Морфофизиологическая лабильность внутриклеточных мембран фототрофных микроорганизмов разных эволюционных уровней

Селях, Ирина Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофизиологическая лабильность внутриклеточных мембран фототрофных микроорганизмов разных эволюционных уровней
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфофизиологическая лабильность внутриклеточных мембран фототрофных микроорганизмов разных эволюционных уровней"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

СЕЛЯХ ИРИНА ОЛЕГОВНА

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБИЛЬНОСТЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ФОТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ РАЗНЫХ ЭВОЛЮЦИОННЫХ УРОВНЕЙ

03.00.25 - ГИСТОЛОГИЯ, ЦИТОЛОГИЯ, КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в виде научного доклада

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Умаров Марат Мутагарович

доктор биологических наук, профессор

Онищенко Галина Евгеньевна

доктор биологических наук, профессор

Балнокин Юрий Владимирович

Ведущая организация:

Институт глобального климата и экологии Росгидромета и РАН

Защита состоится 46декабря 2004 года в 15часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д. 501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомится в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Диссертация в виде научного доклада разослана ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Фотосинтез и дыхание - два основных биоэнергетических процесса, обеспечивающих жизнедеятельность большинства организмов на Земле. Экологические отношения между фотосинтезом и дыханием определяются тем, что фотосинтез лежит в основе создания биологической продукции, а дыхание служит одним из главных способов разрушения органического вещества. Таким образом, в биосфере фотосинтез и дыхание противостоят друг другу. Однако, с позиций клеточной физиологии и биохимии фотосинтез и дыхание имеют много общего. Оба процесса локализованы у эукариот во внутренних мембранах клеточных органелл (хлоропласты и митохондрии), у прокариот - в цитоплазматической мембране (ЦПМ) или ее производных (ламеллярные структуры у цианобактерий, хроматофоры у фотосинтезирующих бактерий, возможно мезосомы у аэробных бактерий).

Важнейшие достижения в области изучения мембран прокариот связаны с их физиолого-биохимическим исследованием, а также анализом индивидуальных компонентов энергетических, биосинтетических и транспортных систем. При этом определяющими являются молекулярно-биологические подходы. Несмотря на значительный прогресс в развитии этих областей науки, некоторые эволюционные, а также динамические аспекты проблемы (адаптационная лабильность мембранного аппарата, биогенез тилакоидов) остаются малоизученными.

Интерес к изучению цианобактерий связан как с их ключевым положением в процессе эволюции жизни на Земле, так и с различными практическими аспектами. Цианобактерий включают большую группу организмов, сочетающих прокариотное строение клетки с фотосинтезом кислородного типа, характерным для всех фототрофных эукариотных организмов. Наряду с этим в группе цианобактерий описаны и другие пути, ведущие к получению клетками энергии, в том числе дыхание и бескислородный фотосинтез. Общей принципиальной чертой организации этих энергетических процессов является локализация их на клеточных мембранах определенного типа - энергопреобразующих, представленных у цианобактерий цитоплазматической и тилакоидными мембранами. Степень дифференцированности клеточных мембран цианобактерий в отношении осуществления ими энергетических функций в настоящее время до конца не ясна. В то же время выяснение путей, какими шло структурное обособление мембранзависимых функций в клетках таких эволюционно продвинутых прокариот, как цианобактерий, важно для понимания возникновения и эволюции фотосинтезирующей эукариотной клетки.

Локализация фотосинтетического аппарата в тилакоидных мембранах цианобактерий ни у кого не вызывает сомнений. Большинство исследователей считают, что дыхательная активность также связана с ними. Относительно роли

ЦПМ в энергетике цианобактерий с

пибран нет

единого мнения. О структурно-функциональной организации дыхания цианобактерий также имеется мало сведений. Все исследованные в настоящее время цианобактерий могут получать энергию за счет дыхания, хотя основным (и единственным у облигатно фототрофных видов) ее источником для роста является фотосинтез, в изучении которого у этих организмов в последнее время достигнуты большие успехи. В то же время дыхание неспособно обеспечить в темноте рост большинства видов. При этом отсутствуют какие-либо повреждения в электрон-транспортной системе и механизмах энергетического сопряжения.

Цианобактерий характеризуются низкой скоростью поглощения О2 в темноте; у факультативно хемогетеротрофных видов дыхание сопровождается медленным ростом, а у облигатных фототрофов достаточно только для снабжения клеток энергией, необходимой для поддержания их жизнедеятельности. Практически все компоненты дыхательной цепи участвуют и в фотосинтетическом электронном транспорте, что указывает на тесную связь между обоими процессами.

Большинство работ по изучению дыхания цианобактерий проведено с применением биохимических методов, предусматривающих разрушение клеток. Одним из подходов к изучению функциональной дифференцированности мембранного аппарата цианобактерий является ультрацитохимический, позволяющий на интактных клетках оценивать уровень активности и локализацию специфических ферментативных реакций.

В клетках примитивных одноклеточных эукариотных красных микроводорослей класса Cyanidiophyceae, сочетающих в себе признаки сине-зеленых, зеленых и красных водорослей и, по мнению ряда ученых, являющихся переходными формами от прокариот к высокоорганизованным эукариотам, эти процессы пространственно разделены. На этом эволюционном уровне организации процессы дыхания и фотосинтеза уже разобщены: первый локализован в митохондриях, второй — в хлоропластах. Примитивность клеточной организации Cyanidiophyceae наряду со способностью представителей этого класса существовать в различных условиях энергообеспечения (фотоавто-, миксо- и хемогетеротрофно) делает их уникальными объектами для изучения динамичности поведения мембранных структур. Следует отметить, что специальных исследований, посвященных изучению связи между развитием определенных структур (органелл) и их функциональной активностью у Cyanidiophyceae не проводилось.

Рассмотрение взаимоотношений между фотосинтезом и дыханием у "высших" прокариот с развитой системой внутрицитоплазматических мембран и примитивных эукариотных организмов, отличающихся разнообразием биоэнергетических процессов, которые в этом смысле могут рассматриваться как «живые ископаемые» или «недостающие звенья», необходимые для реконструкции общей картины эволюции энергетического обмена, является предметом данной работы.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа посвящена экспериментальному и теоретическому обоснованию взаимоотношений двух главных энергетических процессов в клетках различных фототрофных микроорганизмов: от структурного единства фотосинтеза и дыхания в клетках прокариотных культур - к структурному разобщению и независимости их в культурах примитивных эукариот.

Цель работы состояла в изучении локализации биоэнергетических процессов на клеточных мембранах фототрофных прокариотных и органеллах эукариотных микроорганизмов в зависимости от уровня клеточной организации экспериментальных культур и от экологических условий культивирования. В связи с этим решались следующие задачи с применением ультрацитохимических, электронномикроскопических и физиолого-биохимических методов:

• подбор условий для изучения и выявления мембранных структур;

• сравнительное изучение организации мембранного аппарата фотоавто-, миксо- и хемогетеротрофных культур;

• анализ роли цитоплазматической и тилакоидных мембран в энергетических процессах клеток цианобактерий, различающихся уровнями морфологической и генетической организации, циклами развития и физиолого-биохимическими особенностями;

• изучение связи между развитием энергопреобразующих органелл и их функциональной активностью в клетках примитивных красных водорослей;

• проведение кариологических исследований клеток Cyanidiophyceae в связи с неопределенностью их таксономического статуса;

• выявление причин редукции пигментного аппарата фотосинтеза клеток Cyanidiophyceae при гетеротрофном росте.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Экспериментальная часть работы представляет собой исследование приоритетного характера, так как основные результаты получены впервые или на новых объектах. Проведено комплексное рассмотрение фотосинтеза и дыхания с единых физиолого-биохимических и эколого-эволюционных позиций. В результате проведенной работы показана различная степень активности ЦПМ и тилакоидных мембран в восстановлении тетранитросинего тетразолия (ТНСТ) и окислении 3,3'-диаминобензидина (ДАБ) у вегетативных клеток цианобактерий, различающихся уровнями морфологической, генетической организации и физиолого-биохимическими характеристиками.

Впервые выявлена связь между дегидрогеназной активностью ЦПМ и метаболическими особенностями цианобактерий. Установлено, что метаболизм хемогетеротрофного типа индуцирует активность ЦПМ, повышая ее удельный вес в энергетике клетки в этих условиях. Выявлены видоспецифическая и

физиологическая специализация отдельных участков мембранного аппарата цианобактерий для осуществления процессов фотосинтеза и дыхания. Результаты работы объясняют структурно-функциональную организацию мембранного аппарата цианобактерий и примитивных красных водорослей, а также его лабильность в онтогенезе. Обоснованы представления о направленности биохимических процессов и их зависимости от экологической ситуации.

Выявлен внутриклеточный механизм редукции пигментного аппарата фотосинтеза Galdieria partita при гетеротрофном росте. Предложены новые методы фиксации для Cyanidiophyceae, позволившие выявить неизвестные ранее детали ультраструктуры клеток и дать описание новых видов. Установлены межродовые кариологические различия микроводорослей класса Cyanidiophyceae. Исследования фототрофных про- и эукариот дают материал для понимания морфофункциональной эволюции мембранного аппарата клеток.

Проведены модельные исследования, связанные с использованием цианобактерий как биоиндикатора загрязнений и негативного антропогенного воздействия. Результаты работы создают основу для оптимизации культивирования и управления метаболизмом микроорганизмов в практических целях, позволяют прогнозировать динамику развития их природных популяций. Полученные данные и разработки используются в учебном процессе, в курсах лекций и практикумах на биологическом факультете МГУ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

FEMS International Symposium, Pushchino, 1983; V Всесоюзный симпозиум по ультраструктуре растений, Кишинев, 1983; 1 Всесоюзное совещание "Цитология микроорганизмов", Пущино, 1984; VII съезд Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, 1985; II Всесоюзное совещание "Клеточные механизмы адаптации", 1985; VI Всесоюзный симпозиум "Ультраструктура растений", Киев, 1988; XIII Всесоюзная конференция по электронной микроскопии, Звенигород, 1988; Всесоюзная конференция "Регуляция микробного метаболизма", Пущино, 1989; Всесоюзное совещание "Новые методы в практике сельского хозяйства", 1989; Всесоюзная конференция "Микроорганизмы-стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных", Ташкент, 1989; IV Республиканская конференция по электронной микроскопии, Кишинев, 1990; Всесоюзная конференция "Биотехнология и биофизика микробных популяций", Алма-Ата, 1991; IV Всесоюзная конференция "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", Пущино, 1992; Конференция "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду, Москва, 1994; Всесоюзная конференция "Эколого-физиологические исследования водорослей" Ярославль, 1996; I Всероссийская конференция фотобиологов, Пущино, 1996; IV симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, 1997; XI International Congress on Photosynthesis, Budapest, 1998; Международный симпозиум "Молекулярные механизмы стрессовых ответов у растений", Москва, 1998; Международная

конференция "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии", Москва, 1998; 2-nd European Phycological Congress, Italy, 1999; V Международная конференция "Регуляторы роста и развития растений", Москва, 1999; IV съезд Общества физиологов растений, Москва, 1999; Всероссийская конференция "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов", Москва, 2000; Международная конференция «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода», Пущино, 2000; Международная конференция ИНТЕРНАС-2000, Калуга, 2000; Международная конференция «Автотрофные микроорганизмы», Москва, 2000; Международная конференция «Оптические методы исследования потоков», МЭИ, Москва, 2001; Всероссийская научная конференция «Физиология растений и экология на рубеже веков», Ярославль, 2003; II Международный симпозиум «Биокосные взаимодействия: жизнь и камень», Санкт-Петербург, 2004.

ПУБЛИКАЦИИ

Автором опубликованы 82 печатные работы. Выносимые на защиту положения наиболее полно представлены в 55 публикациях.

ЦИАНОБАКТЕРИИ Глава 1. ДЕГИДРОГЕНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

ЦИАНОБАКТЕРИИ

1.1.Электронно-цитохимическое определение суммарной дегидрогеназной активности в клетках фототрофных цианобактерий

Объектами исследования служили штаммы цианобактерий Synechococcus sp. РСС 6301 (Anacystis nidulans), Anabaena variabilis CALU-458 и Chlorogloeopsis fhtschii PCC 6912, различающиеся уровнями организации и физиолого-биохимическими характеристиками. О локализации и активности связанных с мембраной начальных участков дыхательной электронтранспортной цепи судили по способности тетранитросинего тетразолия (ТНСТ, «Хемапол», ЧССР) акцептировать электроны с НАД(Ф)Н2-дегидрогеназ, восстанавливаясь при этом до формазана -нерастворимого электронноплотного соединения (Пирс, 1975; Ковальский, 1978). Электронно-цитохимический анализ проводили по модифицированной методике (Минеева и др., 1985). Препараты просматривали в электронном микроскопах HU-11F и JEM 100 В при ускоряющем напряжении 75-80 кВ.

Локализация продукта восстановления ТНСТ. Формазан, образующийся на поверхности мембран, имеет, как правило, вид гранул диаметром 4-5 нм. Диаметр их постоянен, а количество (плотность прилегания друг к другу) зависит от времени инкубации с ТНСТ. При проведении реакции в темноте отложение гранул формазана в клетках фотоавтотрофных культур Synechococcus sp., A. variabilis, С. fritschii обнаружено на поверхности цитоплазматической, тилакоидных и наружной клеточной мембран (рис.1), а у С. fritschii и на мембраноподобных фрагментах,

Кон*роль( -ТНСТ)

+тнст(+дасо)

+глюкоза или оукцинат

Рис. 1. Отложение гранул формазана (гф) в темноте на мембранах БупвсЬососсиэ эр (А) и А уапаЬШэ (Б), истощенных по эндогенным углеродным субстратам (нм-наружная мембрана, пг-пептидогликановый слой, цпм-цитоплазматическая мембрана, т-тилакоиды)

локализованных в толще чехла (рис.2). Интенсивность отложения восстановленного ТНСТ на цитоплазматической и тилакоидных мембранах в клетках облигатных фототрофов (Synechococcus sp., A. vahabilis) была значительно меньше, чем у факультативного фототрофа (С. fritschii).

Увеличение времени инкубирования клеточных суспензий с ТНСТ от 60 мин до 4 - 6 часов не привело у Synechococcus sp. и A. vahabilis к заметному повышению плотности осадка формазана на внутриклеточных мембранах.

Полученные данные позволили выявить различие в свойствах клеточной стенки С. fritschii, с одной стороны, и Synechococcus sp. и A. vahabilis, с другой. Обнаружено, что низкая скорость восстановления ТНСТ в клетках Synechococcus sp. и A. vahabilis является результатом слабой его проницаемости через клеточные стенки. В дальнейшем при проведении цитохимических реакций с ТНСТ на культурах облигатно фототрофных цианобактерии в инкубационную смесь добавляли диметилсульфоксид (ДМСО, 5%).

У исследованных цианобактерии наблюдение продукта цитохимической реакции было затруднено присутствием в цитоплазме гранул запасных веществ и плотностью цитоплазматического матрикса. Проведение цитохимической реакции с использованием истощенных по эндогенным субстратам клеточных суспензий позволило облегчить наблюдение результатов. Оптимальными сроками истощения оказались для Synechococcus sp. и A. vahabilis 3 суток, С. fritschii - 10 суток Показано, что в клетках растущих и истощенных культур отложение формазана происходит на трех видах мембран (цитоплазматической, тилакоидных, наружной), а у C.fritschii - и в мембранных структурах чехла. Истощение суспензий цианобактерии по эндогенным углеродным субстратам не приводит к изменению картины отложения в клетке продукта восстановления ТНСТ,. позволяя в то же время более четко выявить его локализацию.

Выявление неферментативного восстановления ТНСТ. Известна возможность неферментативного восстановления ТНСТ, являющегося источником артефактов. ТНСТ может восстанавливаться полисахаридами (De Вагу, Needle, 1978), неспецифически адсорбироваться на липопротеинах с последующим восстановлением свободно диффундирующими клеточными метаболитами (Whitton, Carr, 1982). Оба типа макромолекул входят в состав наружной клеточной стенки и чехла цианобактерии. Неферментативное восстановление ТНСТ возможно и при рН выше 8,0 (Ковальский, 1978). В наших опытах последнее исключалось проведением реакции в буфере при рН 7,2.

Для выявления неферментативното отложения формазана реакцию с ТНСТ проводили, используя предварительно прогретые клеточные суспензии цианобактерии (7 мин., 95°). Выбранный режим прогревания приводил к потере способности к фотосинтетическому выделению молекулярного кислорода, которое сменялось его фотопоглощением, приблизительно одинаковым для всех культур (3 -

—ТНСТ)

Рис.2. Отложение гранул формазана на мембранах С МвсИп На фотографиях - в присутствии глюкозы (А), сукцината натрия (Б), в клетках, подвергшихся деструкции (В), на поверхностях внутритилакоидных пространств (Г)

(ч-чехол, втп-внутритилакоидное пространство Остальные обозначения как на рис 1)

5 нмоль Ог/мг сухой массы-ч). В темноте скорость поглощения О2 составляла для всех культур величину порядка 5-12 нмоль Ог/мг сухой массы-ч. Реакция с ТНСТ с использованием предварительно прогретых клеточных суспензий цианобактерий показала, что процесс, приводящий к отложению формазана на тилакоидных и цитоплазматической мембранах, термочувствителен, что указывает на его ферментативную природу. Восстановление ТНСТ на наружной мембране клеточной стенки всех изученных цианобактерий, а у С. ^^^н и на фрагментах мембраноподобных структур, локализованных в чехле, обнаруживает низкую чувствительность к нагреванию, что свидетельствует о неферментативном характере этих реакций.

Восстановление ТНСТ неферментативной природы наблюдали также в клетках цианобактерий, цитоплазматическое содержимое которых, в том числе тилакоиды и ЦПМ, подверглось сильной деструкции. В таких клетках отложение гранул формазана происходило только на поверхности наружной мембраны клеточной стенки и на мембраноподобных фрагментах чехла С. (рис.2).

Таким образом, с проявлением собственно дегидрогеназной активности связаны реакции, локализованные на тилакоидных и цитоплазматической мембранах.

Локализация дегидрогеназной активности на мембранных структурах цианобактерий. Основное место отложения восстановленного ТНСТ в клетках цианобактерий - внешние поверхности тилакоидных мембран, что согласуется с ранее полученными данными (Bisalputra et в!., 1969; Peschek et в!., 1981). Помимо этого отложение гранул формазана можно наблюдать и на внутренних поверхностях тилакоидных мембран в тех случаях, когда последние набухают и отстоят друг от друга. Что касается ЦПМ, то полученные данные не дают возможности сделать четкий вывод о локализации на ней гранул формазана. Отложение формазана на наружных поверхностях тилакоидных мембран согласуется с имеющимися данными

06 акцептировании ТНСТ электронов в основном с НАД(Ф)Н2-дегидрогеназ, локализацию которых на этих мембранах и маркирует образованный формазан.

Процессы, ведущие к отложению формазана на внутренних поверхностях тилакоидных мембран и возрастающие по мере истощения культур цианобактерий, не ясны. Возможно, это результат способности формазана к перераспределению в пределах мембраны, связанный с повышением ее проницаемости. Последняя возрастает по мере истощения клеток цианобактерий и служит указанием на отход этих мембран от нативного состояния. Не исключено также, что в процессе истощения культуры и возрастания деградативных изменений мембран меняются пути, по которым электроны поступают на ТНСТ.

На наружной мембране всех цианобактерий формазан откладывается только на поверхности, обращенной к внешней среде. Что же касается мембраноподобных фрагментов чехла С. то на них гранулы формазана обнаружены на обеих

сторонах.

Вклад цитоплазматической и тилакоидных мембран в дегидрогеназную активность. В клетках, истощенных по эндогенным углеродным субстратам, можно оценить вклад цитоплазматической и тилакоидных мембран в общую дегидрогеназную активность. Анализ показал, что в клетках цианобактерий, выращенных в фотоавтотрофных условиях, интенсивность отложения формазана на ЦПМ значительно ниже, чем на тилакоидных мембранах. Особенно это характерно для Synechococcus sp., в некоторых клетках на ЦПМ вообще не удавалось обнаружить восстановление ТНСТ.

Таким образом, у всех изученных цианобактерий (облигатно- и факультативно фототрофных) при фотоавтотрофном способе существования основными местами дегидрогеназной активности являются тилакоидные мембраны. Роль ЦПМ в проявлении дегидрогеназной активности клеток связана с метаболическими особенностями культур. При фотоавтотрофном типе метаболизма дегидрогеназная активность ЦПМ значительно ниже, чем тилакоидных мембран.

1.2. Электронно -цитохимическое изучение субстратспецифической дегидрогеназной активности клеток

цианобактерий

У облигатно фототрофных цианобактерий интенсивность восстановления ТНСТ в наибольшей степени возрастала при введении в инкубационную среду глюкозы, что приводило к увеличению плотности отложения гранул формазана в основном на тилакоидных мембранах. У C.fritschii наиболее активное восстановление тетразолия происходило при добавлении сукцината. Особенностью клеток C.fritschii в этом случае было интенсивное отложение формазана во внутритилакоидных пространствах, а также на внутренних поверхностях набухших тилакоидных мембран.

Выявление субстратспецифической дегидрогеназной активности возможно только при использовании клеточной суспензии, предварительно истощенной по эндогенным углеродным субстратам, в присутствии экзогенного субстрата. Из литературы нам неизвестны попытки использования методов электронной цитохимии для выявления в клетках цианобактерий субстратспецифических дегидрогеназных активностей. Нами изучены дегидрогеназные активности клеток Synechococcus sp., A. variabilis и С. fritschii после предварительного истощения по эндогенным углеродным субстратам в ответ на введение в инкубационную смесь глюкозы или сукцината натрия. Выбор именно этих соединений связан с тем, что глюкоза является исходным, а сукцинат - промежуточным субстратом окислительного пентозофосфатного пути (ОПФП) и цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) соответственно. Известна роль ОПФП как основного катаболического пути в клетках цианобактерий (Stanier, 1977). Водород с двух НАДФ-зависимых дегидрогеназ этого пути переносится на мембранно-связанные НАДФНг-дегидрогеназы и далее по цепи дыхательных переносчиков на молекулярный кислород. ТНСТ акцептирует водород в основном с НАДФНг-дегидрогеназ, а также с

других переносчиков начального этапа дыхательной цепи до цитохрома b (Sexton, Hall, 1978). Таким образом, отложение формазана при введении глюкозы в инкубационную среду, содержащую истощенную суспензию цианобактерий, маркирует в основном локализацию на мембранах НАДФ Н2 - дегидрогеназ. Интенсивность отложения формазана служит общим показателем НАД(Ф)Н2-генерирующей системы дегидрогеназ в клетках цианобактерий и в первую очередь НАДФ-зависимых дегидрогеназ ОПФП.

В отличие от ОПФП, роль ЦТК в метаболизме цианобактерий менее ясна. По одним представлениям, в клетках цианобактерий ЦТК в «разорванном» виде не функционирует в системе клеточного катаболизма. Исключение составляют до сих пор не подтвержденные данные (Miller, Allen, 1972) о существовании у С. fritschii «замкнутого» ЦТК. В то же время данные, полученные на мембранных препаратах цианобактерий, свидетельствуют в пользу переноса водорода с сукцината в дыхательную цепь (Peschek, 1980).

При восстановлении ТНСТ образуется хромофор с максимумом поглощения в области 520-580 нм. О количестве откладываемого формазана судили по разностному спектру поглощения, полученному после вычитания из спектра поглощения при 480-600 нм опытного варианта (клеточная суспензия +ТНСТ±экзогенный субстрат) поглощения в этой же области клеточной суспензии без каких-либо добавок.

Влияние экзогенных источников углерода на уровень дегидрогеназной активности. Добавление глюкозы к клеточным суспензиям Synechococcus sp. и А. variabilis, подвергнутым предварительному истощению по эндогенным углеродным субстратам в течение 3 суток приводило к резкому повышению ферментативного восстановления ТНСТ. Уровни неферментативно образованного формазана в про-

Рис.З. Спектры поглощения формазана, восстановленного истощенными клеточными суспензиями Synechococcus sp. (а) и A.variabihs (б) за счет эндогенных углеродных субстратов (1), в присутствии глюкозы (2) или сукцината (3); неферментативное образование формазана истощенными клеточными суспензиями (4), после добавления глюкозы (5) или сукцината (6)

гретых суспензиях клеток составляли около 10—20% от общего количества восстановленного ТНСТ. Добавление сукцината натрия в незначительной степени приводило к повышению восстановления ТНСТ (A. variabilis) или не оказывало эффекта (Synechococcus sp.) (рис. 3).

Рис.4. Спектры поглощения формазана, восстановленного клеточными суспензиями C.fhtschii, истощенными по эндогенным углеродным субстратам в течение 10 (а) и 19 (6) суток. Остальные обозначения как на рис. 3.

Выявление у C.fritschii субстратспецифических дегидрогеназных активностей проводили с использованием культур, подвергнутых истощению по эндогенным углеродным субстратам в течение 10 и 19 суток. Уровень восстановления ТНСТ за счет эндогенных клеточных субстратов падает по мере истощения культуры. Уровень дегидрогеназной активности после добавления экзогенных субстратов у культуры, истощенной в течение 19 суток, в 2—3 раза выше, чем в клетках после 10-суточного истощения. В обоих случаях получены аналогичные результаты, хотя эффект от добавления экзогенных субстратов больше у культуры, подвергнутой более длительному истощению. Достигается он в основном не за счет возрастания стимулирующего эффекта добавления экзогенных субстратов, а в результате понижения уровня восстановления ТНСТ за счет эндогенных субстратов. В отличие от облигатно-фототрофных цианобактерий у С. ^^^н наиболее активное восстановление ТНСТ происходит при добавлении в реакционную смесь сукцината. Количество образованного формазана в этом случае заметно выше, чем в варианте с добавлением глюкозы (рис. 4). Обнаружение и оценка уровня специфических дегидрогеназных активностей в ответ на добавление экзогенных субстратов позволяет подойти к выяснению вопроса об их локализации на клеточных мембранах.

Влияние экзогенных источников углерода на локализацию дегидрогеназной активности. Истощение суспензии цианобактерий по эндогенным углеродным субстратам приводит к снижению активности восстановления ТНСТ, не меняет картины отложения в клетке продукта цитохимической реакции, но влияет на тонкую локализацию гранул формазана, вызывая его перераспределение в тилакоидных мембранах с изменениями деградативного типа.

I' - л. л..'

Ui_I_' 1*

о ш sto т л., ни

II_I_I_LL

При электронно-микроскопическом изучении вариантов с добавлением глюкозы к истощенным клеточным суспензиям Synechococcus sp. и A. variabilis обнаружено увеличение плотности отложения гранул формазана в основном на тилакоидных мембранах. На ЦПМ также происходило увеличение плотности осадка восстановленного ТНСТ, но в значительно меньшей степени (pnc.1). Аналогичные данные получены и для фотоавтотрофной культуры C.fritschii. Это позволило предположить, что у облигатно фототрофных цианобактерий и у фотоавтотрофной культуры C.fritschii водород с НАДФ-зависимых дегидрогеназ ОПФП поступает на - начальные звенья, дыхательной цепи, локализованные преимущественно на тилакоидных мембранах.

В опытах с добавлением глюкозы к истощенной хемогетеротрофной культуре С. fritschii практически во всех клетках наблюдалось отложение гранул формазана на мембранах трех типов и в фибриллярном слое чехла (рис. 2). Активность восстановления ТНСТ на тилакоидных и цитоплазматической мембранах примерно одинакова. На наружной мембране клеточной стенки и в фибриллярном слое чехла при сравнении вариантов с добавлением глюкозы и без нее не отмечено различий в интенсивности отложения формазана. Полученные данные указывают на то, что при осуществлении клетками цианобактерий метаболизма хемогетеротрофного типа НАДФН2-дегидрогеназная активность в равной степени связана с тилакоидными и цитоплазматической мембранами.

Добавление сукцината к истощенным клеточным суспензиям Synechococcus sp. и A.variabilis не меняло картины отложения формазана: оно было таким же, как за счет эндогенных субстратов. При инкубировании суспензии истощенных в течение 10 суток клеток C.fritschii с сукцинатом и ТНСТ отложение формазана наблюдали на трех видах мембран и в фибриллярном слое чехла. Отличительной особенностью таких клеток было интенсивное отложение гранул формазана во внутритилакоидных пространствах, а также на внутренних поверхностях набухших тилакоидных мембран. На ферментативную природу этих отложений указывает их отсутствие при проведении реакции с прогретой клеточной суспензией C.fritschii (рис.2). Относительно такой необычной локализации гранул формазана может быть высказано несколько предположений. Одно из них основано на возможности существования промежуточных переносчиков водорода с сукцината на ТНСТ. Известно, что сукцинатдегидрогеназа - фермент, локализованный на внутренней (обращенной к цитоплазме) поверхности ЦПМ (Miller, Allen, 1972), являющийся как компонентом ЦТК, так и компонентом дыхательной электронной цепи. По одним данным, водород с сукцинатдегидрогеназы прямо переносится на ТНСТ и, таким образом, формазан маркирует сукцинатдегидрогеназу на внутренней поверхности ЦПМ прокариотной клетки. По другим данным, в этом процессе участвуют промежуточные переносчики водорода. Тогда отложение гранул формазана будет отражать локализацию этих переносчиков. Если промежуточные переносчики не

связаны с мембраной, формазан будет откладываться вне мембраны. Можно предположить, что в процессе возрастания деструктивных изменений в мембране возрастает активность не связанных с ней промежуточных переносчиков водорода на пути сукцинатдетидрогеназа->ТНСТ. Полученные данные могут быть объяснены также существованием недостаточно прочной связи сукцинатдегидрогеназы с мембраной и ослаблением этой связи при деструктивных изменениях мембраны.

1.3. Электронно-микроскопическое определение суммарной дегидрогеназной активности в клетках хемогетеротрофной цианобактерии Chlorogloeopsis fritschii Данный раздел посвящен изучению локализации дегидрогеназной активности у C.fritschii в условиях, когда ее рост обеспечивается энергией, получаемой только в процессе дыхания. Активность эндогенного дыхания культуры в этот период поддерживается на уровне 30-40 нмоль О/мг сухой биомассы/ч. После перенесения на свет скорость выделения кислорода составляет 130-150 нмоль. О2/мг сухой биомассы/ч. При росте в темноте на среде с глюкозой клетки накапливают большое количество запасных веществ, маскирующих отложение формазана на мембранах. Для дальнейшей работы выбрана культура, подвергнутая 10-суточному истощению, клетки которой сохраняют интактность цитоплазмы и мембранных систем.

Локализация суммарной дегидрогеназной активности в клетках хемогетеротрофной культуры С. После 60-минутной темновой инкубации с ТНСТ все имеющиеся типы элементарных мембран в большинстве клеток были практически полностью покрыты осмиофильным осадком. В тех же препаратах встречались клетки, в которых можно было видеть участки тилакоидных и цитоплазматической мембран, свободные от образования на них продуктов восстановления ТНСТ, а также клетки с наблюдаемым отложением формазана только на поверхности наружной клеточной мембраны и в фибриллярном слое чехла. Ни в одном случае не обнаружена способность клеток к восстановлению ТНСТ на тилакоидных мембранах при отсутствии такового на ЦПМ и наоборот.

Формирование гранул формазана на тилакоидах, образованных плотно прилегающими мембранами, в большей степени происходит на их внешних поверхностях. Однако иногда гранулы формазана можно обнаружить в виде тонкослойных фрагментов и на внутренних сомкнутых поверхностях мембран. Особенно четко гранулы формазана выявляются на внутренних поверхностях тилакоидных мембран, когда последние набухают и расходятся, образуя внутритилакоидное пространство (рис. 2).

На наружной мембране наблюдали образование гранул формазана только на поверхности, обращенной к чехлу, причем плотность отложения почти не зависела от времени инкубации культуры с ТНСТ в изученном диапазоне (15-60 мин.).

На мембраноподобных фрагментах чехла формазан откладывался симметрично с обеих сторон. Независимо от длительности реакции с ТНСТ локализация гранул формазана происходит всегда на одних и тех же клеточных структурах. Для исключения маскировки образующегося формазана контрастирующими веществами часть препаратов не подвергали контрастированию цитратом свинца. Просмотр их в электронном микроскопе выявил те же места отложения формазана в клетках С. что и в основных опытах.

Рис.5. Восстановление ТНСТ суспензией клеток C.fntschii в разных условиях инкубирования, в течение 15 (1), 30 (2) и 60 (3) мин, прогретой суспензии - в течение 30 (4) и 60 (5) мин. На оси ординат отложена разность между поглощением в опытных вариантах и контроле без ТНСТ

Для выявления неферментативного отложения формазана реакцию с ТНСТ проводили, используя предварительно прогретую клеточную суспензию СЛг^сИИ. Выбранный режим прогревания приводил к полной потере клетками способности к фотосинтетическому выделению О2. В темноте скорость поглощения кислорода составляла 5-10 мкмоль/мг сухой биомассы/ч. В клетках, прогретой суспензии отложение гранул формазана практически не происходит на тилакоидных и цитоплазматической мембранах, но частично сохраняется на наружной мембране клеточной стенки и мембраноподобных фрагментах фибриллярного слоя чехла. Количественная характеристика ферментативного и неферментативного восстановления ТНСТ суспензией клеток С. ^^сИИ представлена на рис. 5. Таким образом, в клетках хемогетеротрофной культуры С. ^^сИИ, истощенной по эндогенным углеродным субстратам, отложение гранул формазана происходит на мембранах трех типов (тилакоидных, цитоплазматической и наружной), а также на мембраноподобных фрагментах, локализованных в фибриллярном слое чехла. Термочувствительность процесса, приводящего к образованию формазана на тилакоидных и цитоплазматических мембранах, указывает на его ферментативную природу. Сходство в способности восстанавливать ТНСТ тилакоидными и цитоплазматической мембранами в клетках хемогетеротрофной культуры С. ^^сИИ не дает оснований для вывода о существовании между ними в этих условиях функциональных различий в отношении дегидрогеназной активности, связанной с дыхательной электронтранспортной цепью. Образование гранул формазана на наружной мембране клеточной стенки и мембраноподобных фрагментах, локализованных в чехле, имеет явно выраженный неферментативный характер, на

что указывает низкая чувствительность процесса к воздействию высокими температурами. Мембраноподобные фрагменты, обнаруженные в чехле, вероятно, имеют ту же природу, что и наружная мембрана клеточной стенки. Глава 2. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОДУКТА ОКИСЛЕНИЯ ДАБ В КЛЕТКАХ

ЦИАНОБАКТЕРИЙ 2.1. Окисление ДАБ клетками, различающимися способами

получения энергии О локализации и активности связанных с мембраной конечных участков электронтранспортной цепи и компонентов электронного транспорта судили по окислению 3,3'-диаминобензидина (ДАБ, «Сигма», США) гемопротеидами, в том числе цитохромами типа с, приводящему к образованию электронноплотного осмиофильного полимера (Ковальский, 1978; Селях и др., 1990).

Окисление ДАБ клетками, различающимися способами получения энергии. Продукт реакции во всех случаях откладывался только на тилакоидных мембранах. В клетках облигатно-фототрофных видов (Synechococcus sp., A.variabilis) окисление ДАБ сопровождалось видимым образованием осадка и происходило только на свету. Ни в одном случае в клетках этих цианобактерий не обнаружено отложения продукта реакции в темноте даже после инкубирования в течение 4 - 6 часов. Клетки фотоавтотрофной культуры C.fritschii также не обладали способностью окислять ДАБ в темноте. После перенесения на свет проб, выдержанных в течение длительного времени в темноте, уже через несколько минут можно было наблюдать потемнение суспензии клеток, свидетельствующее о прохождении реакции (рис. 6).

В клетках хемогетеротрофной культуры C.fritschii отложение окисленного ДАБ на тилакоидных мембранах происходило не только на свету, но и в темноте. При проведении реакции на свету первые признаки ее можно наблюдать визуально уже через 5-10 мин., в темноте - через 30-40 мин. Продление инкубирования на свету и в темноте приводило к увеличению поверхности мембран с отложенным на них продуктом реакции, а также к повышению плотности образующегося осадка.

Локализация окисленного ДАБ на тилакоидных мембранах цианобактерий. В клетках всех изученных цианобактерий продукт реакции откладывался на внутренних поверхностях тилакоидных мембран (рис. 6), что согласуется с имеющимися литературными данными (_аигШэ е1 а1., 1975; РевеИек е1 а!., 1983). Для Synechococcus ер. и A.variabilis характерно, что мембраны тилакоидов плотно прилегают друг к другу, сливаясь своими внутренними сторонами. В культурах C.fritschii, выращенных на свету и в темноте, клетки содержат тилакоиды различной структуры: образованные плотно прилегающими друг к другу фотосинтетическими мембранами и имеющие внутритилакоидные пространства. Отличительной чертой клеток С. fritschii, особенно выращенных хемогетеротрофно, является наиболее интенсивное отложение окисленного ДАБ на внутренних

Контроль(-ДАВ)

Рис.6 Окисление ДАБ фототрофными клетками $упесЬососси& ар (1), А vanabllls (2) и С МзсНп (3). Обозначения - см рис 2

поверхностях тилакоидных мембран, образующих внутритилакоидные «вакуоли». Часто продукт реакции накапливается и в «вакуолярном» пространстве аналогично отложению гранул формазана при восстановлении ТНСТ в ответ на добавление сукцината. В таких клетках на внутренних сомкнутых поверхностях тилакоидных мембран активность окисления ДАБ слабая.

Наблюдаемое окисление ДАБ в клетках цианобактерий - результат нескольких реакций взаимодействия ДАБ с гемопротеинами (компоненты фотосинтетической и дыхательной электрон-транспортной цепи, ферменты, катализирующие разложение перекиси водорода). Поэтому не исключено, что к окислению ДАБ в местах деструктивных изменений тилакоидных мембран и на внутренних сомкнутых поверхностях могут вести процессы разной ферментативной природы. Полученные результаты показали также, что окисление ДАБ в клетках различных цианобактерий связано только с тилакоидными мембранами. Ни в одном случае не удалось обнаружить отложение продукта реакции на ЦПМ. Отсутствие в ЦПМ компонентов, способных взаимодействовать с ДАБ, по полученным результатам, является ее стабильным свойством в отличие от обнаруженной способности к проявлению дегидрогеназной активности. Таким образом, в отношении компонентов, взаимодействующих с ДАБ, тилакоидные и цитоплазматическая мембраны обнаруживают четкую дифференцированность.

2.2. Природа акцепторов, взаимодействующее ДАБвклетках

цианобактерий

Цель данного раздела работы - выяснение природы реакций, приводящих к отложению окисленного ДАБ на свету и в темноте на тилакоидных мембранах цианобактерий, различающихся морфологическими и физиолого-биохимическими особенностями.

Выявление пероксидазной активности. Для оценки возможного вклада пероксидазной активности клеток цианобактерий в наблюдаемое ферментативное окисление ДАБ цитохимическую реакцию проводили в темноте с предварительным выдерживанием клеточной суспензии в присутствии 5,9 мМ Н2О2 или 9,2 мМ каталазы. В первом случае добавление субстрата пероксидазной активности стимулирует окисление ДАБ, во втором - быстрое разложение эндогенной перекиси водорода каталазой сводит активность реакции к минимуму.

Ранее было отмечено (Laurftis et al., 1975), что эффект, оказываемый перекисью водорода на окисление ДАБ, зависит от ее концентрации: в концентрации 5,9-17,5 мМ Н2О2 стимулирует окисление ДАБ, в более высоких (220-440 мМ) -подавляет.

В клетках A variabilis видимого продукта реакции в этих условиях (темнота, Н2О2) не обнаружено; у Synechococcus sp. наблюдали слабое окисление ДАБ. Продукт реакции откладывался на внутренних сомкнутых поверхностях тилакоидных мембран. В клетках С. fritschii значительная часть окисленного ДАБ сконцентрирована в периферической зоне цитоплазмы, примыкающей к ЦПМ, и

имеет вид отдельных осмиофильных гранул. Иногда продукт реакции выявляется в виде коротких осмиофильных полос в периплазматическом пространстве. В отдельных клетках продукт реакции обнаруживается в чехле. Во всех случаях в клетках присутствуют слабые отложения окисленного ДАБ на внутренних сомкнутых поверхностях тилакоидных мембран и интенсивные - на поверхности внутритилакоидных «вакуолей».

Проведение цитохимической реакции на свету в присутствии каталазы приводило у Synechococcus sp. к полному, а у A. variabilis частичному ингибированию окисления ДАБ. В клетках хемогетеротрофной культуры С. fritschii окисление ДАБ происходило как на свету, так и в темноте, при этом продукт реакции был связан с тилакоидными мембранами.

Таким образом, отложение окисленного ДАБ в темноте в клетках изученных цианобактерий, инкубированных предварительно с Н2О2, вероятно, отражает индуцированную этим субстратом пероксидазную активность. В клетках Synechococcus sp. она связана с тилакоидными мембранами, а у C.fritschii в основном находится в растворимой форме и локализована в зоне цитоплазмы, примыкающей к ЦПМ. Подавление каталазой пероксидазной активности позволяет заключить, что в клетках Synechococcus sp. окисление ДАБ исключительно, а у A.variabilis в основном связано с пероксидазной активностью. У хемогетеротрофной культуры C.fritschii окисление ДАБ на свету и в темноте, локализованное на тилакоидных мембранах, связано преимущественно с его взаимодействием с компонентами электронного транспорта.

Взаимодействие ДАБ с компонентами электронного транспорта. По имеющимся данным, ДАБ может быть донором электронов для различных компонентов фотосинтетической электронтранспортной цепи, связанной с I (Chua, 1972; Yokomura, 1982) или II (Lauritis et al., 1975) фотосистемами. Авторы не исключают и возможности того, что компоненты, относящиеся к обеим фотосистемам, одновременно могут участвовать в окислении ДАБ.

Для идентификации места взаимодействия ДАБ с компонентами фотосинтетической электрон-транспортной цепи было изучено влияние 3-(3,4-дихлорфенил)-1-1'-диметилмочевины (ДХММ) на окисление ДАБ. Преинкубация клеток облигатно фототрофных цианобактерий (A. variabilis и Synechococcus sp.) с 2 мМ ДХММ в течение 30 мин приводила к значительному, но неполному подавлению окисления ДАБ на свету, что позволяет сделать вывод о преимущественной связи окисления ДАБ со II ФС. Добавление ДХММ к суспензии клеток хемогетеротрофной культуры С. fritschii, напротив, стимулировало окисление ДАБ на свету, что, вероятно, обусловлено связью этой реакции с активностью I ФС. Отложение продукта реакции в этом случае наблюдали только на тилакоидных мембранах. Сопоставление данных, полученных в опытах с использованием Н2О2 и каталазы, с результатами, полученными при использовании ДХММ, позволяет заключать, что у

облигатных фототрофов пероксидазная активность, ответственная за окисление ДАБ, связана с образованием эндогенной Н2О2 в основном при функционировании ФСИ, а окисление ДАБ собственно компонентами фотосинтетического электронного транспорта происходит на уровне ФС1.

Темновое окисление ДАБ, чувствительное к цианиду, может указывать на его взаимодействие с компонентами дыхательного электронного транспорта. Преинкубация в течение 0,5-1,0 часа клеточных суспензий цианобактерий с 0,1 М КОЫ и последующее проведение на свету реакции с ДАБ выявили у облигатных фототрофов частичное ингибирование окисления ДАБ, а в клетках хемогетеротрофной культуры - полное ингибирование реакции как на

свету, так и в темноте. Ни в одном случае не обнаружены клетки с отложением на мембранах продукта реакции. Ингибирование окисления ДАБ в темноте указывает на возможность взаимодействия последнего с компонентами дыхательного электронного транспорта. Наблюдаемое подавление реакции на свету, возможно, объясняется ингибирующим действием КОЫ на пластоцианин — медьсодержащий переносчик фотосинтетической цепи. Таким образом, у изученных цианобактерий оказалось возможным разделить отложение окисленного ДАБ на тилакоидных мембранах, являющееся результатом пероксидазной активности или взаимодействия с цитохромами.

В настоящее время мы не можем с определенностью ответить на вопрос, взаимодействует ли ДАБ на свету или в темноте с одними и теми же или разными цитохромами. По данным биохимического анализа, у цианобактерий большинство компонентов фотосинтетического и дыхательного электронного транспорта являются общими для обоих путей. В то же время получены данные о том, что фотосинтетические и дыхательные электрон-транспортные цепи могут быть локализованы в разных областях одной мембраны и, следовательно, не имеют общих переносчиков.

Глава 3. ДЕЙСТВИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА МЕМБРАННЫЙ АППАРАТ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

Морфология мембранной системы цианобактерий родоспецифична и консервативна (Пиневич, 1986). Тилакоиды расположены в цитоплазме более или менее равномерно и не образуют фан. Важнейшим фактором, влияющим на фотосинтетический аппарат цианобактерий является свет. Даже кратковременное его отсутствие вызывает реорганизацию пигмент-белковых комплексов ФСН у облигатно фототрофных видов. Длительное пребывание в темноте изменяет липидный состав и морфологию тилакоидов. Одновременно происходит общая редукция фотосинтетического аппарата, связанная с уменьшением количества тилакоидов и фикобилисом. Отсутствие света при наличии экзогенных субстратов обеспечивает рост факультативно хемогетеротрофных штаммов, например Анализ пигментов показывает, что в темноте повышается количество

хлорофилла и каротиноидов, но уменьшается количество фикобилипротеинов. Система тилакоидов при этом не редуцируется. В отличие от хлоропластов, синтез хлорофилла у цианобактерий не требует света (Ohad, Drews, 1982). Биогенез фотосинтетического аппарата может осуществляться в темноте, однако без фотоконтроля нарушается его регуляция. В литературе имеются данные, что биогенез тилакоидов осуществляется без участия ЦПМ. Система тилакоидных мембран образуется конститутивно, и без необратимого нарушения жизнеспособности цианобактерий не могут быть полностью этиолированы (Пиневич, 1986).

При азотном голодании у цианобактерий изменяется морфология тилакоидов: они утолщаются, укорачиваются, изменяется их количество и сорасположение в клетке. При восполнении дефицита азота происходит восстановление тилакоидных мембран в первоначальное состояние.

Физиологические отклики микроводорослей и цианобактерий по степени токсического действия тяжелых металлов можно расположить в такой последовательности: деление - рост - функции клеточных мембран - фотосинтез -дыхание. Исследованные нами культуры проявляют адаптационные способности и большую устойчивость к действию ионов цинка, возрастающую в ряду A.nidulans-A.variabilis-C.fritschit-N.muscorum. Различия проявляются в неодинаковой скорости отклика культур на действие ионов цинка, а также видовом составе мембран, реагирующих на действие металла. Наиболее уязвимы клетки, лишенные внешних защитных приспособлений в виде слизистых чехлов. Наиболее лабильными показателями являются: изменения формы и объема клеток в 1,5-2 раза за счет варьирования толщины и нарушения целостности пептидогликанового слоя; расхождение тилакоидных мембран с образованием внутритилакоидных пространств; накопление полифосфатных и липидных гранул.

Следует отметить, что действие ионов цинка в концентрации выше 1000 мкг/л можно назвать пороговым для исследуемой культуры Anidulans. В широком плане под таким действием мы понимаем ингибирующее влияние вещества, превышение которого приводит к необратимым изменениям в структуре и функционировании сообщества или экосистемы. Предел устойчивости выбранного тест-объекта определяется в этом случае по такому состоянию, когда происшедшие с ним изменения еще имеют обратимый характер. При концентрации ионов Zn в среде 2000 мкг/л клетки погибают и культура лизируется.

Полученные результаты позволяют заключить, что облигатно фотоавтотрофная культура цианобактерий A.nidulans проявляет высокую чувствительность к действию цинка и обладает быстрыми физиологическими откликами. Содержание ионов Zn 1000 мкг/л соответствует нижнему концентрационному пределу влияния этого металла на эукариотные водоросли и вызывает значительные изменения в клетках. Наиболее чувствительными тест-

параметрами можно считать изменение формы и размера клеток; изменения в общем содержании пигментов, приводящие к усилению каротиногенеза и подавлению роста культуры и проявляющиеся в нарушении структуры и функционирования всех видов клеточных мембран (Савельев, Селях, 2000; Егоров и др.,2001).

Мутантные клетки цианобактерий, описанные в литературе, в большинстве случаев сходны по своим морфологическим признакам с клетками дикого типа, и только небольшая их часть имеет морфоструктурные изменения мембранного аппарата. В первую очередь к ним относятся пигментные мутанты с пониженным содержанием хлорофилла и числа тилакоидов. В отдельных случаях показано нарушение как структуры, так и функции тилакоидных мембран, их расположения в клетке. Первичные нарушения на уровне плазмалеммы и тилакоидов отмечены для цианобактерии с мутациями по пермеазам Сахаров и аминокислот, переносчикам неорганического азота и углерода, а также по синтезу пептидогликана и клеточному делению (Негс1тап, 1982).

Нами описана ультраструктура регуляторных мутантов азотфиксирующей цианобактерии A.vahabШs АТСС 29413 - продуцентов биологически активных веществ. Отличием исследованных мутантов от клеток исходного типа является увеличение размеров клеток, уменьшение в них количества резервных веществ, а также изменение длины трихомов. Наиболее значительные ультраструктурные перестройки наблюдаются в поздней логарифмической фазе у мутантов, обладающих множественной устойчивостью к аналогам аминокислот, и заключаются в изменении формы клеток, нарушении процесса деления и толщины пептидогликанового слоя клеточной стенки при сохранении интактности фотосинтетического аппарата. Предполагается, что наблюдаемые морфоструктурные изменения не являются прямым результатом действия мутаций, а вызваны нарушениями общего метаболизма клеток, в том числе пути биосинтеза ароматических аминокислот (Селях и др., 1986).

Особый интерес, на наш взгляд, представляют изменения в строении клеточной стенки, наблюдаемые нами у одного из сверхпродуцентов аминокислот и ауксина (ФФ-19) и совпадающие по времени с секрецией биологически активных веществ. Клетки этого мутанта в поздней логарифмической фазе утрачивают ригидность клеточной стенки. У них частично или полностью исчезает пептидогликановый слой, появляются 1_-подобные формы, содержание которых может достигать в популяции 60%. При этом не происходит деструкции клеточного содержимого. Напротив, плотность цитоплазмы, состояние тилакоидов, обилие рибосом свидетельствуют, что клетки активно функционируют. Эти изменения в строении клеточной стенки совпадают по времени с максимальной секрецией аминокислот и фитогормона ауксина и сопровождаются значительным подкислением среды. Такие же ультраструктурные изменения мы наблюдали у

мутанта C.fritschii, отобранного по устойчивости к аналогу триптофана и секретирующего, также как ФФ-19, большое количество фенилаланина.

Исследование мутантных штаммов цианобактерий, выращенных на среде с добавлением триптофана и ауксина, показало, что в первом случае удлиняется лаг-период, клетки длительное время остаются активно функционирующими, делящимися, при этом ни в одном случае не отмечены ультраструктурные нарушения мембранных систем клеток. Добавление ауксина не влияет на рост и развитие исследованных штаммов. Общим отличием исследованных мутантов от клеток дикого типа является необратимое увеличение размеров клеток и уменьшение в них количества резервных веществ.

Рис.7. Схема переходов типов питания у факультативно хемогетеротрофной цианобактерий

Как свидетельствуют данные литературы и собственные эксперименты, изменения, происходящие в клетках цианобактерий, затрагивают в основном внешние структуры: форму и размер клеток, длину трихомов, структуру клеточной стенки (наличие или отсутствие пептидогликанового слоя) и, в меньшей степени, касаются внутриклеточных мембран, участвующих в обеспечении клетки энергией. По-видимому, с этим связана уникальная способность цианобактерий адаптироваться к экстремальным внешним условиям. Факультативно гетеротрофные цианобактерий, например C.fritschii, способны достаточно легко переходить с одного типа питания на другой в зависимости от экологических или созданных в лаборатории условий (рис.7). При росте в темноте в присутствии Сахаров изменяется морфология тилакоидов: они не образуют параллельных рядов, а изгибаются во всех направлениях. Клетки накапливают большое количество запасных веществ. При перенесении культуры на свет тилакоиды принимают форму и организацию, свойственные автотрофным клеткам C.fritschii.

Несмотря на то, что ЦПМ и тилакоидные мембраны цианобактерий являются мембранами разного типа, они не способны к кардинальным структурным перестройкам. Все изменения, происходящие с ними под действием внешних факторов, приводят либо к гибели клеток, если перейден предел диапазона толерантности, либо к возврату в исходное состояние при прекращении действия индуктора. На свойстве лабильности мембранных систем основано использование некоторых видов цианобактерий для индикации состояния природной среды.

фотоавтотрофия

хемогетеротрофия

ииксотрофия

C.fritschii.

КРАСНЫЕ ПРИМИТИВНЫЕ МИКРОВОДОРОСЛИ

Микроводоросли класса Cyanidiophyceae - одноклеточные термоацидофильные эукариоты, обитающие в кислых серных источниках и вулканических кальдерах при рН 0,5-3,0 и 25°-56°С. Они занимают особое место в систематике водорослей, так как объединяют в себе отдельные признаки синезеленых, зеленых и красных водорослей, а также ряд присущих только им особенностей. Многие авторы относят эти организмы к реликтовым формам, связанным с переходным этапом в эволюции низших фототрофов. Способность обитать в горячих кислых источниках следует считать уникальной среди фотосинтезирующих эукариот (Seckbach, 1999).

Таксономическое положение Cyanidiophyceae дискутируется уже в течение нескольких десятилетий (Ott, Seckbach, 1994). В литературе эти водоросли помещали в различные таксоны: Cyanophyta (Seckbach, 1994), Chlorophyta (Allen, 1959), Cryptophyta (Lewin, 1961), Glaucophyta (Kremer, 1982), Rhodophyta (Seckbach, 1972, 1983). Одно время виды Cyanidiophyceae относили к новому таксону Prerhodophyta (Seckbach et al., 1994), а с 1995 г. помещают среди низших Rhodophyta. Долгое время все эти водоросли ошибочно объединяли под одним названием Cyanidium caldarium (Tilden) Geitler. В настоящее время выделяют три различных, но родственных рода класса Cyanidiophyceae; Galdieria, Cyanidium и Cyanidioschyzon. Клетки последнего отличаются наименьшими размерами, составляют минорный компонент природных популяций, имеют тонкую клеточную стенку, практически невидимую даже при исследовании в электронном микроскопе. Для похожих морфологически и часто обнаруживаемых в природе в смешанных популяциях представителей родов Galdieria и Cyanidium было предпринято несколько попыток уточнения их таксономического положения (Merola et al., 1981; Seckbach, 1994; Sentsova, 1994; Gross, 1999). В качестве критериев для разделения видов Galdieria и Cyanidium предложены три основные характеристики: способность к гетеротрофному росту, исследование состава жирных кислот и поглощение нитратов (Gross, 1999). Четко установлено, что Galdieria отличается от Cyanidium только одной особенностью: Galdieria способна расти авто- и гетеротрофно, в то время как Cyanidium относится к облигатным автотрофам.

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ СМЕШАННЫХ КУЛЬТУР CYANIDIOPHYCEAE 4.1. Мембранные структурыклетокС. caldarium

В работах 80-х годов исследователи выделяли две формы C.caldarium. Подробное описание культивирования и ультраструктурной организации этих водорослей дано в работах Селях и др. (1981, 1984). В настоящем разделе обсуждаются материалы этих исследований, не утратившие своего значения, несмотря на принятую новую классификацию. Однако, необходимо принять во внимание, что с позиций вышеупомянутой современной классификации, данные, рассматриваемые в разделах 4.1.-4.3., относятся к смешанной культуре {C.caldarium

- Galdieria sp.) в случае фотоавтотрофных условий и к культурам различных видов рода Galdieria при миксотрофных и хемогетеротрофных условиях.

Известно, насколько важен выбор фиксатора при исследовании структуры клетки с помощью электронной микроскопии. Многие авторы, изучавшие С. caldarium, использовали в качестве фиксатора КМпО4, рекомендованный в соответствующих руководствах для исследования мембранных систем клетки, и испытывали неудачу при применении OSO4. Поэтому в последнее время находит применение так называемая двойная фиксация, в том числе и по отношению к С. caldarium с использованием глутарового альдегида и постфиксацией КМпО4 или OsC4 Имеющиеся в литературе данные относительно внутрицитоплазматических мембран в клетках C.caldarium противоречивы. По наблюдениям ряда авторов (Castaldo, 1967) в цитоплазме C.caldarium можно видеть парные мембраны, соответствующие эндоплазматическому ретикулуму (ЭПР) других эукариотных клеток, но в отличие от последних внутрицитоплазматическая мембранная система C.caldarium развита очень слабо. Клейн и Кронквист (1967) считали, что у C.caldarium ЭПР отсутствует. Аппарат Гольджи (диктиосомы) обнаружить не удавалось (Тоуата, 1980).

Поскольку особое внимание было уделено изучению мембранного аппарата C.caldarium, мы остановились на двух из 11 опробованных способах (Селях и др., 1981), обеспечивающих наилучшую сохранность клеточных структур и хорошее разрешение мембранных систем. Следует отметить, что фиксация водным 3% КМпО4 ранее не была использована для исследования ультраструктуры С. caldarium, а лишь для выявления аппарата Гольджи и других цитоплазматических структур в клетках ткани млекопитающих. Используя этот метод нам удалось в клетках C.caldarium четко выявить мембраны ЭПР и диктиосомы в количестве от 1 до 3 в плоскости среза. ЭПР C.caldarium представлен одним или двумя каналами толщиной 15-20 нм, расположенными в цитоплазме, как правило, по периферии клетки. Особой приуроченности к хлоропласту или ядру, как это описано для ряда эукариотных водорослей (Седова, 1977), в данном случае не отмечено. Аппарат Гольджи C.caldarium, состоящий из 3-6 дисков толщиной в среднем 20 нм и отшнуровывающихся от них пузырьков, располагается, как правило, вблизи клеточной стенки. Это может свидетельствовать о большей примитивности С. caldarium по сравнению с высшими формами красных водорослей, у которых диктиосомы располагаются вблизи митохондрий, образуя митохондриально-диктиосомный комплекс. В остальном аппарат Гольджи C.caldarium сравним с диктиосомами других водорослей, грибов и высших растений.

Использованные в работе способы фиксации позволили достаточно полно описать ультраструктурную организацию клеток С. caldarium, подтвердить отмеченные ранее в литературе особенности строения этой водоросли:наличие одного чашевидного хлоропласта, окруженного одинарной мембраной, одной

извитой или разветвленной митохондрии, дающей на срезе несколько сечений. В дальнейшем тексте мы их будем называть митохондриями без дополнительных оговорок. Кроме того, выявлены некоторые детали ультраструктуры этих водорослей, не описанные ранее - аппарат Гольджи, ядерные поры, ветвление тилакоидов.

4.2. ОсобенностиультраструктурыклетокС. caldarium на разныхстадияхроста периодической культуры

Ультраструктура клеток в значительной степени определяется стадией роста микроорганизмов при культивировании в периодическом режиме. Специального изучения строения клеток С. са!Сапит в зависимости от способа культивирования в периодическом режиме на разных стадиях роста ранее не проводили.

Длительность логарифмической фазы, независимо от условий выращивания, составляет около 2 суток (рис. 8). Этот период, как показано на рис 9, характеризуется резким увеличением средних размеров клеток, уменьшающихся с началом размножения водоросли

Рис.8 Рис.9.

Рост С caldanum в условиях фотоавто- Средний диаметр клеток С caldanum в лаг-(/), миксо- (2) и хемогетеротрофного (3) фазе и в фазе роста в условиях фотоавто- (1), культивирования миксо- (2) и хемогетеротрофного (3)

культивирования

Обнаружено, что клетки С. caldanum в этой фазе роста характеризуются принципиально одинаковой ультраструктурой независимо от способа культивирования водоросли, хотя они находятся в разных условиях, предопределяющих функционирование специфических (фотоавто- и хемогетеро-) или смешанных (миксотрофных) путей метаболизма Логарифмическую фазу в этом плане можно рассматривать как период, в котором закладываются основы будущей клеточной ультраструктурной специализации. Для таких клеток характерно наличие одной большой или нескольких более мелких вакуолей, заполненных электронно-плотным содержимым; большое лопастное ядро с хорошо видными порами и ядрышком; хлоропласт с немногочисленными, редко расположенными в матриксе тилакоидами и характерной для последних «изогнутой» мембраной; митохондрии, как правило, мелкие, округлые или овальные (больше четырех в плоскости среза). В

цитоплазме много беспорядочно расположенных внутрицитоплазматических мембран (диктиосом, цистерн эндоплазматического ретикулума и др.), встречаются немногочисленные гранулы запасных веществ. Клеточная стенка гомогенна по своей структуре; к ней плотно прилегает или несколько отстает плазмалемма. Выявление в клетках С. caldahum, находящихся в лаг-фазе, увеличенного числа митохондрий, развитой системы внутрицитоплазматических мембран и электронно-плотных вакуолей может служить указанием на их активное метаболическое состояние. Основным источником энергии в этот период, вероятно, является процесс дыхания, на что указывает обнаружение в клетках миксотрофных культур множества митохондрий в сочетании с хлоропластом деградативного типа. Известно, что наличие логарифмической фазы обусловлено реорганизацией, происходящей в клетке, попавшей в новые условия (Перт,1978). Последнее связано с «обновлением» структур и ферментного аппарата клетки, сопровождающимся активным синтезом и распадом основных клеточных макромолекул, кроме ДНК.

Интересно отметить, что клетки миксотрофной культуры, способные к одновременному осуществлению нескольких путей энергетического и конструктивного метаболизма, в начале фазы роста ультраструктурно (по степени развития и организации хлоропласта и митохондрий) ближе к клеткам фотоавтотрофной культуры, в то время как позднее отмечается тенденция к деградации хлоропласта и развитию митохондрий, что сопровождается общим увеличением поверхности митохондриальных мембран. Для более поздней стадии роста характерно также увеличение объема вакуолей и запасных веществ в цитоплазме.

В разных условиях культивирования водоросли, но чаще в культурах с гетеротрофным типом питания, в процессе роста встречаются клетки без клеточной стенки, ограниченные одной лишь плазмалеммой. Такие протопластоподобные формы ультраструктурно сходны с типичными клетками популяции. В культурах наблюдали два типа клеток. Для первого из них характерно наличие одной большой вакуоли, оттесняющей клеточные органеллы на периферию, и малое число митохондрий. Для второго типа присутствие вакуолей не являлось обязательным, в то время как число митохондрий на клетку увеличивалось в отдельных случаях до 20. Вопрос о природе и жизнеспособности такого рода клеток требует специального изучения. Переход в стационарную фазу сопровождается дальнейшим быстрым накоплением в клетке ультраструктурных изменений деградативной природы.

Таким образом, для клеток водорослей в разных условиях культивирования деградационные процессы имеют однотипный характер, проявляющийся для мембранных систем в потере ими упорядоченности расположения (хлоропласт), набухании и расхождении мембран, их вакуолизации с постепенным увеличением внутритилакоидного пространства и фрагментации. Это характерно для всех типов

мембран (фотосинтетических, хлоропластных, ядерных, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума). Четко проявляется тенденция к увеличению общего объема вакуолей в клетке, хотя здесь следует отметить, что вакуоли, заполненные электронно-плотным гранулярным содержимым, на всем протяжении роста культуры в большей мере развиты в клетках с гетеротрофным типом питания. Описанные в работе изменения ультраструктуры клеток С. caldarium в разных условиях культивирования можно рассматривать также как доказательство в пользу общих принципов деградации микроорганизмов в периодической культуре. Полученные результаты в этом плане хорошо согласуются с данными работ по изучению деградации цианобактерий в сходных условиях культивирования.

4.3. Влияние кислотности среды на рост, пигментный состав и ультраструктуру С. caldarium Все исследователи сходятся на том, что оптимальные условия для роста C.caldarium находятся в области низких рН среды. В природной водной среде водоросль обитает в диапазоне рН 1,8-4,0, в почвах - 0,5-5,0 (Doemel, Brock, 1971). Один из штаммов был выделен из источника, содержащего 0,1 н H2SO4, а в лабораторной культуре водоросль росла в среде, содержащей 1 н (Allen,

1952). Неспособность водоросли к росту в нейтральной и слабокислой среде, сочетающаяся с активным ростом в сильнокислых условиях, позволяет сделать вывод об облигатно ацидофильной природе С. caldarium.

Эксперименты показали, что оптимальные условия для роста водоросли приурочены к низким значениям рН среды и не зависят от типа осуществляемого ею конструктивного и энергетического метаболизма (рис.10). Скорости роста культур в фото- и хемогетеротрофных условиях практически постоянны в

Рис.10.

Скорость роста фотоавто-(1), хемогетеро-(2) и миксотрофной (3) культур C.caldarium в зависимости от рН среды.

ДШ

области (рН>3), позволяет предположить, что факторы, определяющие реакцию организма на кислотность среды, в этом случае не зависят от источника углерода и энергии.

Изучение пигментного состава C.caldahum в зависимости от способа существования (фотоавто- и миксотрофия) и кислотности среды показало, что в оптимальной для водоросли области рН характер конструктивного метаболизма в значительной степени определяет содержание пигментов в клетках водоросли. Клетки миксотрофной культуры содержат в 2,5-5,0 раз меньше фикоцианина, в 2-3 раза меньше хлорофилла и в 1,5-2,0 раза меньше каротиноидов сравнительно с фотоавтотрофной культурой (рис. 11).

При анализе пигментного состава миксотрофной культуры в области падения роста в сильнокислой зоне обнаружено уменьшение количества всех фотосинтетических пигментов и в первую очередь фикоцианина и хлорофилла. При содержании в среде 2 н культура по пигментным характеристикам

приближается к хемогетеротрофной, а при повышении концентрации кислоты до Зн содержание фотосинтетических пигментов в клетках фотогетеротрофной культуры становится равным таковому клеток темновой культуры.

Рис.11. Пигментный состав С. caldarium в разных условиях культивирования (% от контроля):

х - хлорофилл а; к - каротиноиды; ф - фикоцианин. а - свет+глюкоза, рН 3,0; б- 1н НгБО*; в - 2н Нгв04;

г - темнота+глкжоза, рН 3,0.

Наоборот, при изучении пигментного состава клеток фотоавтотрофной культуры, инкубированных в течение 1-2 суток в среде при рН 5,0-7,0, в которой рост водоросли по неизвестным причинам невозможен, обнаружена стабильность пигментного состава и его сходство с таковым при рН 3,0.

Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что С. caldarium может существовать в условиях крайне высокой кислотности среды, только переключаясь на метаболизм хемогетеротроФного типа, так как повышение кислотности среды при культивировании на свету приводит к подавлению синтеза всех фотосинтетических пигментов. В противоположность этому отсутствие роста при рН выше 5,0 не связано с заметными нарушениями пигментного аппарата и не зависит от типа конструктивного и энергетического метаболизма водоросли.

Переключение с фототрофного на хемотрофный способ существования,

рассматриваемое как адаптация водоросли к высокой кислотности среды, связано со значительной перестройкой ультраструктурной организации клетки и, прежде всего энергопреобразующих органелл и клеточной стенки (рис. 12).

Рис.12. Фрагменты ультраструктуры С.саМапит Рост в присутствии 1н НгЭО«

Хлоропласты претерпевают явно выраженные деградационные изменения, проявляющиеся в нарушении упорядоченности, уменьшении числа и размеров, расположения тилакоидов, их набухании. Это компенсируется значительным увеличением числа митохондрий в клетке по сравнению с фотосинтезирующей культурой, имеющей типичное для водоросли строение. Изучение клеточной популяции, выросшей в темноте в среде с выявило фракцию клеток,

имеющих черты строения, сходные с таковыми клеток хемогетеротрофной культуры, выросшей в оптимальных для Оyanidium саШапит условиях кислотности среды (рН 3,0). Особенностью таких клеток является нарушение гомогенности строения клеточной стенки, появление в ней электронно-прозрачных каналов. Основную массу популяции составляют клетки с глубокими деградационными нарушениями цитоплазмы, окружённые плазмалеммой и фрагментарно сохранившейся клеточной стенкой.

Таким образом, вероятной причиной ограничивающей рост водоросли при высокой кислотности среды в этих условиях, являются не только подавление синтеза пигментов, но и изменения в строении клеточной стенки, приводящие к нарушению ее проницаемости и сдвигу нейтрального внутриклеточного рН в кислую сторону.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ МОНОКУЛЬТУР CYANIDIOPHYCEAE

5.1.Хромосомные числа и содержание ядернойДНКу микроводорослей родов Cyanidium и Galdieria

Хромосомный набор является одной из основных характеристик, позволяющих идентифицировать виды. Вместе с тем, число хромосом известно не более чем у 1-1,5% высших растений и 5% водорослей. Красные термофильные

микроводоросли класса Cyanidiophyceae остаются практически неизученными, а таксономия данного класса базируется только на морфологических признаках.

Проведенное кариологическое исследование вышеназванных водорослей наряду с количественным определением их ядерной ДНК вызваны недостаточностью существующих критериев для различения этих таксономических групп.

В работе изучены водоросли C.caldarium штамм Р-511, Gaidieria maxima штамм Р-507, Gaidieria partita штамм Р-500 и Gaidieria sulphuraria штамм 074W из альгологической коллекции Института физиологии растений РАН. Для получения хромосомных препаратов клетки водорослей обрабатывали интеркалятором ДНК 9-аминоакридином, фиксировали в смеси этанол-уксусная кислота (3:1) и окрашивали ацетоорсеином. Временные давленые препараты исследовали на микроскопе Amplival! (Carl Zeiss) с помощью автоматизированной системы анализа изображения и программы хромосомного анализа «Видео-ТесТ-Карио 1.5» совместно с О.В.Муравенко в ИМБ РАН им. ВАЭнгелыардта (Muravenko et al., 2001; Селях и др., 2001; Стадничук и др., 2003). Содержание ДНК определяли в окрашенных по Фельгену митотических ядрах клеток с помощью микроспектрофотометра Opton MSP-20 (Germany). В качестве стандартного препарата с известным количеством ДНК использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

Выявленные хромосомные числа изученных водорослей разделяются на две группы: п=2 для всех трех видов Gaidieria и n=5 (7) для C.caldarium. В кариотипах трех разных видов Gaidieria две хромосомы различаются по длине: меньшая из них варьирует от 0,8 до 1,8 мкм, а большая - от 1,2 до 2,3 мкм, Размеры каждой из хромосом у G.maxima, G partita и G.sulphuraria имеют статистически значимые межвидовые различия. Из 5 четко различимых хромосом в кариотипе C.caldarium две меньшие были около 0,4 мкм длиной, тогда как остальные три хромосомы имели длину 0,5-0,7 мкм. Хромосомы этого вида очень мелкие, точковидные, с размерами, сопоставимыми с пределом разрешающей способности светового микроскопа. В некоторых клетках С. caldarium наблюдали две возможных дополнительных хромосомы около 0,2 мкм, что позволяет предположить, что хромосомное число этого вида может быть равно 7. Однако слишком малые размеры добавочных хромосомоподобных телец не позволяют сделать однозначного заключения о хромосомном числе у этого вида. Вместе с тем, наличие в клетках двух хромосом является показателем рода Gaidieria и может быть использовано как маркер для распознавания видов этого таксона и рода Cyanidium (рис.13).

Изучение содержания ядерной 1С ДНК показало, что все исследованные виды имеют гаплоидные геномы размером По количеству ДНК виды

распределяются в порядке убывания следующим образом: G.maxima-G.partita-C.caldarium-G.sulphuraria. Установленные размеры геномов изученных видов водорослей коррелируют с суммарной длиной их хромосом. Таким образом,

представители семейства Cyanidiaceae имеют самые маленькие из известных геномов у фотосинтезирующих эукариот. Наше исследование подтверждает эффективность учета кариологических признаков в систематике не только высших, но и низших растений.

0 _Ф 2 гу 3 4 *

...............................5 V в 7 в. а

Рис.13. (1-8) Фотографии окрашенных ацетоорсеином митотических хромосом и их компьютерная модификация у видов Galdiena и CcakJarium. 1, 2 - G maxima: прометафазные и метафазные хромосомы (n = 2), 3, 4 - G.partita, хромосомы в ранней метафазе (n = 2); 5,6 - G sulphuraha- метафазные хромосомы (n = 2); 7,8 - C.caldanum, 5 метафазных хромосом. Масштабная линейка - 3 мкм.

Цитофотометрическое определение количества ДНК ранее не проводилось для Galdieria, но размер генома одного из видов - G.sulphuraria был определен пульс-электрофорезом ДНК (Moreira et al, 1994). ДНК C.caldanum шт. RK-1, фактически идентичный C.caldanum шт. Р-511, была определена количественно спектрофотометрически после окрашивания 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (Suzuki et al., 1992). Согласно этим исследованиям, ядерная ДНК C.caldanum шт. RK-1 и G.sulphuraria шт. 17.91 составляла 13 и 9,8 Мбп соответственно. Для сравнения наших результатов с этими данными было принято во внимание, что 1,7x10'2 пг ДНК, присутствующая в ядре дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Sherman, 1991), эквивалентна размеру генома 13,6-14,0 Мбп (Link, Olson, 1991; Gotta, Gasser, 1996). To же соотношение пг/Мбп, примененная к Cyanidiophyceae, указывает на то, что ядерная ДНК в C.caldarium шт. Р-511 и G.sulphuraria шт. 074W составляет 12,0 Мбп и 10,8 Мбп соответственно. Как известно, только геномы дрожжей и простейших имеют столь малые величины (Link, Olson, 1991). Размер генома некоторых низших одноклеточных эукариот, включая Chlorella, составляет 35-47 Мбп (Takahashi et al., 1993). Таким образом, Cyanidiophyceae, имеющие наименьший растительный геном, могут считаться наиболее примитивными из всех фотосинтезирующих организмов.

5.2. Особенности организации белковойкомпоненты клеток Cyanidiophyceae

Первым барьером для внешних физико-химических воздействий в условиях повышенной температуры и низких значений рН является плотная клеточная стенка с чрезвычайно высоким (до 60 %) содержанием белка, небольшим количеством полисахаридов (до 15%) и следовыми количествами целлюлозы (Baily, Staechelin, 1968). Именно со структурно-биохимическими характеристиками и интактностью клеточной стенки многие авторы связывают термо- и кислотоустойчивость этих организмов (Enami, Fukuda, 1977; Seckbach, 1994), хотя механизмы этих свойств до сих пор не расшифрованы. Исходя из этого было исследовано действие различных ферментов, действующих на компоненты клеточной стенки C.caldarium. Показано, что ацидо- и термоустойчивость культуры зависит от интактности клеточной стенки, которая, в свою очередь, строго зависит от состава мембранных липидов и, в меньшей степени, от белков. Нарушение этих свойств достигалось обработкой клеток протеазами. Другие ферменты (целлюлаза, гемицеллюлаза, кислая фосфатаза, (3-глюкозидаза и лизоцим) давали меньший эффект (Enami, Fukuda, 1977). Обработку ферментами проводили при оптимальном для их действия значении рН (5,0; 5,6; 7,0; 8,0), но не оптимальном для роста культуры.

Протеолитические ферменты нами использовались ранее для изучения клеточной стенки дрожжей (Kalebina et al., 1988; Калебина и др., 1997). Данные об обработке клеток микроводорослей пищеварительным ферментом пепсином в литературе отсутствуют. Ранее этот фермент был применен нами как вспомогательный реагент при определении хромосомных чисел у микроводорослей класса Cyanidiophyceae (Muravenko et al., 2001). Пепсин специфичен главным образом к пептидным связям ароматических и алифатических аминокислотных остатков. Фермент применяется с целью ограниченного протеолиза нативных белков и проявляет активность при кислых значениях рН в диапазоне от 1 до 5 (Практическая химия белка, 1989). В нашей работе мы использовали этот фермент, действующий на белки клеточной стенки при оптимальном для роста культур значении рН 3,0 с целью оценить на живых культурах изменения мембранных структур (прежде всего клеточной стенки) у представителей родов Cyanidium и Galdieha.

Условия культивирования описаны нами ранее (Селях и др., 1984). Для работы отбирали клетки, находящиеся в логарифмической стадии роста (5-6 сутки после посева) и отделяли от среды центрифугированием. Осадок ресуспендировали в новой среде с добавлением 1 мг/мл фермента пепсина (Merck, USA). Культуры инкубировали при 35°С в течение 3-5 часов. Препараты просматривали в микроскопе Zeiss Axioskop 40 FL при увеличении ЮООх, съемку производили цифровой камерой Zeiss AxioCam MRc.

РОС. млцжжллънаь ; Б«&лаатЕКА

C.nereptfyv I

__03 МО «т f

...............«Л »j

Для оценки состояния клеточной стенки и получения данных о конформационных изменениях в поверхностных слоях объектов был подобран оригинальный спектральный метод, основанный на неинвазивном анализе (Калабеков, Королев, 2000; Селях и др., 2003). В экспериментах использованы методы спектрометрии многократного нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО) и спектрополяриметрии МНПВО в инфракрасном диапазоне (ИК) в области 1800-1200см'1 (Калабеков, Королев, 2000).

Полоса поглощения 1650 - 1660 связана с валентными

колебаниями связи С=0 в пептидной группе и соответствует, в основном, белкам, полипептидам и аминокислотам, хотя небольшой вклад могут внести нуклеиновые кислоты и полисахариды. Специфичной только для белков считается полоса амид II с длиной волны 1550 см"1, отражающая смешанные деформационные колебания связи N-H и валентные колебания связей C-N и С=0 в пептидах. Наличие упомянутых полос поглощения в ИК-области обусловлено свойствами амидных групп, связывающих аминокислотные остатки в полипептидной цепи (Калина и др., 1968). Спектры снимали на спектрофотометре Specord IR-71. Измерительные элементы из Ge использовали для анализа поверхностных структур (клеточной стенки); измерительные элементы из КО-2 (сульфид цинка) использовали для анализа суммарного белка клеток.

Наиболее интересным представляется появление в ответ на действие пепсина по всей поверхности клеток C.caldarium каплевидных «выростов», ограниченных мембраной. В таком состоянии клетки могли существовать в течение нескольких суток без потери жизнеспособности. При наличии в инкубационной среде осмотических стабилизаторов (1М сахароза) таких изменений клеточной поверхности не отмечалось. В отличие от C.caldarium ни в одном случае мы не наблюдали аналогичного эффекта на клетках Galdieria, которые лишь увеличивались в размерах, сохраняя сферические очертания и неизмененную текстуру поверхности. Продолжение воздействия пепсином приводило к некрозу клеток. По всей видимости, пепсин избирательно и локально действует на белки клеточной стенки C.caldarium в отличие от Galdieria, что может уже на этом уровне исследