскрипционной, и на посттранскрипционных стадиях, тогда как у G. alpicola в условиях недостатка азота -только на постранскрипционных. Изучение каталитических свойств изолированной гидрогеназы G. alpicola показало, что она эффективно катализирует и окисление Н2, и восстановление протонов. Получены убедительные данные, свидетельствующие, что физиологическими донорами/акцепторами электронов, с которыми взаимодействует этот фермент, являются пиридиннукпеотиды. Продемонстрировано, что G. alpicola способна поглощать Н2 in vivo на свету, независимо от присутствия Oj, и выделять водород в темновых анаэробных условиях.

Полученные данные позволяют заключить, что обратимая гидрогеназа у разных цианобактерий подчиняется различным регуляторным механизмам и по-разному проявляет активность, катализируя поглощение или образование Нг, в зависимости от внешних факторов и особенностей метаболизма данного штамма.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-й и 3-й Конференциях молодых ученых (Пущино, 1998 и 1999 гг.), на XI Конференции северных стран по азотфиксации (Стокгольм, Швеция, 2000 г.), на б-й Международной конференции по молекулярной биологии гидрогеназ (Потсдам, Германия, 2000 г.), на конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2000 г.), на конференции «Научные исследования в наукоградах Московской области» (Пущино, 2001 г.), на конференции «BioHydrogen 2002» (Эде, Нидерланды, 2002 г.), на 5-м Европейском совещании по молекулярной биологии цианобактерий (Стокгольм, Швеция, 2002 г.) и на 7-й Международной конференции по солнечной энергии и прикладной фотохимии, объединённой с 4-м Международным совещанием по фотохимии окружающей среды (Луксор, Египет, 2003 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них пять статей в реферируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы по теме, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитированной литературы из 238 пунктов. Текст работы занимает 141 страницу, содержит 37 рисунков и 19 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследования служили одноклеточные неазотфик-сирующие цианобактерии Gloeocapsa alpicola CALU 743 (=Synechocystis sp. PCC 6308) и Chroococcidiopsis thermalis CALU 758, полученные из Коллекции

водорослей Санкт-Петербургского государственного университета. В сравнительных и контрольных экспериментах использовали одноклеточную неазот-фиксирующую цианобактерию Synechocystis sp. РСС 6803 и гетероцистную цианобактерию Anabaena variabilis АТСС 29413. Все штаммы выращивали на среде BG|i [Stanier at al, 1971], обогащенной KN03 (2-15 мМ, в зависимости от условий эксперимента) в случае одноклеточных цианобактерий и 5 мМ NH4CI в случае A. variabilis. Периодическое культивирование осуществляли в стеклянных сосудах при температуре 28-30°С, освещении 25 Вт/м2 и продувании воздухом или аргоном с 1-2 % СОа- Непрерывное культивирование с контролем температуры (30°С), рН (7,0) и содержания в среде СОг (1-3 %) проводили в управляемом фотобиореакторе [Tsygankov et al, 1994].

Рост культур цианобактерий отслеживали по оптической плотности суспензии клеток. Кроме того, определяли содержание в клетках хлорофилла а (методом метаноловой экстракции), гликогена (фенольным методом) и белка (по Лоури и Брэдфорд).

Активность гидрогеназы в клетках, бесклеточных экстрактах и частично очищенных препаратах фермента определяли по скорости образования Н2 из восстановленного метилвиологена (MB*), используя газовую хроматографию. Окисление Н2 очищенными препаратами гидрогеназы регистрировали спектро-фотометрически по восстановлению окисленного метилвиологена (МВ2+); этот же метод применяли для прямой регистрации активации гидрогеназы в атмосфере Нг. Удельную гидрогеназную активность в обоих случаях выражали как отношение общей активности (нмоль Н2 / мл / час или нмоль Н2 / мл / мин) к содержанию в препарате хлорофилла а или белка. Способность клеток цианобактерий поглощать или выделять Н2 in vivo оценивали амперометрическим методом, с помощью Ог/Нг-электрода [Oxelfelt et al, 1995].

Для получения бесклеточных экстрактов осаждённые клетки цианобактерий разрушали ультразвуком при постоянном охлаждении, а затем мембранную фракцию отделяли центрифугированием. Частично очищенные препараты гидрогеназы получали с помощью двухстадийной ионообменной хроматографии на колонках с DEAE-целлюлозой DE52. Молекулярную массу фермента оценивали методом гель-фильтрации на колонке с Sephaciyl S-200. Электрофорез препаратов гидрогеназы проводили в неденатурирующих условиях в ПААГ (7,5 %) [Серебрякова, Гоготов, 1995].

Очистку геномной ДНК и тотальной РНК цианобактерий осуществляли методом экстракции с фенолом и хлороформом [Tamagnini et al, 1997; Axelsson et al, 1999], с некоторыми модификациями. Для очистки плазмидной ДНК Е. coli использовали набор «Wizard Plus Minipreps DNA Purification System», для очистки ДНК из геля и реакционных смесей - наборы «Wizard Minipreps DNA Purification System» (Promega), «QIAquick Gel Extraction Kit» (QIAGEN) и «GFK™» (Amersham-Pharmacia Biotech). Гидролиз ДНК рестрикционными эн-донуклеазами производили согласно инструкциям поставщика ферментов (Ат-

ersham-Pharmacia Biotech). Визуализацию и разделение ДНК с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле осуществляли по стандартному протоколу [Sambrook et al, 1989]. Полимеразные цепные реакции (ПЦР) проводили с использованием Taq-ДНК-полимеразы (Amersham-Pharraacia Biothech), в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) осуществляли по известному методу [Axelsson et al, 1999], с рядом модификаций. Продукты ПЦР клонировали в вектор pPCR®2.1-TOPO (Invitrogen) по прописи производителя. Для создания частичной библиотеки генов использовали вектор pBlueScript II SK+ (Amersham-Pharmacia Biotech); гидролиз ДНК, дефосфорилирование, лигирование и трансформацию компетентных клеток проводили по стандартным методикам.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Гидрогеназная активность G. alpicola

Интактные клетки G. alpicola обладают гидрогеназной активностью, которая проявляется в реакции выделения Н2 из МВ+. В периодических культурах гидрогеназная активность была минимальна в экспоненциальной фазе, увеличивалась в период линейного роста клеток и достигала максимума к стационарной фазе. ' -

Влияние света и О?. Используя непрерывное культивирование, исследовали влияние на гидрогеназ-Таблица 1. ную активность освещения, Влияние освещения на скорость роста (ц), содержание содержания 02 в среде И СЬ и гидрогеназную активность турбидостатных куль- _

G. alpicola. обеспеченности культуры

нитратом. Оказалось, что активность увеличивается при лимитировании роста культуры светом (табл. 1), но не зависит от концентра-

Освещение, И.*' о2) ГА,

Вт/м2 мкМ нмоль Н2/ч / мг белка

25 0,02 248 3610

50 0,05 261 2100

75 0,08 308 790

Равновесная концентрация биомассы 0,2 мг белка / мл. цИИ в среде (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние микроаэробных условий на ростовые параметры и гидрогеназную активность турбидостатных культур С. а1рко1а.

Газовая фаза 02, Хлорофилл Белок, Гликоген, Гд, нмоль Н2 / ч / мг

ч мкМ а, мкг/мл мг/мл мг/мг белка белка

Воздух + 2 % С02 0,07 325 2,7 ОД 0,65 2130

Аргон + 2 % ССЪ 0,07 5-8 2,7 0,2 0,67 2150

Культивирование проводилось при освещении 50 Вт/м'1.

Влияние обеспеченности культуры азотом. На непрерывных культурах в. а1рко1а было показано, что гидрогеназная активность увеличивается также при

лимитировании роста нитратом (табл. 3). Развитие активности наблюдалось и тогда, когда нитрат-лимитированные клетки получали при периодическом культивировании на среде с пониженной исходной концентрацией нитрата (рис. 1). Скорость увеличения гидрогеназной активности и ее конечный уровень в нитрат-лимитированных клетках были выше таковых в клетках из культур, растущих в нормальных условиях. Развитие активности нитрат-лимитиро-ванной культуры предотвращалось добавлением хлорамфеникола. Исчерпание азота в среде приводило к накоплению в клетках необычно большого количества гликогена. Нитрат-лимитированные клетки содержали меньше хлорофилла а и фикобилиновых пигментов, чем клетки, обеспеченные азотом, о чём свидетельствовали цвет культур и спектры поглощения суспензий клеток. Между клетками из нормальных и нитрат-лимитированных культур были выявлены и структурные отличия: первые имели развитый блок тилакоидных мембран, в то время как у вторых он был редуцирован; всё внутриклеточное пространство нитрат-лимитированных клеток было заполнено гликогеном.

Таблица 3.

Ростовые параметры и гидрогеназная активность нитрат-лимитированных хемостатных культур <?. а!рко1а, растущих при разных скоростях протока (О).

D.4-1 Хлорофилл Ог, мкМ Белок, Гликоген, Гд, нмоль Н2 / ч / мг бежа

а, мкг/мл мг/мл мг/мг белка

0,01 3,3 235 0,27 2,37 5650

0,03 6,4 248 0,25 1,02 3340

0,06 7,2 269 0,25 0,65 2500

Рис. 1. Рост и гидрогеназная активность клеток в. а1р!со1а, растущих в условиях обеспеченности нитратом (А-Б) и азотного голодания (В-Г)-Обозначения: (•, О) оптическая плотность культуры; (■, □) содержание хлорофилла а; (♦, О) содержание гликогена; (▲, Д) гидрогеназная активность. Стрелкой указано время добавления хлорамфеникола (10 мкг/мл).

96 120 144 24 48 Время роста, часы

Перечисленные изменения аналогичны тем, которые претерпевают многие другие цианобактерии при адаптации к недостатку азота в среде [Allen et al, 1990; Collier, Grossman, 1992; Sauerat al, 1999; Miller, Castenholz, 2001]. Одно из наиболее важных изменений, происходящих в клетках в таких условиях - это инактивирование ФСИ, и, следовательно, уменьшение внутриклеточной концентрации 02 [Allen et al, 1990; Görl et al, 1998]. Если подобное имеет место и у

G. alpicola, то в нитрат-лимитирован-ных клетках этой цианобактерии должна создаваться восстановленная среда. Это было доказано экспериментом, в котором к суспензиям нитрат-лимитированных и обеспеченных азотом клеток добавили раствор хлорида трифенилтетразолия (ТФТХ), кристаллизующегося и приобретающего красную окраску при относительно низком Рис. 2. Электронно-микроскопическая фото- значении редокс-потенциала. Развитие графия ультратонкого среза нитрат-лимити- окраски наблюдалось только в случае рованной клетки G. alpicola, обработанной нитрат-лимитированных клеток. На ТФТХ. фотографии клетки можно видеть кри-

Кристалл ТФТХ обозначен окружностью; х сталл этого соединения (рис. 2). Уве--¡2 500

личение гидрогеназной активности клеток G. alpicola при лимитировании роста культуры светом также может быть обусловлено снижением внутриклеточного Еь, поскольку недостаток света приводит к резкому снижению интенсивности фотосинтеза и, следовательно, к уменьшению концентрации 02 внутри клеток.

Физиологические реакции гидрогеназы. Как многие другие цианобактерии [Moezelaar, S tal, 1994], G. alpicola способна выделять водород in vivo в темно-вых анаэробных условиях. Образование Н2 начиналось без лаг-фазы и происходило за счёт сбраживания эндогенного гликогена (рис. 3). Более высокая интенсивность выделения Н2 нитрат-лимитированными клетками, по сравнению с обеспеченными нитратом, объясняется тем, что первые содержат больше гликогена и имеют более высокий уровень гидрогеназной активности. Замедление процесса, происходившее через 4 часа инкубации в случае нитрат-лимитированных клеток, было связано с накоплением водорода в среде, поскольку замена газовой фазы на аргон приводила к увеличению скорости реакции до начального уровня.

Поглощение водорода клетками G. alpicola было строго светозависимым, что указывает на взаимодействие гидрогеназы с фотосинтетической ЭТЦ (рис. 4). Скорость поглощения водорода нитрат-лимитированными клетками была примерно на порядок выше скорости поглощения Н2 клетками, обеспеченными азотом, и, в отличие от последних, не зависела от присутствия DCMU.

Г 1Л

О 60 120 180 240 300 360 Время инкубации, мин

Рис. 3. Выделение водорода ш vivo обеспеченными нитратом (А) и нитрат-лимитированными (Б) клетками G. alpicola при инкубации в темно-вых анаэробных условиях. Обозначения: (•) концентрация Н2 в газовой фазе; (О) содержание гликогена в клетках; стрелкой отмечена замена газовой фазы на аргон.

Гидрогеназная активность клеток обоих типов, измеренная по выделению Н2 с МВ+, различалась менее значительно. В случае нит-рат-лимитированных клеток она была близка скорости поглощения Н2 in vivo, откуда следует, что гид-рогеназа в таких клетках находилась в максимально активированном состоянии.

Выделение Н2 клетками G. alpicola в темновых анаэробных условиях имеет важное физиологическое значение, поскольку обеспечивает сброс избытка восстановителя, образующегося при сбраживании эндогенных углеводов. Инактивация ФСП, происходящая у цианобактерий в условиях азотного голодания, приводит к необходимости использования альтернативного источника электронов, которым может быть молекулярный водород, окисляемый гидрогеназой.

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0 2 4 6 8 10 12 14 16 182022 242628 30 Время инкубации, мин Время инкубации, мин

Рис. 4. Поглощение водорода суспензиями обеспеченных азотом (А) и нитрат-лимити-рованных клеток (Б) О. а1р1Со1а.

2. Молекулярно-генетические свойства гидрогеназы б. з/р/со/з

Идентификация и характеристика генов, кодирующих гидрогеназу (7. а1Ы-со1а. Для выявления генов, кодирующих гидрогеназу у С а\р1со1а, была осуществлена ПЦР с геномной ДНК цианобактерии и праймерами, сконструирован-

ными для hoxH A. variabilis. Один из продуктов реакции был клонирован и сек-венирован, обнаружив высокую степень гомологии с hoxH Synechocystis sp. РСС 6803. Гибридизация геномной ДНК с клонированным продуктом подтвердила присутствие в геноме G. alpicola данной последовательности (рис. 5). Остальные структурные гены обратимой гидрогеназы - hoxEFUY - были идентифицированы при помощью ПЦР с геномной ДНК G. alpicola и праймерами, сконструированными на основе известных последовательностей Лох-генов Synechocystis sp. РСС 6803 [Appel,

Рис. 5. Блот-гибридизация

hoxH hoxY т.п.н.

23.1 942 6 56 4 36

по Саузерну, подтверждающая присутствие генов ИохН и \ioxY в геноме О. а1р\со1а.

Геномная ДНК (3. а1рко1а, гидролизованная с помощью Нтс11, гибридизована с зондами ИохН-Са\ и ИохУ-Оа.

Schulz, 1996]. Были амплифициро-ваны, клонированы и секвенирова-ны продукты ожидаемых размеров. Наличие этих последовательностей в геноме G. alpicola подтвердили, показав гибридизацию продуктов с геномной ДНК. Все они оказались почти идентичными аналогичным последовательностям Synechocystis sp. РСС 6803.

Анализ транскрипции hoxH и hoxY в условиях, благоприятных для развития гидрогеназной активности. Идентифицировав Лох-гены G. alpicola, мы смогли определить, регулируется ли синтез гидрогеназы на транскрипционном уровне, оценив содержание соответствующих транскриптов в клетках. Анализ транскрипции гидрогеназы в клетках G. alpicola, растущих при недостатке в среде азота, провели методом ПЦР с обратной транскрипцией, используя прай-меры, специфичные для генов hoxH и hoxY (рис. 6). Уровень транскриптов Лох-генов варьировал незначительно, не коррелируя с уровнем гидрогеназной активности клеток, следовательно, синтез гидрогеназы в этом случае не подчиняется регуляции на транскрипционном уровне.

Для гетероцистных цианобактерий было показано, что индукция активности обратимой гидрогеназы, происходящая при микроаэробной адаптации [Houchins, Burns, 1981; Серебрякова и др., 1992], по-видимому, обусловлена усилением транскрипции фермента [Axelsson, Lindblad, 2002]. Это не согласуется с результатами, полученными нами для G. alpicola. Чтобы сравнить регуляцию гидрогеназы у G. alpicola с таковой у гетероцистных цианобактерий, мы провели анализ транскрипции Лох-генов у A. variabilis, применив тот же самый метод (рис. 7). Наибольшее количество транскрипта присутствовало в образцах, отобранных через 12 часов и через сутки после начала микроаэробной адаптации. Уровень транскрипции был намного ниже в нулевой точке, когда клетки почти не проявляли гидрогеназной активности, и через 6 часов инкубации, когда гидрогеназная активность только начинала увеличиваться. Таким образом, микроаэробная индукция обратимой гидрогеназы A. variabilis регулируется как на транскрипционной, так и на посттранскрипционных стадиях синтеза.

МАБВГДЕЖЗ М А Б В Г

Рис. б. Уровень транскриптов ИохН и hoxY в клетках G. alpicola, Рис. 7. Уровень транскриптов hoxH и hoxY в клетках A. variabilis, растущих в условиях азотного голодания. инкубируемых в микроаэробных условиях.

А. Содержание белка в клетках (о) и гидрогеназная активность (•). Б. ПЦР с кДНК. В. Отрицательный контроль. Линии А-3 - продукты ПЦР с/без кДНК; линия М - маркер молекулярного веса «100 Ьр»; линия К - положительный контроль с геномной ДНК в качестве матрицы; (*) артефакты, результат димеризации праймеров.

-т

3. Каталитические свойства изолированной гидрогеназы 6. а/р/со/а

Были охарактеризованы биохимические и каталитические свойства изоли- . рованной гидрогеназы б. а1рко1а (табл. 5).

Таблица 5.

Биохимические и каталитические свойства изолированной гидрогеназы G. alpicola.

Локализация: слабая ассоциация с мембранами

Чувствительность к 02: 1|/2 = 10 часов (воздух, ИТ)

Т|а = 8 суток (аргон, 4°С)

Термостабильность: 60°С

Температурный оптимум:

МВ+-зависимое образование Н2 55°С

Н2-зависимое восстановление МВ2+ 75°С

НАДН-зависимое образование Н2 45°С

Н2-зависимое восстановление НАД* 50°С

Энергия активации:

МВ+-зависимое образование Н2 40 кДж/моль

Н2-зависимое восстановление МВ2+ 24 кДж/моль

НАДН-зависимое образование Н2 50 кДж/моль

Н2-зависимое восстановление НАД* 50 кДж моль

Оптимум рН:

МВ+-зависимое образование Н2 4,5

Н2-зависимое восстановление МВ2+ 9,0

Н2-зависимое восстановление НАД* 8,0

Сродство к донорам/акцепторам электронов:

выделение Н2 —

• ■ MB+ 0,073мМ (Утах = 500 нмоль/мин/мг б.)

V НАДН 0,083 мМ (Ути = 10,5 нмоль/мин/мг б.)

поглощение Н2 —

v H2 0,038 мМ

v MB2+ 0,103 мМ (Утах = 1647 нмоль/мин/мг б.)

v БВ2+ i^-m 0,105 мМ (Утах = 4450 нмоль/мин/мг б.)

v НАД+ 0,110 мМ (Утах = 52 нмоль/мин/мг б.)

K,co 0,042 мМ

Молекулярная масса: 100 кДа (гель-фильтрация)

Фермент слабо ассоциирован с мембранами. Он чувствителен к воздейст-I вию Ог, поэтому препараты фермента хранили в атмосфере аргона. В таких ус-

ловиях гидрогеназа относительно термостабильна (рис. 8).

Она взаимодействует с искусственными переносчиками электронов -метилвиологеном и бензилвиологеном - в реакциях окисления Н2 и ^ катализирует образование водорода из МВ+. Измерены каталитические

константы этих реакций.

Мы установили, что, помимо собственно гидрогеназной активности, полученные препараты гидрогеназы обладают диафоразной активностью, катализируя восстановление протонов и окисление Н2 с пиридиннуклеотидами. Каталитические параметры этих реакций также определены.

40 45 50 55 60 65 70 75 t°C

3 кДа

Рис. 8. Термостабильность гидрогеназы О. а!рко1а в экстрактах из клеток, выращенных при достаточной (А) и лимитирующей (Б) концентрации ЫОз" в среде. Суспензии клеток на воздухе (А) и бесклеточные экстракты на воздухе (•) или под аргоном (О) прогревали до указанных температур в течение 10 мин., после чего измеряли гидрогеназную активность по выделению Н2 с МВ+ при 30°С.

Рис. 9. Электрофореграмма препаратов гидрогеназы в. а1рко1а в ПААГ в неденатурирующих условиях.

Линия 1 - бесклеточный экстракт; линия 2 - частично очищенный препарат гидрогеназы; линия 3 -маркер молекулярного веса. Для проявления активности использована реакция Нг-зависимого восстановления БВ2+.

Изолированный фермент й. в восстановительной активации, рода (рис. 10). Мы обнаружили,

Однако необходимо отметить, что манипуляции очистки приводят к разрушению мультимерной молекулы фермента и потере ею диафоразной активности, при сохранении собственно гидрогеназной. Оценка молекулярного веса гидрогеназы методом гель-фильтрации даёт величину порядка 100 кДа, соответствующую двухсубъединичной структуре. При неденатурирующем электрофорезе в случае бесклеточного экстрактра зоны активности указывают на белки с молекулярной массой около 140 кДа, тогда как в случае частично очищенного препарата фермента - около 60 кДа (рис. 9).

Гидрогеназная активность в реакциях с искусственными переносчиками электронов в таком препарате сохраняется, следовательно, на поверхности молекулы гидрогеназы существует независимый от диафоразной части центр связывания доноров/акцепторов элек-' тронов. Не исключено, что обратимые гидрогеназы цианобактерий могут in vivo взаимодействовать не только с пиридиннуклеотида-ми.

alpicola для проявления активности нуждается которая может достигаться в атмосфере водо-что этот процесс стимулируется добавлением

НАДН (рис. И), что характерно для классической НАД-восстанавливающей гидрогеназы водородных бактерий [Hyman et al, 1988].

400 350 300 250 200 150 100 50 0

0 50 100 150 200 250 Время инкубации, мин

Рис. 10. Активация и инактивация частично очищенной гидрогеназы С. а1рко1а. Обозначения: (О) инкубация препарата фермента под водородом; (•) инактивация на воздухе; (А) изменение активности под аргоном

2,0 1,6

i 1,2

J 0,1

0 5 10 15 20 Вромя инкубации, мин

Рис. 11. Влияние НАДН на процесс Н2-зависимого восстановления МВ2+, катализируемого гидрогеназой & а1рко1а. Условия реакции: Н2 (пунктир); Н2 + НАДН (сплошная линия); аргон + НАДН (О); аргон (•). 1 - добавление глюкозооксидазной системы; 2 - добавление НАДН (0,3 мМ).

4. Метаболизм Н2 у С. thermalis

Рост культуры и гидрогеназная активность. Гидрогеназная активность клеток аэробно растущей цианобактерии С. thermalis, измеренная в реакции образования Н2 с МВ+, крайне низка. Методы, используемые для увеличения активности обратимой гидрогеназы у гетероцистных цианобактерий и G. alpicola -микроаэробная адаптация и выращивание культуры в условиях недостатка азота, соответственно — в

Таблица 6.

Поглощение Н2 in vivo и МВ+-зависимое образование Н2 клетками С. thermalis, растущими в разных условиях (мкмоль Н2 / час / мг хл а).

Условия роста Поглощение Н2 Образование Н2

Аэробные 15,0 0,5

Микроаэробные 18,4 0,7

Лимитирование NO3" 11,3 0,4

случае гидрогеназнои активности С. thermalis не привели к успеху (табл. 6). Однако суспензии ин-тактных клеток интенсивно поглощали Н2 in vivo (рис. 12-13). Поглощение было строго светозависи-

мым и ингибировалось DCMU (рис. 12). Наиболее высокие скорости поглощения Н2 были характерны для культур из начальной стадии роста, то есть тогда, когда максимальна интенсивность образования в клетках фотосинтетического 02 (рис. 13). Следовательно, окисление водорода гидрогеназой С. thermalis происходило в оксиводородной реакции.

В отличие от многих других цианобактерий, интактные клетки С. thermalis не выделяли Н2 в темновых анаэробных условиях.

о А

15 30 45 60 Время инкубирования, мин

10 20 30 40 Время инкубирования, мин

Рис. 12. Влияние света (А) и DCMU (Б) на поглощение Нг in vivo клетками С. thermalis. Пунктирной линией показан контроль - клетки, инкубируемые в темноте и в присутствии DCMU, соответственно.

При разделении грубого экстракта клеток С. thermalis на фракции с помощью ультрацентрифугирования около 90 % МВ+-зависимой активности сохранялось в растворимой фракции, что характерно для гидрогеназы обратимого типа. Однако особенности метаболизма водорода у С. thermalis - интенсивное поглощение Н2 в оксиводород-ной реакции и отсутствие выделения водорода в темновых анаэробных условиях - более характерны для мембра-носвязанной поглощающей гидрогеназы.

Идентификация и характеристика генов, кодирующих гидрогеназу С. thermalis. Геномную ДНК С. thermalis подвергли гибридизации по Саузерну с зондами, представляющими собой фрагменты генов hupL и hoxYA. variabilis. Была выявлена строгая гибридизация с зондом hoxH, тогда как гибридизации с зондом hupL не наблюдалось вообще (рис. 14). ПЦР с использованием геномной ДНК С. thermalis в качестве матрицы и праймеров, специфичных для цианобактериальных генов hupL, hoxY и hoxH, привели к амплификации продуктов ожидаемых размеров в случае hox-генов, но не дали отчётливых результатов в случае генов hup. Продукты ПЦР были клонированы и секвенированы. Анализ полученных последовательностей

0 24 48 72 96 120 144 168 192 Время роста, часы

Рис. 13. Рост С. thermalis (А) и in vivo поглощение (Б).

Обозначения: (О) концентрация хлорофилла а; (•) оптическая плотность культуры; (■) валовое поглощение Нг; (□) специфическое поглощение Н2.

НирЪ 1 2

кохГ

(Йрямм

Рис. 14. Блот-гибридизация по Саузер-ну, показывающая присутствие/отсутствие в геноме С. ГкегтаШ последовательностей, гомологичных цианобакте-риальным генам ИирЬ и ИохУ. Геномная ДНК С. АегтаНз, гидролизо-ванная с помощью Нт<ЛII, гибридизо-вана с зондами ИирЬ и НохУ-Ау. Линии 1 - ДНК А. уагшЫШ; линии 2 - ДНК С. ¡ИегтаИз.

показал, что они соответствуют Аах-генам и наиболее близки ИохН и ИохУ гетероци-стных цианобактерий. Гибридизация между ДНК С. ЛегтаШ и этими фрагментами подтвердила присутствие генов ИохН и ИохУ в геноме цианобактерии.

Заключительным шагом в характеристике гидрогеназы С. хЪегтаИв стало создание частичной библиотеки генов и составление на её основе физической карты Лох-кластера у данной цианобактерии (рис. 15). Анализ частичной библиотеки показал, что Лох-гены С. ЛегтаШ очень схожи с аналогичными генами других цианобактерий [Татарии е1 а1, 2002] по нуклеотидной и аминокислотной последовательностям, имеют такие же размеры, направление и взаимное расположение. Особенностью организации Лох-кластера у С. МегтаНя является отсутствие интергенных участков между структурными генами.

кахН ■У-

Рис. 15. Физическая карта генов Лох-кластера С. ЛегтаШ.

Вертикальными линиями показаны специфические сайты рестрикционных эндонуклеаз, горизонтальными - взаимное расположение клонированных фрагментов ДНК; направление стрелок, которыми показаны гены, соответствует направлению транскрипции.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: МВ — метилвиологен; ПААГ -полиакриламидный гель; ц — скорость роста; Б - скорость протока при непрерывном культивировании; Гд - гидрогеназная активность; ТФТХ - хлорид трифенилтетразолия; БСМи - 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина, диурон.

ЕсоК!

ЕсоИУ

ЕсоЫ

СШ

выводы

1. Изучено действие факторов внешней среды (свет, Ог, обеспеченность азотом) на рост и гидрогеназную активность периодических и непрерывных культур Gloeocapsa alpicola CALU 743 и периодических культур Chroococcidi-opsis thermalis CALU 758. Выявлено, что гидрогеназная активность G. alpicola не зависит от содержания О2 в среде, но увеличивается при лимитировании роста культуры светом и, в большей степени, нитратом. Ни один из этих факторов не влияет на гидрогеназную активность С. thermalis.

2. Идентифицированы и охарактеризованы гены, кодирующие гидрогена-

зы у G. alpicola и С. thermalis: в обоих случаях это кластеры Лох-генов. Гены *

hoxEFUYH G. alpicola проявляют наибольшую степень гомологии с аналогичными генами Synechocystis sp. РСС 6803; гены hoxFUYH С. thermalis наиболее ' близки генам гетероцистных цианобактерий. i

3. Показано, что в условиях азотного голодания в клетках G. alpicola осуществляется ряд адаптивных изменений (деградация фикобилисом, инактивация ФСИ, запасание больших количеств гликогена), следствием которых становится снижение внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала. Предполагается, что именно он контролирует уровень гидрогеназной активности у этого штамма: чем ниже Eh внутри клеток, тем выше их гидрогеназная активность.

4. Обнаружено, что у G. alpicola, растущей в условиях азотного голодания, синтез гидрогеназы не регулируется на транскрипционном уровне, тогда как у гетероцистной цианобактерии Anabaena variabilis АТСС 29413 на ранних стадиях индукции активности фермента в микроаэробных условиях транскрипция кодирующих его генов резко возрастает.

5. Продемонстрировано взаимодействие гидрогеназы G. alpicola в изолированном состоянии с пиридиннуклеотидами. Показано, что НАДН стимулирует восстановительную активацию фермента в атмосфере Н2. Этим подтверждается предположение о том, что пиридиннуклеотиды являются физиологическими донорами/акцепторами электронов для данной гидрогеназы.

6. Установлено, что G. alpicola и С. thermalis располагают активной гид-рогеназой Нох-типа, но существенно различаются по характеру проявления её ч активности. G. alpicola поглощает водород на свету, как аэробно, так и ана- ( эробно, и выделяет Н2 в темновых анаэробных условиях. С. thermalis поглощает

Н2 лишь в оксиводородной реакции и не способен к выделению Н2 in vivo. Таким образом, физиологическое значение гидрогеназ одного типа может быть * неодинаковым у разных форм цианобактерий.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Serebryakova, L. Т., Sheremetieva, М. Е., Tsygankov, A. A. Reversible hydrogenase activity of Gloeocapsa alpicola in continuous culture // FEMS Microbiol. Lett. -1998. - Vol. 166. - P. 89-94.

2. Серебрякова, JI. Т., Шереметьева, М. Е., Линдблад, П. Гидрогеназная активность одноклеточной цианобактерии Gloeocapsa alpicola САШ 743 в условиях азотного голодания // Микробиология. - 1999. - Вып. 68. - С. 249-252.

3. Serebryakova, L., Sheremetieva, М., Lindblad, P. H2-uptake and evolution in the unicellular cyanobacterium Chroococcidiopsis thermalis CALU 758 // Plant Physiol. Biochem. - 2000. - Vol. 38(6).-P. 1-6.

# 4. Sheremetieva, M. E., Troshina, O. Yu., Serebryakova, L. Т., Lindblad, P. Identification of hox

genes and analysis of their transcription in the unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola CALU 743 growing under nitrate-limiting conditions // FEMS Microbiol. Lett. - 2002. - Vol. 214. i -P. 229-233.

t 5. Troshina, O. Yu, Serebryakova, L. Т., Sheremetieva, M. E., Lindblad P. Production of Нз by the

unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola CALU 743 during fermentation // Int. J. of Hydrogen Energy. - 2002. - Vol. 27. - P. 1283-1289. Материалы конференций:

6. Шереметьева, M. Е., Серебрякова, Л. Т. Гидрогеназа одноклеточной неазотфиксирующей цианобактерии Gloeocapsa alpicola-. функции и регуляция биосинтеза // 2-я Конференция молодых ученых. - Пущино, 1998.

7. Шереметьева, М. Е. Гидрогеназа одноклеточной неазотфиксирующей цианобактерии Gloeocapsa alpicola: каталитические и биохимические свойства // 3-я Конференция молодых ученых. - Пущино, 1999.

8. Sheremetieva, М., Serebryakova, L., Lindblad, P. Properties of the reversible hydrogenase of the unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola II XI Nordic Nitrogen Fixation Conference. -Stockholm University, Sweden, January 27-29,2000. - P. 43.

9. Sheremetieva, M. E., Serebryakova, L. Т., Lindblad, P. Biochemical characterization of the reversible hydrogenase of the unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola // 6й1 International Conference on the Molecular Biology of Hydrogenases. - Potsdam, 2000. - pB 4.

10. Serebryakova, L. Т., Sheremetieva, M. E., Lindblad, P. Hydrogen metabolism of the unicellular cyanobacterium Chroococcidiopsis thermalis £ ALU 758 // б International Conference on the Molecular Biology of Hydrogenases. - Potsdam, 2000. - pB 3.

11. Шереметьева, M. E., Серебрякова, Л. Т. Метаболизм водорода у одноклеточной цианобактерии Gloeocapsa alpicola II Автотрофные микроорганизмы. - Москва, 2000.

12. Серебрякова, Л. Т., Трошина, О. Ю., Шереметьева, М. Е. Продукция молекулярного водорода одноклеточной цианобактерией Gloeocapsa alpicola // Труды конференции «Научные исследования в наукоградах Московской области». -Пущино, 2001. -С. 98.

13. Sheremetieva, М. Е., Troshina, О. Yu., Serebryakova, L. Т., Lindblad, P. Is the activity of cyanobacterial bidirectional hydrogenase regulated at the transcriptional level? // BioHydrogen 2002. - Ede, the Netherlands, April 21-24,2002. - P. 120.

I 14. Sheremetieva, M. E„ Troshina, O. Yu., Serebiyakova, L. Т., Lindblad, P. Transcription of the

cyanobacterial hoxH during development of bidirectional hydrogenase activity // 5 European Workshop on the Molecular Biology of Cyanobacteria. - Stockholm, Sweden, June 9-12,2002. - P. 120.

15. Serebryakova, L. Т., Sheremetieva, M. E. Physiological role of the hydrogenase in metabolism of the unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola // 7th International Conference on Solar Energy and Applied Photocemistry (SOLAR '03) combined with 4th International Workshop on Environmental Photochemistry (Enpho '03). - Luxor, Egypt, February 28-23,2003.

р 1 1 О V

Научное издание ' Автореферат М.Е.Швреметъавой

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции (Ж-005-93, том 2; 953000 - книги и брошюры

11.06.2003 г. Заказ 9874Р. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,0.

Отпечатано с оригинала-макета в Объединенном научно-техническом издательстве Путинского научного центра РАН 142290 г Пущи но Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ПНЦ РАН.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шереметьева, Марина Евгеньевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общая характеристика цианобактерий

1. Морфология, классификация и распространение в природе 2. Особенности метаболизма

3. Адаптация к недостатку питательных элементов в среде

Глава 2. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов

1. Гидрогеназы

2. Метаболизм Нг у цианобактерий

2.1. Поглощающая гидрогеназа

2.2. Нитрогеназы

Глава 3. Обратимая гидрогеназа цианобактерий

1. Распространение и физиологическое значение

2. Организация генов и их экспрессия

3. Регуляция активности и синтеза

4. Биохимические и каталитические свойства

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 4. Объекты и методы исследования

1. Организмы и условия их культивирования

2. Методы исследования

2.1. Определение ростовых параметров

2.2. Определение гидрогеназной активности

2.3. Определение скорости образования и поглощения Н2 интактными клетками

2.4. Получение бесклеточных экстрактов и частичная очистка гидрогеназы

2.5. Аналитические методы

2.6. Молекулярно-биологические методы 60 2.6.1. Очистка ДНК и РНК

2.6.2. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами и электрофорез в агарозном геле

2.6.3 Создание праймеров и полимеразные цепные реакции

2.6.4. Гибридизация по Саузерну

2.6.5. Клонирование и создание частичных библиотек генов

2.6.6. Определение и анализ последовательностей нуклеотидов 66 *

2.7. Другие методы

2.8. Обработка данных и воспроизводимость измерений

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Гидрогеназная активность G. alpicola

1. Влияние света и Ог

2. Влияние обеспеченности культуры азотом

3. Физиологические реакции гидрогеназы

Глава 6. Молекулярно-генетические свойства гидрогеназы С. alpicola

1. Идентификация и характеристика генов, кодирующих гидрогеназу G. alpicola

2. Анализ транскрипции hoxH и hoxY в условиях, благоприятных для развития гидрогеназной активности

Глава 7. Каталитические свойства изолированной гидрогеназы G. alpicola

Глава 8. Метаболизм Н2 у С. thermalis

1. Рост культуры и гидрогеназная активность

2. Идентификация и характеристика генов, кодирующих гидрогеназу С. thermalis

Глава 9. Обсуждение результатов

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболизм молекулярного водорода у одноклеточных цианобактерий"

Актуальность проблемы. Способность к поглощению и выделению молекулярного водорода обнаружена у множества микроорганизмов различных таксономических групп. Метаболические пути, в которых участвует Нг, очень разнообразны, так же, как его функции в жизнедеятельности клеток. Исследования, касающиеся метаболизма водорода, ведутся уже давно, но в последние годы их количество резко увеличилось, в связи с поиском новых, альтернативных источников энергии. Как известно, использование традиционных топливных ресурсов, таких, как каменный уголь, нефть и газ, отрицательно сказывается на атмосфере планеты; кроме того, запасы нефти и угля не бесконечны и при современных темпах потребления будут израсходованы через несколько десятилетий [Промышленная микробиология, 1989, с. 618]. Нг - один из наиболее перспективных кандидатов на роль экологически чистого и возобновляемого топлива будущего [Benemann, 1996]. Во многих странах разрабатываются методы синтеза водорода с помощью биосистем.

Метаболизм молекулярного водорода включает процессы восстановления Н+ и окисления Н2 в соответствии с простейшей химической реакцией:

2Н+ + 2е" S Н2.

В большинстве случаев она катализируется специфическими ферментами - гидрогеназа-ми. Это очень древняя группа ферментов [Vignais et al, 2001], сложность организации и функционирования которых контрастирует с внешней простотой осуществляемой ими реакции. Последняя рассматривается как прототип всех реакций, катализируемых металло-ферментами [Adams, Steifel, 2000]. Таким образом, изучение гидрогеназ обладает не только прикладным, но и фундаментальным значением, поскольку помогает понять общие принципы ферментативного катализа и эволюции метаболических процессов.

Использование цианобактерий как возможных продуцентов Н2 выглядит особенно заманчивым, поскольку они образуют водород за счёт конверсии солнечной энергии и не требуют сложных дорогостоящих питательных сред [Hall et al, 1995; Schulz, 1996; Hansel, Lindblad, 1998]. Цианобактерии располагают, по меньшей мере, тремя ферментами, ответственными за окисление Нг и/или восстановление протонов — нитрогеназой и двумя гид-рогеназами [Houchins, 1984]. Нитрогеназа катализирует образование водорода как побочного продукта при восстановлении N2. Поглощающая гидрогеназа (HupSL) реутилизирует Нг, выделяющийся в клетках с активной нитрогеназой. Обратимая гидрогеназа (Hox(E)FUYH), катализирующая реакцию в обоих направлениях, не имеет отношения к фиксации азота и является ключевым ферментом метаболизма водорода у большинства изученных неазотфиксирующих цианобактерий.

К настоящему времени в области изучения водородного метаболизма и гидрогеназ цианобактерий достигнут значительный прогресс. Детально исследована взаимосвязь образования и поглощения Нг с азотфиксацией. У ряда цианобактерий идентифицированы и секвенированы структурные и вспомогательные гены нитрогеназ и гидрогеназ. Изучается регуляция синтеза и активности этих ферментов. Сконструированы цианобактериальные мутанты с нарушенным синтезом гидрогеназ. Некоторые гидрогеназы частично очищены и охарактеризованы с биохимической точки зрения. Выдвинуты интересные предположения о роли реакций метаболизма водорода в жизнедеятельности цианобактерий. Ведутся поиски цианобактериальных штаммов, наиболее интенсивно выделяющих Нг, и исследования, направленные на оптимизацию этого процесса.

Первоначально самыми привлекательными в прикладном аспекте считались азот-фиксирующие цианобактерии, выделяющие водород на свету при восстановлении N2, поэтому большинство работ было посвящено им и сосредоточено на нитрогеназе и поглощающей гидрогеназе, функционирование которой снижает эффективность конверсии солнечной энергии в энергию химической связи Нг. Однако гидрогеназа обратимого типа, обнаруженная у разных цианобактерий, в том числе одноклеточных неазотфиксирующих, в определённых условиях также катализирует выделение Нг in vivo. Разработка методов использования этого фермента на практике сдерживается его недостаточной изученностью. Информация о его каталитических и биохимических свойствах скудна; не вполне понятно, с каким естественным донором/акцептором электронов он взаимодействует. Относительно недавно у ряда штаммов выявлены и секвенированы гены, которые кодируют эту гидрогеназу, но данные по регуляции её синтеза и активности фрагментарны и противоречивы. В конечном итоге, до сих пор остаётся неясным, каково значение обратимой гидрогеназы в жизнедеятельности цианобактерий.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - сравнительная характеристика водородного метаболизма, участвующих в нём гидрогеназ и его физиологического значения у одноклеточных неазотфиксирующих цианобактерий Gloeocapsa alpicola CALU 743 (=Synechocystis sp. PCC 6308) и Chroococcidiopsis thermalis CALU 758.

Задачи работы состояли в следующем:

2) идентифицировать и охарактеризовать гены, кодирующие гидрогеназы G. alpicola и С. thermalis;

Научная новизна работы. Данное исследование расширяет наши знания о метаболизме водорода у неазотфиксирующих цианобактерий и о свойствах цианобактериальной обратимой гидрогеназы. Как выяснилось, именно она ответственна за наблюдаемые реакции образования и поглощения Нг у обоих изученных штаммов, поскольку в геномах последних найдены полные кластеры hox-генов, но не гены hup. Однако по характеру проявления и уровню гидрогеназной активности G. alpicola и С. thermalis значительно различаются.

На примере С. thermalis впервые показано, что обратимая гидрогеназа может служить, главным образом, для окисления Нг - клетки данной цианобактерии поглощают водород на свету, используя Ог как акцептор электронов. Гидрогеназная активность, измеренная по образованию Нг с искусственными переносчиками электронов, крайне низка и не зависит от таких факторов, как содержание кислорода в среде и обеспеченность культуры азотом.

G. alpicola проявляет высокий уровень гидрогеназной активности в реакции образования Нг in vitro. В отличие от гетероцистных цианобактерий, активность обратимой гидрогеназы G. alpicola не увеличивается при росте клеток в микроаэробных условиях, но возрастает при лимитировании роста культуры светом и, в большей степени, нитратом. Показано, что при переходе в состояние азотного голодания в клетках G. alpicola осуществляется ряд адаптивных изменений, следствием которых становится снижение окислительно-восстановительного потенциала внутри клеток. Выдвинуто предположение о том, что внутриклеточный Ей является тем фактором, который прямо или опосредованно контролирует обратимую гидрогеназу G. alpicola. Получены оригинальные данные, показывающие, что механизмы регуляции фермента у G. alpicola отличаются от таковых у гетероцистных форм: у Anabaena variabilis синтез обратимой гидрогеназы регулируется и на транскрипционной, и на посттранскрипционных стадиях, тогда как у G. alpicola - только на постранскрипционных. Изучение каталитических свойств изолированной гидрогеназы G. alpicola показало, что она эффективно катализирует и окисление Нг, и восстановление протонов. Получены убедительные данные, свидетельствующие, что физиологическими донорами/акцепторами электронов, с которыми взаимодействует этот фермент, являются пиридиннуклеотиды. Продемонстрировано, что G. alpicola способна поглощать Н2 in vivo на свету, как аэробно, так и анаэробно, и выделять водород в темновых анаэробных условиях.

Полученные данные позволяют заключить, что обратимая гидрогеназа у разных циа-нобактерий подчиняется различным регуляторным механизмам и по-разному проявляет активность, катализируя поглощение или образование Нг, в зависимости от внешних факторов и особенностей метаболизма данного штамма. Физиологическое значение этого фермента заключается в участии в процессах адаптации к меняющимся условиям среды, также отличающихся у разных форм цианобактерий.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-й и 3-й Конференциях молодых ученых (Пущино, 1998 и 1999 гг.), на XI Конференции северных стран по азотфиксации (Стокгольм, Швеция, 2000 г.), на 6-й Международной конференции по молекулярной биологии гидрогеназ (Потсдам, Германия, 2000 г.), на конференции «Авто-трофные микроорганизмы» (Москва, 2000 г.), на конференции «Научные исследования в наукоградах Московской области» (Пущино, 2001 г.), на конференции «BioHydrogen 2002» (Эде, Нидерланды, 2002 г.), на 5-м Европейском совещании по молекулярной биологии цианобактерий (Стокгольм, Швеция, 2002 г.) и на 7-й Международной конференции по солнечной энергии и прикладной фотохимии, объединённой с 4-м Международным совещанием по фотохимии окружающей среды (Луксор, Египет, 2003 г.).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 5 статей в реферируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шереметьева, Марина Евгеньевна

выводы

1. Изучено действие факторов внешней среды (свет, обеспеченность азотом) на рост и гидрогеназную активность периодических и непрерывных культур Gloeocapsa alpicola С ALU 743 и периодических культур Chroococcidiopsis thermalis С ALU 758. Выявлено, что гидрогеназная активность G. alpicola не зависит от содержания О2 в среде, но увеличивается при лимитировании роста культуры светом и, в большей степени, нитратом. Ни один из этих факторов не влияет на гидрогеназную активность С. thermalis.

2. Идентифицированы и охарактеризованы гены, кодирующие гидрогеназы у G. alpicola и С. thermalis: в обоих случаях это кластеры Лох-генов. Гены hoxEFUYH G. alpicola проявляют наибольшую степень гомологии с аналогичными генами Synechocystis sp. РСС 6803; гены hoxFUYHC. thermalis наиболее близки генам гетероцистных цианобактерий.

6. Установлено, что G. alpicola и С. thermalis располагают активной гидрогеназой Нох-типа, но существенно различаются по характеру проявления её активности. G. alpicola поглощает водород на свету, как аэробно, так и анаэробно, и выделяет Н2 в темновых анаэробных условиях. С. thermalis поглощает Н2 лишь в оксиводородной реакции и не способен к выделению Н2 in vivo. Таким образом, физиологическое значение гидрогеназ одного типа может быть неодинаковым у разных форм цианобактерий.

Выражаю глубочайшую благодарность моему научному руководителю кандидату биологических наук Ларисе Тимофеевна Серебряковой за плодотворное руководство, внимание к работе и помощь в ней, бесценную научную школу и понимание.

Сердечно благодарю научного консультанта доктора биологических наук Анатолия Анатольевича Цыганкова за постоянное содействие в работе, ценные советы и замечания и за моральную поддержку.

Искренне признательна профессору Питеру Линдбладу (Упсальский Университет, Швеция) за предоставление возможности провести молекулярно-биологические исследования и помощь в га осуществлении, а также всем сотрудникам «Цианогруппы» под руководством П. Линдблада за тёплый приём и внимание к работе.

Огромное спасибо кандидату биологических наук Ольге Юрьевне Трошиной за помощь в проведении молекулярно-биологической части исследований и дружеское участие.

Выражаю глубокую благодарность доктору биологических наук, профессору Ивану Николаевичу Гоготову и всем сотрудникам лаборатории биохимии и биотехнологии фо-тотрофных микроорганизмов, а также сотрудникам лаборатории физиологии и биотехнологии фототрофпых организмов за содействие в работе и моральную поддержку.

От всей души признательна моим родителям Татьяне Александровне и Евгению Ивановичу Шереметьевым и друзьям в Пущино и Екатеринбурге за теплоту, понимание и поддержку на всём протяжении работы. т

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шереметьева, Марина Евгеньевна, Пущино

1. Гоготов, И. Н., Глинский, В. П. Сравнительное исследование азотфиксации у пурпурных бактерий // Микробиология. - 1973. - Вып. 42. - С. 983-986.

2. Гусев, М. В., Минеева, Л. А. Микробиология: Учебник. М.: Изд-во МГУ. 1992. -448 с.

3. Кондратьева Е. Н. Автотрофные прокариоты. М.: Изд-во МГУ, 1996. - 312 с.

4. Кондратьева, Е. Н., Гоготов И. Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. М.: Наука, 1981. - 344 с.

5. Методы общей бактериологии. В 3-х т. Т. 2 / Под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984.-472 с.

6. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1.: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир, 1997. - 432 с.

7. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. -536 с.

8. Промышленная микробиология / 3. А. Аркадьева, А. М. Безбородое, И. Н. Блохина и др.; Под ред. Н. С. Егорова. М.: Высш. шк., 1989. - 688 с.

9. Пиневич, А. В., Аверина, С. Г. Оксигенная фототрофия: Руководство по эволюционной клеточной биологии. СПб: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2002. - 236 с.

10. Серебрякова, J1. Т., Зорин, Н. А., Гоготов, И. Н. Гидрогеназная активность нитчатых цианобактерий // Микробиология. 1992. - Т. 61, Вып. 2. - С. 175-182.

11. Серебрякова, JI. Т., Трошина, О. Ю., Гоготов, И. Н. Очистка и формы обратимой гидрогеназы Anabaena variabilis АТСС 29413 // Биохимия. 1995. - Вып. 60, № 4. -С. 508-514.

12. Серебрякова, JI. Т., Гоготов, И. Н. Каталитические свойства обратимой гидрогеназы Anabaena variabilis АТСС 29413 // Биохимия. 1995. - Вып. 60, № 7. - С. 785-785.

13. Якунин, А. Ф., Чан Ван Ни, Гоготов, И. Н. Образование альтернативных нитрогеназ у гетероцистной цианобактерии Anabaena variabilis II Докл. Акад. Наук. 1989. -Вып. 307.-С. 1269-1271.

14. Якунин, А. Ф., Трошина, О. Ю., Гоготов И. Н. Свойства и регуляция флаводоксина азотфиксирующей гетероцистной цианобактерии Anabaena sphaerica II Микробиология. 1993. - Вып. 62. - С. 83-89.

15. Abdel-Basset, R., Bader, К. P. Physiological analysis of the hydrogen gas exchange in cyanobacteria// J. Photochem. Photobiol. B. 1998. - Vol. 43. - P. 146-151.

16. Albracht, S. P. J. Nickel hydrogenases: in search of active site // Biochim. Biophys. Acta. 1994.-Vol. 1188.-P. 167-204.

17. Alfonso, M., Perewoska, I., Kirilovsky, D. Redox control of ntcA gene expression in Synechocystis sp. PCC 6803. Nitrogen availability and electron transport regulate the level of NtcA protein // Plant Physiol. 2001. - Vol. 125. - P. 969-981.

18. Allen, M. M., Smith, A. J. Nitrogen chlorosis in blue-green algae // Arch. Microbiol. -1969. Vol. 69(2). - P. 114-120.

19. Allen, M. M., Law, A., Evans, E. H. Control of photosynthesis during nitrogen depletion and recovery in a non-nitrogen-fixing cyanobacterium // Arch. Microbiol. 1990. - Vol. 15.-P. 428-431.

20. Almon, H., Boger, P. Nickel-dependent uptake-hydrogenase activity in the blue-green alga Anabaena variabilis IIZ. Naturforsch. 1984. - Vol. 39c. - P. 90-92.

21. Almon, H., Boger, P. Hydrogen metabolism of the unicellular cyanobacterium Chroococ-cidiopsis thermalis ATCC 29380 // FEMS Microbiol. Lett. 1988. - Vol. 49. - P. 445449.

22. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Zh., Miller, W., Lipman, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs//Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P. 3389-3402.

23. Aoyama, K., Uemura, I., Miyake, J., Asada, Y. Fermentative metabolism to produce hy-i drogen gas and organic compounds in a cyanobacterium, Spirulina platensis // J. Fermenta-; tion and Bioengineering. 1997. - Vol. 83, No. 1. - P. 17-20.

24. Appel, J., Schulz, R. Hydrogen metabolism in organisms with oxygenic photosynthesis: hydrogenases as important regulatory devices for a proper redox poising? // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1998. - Vol. 47. - P. 1-11.

25. Appel, J., Phunpruch, S., Steinmiiller, K., Schulz, R. The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis // Arch. Microbiol. 2000. - Vol. 173. - P. 333-338.

26. Arieli, В., Padan, E., Shahak, Y. Sulfide-induced sulfide-quinone reductase activity in thy-lakoids of Oscillatoria limnetica II J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266(1). - P. 104-111.

27. Asada, Y., Kawamura, S. Hydrogen evolution by Microcystis aeruginosa in darkness // Agric. Biol. Chem. 1984. - Vol. 48, No. 10. - P. 2595-2596.

28. Asada, Y., Kawamura, S. Hydrogen evolving activity among the genus Microcystis, under dark and anaerobic conditions // Rep. Fermentation Research Institute. 1985. - No. 63. -P. 39-54.

29. Asada, Y., Kawamura, S. Screening for Cyanobacteria that evolve molecular hydrogen under dark and anaerobic conditions // J. Fermentation Technology. 1986. - Vol. 64, No. 6. -P. 553-556.

30. Asada, Y., Kawamura, S., Ho, K.-K. Hydrogenase from the unicellular cyanobacterium, Mycrocystis aeruginosa И Phytochemistry. 1987. - Vol. 26, No. 3. - P. 637-640.

31. Axelsson, R., Oxelfelt, F., Lindblad, P. Transcriptional regulation of Nostoc uptake hydrogenase // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 170. - P. 77-81.

32. Axelsson, R., Lindblad, P. Transcriptional regulation of Nostoc hydrogenases: effect of oxygen, hydrogen and nickel // Appl. Env. Microbiol. 2002. - Vol. 68, No. 1. - P. 444447.

33. Belkin, S., Padan, E. Sulfide-dependent hydrogen evolution in the cyanobacterium Oscillatoria limnetica IIFEBS Lett. 1978. - Vol. 94. - P. 291-294.

34. Benemann, J. Hydrogen biotechnology: progress and prospects // Feature Hydrogen Biotechnology. 1996.-Vol. 14.-P. 1101-1103.

35. Bergman, В., Gallon, J. R., Rai, A. N., Stal, L. J. N2 fixation by non-heterocystous cyano-bacteria//FEMSMicrobiol. Rev.- 1997.-Vol. 19.-P. 139-185.

36. Bhattacharya, D. Medlin, L. Algal phylogeny and the origin of land plants // Plant Physiol. 1998.-Vol. 116.-P. 9-15.

37. Bhaya, D., Schwarz, R., Grossman, A. R. Molecular responses to environmental stress // The ecology of cyanobacteria. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2000. — P. 397-442.

38. Bishop, P. E., Joerger, R. D. Genetics and molecular biology of alternative nitrogen fixation systems // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. - Vol. 41. - P. 109-125.

39. Boison, G., Schmitz, O., Mikheeva, L., Shestakov, S., Bothe, H. Cloning, molecular analysis and insertional mutagenesis of the bidirectional hydrogenase genes from the cyanobac-terium Anacystis nidulans // FEBS Lett. 1996. - Vol. 394. - P. 153-158.

40. Boison, G., Bothe, H., Hansel, A., Lindblad, P. Evidence against a common use of the dia-phorase subunits by the bidirectional hydrogenase and by the respiratory complex I in cyanobacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 174. - P. 159-165.

41. Boison, G., Bothe, H., Schmitz, O. Transcriptional analysis of hydrogenase genes in the cyanobacteria Anacystis nidulans and Anabaena variabilis monitored by RT-PCR // Curr. Microbiol. 2000. - Vol. 40. - P. 315-521.

42. Bothe, H., Kentemich, Т., Dai Heping. Resent aspects on the hydrogenase-nitrogenase relationship in cyanobacteria // Nitrogen Fixation. Dordrecht: Cluwer Academic, 1991. - P. 367-375.

43. Bradley, R. L., Reddy, K. J. Cloning, sequencing and regulation of the global nitrogen regulator gene ntcA in the unicellular diazotrophic cyanobacterium Cyanothece sp. strain BH68K // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 4407-4410.

44. Bredford, M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle protein-dye binding // Analyt. Biochem. 1976. - Vol. 72, No. 1-2.-P. 248-254.

45. Burris, R. H. The acetylene reduction techniques // Nitrogen fixation by free-living microorganisms. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1975. - P. 249-257.

46. Burris, R. H. Nitrogenases // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. - P. 9339-9342.

47. Cammack, R. Origins, evolution and the hydrogen biosphere // Hydrogen as a fuel: learning from Nature. London and New York: Taylor and Francis, 2001. - P. 1-8.

48. Carrasco, C. D., Buettner, J. A., Golden, J. W. Programmed DNA rearragment of a cyano-bacterial hupL gene in heterosysts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 791-795.

49. Casalot, L., Rousset, M. Maturation of NiFe. hydrogenases // Trends in Microbiology. -2001. Vol. 9, No. 5. - P. 228-238.

50. Chandler, D. P., Wagnon, C. A., Bolton Jr., H. Reverse transcriptase (RT) inhibition of PCR at low concentration of template and its implications for quantitative RT-PCR // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64. - P. 669-677.

51. Cohen, Y., Padan, E., Shilo, M. Facultative anoxygenic photosynthesis in the cyanobacte-rium Oscillatoria liamnetica И J. Bacteriol. 1975. - V. 123. - P. 855-861.

52. Collier, J. L., Grossman, A. R. Chlorosis induced by nutrient deprivation in Synechococcus sp. strain PCC 7942: not all bleaching is the same // J. Bacteriol. 1992. - P. 4718-4726.

53. Collier, J. L., Grossman, A. R. A small polypeptide triggers complete degradation of light-harvesting phycobiliproteins in nutrient-deprived cyanobacteria // EMBO J. 1994. - Vol. 13,No. 5.-P. 1039-1047.

54. Daday, A., Lambert, G. R., Smith, G. D. Measurement in vivo of hydrogenase-catalysed hydrogen evolution in the presence of nitrogenase enzyme in cyanobacteria // Biochem. J. 1979.-Vol. 177(1).-P. 139-144.

55. Daday, A., Mackerras, A. H., Smith, G. D. The effect of nickel on hydrogen metabolism and nitrogen-fixation in the cyanobacterium Anabaena cylindrica И J. Gen. Microbiol. — 1985.-Vol. 131.-P. 231-238.

56. Daday, A., Smith, G. D. The effect of nickel on the hydrogen metabolism of the cyanobac-teium Anabaena cylindrica IIFEMS Microbiol. Lett. 1983. - Vol. 20. - P. 327-330.

57. Daday, A., Smith, G. D. The hydrogenase-nitrogenase relationship in a symbiotic cyano-bacteium isolated from Macrozamia communis L. Johnson // Aust. J. Plant. Physiol. -1987.-Vol. 14.-P. 319-324.

58. Das, D., Veziroglu, T. N. Hydrogen production by biological processes: a survey of literature // Int. J. Hydrogen Energy. 2001. - Vol. 26. - P. 13-28.

59. Dawar, S., Mohanty, P., Behera, В. K. Sustainable hydrogen production in the Cyanobacte-rium Nostoc sp. ARM 411 grown in fructose- and magnesium sulfate-enriched culture // World J. Microbiol. Biotech. 1999. - Vol. 15. - P. 289-292.

60. Dean, D. R., Jacobson, M. R. Biochemical genctics of nitrogenase // Biological nitrogen fixation. New York: Chapman&Hall, 1992. - P. 763-834.

61. Dolganov, N., Grossman. A. R. A polypeptide with similarity to phycocyanin a-subunit phycocyanobilin lyase involved in degradation of phycobilisomes // J. Bacteriol. 1999. — P. 610-617.

62. Eisbrenner, G., Distler, E., Floener, L., Bothe, H. The occurrence of the hydrogenase in some blue-green algae // Arch. Microbiol. 1978. - Vol. 118. - P. 177-184.

63. Eisbrenner, G., Roos, P., Bothe, H. The number of hydrogenases in cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1981.-Vol. 125.-P. 383-390.

64. Elnaggar, M. Studies of the fresh water algae of Makkah Area, Saudi-Arabia // Pakistan J. Botany. 1994. - Vol. 26, No. 2. - P. 203-213.

65. Ewart, G. D., Smith, G. D. Purification and properties of soluble hydrogenase from the cyanobacterium Anabaena cylindrica II Arch. Biochem. Biophys. 1989. - Vol. 268, No. l.-P. 327-337.

66. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria // Microbiol. Rev. 1992. — No. 6. - P. 340-373.

67. Fewer, D., Friedl, Т., Budel, B. Chroococcidiopsis and heterocyst-differentiating cyanobacteria are each other's closest living relatives // Mol. Phylogen. Ev. 2002 - Vol. 23,No. l.-P. 82-90.

68. Florin, L., Tsokoglou, A., Happe, T. A novel type of iron hydrogenase in the green alga Scenedesmus obliquus is linked to the photosynthetic electron transport chain // J. Biol. Chem. Mar. 2001. - Vol. 276, No. 9. - P. 6125-6132.

69. Frias, J. E., Merida, A., Herrero, A., Martin-nieto, J., Flores, E. General distribution of the nitrogen control gene nlcA in cyanobacteria // J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 57105713.

70. Friedrich, В., Vignais, P. M., Lenz, O., Colbeau A. Regulation of hydrogenase gene expression // Hydrogen as a fuel: learning from Nature. London and New York: Taylor and Francis, 2001.-P. 33-72.

71. Forchhammer, K., Tandeau de Marsas, N. The Pn protein in the cyanobacterium Synecho-coccus sp. strain PCC 7942 is modified by serine phosphorylation and signals the cellular N-status // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - P. 84-91.

72. Forchhammer, K., Tandeau de Marsas, N. Functional analysis of the phosphoprotein Pn {glnB gene product) in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942 // J. Bacteriol. 1995a. - P. 2033-2040.

73. Forchhammer, K., Tandeau de Marsas, N. Phosphorylation of the Pn proyein {glnB gene product) in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942: analysis of in vitro kinase activity // J. Bacteriol. 1995b. - P. 5812-5817.

74. Frenkel, A., Gaffron, H., Battley, E. H. Photosynthesis and photoreduction by the blue green alga, Synechococcus elongatus // Nag., Biol. Bull. 1950. - Vol. 99. - P. 157-162.

75. Frey, M. Hydrogenases: hydrogen-activating enzymes // ChemBioChem. 2002. - Vol. 3. -P. 153-160.

76. Fry, I., Robinson, E., Spatch, S., Packer, L. The role of sodium sulfide in anoxigenic photosynthesis and hydrogen formation in the cyanobacterium Nostoc muscorum // Biochem. Res. Comm.- 1984.-Vol. 123.-P. 1138-1143.

77. Gaffron, H. Carbon dioxide reduction with molecular hydrogen in green algae // Am. J. Bot. 1940. - Vol. 27. - P. 273-283.

78. Gaffron, H., Rubin, J. Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae // J. Gen. Physiol. 1942. - Vol. 26. - P. 219-240.

79. Gallon, J. R. Reconciling the incompatible: N2 fixation an O2 // New Phytol. 1992. - Vol. 122.-P. 571-609.

80. Garcia-Dominguez, M., Florencio, F. J. Nitrogen availability and electron transport control the expression of glnB gene (PII encoding protein) in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 6803 // Plant. Mol. Biol. 1997. - Vol. 35(6). - P. 723-734.

81. Garlick, S., Oren, A., Padan, E. Occurrence of facultative anoxygenic photosynthesis among filamentous and unicellular cyanobacteria // J. Bacteriol. 1977. - Vol. 129(2). - P. 623-629.

82. Ghirardi, M. L., Zhang, L., Lee, J. W., Flynn, Т., Seibert, M., Greenbaum, E., Melis, A. Microalgae: a green source of renewable H2 // Tibtech. 2000a. - Vol. 18. - P. 506-511.

83. Gubili, J., Borthakur, D. Organization of the hupDEAB genes within the hydrogenase gene cluster of Anabaena sp. strain PCC 7120 // J. Appl. Phycol. 1998. - Vol. 10(2). - P. 163i 167.

84. Gutekunst, K., Phunpruch, S., Schwarz, C., Appel, J., Schulz, R. Regulation of the bidirectional hydrogenase in Synechocystis sp. PCC 6803 // 5th European Workshop on the Molecular Biology of Cyanobacteria. Stockholm, 2002. - P. 116.

85. Gorl, M., Sauer, J., Baier, Т., Forchhammer, K. Nitrogen-starvation-induced chlorosis in Synechococcus PCC 7942: adaptation to long-ter survival // Microbiology. 1998. - Vol. 144.-P. 2449-2458.

86. Hall, D. O., Markov, S., Watanabe, Y., Rao, K. The potential applications of cyanobacte-rial photosynthesis for clean technologies // Photosynthesis Res. 1995. - Vol. 46. - P. 159-167.

87. Hallenbeck, P. C., Benemann, J. R. Characterization and partial purification of the reversible hydrogenase of Anabaena cylindrica II FEBS Lett. 1978. - Vol. 94, No. 2. - P. 261264.

88. Hansel, A., Lindblad, P. Towards optimization of cyanobacteria as biotechnologically relevant producers of molecular hydrogen, a clean and renewable energy source // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - Vol. 50. - P. 153-160.

89. Hansel, A., Axelsson, R., Lindberg, P., Troshina, O., Wiinschiers, R., Lindblad, P. Cloning and characterization of a hyp gene cluster in the filamentous cyanobacteium Nostoc sp. strain PCC 73102//FEMS Microbiol. Lett. 2001.-Vol. 201. - P. 59-64.

90. Happe, Т., Schiitz, K., Bohme, H. Transcriptional and mutational analysis of the uptake hydrogenase of the filamentous cyanobacterium Anabaena variabilis ATCC 29413 I I J. Bacteriol.- 2000. -Vol. 182.-P. 1624-1631.

91. Нарре, Т., Kaminski, A. Differential regulation of the Fe-hydrogenase during anaerobic adaptation in the green alga Chlamydomonas reihardlii И Eur. J. Biochem. 2002. — Vol.269.-P. 1022-1032.

92. Hess, W. R. Comparative and functional genomics in marine cyanobacteria // 5th European Workshop on the Molecular Biology of Cyenobacteria. Stockholm, 2002. - P. 130.

93. Heyer, H., Stal, L. J., Krumbein, W. E. Simultaneous heterolactic and acetate fermentation in the marine cyanobacterium Oscillatoria limosa incubated anaerobically in the dark // Arch. Microbiol. 1989. - Vol. 151. - P. 558 -564.

94. D. J. Comparative ecology of H2 cycling in sedimentary and phototrophic ecosystems // Antonie Van Leeuwenhoek. 2002. - Vol. 81. - P. 575-585.

95. Houchins, J. P. The physiology and biochemistry of hydrogen metabolism in cyanobacteria // Biochim. Biophys. Acta. 1984. - Vol. 768. - P. 227-255.

96. Houchins, J. P., Burris, R. H. Occurence and localization of the two distinct hydrogenases in the heterocystous cyanobacterium Anabaena sp. strain 7120 // J. Bacteriol. 1981a. -No. 4.-P. 209-214.

97. Houchins, J. P., Burris, R. H. Comparative characterization of two distinct hydrogenases from Anabaena sp. strain 7120II J. Bacteriol. 1981b. - No. 4. - P. 215-221.

98. Houchins, J. P., Burris, R. H. Physiological reactions of the reversible hydrogenase from Anabaena 7120 // Plant Physiol. 1981c. - Vol. 68. - P. 717-721.

99. Howart, D. C., Codd, G. A. The uptake and production of molecular hydrogen by unicellular cyanobacteria//J. Gen. Microbiol. 1985.-Vol. 131.-P. 1561-1569.

100. Hyman, M. R., Fox, С. A., Arp. D. Role of hydrogen in the activation and regulation of hydrogen oxidation by the soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrpphus H16 // Bio-chem. J. 1988. - Vol. 254. - P. 463-468.

101. Ikuta, Y., Akano, Т., Shioji, N., Maeda, I. Hydrogen production by photosynthetic microorganisms // BioHydrogen, Proceedings of an International Conference on Biological Hydrogen Production. Hawaii: Waikoloa, 1997. - P. 319-328.

102. Jorgensen, В. B. Space for hydrogen // Nature. 2001. - Vol. 412. - P. 286-289.

103. Kasting, J. F., Siefert, J. L. Life and the Evolution of Earth's Atmosphere // Science. -2001.-Vol. 296.-P. 1066-1068.

104. Kentemich, Т., Danneberg, G., Hundeshagen, В., Bothe, H. Evidence for the occurrence of the alternative, vanadium-containing nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis // FEMS Microbiol. Lett. 1988. - Vol. 51. - P. 19-24.

105. Kentemich, Т., Bahnweg, M., Mayer, F., Bothe, H. Localization of the reversible hydrogenase in cyanobacteria//Z. Naturforsch. 1989. - Vol. 44c.-P. 384-391.

106. Kentemich, Т., Haverkamo, G., Bothe, H. The expression of a third nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis IIZ. Naturforsch. 1991. - Vol. 46c. - P. 217-222.

107. Kim, J., Rees, D. S. Nitrogenase and biological nitrogen fixation // Biochem. 1994. -Vol. 33.-P. 389-397.

108. Klibanov, M. Biotechnological potential of the enzyme hydrogenase // Proc. Biochem. -1983.-Vol. 18.-P. 13-16.

109. Kumar, A. P., Perraju, В. Т. V. V., Singh, H. N. Carbon nutrition and the regulation of uptake hydrogenase activity in free-living and symbiotic Anabaena cycadae // New. Phytol. -1986.-Vol. 104.-P. 115-120.

110. Laczko, I. Protective mechanisms in photosynthesis of Anabaena cylindrica II Physiol. Plant. 1985.-Vol. 63.-P. 221-224.

111. Lambert, G. R., Smith, G. D. The hydrogen metabolism of cyanobacteria (blue-green algae) // Biol. Rev. 1981. - Vol. 56. - P. 589-560.

112. Lee, R. E. Phycology. Cambrige University Press, 1999. - 614 p.

113. Lindblad, P., Sellstedt, A. Occurrence and localization of an uptake hydrogenase in the filamentous heterocystous cyanobacterium Nostoc PCC 73102 // Protoplasma. 1990. - Vol. 159.-P. 9-15.

114. Lindblad, P., Sellstedt, A. Immunogold localisation in ТЕМ using uptake hydrogenase an example // Microsc. Anal. 1991. - V. 26. - P. 29-31.

115. Lindberg, P., Hansel, A., Lindblad, P. hupS and hupL constitute a transcription unit in the cyanobacterium Nostoc sp. PCC 73102 // Arch. Microbiol. 2000. - Vol. 174. - P. 129133.

116. Lindell, D., Post, A. F. Ecological aspects of ntcA gene expression and its use as an indicator of the nitrogen status of marine Synechococcus spp. // Appl. Env. Microbiol. 2001. -P. 3340-3349.

117. Llama, M. J., Serra, J. L., Rao, К. K., Hall, D. O. Isolation and characterization of the hydrogenase activity from the non-heterocystous cyanobacterium Spirulina maxima И FEBS Lett. 1979. - Vol. 98, No. 2. - P. 342-346.

118. Lloyd, D., Ralphs, J. R., Harris, J. C. Giardia intestinalis, a eukaryote without hydrogeno-somes, produces hydrogen // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - 727-733.

119. Luque, I., Flores, E., Herrero, A. Molecular mechanism for the operation of nitrogen control in cyanobacteria // EMBO J. Jun. 1994. - Vol. 13(12). - P. 2863-2869.

120. Madamwar, D., Gard, N., Shah, V. Cyanobacterial hydrogen production // World J. Microbiol. Biotechnol. 2000. - Vol. 16. - P. 757-767.

121. Maier, R. J., Triplett, E. W. Toward more productive, efficient and competitive nitrogen-fixing symbiotic cyanobacteria // Crit. Rev. Plant. Sci. 1996. - Vol. 15. - P. 191-234.

122. Makkiney, G. Absorption of light by chlorophyll solutions // J. Biol. Chem. — 1941. — Vol. 140.-P. 315-322.

123. Mann, N. H. Detecting the environment // The ecology of cyanobacteria. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2000. - P. 367-395.

124. Margheri, M. C., Alotta, G. Homoacetic fermentation in the cyanobacterium Nostoc sp. strain Cc from Cycas circinalis // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - Vol. 111. - P. 213-218.

125. Markov, S. A., Weaver, P. F., Seibert, M. Hydrogen production using microorganisms inthhollow-fiber bioreactors // Hydrogen Energy Progress XI, Proceedings of the 11 World Hydrogen Energy conference. Germany: Stuttgart, 1996b. - P. 2619-2624.

126. Meeks, J. C., Elhai, J., Thiel, Т., Potts, M., Larimer, F., Lamerdin, J., Predki, P., Atlas, R. An overwiew of the genome of Nostoc punctiforme, a multicellular symbiotic cyanobacterium // Photosynthesis Res. 2001. - Vol. 70. - P. 85-106.

127. Meeks, J. C., Elhai, J. Regulation of cellular differentiation in filamentous cyanobacteria in free-living and plant-associated symbiotic growth states // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2002. Vol. 66, No. 1. - P. 94-121.

128. Melis, A., Happe, T. Hydrogen production. Green algae as a source of energy // Plant Physiol. Nov. 2001. - Vol. 127. - P. 740-748.

129. Mikheeva, L. E., Schmitz, O., Shestakov, S. V., Bothe, H. Mutants of the cyanobacterium Anabaena variabilis altered in hydrogenase activities // Z. Naturforsch. 1995. - Vol. 50c. -P. 505-510.

130. Miller, S. Т., Castenholz, R. W. Ecological physiology of Synechocossus sp. strain SH-94-5, a naturally occurring cyanobacterium deficient in nitrate assimilation // Appl. Env. Miff crobiol.-2001.-P. 3002-3009.

131. Miller, S. Т., Martin, M., Touchton, J., Castenholz, R. W. Effect of nitrogen availability on pigmentation and carbon assimilation in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain SH-94-5 // Arch. Microbiol. 2002. - Vol. 177(5). - P. 392-400.

132. Misra, H. S., Tuli, R. Differential expression of photosynthesis and nitrogen fixation genesin the cyanobacterium Plectonema boryanum II Plant Physiol. 2000. - Vol. 122. - P. 731736.

133. Miura, Y. Hydrogen production by biophotolysis based on microalgal photosynthesis //

134. Process Biochem.-1995.-Vol. 30, No. l.-P. 1-7.

135. Miyamoto, K., Hallenbeck, P. C., Benemann, J. R. Solar energy conversion by nitrogeni limited cultures of Anabaena cylindrica II J. Ferment. Technol. 1979. - Vol. 57. — P. 287293.

136. Moezelaar, R., Bijvank, S., Stal, L. J. Fermentation and sulfur reduction in the mat-buildingcyanobacterium Microcoleus chlonoplastes II Appl. Env. Microbiol. 1996. - Vol. 62. - P. 1752-1758.

137. Moezelaar, R., Stal, L. J. Fermentation in the unicellular cyanobacterium Mycrocystis PCC 7806 // Arch. Microbiol. 1994. - Vol. 162. - P. 63-69.

138. Miiller, M. The hydrogenosome // J. Gen. Microbiol. 1993. - Vol. 139. - P. 2879-2889.

139. Nakamura, Y., Kaneko, Т., Hirosawa, M., Mayajima, N., Tabata, S. CyanoBase, a www database containing the complete genome of Synechocystis strain PCC 6803 // Nicleic Acid Res. 1998. - Vol. 20. - P. 63-67.

140. Nielsen, А. Т., Amandusson, H., Bjorklund, R., Dannetun, H., Ejlertsson, J., Ekedahl, L.-G., Lundstrom, I., Svensson, В. H. Hydrogen production from organic waste // Int. J. Hydrogen Energy. -2001. Vol. 26. - P. 547-550.

141. Odom, J. M., Peck Jr., H. D. Hydrogenase, electron-transfer proteins and electron coupling in the sulfate-reducing bacteria Desulfovibrio II Ann. Rev. Microbiol. 1984. - Vol. 38.1. P.551-592.

142. Oliver, R. L., Ganf, G. G. Freshwater blooms // The ecology of cyanobacteria. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2000. - P. 149-194.i 161. Oren, A., Padan, E. Induction of anaerobic, photoautotrophic growth in the cyanobacterium

143. Oscillatoria limnetica II J. Bacteriol. 1978. - P. 558-563.

144. Oren, A., Shilo, M. Anaerobic heterotrophic dark metabolism in the cyanobacterium Oscillatoria limnetica-. sulfur respiration and lactate fermentation // Arch. Microbiol. 1989. 1.Vol. 122.-P. 77-84.

145. Oxelfelt, F., Tamagnini, P., Lindblad, P. Hydrogen uptake in Nostoc sp. PCC 73102. Cloniing and characterization of hupSL homologue // Arch. Microbiol. 1998. - Vol. 169. — P.267.274.

146. Oxelfelt, F., Tamagnini, P., Salema, R., Lindblad, P. Hydrogenase uptake in Nostoc strain

147. PCC 73102: Effect of nickel, hydrogen, carbon and nitrogen // Plant Physiol. Biochem.1995.-Vol. 33(6).-P. 617-623.

148. Papen, H., Kentemich, Т., Schmulling, Т., Bothe, H. Hydrogenase activities in cyanobacteria // Biochimie. 1986.- Vol. 68. - P. 121-132.

149. Pederson, D. M., Daday, A., Smith, G. D. The use of nickel to probe the role of hydrogen metabolism in cyanobacterial nitrogen fixation // Biochimie. 1986. - Vol. 68(1). — P. 113-120.

150. Peschek, G. Anaerobic hydrogen activity in Anacystis nidulans: ^-dependent photoreduc-tion and related reactions // Biochim. Biophys. Acta. 1979a. - Vol. 548. - P. 187-202.

151. Peschek, G. Aerobic hydrogen activity in Anacystis nidulans: the oxyhydrogen reaction // Biochim. Biophys. Acta. 1979b. - Vol. 548. - P. 203-215.

152. Peterson, R. В., Burris, R. H. Hydrogen metabolism in isolated heterocysts of Anabaena 1ШII Arch. Microbiol. 1978. - Vol. 116. - P. 125-132.

153. Rai, A. N., Borthakur, M., Soderback, E., Bergman, B. Immuno-gold localization of hydrogenase in the cyanobacterial-plant symbioses Peltigera canina, Anthoceros punctatus and Gunnera magellanica II Symbiosis. 1992. - Vol. 12. - P. 131-144.

154. Reddy, P. M., Spiller, H., Albrecht, S. L., Shanmungam, К. T. Photodissimilation of fructose to H2 and CO2 by a dinitrogen-fixing cyanobacterium, Anabaena variabilis II Appl. Env. Microbiol.-Apr. 1996.-P. 1220-1226.

155. Richaud, C., Zabulon, G., Joder, A., Thomas, J. C. Nirogen or sulfur starvation differentially affects phycobilisome degradation and expression of the nblA gene in Synechocystis strain 6803//J. Bacteriol.-2001.-Vol. 183(10). P. 2989-2994.

156. Robson, R. The assembly line // Hydrogen as a fuel: learning from Nature. London and New York: Taylor and Francis, 2001. - P. 57-72.

157. Ruschel, A. P., de Freitas, J. R., da Silva, P. M. Hydrogen uptake by Azolla-Anabaena //

158. Plant and Soil. 1986. - Vol. 97. - P. 79-83.

159. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989. (страницы?)

160. Sartou, C., Therezien, Y., Coute, A. Cyanophyceae on the Nouragues Inselberg (French Guiana) // Nova Hedwigia. 1995. - Vol. 61., No. 1-2. - P. 85-109.

161. Sauer, J., Gorl, M., Forchhammer, K. Nitrogen starvation in Synechococcus PCC 7942: involvement of glutamine synthetase and NtcA in phycobiliprotein degradation and survival // Arch. Microbiol. 1999. - Vol. 172. - P. 247-255.

162. Sauer, J., Dirmeier, U., Forchhammer, K. The Synechococcus strain PCC 7942 glnN product (glutamine synthetase III) helps recovery from prolonged nitrogen chlorosis // J. Bacte-riol.-2000.-Vol. 182,No. 19.-P. 5615-5619.

163. Sauer, J., Schreiber, U., Schmidt, R., Volker, U., Forchhammer, K. Nitrogen starvation-induced chlorosis in Synechococcus PCC 7942. Low-level photosynthesis as a mechanism of long-term survival // Plant Physiol. 2001. - Vol. 126. - P. 233-243.

164. Shmetterer, G. Cyanobacterial respiration // The molecular biology of cyanobacteria. -Dordrecht: Kluwer, 1994. P. 409-435.

165. Schmitz, O., Boison, G., Hilscher, R., Hundeshagen, В., Zimmer, W., Lottspeich, F.,

166. Bothe, H. Molecular biological analysis of a bidirectional hydrogenase from cyanobacteria // Eur. J. Biochem. 1995. - Vol. 233. - P. 266-276.

167. Schmitz, О., Bothe, H. NAD(H)+-dependent hydrogenase activity in extracts from the cyanobacterium Anacystis nidulans II FEMS Microbiol. Lett. 1996a. - Vol. 135. - P. 97 -102.

168. Schmitz, O., Bothe, H. The diaphorase subunit HoxU of the bidirectional hydrogenase as electron transferring protein in cyanobacterial respiration? // Naturwissenscharten. 1996b. -Vol. 83.-P. 525-527.

169. Schmitz, O., Boison, G., Bothe, H. Quantitative analysis of expression of two circadian clock-controlled gene clusters coding for the bidirectional hydrogenase in the cyanobacterium // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 41(6). - P. 1409-1417.

170. Schmitz, O., Boison, G., Salzmann, H., Bothe, H., Schutz, K., Wang, Sh., Happe, T. HoxE- a subunit specific for the pentameric bidirectional hydrogenase complex (HoxEFUYH) of cyanobacteria // Biochim. Biophys. Acta. 2002. - P. 66-74.

171. Schopf, J. W. The fossil record: tracing the roots of the cyanobacterial lineage // The ecology of cyanobacteria. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2000. - P. 13-35.

172. Schrautemeier, В., Bohme, H. A distinct ferredoxin for nitrogen fixation isolated from het-erocysts of the cyanobacterium Anabaena variabilis II FEBS Lett. — 1985. Vol. 184. - P. 304-308.

173. Schulz, R. Hydrogenases and hydrogen production in eukaryotic organisms and cyanobacteria // J. Mar. Biotechnol. 1996. - Vol. 4. - P. 16-22.

174. Schwarz, R., Grossman, A. A response regulator of cyanobacteria integrates diverse environmental signals and is critical for survival under extreme conditions // Proc. Natl. Sci. USA. Sep. 1998. - 95. - P. 11008-11013.

175. Serebryakova, L. Т., Zorin, N. A., Lindblad, P. Reversible hydrogenase in Anabaena variabilis ATCC 29413. Presence and localization in non-N2-fixing cells // Arch. Microbiol. -1994.-Vol. 161.-P. 140-144.

176. Serebryakova, L. Т., Medina, M., Zorin, N. A., Gogotov, I. N., Cammack, R. Reversible hydrogenase of Anabaena variabilis ATCC 29413: catalytic properties and characterization of redox centres // FEBS Lett. 1996. - Vol. 383. - P. 79-82.

177. Serebryakova, L., Novichkova, N., Gogotov, I. Facultative H2-dependent anoxygenic photosynthesis in the unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola CALU 743 // Int. J. Photoenergy. 2002. - Vol. 4. - P. 169-173.

178. Smith, A. J. Models of cyanobacterial carbon metabolism // The biology of cyanobacteria.- Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1982. P. 47-85.

179. Smith, G. D. Hydrogen metabolism in cyanobacteria // Phycotalk. 1990. - Vol. 2. - P. 135-143.

180. Щ 197. Spiller, H., Bookjans, G., Shanmungam, К. T. Regulation of hydrogenase activity in vegetative cells of Anabaena variabilis II J. Bacteriol. Jul. 1983. - Vol. 155, No 1. — P. 129137.

181. Stal, L. J, Heyer, H. Dark anaerobic nitrogen ficxation (acetylene reduction) in the cyanobacterium Oscillatoria sp. // FEMS Microbiol. Ecol. 1987. - Vol. 45. - P. 227 -232.

182. Stal, L. J., Moezelaar, R. Fermentation in cyanobacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1997. -Vol. 21.-P. 179-211.

183. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of ^ unicellular blue-green algae. (Order Chroococcales) // Bacteriol. Rev. 1971. - 171-205.

184. Stephenson, M., Stickland, L. H. XXVII Hydrogenase: a bacterial enzyme capable of activating molecular hydrogen: I. The properties of the enzyme // Biochem. J. (London) -1931.-Vol. 25.-P. 205-214.

185. Sveshnikov, D. A., Sveshnikova, N. V., Rao, К. K., Hall, D. O. Hydrogen metabolism of mutant forms of Anabaena variabilis in continuous cultures and under nutritional stress // FEMS Microbiol. Lett. 1997. - Vol. 147(2). - P. 297-301.

186. Tamagnini, P., Oxelfelt, F., Salema, R., Lindblad, P. Immunological characterization of hydrogenases in the nitrogen-fixing Nostoc sp. PCC 73102 // Curr. Microbiol. 1995. -Vol. 31.-P. 102-107.

187. Tamagnini, P., Troshina, O., Oxelfelt, F., Salema, R., Lindblad, P. Hydrogenases in Nostoc sp. strain PCC 73102, a strain lacking a bidirectional enzyme // Appl. Env. Microbiol. -1997.-P. 1801-1807.

188. Tamagnini, P., Costa, J.-L., Almeida, L., Oliveira, M.-J., Salema, R., Lindblad, P. Diversity of cyanobacterial hydrogenases, a molecular approach // Curr. Microbiol. 2000. - Vol. 40.-P. 356-361.

189. Tamagnini, P., Axelsson, R., Lindberg, P., Oxelfelt, F., Wunschiers, R., Lindblad, P. Hydrogenases and hydrogen metabolism of cyanobacteria // Microbiol. Molec. Biol. Rev. -2002a. Vol. 66, No. 1. - P. 1-20.

190. Tandeau de Marsas, N., Houmard, J. Adaptation of cyanobacteria to environmental stimuli: new stapstowards molecular mechanisms // FEMS Microbiol. Rev. 1994. - Vol. 104. — P. 119-190.

191. Tel-Or, E., Luijk, L. W., Packer, L. An inducible hydrogenase in cyanobacteia enhances N2-fixation // FEBS Lett. Jun. 1977. - Vol. 78, No. 1. - P. 49-52.

192. Tel-Or, E., Luijk, L. W., Packer, L. Hydrogenase in N2-fixing cyanobacteria // Arch. Bio-chem. Biophys. Jan. 1978. - Vol. 185, No. 1. - P. 185-194.

193. Thiel, T. Characterization of genes for an alternative nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis II J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 6276-6286.

194. Thiel, Т., Lyons, E. M., Erker, J. C., Ernst, A. A second nitrogenase in vegetative cells of a ^ heterocyst-forming cyanobacterium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P.9358-9362.

195. Tian-qing, G., Pei-zhen, Zh. Isolation and characterization of hydrogenase from Spirulina platensis II Hydrobiologia. 1987. - Vol. 151/152. - P. 557-761.

196. Tredici, M. R., Margheri, M. C., De Philippis, R., Materassi, R. The role of hydrogen metabolism in photoheterotrophic cultures of the cyanobacteium Nosioc sp. strain Cc isolated from Cycas circinalis L. // J. Gen. Microbiol. 1990. - P. 1009-1015.

197. Troshina, O. Yu., Serebryakova, L. Т., Lindblad, P. Induction of H2-uptake and nitrogenase activities in the cyanobacterium Anabaena variabilis ATCC 29413: effects of hydrogen and organic substrate // Curr. Microbiol. 1996. - Vol. 33. - P. 11-15.

198. Troshina, O. Yu, Serebryakova, L.T., Sheremetieva, M.E., Lindblad, P. Production of H2 i by the unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola CALU 743 during fermentation //1.t. J. of Hydrogen Energy. 2002. - Vol. 27. - P. 1283-1289.

199. Tsygankov, A. A., Laurinavichene, Т. V., Gogotov, I. N. Laboratory scale photobioreactor // Biotech. Tech. 1994. - Vol. 8., No. 8. - P. 575.

200. Tsygankov, A. A., Borodin, V. В., Rao, К. K., Hall, D. H2 photoproduction by batch culture of Anabaena variabilis ATCC 29413 and its mutant PK84 in photobioreactor // Biotechnol. Bioeng. Sep. 1999. - Vol. 64, No. 6. - P. 709-715.

201. Van der Oost, J., Kanneworff, W. A., Krab, K., Kraayenhof, R. Hydrogen metabolism of three unicellular nitrogen-fixing cyanobacteria // FEMS Microbiol. Lett. — 1987. Vol. 48. -P. 41-45.

202. Van der Oost, J., Bulthuis, B. A., Feitz, S., Krab. K., Krauayenhof, R. Fermentation metabolism of the unicellular cyanobacterium Cyanothece PCC 7822 // Arch. Microbiol. -1989.-Vol. 152.-P. 415-419.

203. Vignais, P. M., Billoud, В., Meyer, J. Classification and phylogeny of hydrogenases // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 25. - P. 455-501.

204. Volbeda, A., Charon, M.-H., Piras, C., Hatchinkian, E. C., Frey, M., Fontecilla-Camps, J. C. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas // Nature. -1995. Vol. 373. - P. 580-587.

205. Vonken, F. G., Boxma, В., van Hoek, A. H., Akhmanova, A. S., Vogels, G. D., Huynen, M., Veehuis, M., Hachstein, J. H. A hydrogenosomal Fe.-hydrogenase from the anaerobic chytrid Neocallimastix sp. L2 // Gene. 2002. - Vol. 284(1-2). - P. 103-112.

206. Vyas, D., Kumar, H. D. Nitrogen fixation and hydrogen uptake in four cyanobacteria // Int. J. Hydrogen Energy. 1995. - Vol. 20, No. 2. - P. 163-168.

207. Wang, S. H., Chen, P. C. Partial purification of hydrogenase from Anabaena sp. CH3 with heat treatment // Zhonghua Min Gou Wei Sheng Wu Ji Mian Yi Xue Za Zhi. 1994. - Vol. 27(3).-P. 113-119.

208. Wanner, G., Henkelmann, G., Schmidt, A., Kost, H. P. Nitrogen and sulfur starvation of the cyanobacteium Synechococcus 6301 // Z. Naturforsch. 1986. - Vol. 41c. — P. 741750.

209. Ward, D. M., Casteholz, R. W. Cyanobacteria in geothermal habitats // The ecology ofcyanobacteria. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2000. - P. 37-59.

210. Wei, T.-F., Ramasubramanian, T. S., Pu, F., Golden, J. W. Anabaena sp. strain PCC 7120 ntcA gene required for growth on nitrate and heterocyst development // J. Bacteiol. 1994. -Vol. 176.-P. 4473-4482.

211. Whitton, B. A., Potts, M. Introduction to the cyanobacteria // The ecology of cyanobacteria. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2000. - P. 1-11.

212. Wolk, C. P., Ernst, A., Elhai, J. Heterocyst metabolism and development // The molecular biology of Cyanobacteria. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers, 1994.-P. 769-823.

213. Wu, L.-F., Mandrand, M. A. Microbial hydrogenases: primary structure, classification, signatures and phylogeny // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - Vol. 104. - P. 243-270.

214. Wiinschiers, R., Batur, M., Lindblad, P. Presence and expression of hydrogenase specific C-terminal endopeptidases in cyanobacteria // BMC Microbiol. 2003. - Vol. 3(1). - P. 8.

215. Wiinschiers, R., Stangier, K., Senger, H., Schulz, R. Molecular evidence of a Fe-hydrogenase in the green alga Scenedesmus obliquus II Curr. Microbiol. 2001. - Vol. 42. -P. 353-360.

216. Zhang, X., Tabita, R., Van Vaalen, C. Nickel control of hydrogen production and uptake in Anabaena spp. strains CA and IF//J. Gen. Microbiol. 1984. -Vol. 130. - P. 1815-1818.

217. Публикации по теме диссертации

218. Serebryakova, L. Т., Sheremetieva, М. Е., Tsygankov, A. A. Reversible hydrogenase activity of Gloeocapsa alpicola in continuous culture // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 166.-P. 89-94.

219. Серебрякова, JI. Т., Шереметьева, M. E., Линдблад, П. Гидрогеназная активность одноклеточной цианобактерии Gloeocapsa alpicola CALU 743 в условиях азотного голодания // Микробиология. 1999. - Вып. 68. - С. 249-252.

220. Serebryakova, L., Sheremetieva, М., Lindblad, P. Нг-uptake and evolution in the unicellular cyanobacterium Chroococcidiopsis thermalis CALU 758 // Plant Physiol. Biochem. -2000.-Vol. 38(6).-P. 1-6.

221. Шереметьева, M. Е., Серебрякова, Л. Т. Гидрогеназа одноклеточной неазотфикси-рующей цианобактерии Gloeocapsa alpicola: функции и регуляция биосинтеза // 2-я Конференция молодых ученых. Пущино, 1998.

222. Шереметьева, М. Е. Гидрогеназа одноклеточной неазотфиксирующей цианобактерии Gloeocapsa alpicola: каталитические и биохимические свойства // 3-я Конференция молодых ученых. Пущино, 1999.

223. Sheremetieva, М., Serebryakova, L., Lindblad, P. Properties of the reversible hydrogenase of the unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola II XI Nordic Nitrogen Fixation Conference. Stockholm University, Sweden, January 27-29, 2000. - P. 43.

224. Serebryakova, L. Т., Sheremetieva, M. E., Lindblad, P. Hydrogen metabolism of the unicellular cyanobacterium Chroococcidiopsis thermalis CALU 758 // 6th International Conference on the Molecular Biology of Hydrogenases. Potsdam, 2000. - pB 3.

225. Шереметьева, М. Е., Серебрякова, JI. Т. Метаболизм водорода у одноклеточной цианобактерии Gloeocapsa alpicola II Автотрофные микроорганизмы. Москва, 2000.

226. Ъ 12. Серебрякова, JI. Т., Трошина, О. Ю., Шереметьева, М. Е. Продукция молекулярноговодорода одноклеточной цианобактерией Gloeocapsa alpicola // Труды конференции «Научные исследования в наукоградах Московской области». Пущино, 2001. - С. 98.

227. Sheremetieva, М. Е., Troshina, О. Yu., Serebryakova, L. Т., Lindblad, P. Is the activity of cyanobacterial bidirectional hydrogenase regulated at the transcriptional level? // BioHy-drogen 2002. Ede, the Netherlands, April 21-24, 2002. - P. 120.

Информация о работе

Шереметьева, Марина Евгеньевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Метаболизм молекулярного водорода у одноклеточных цианобактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы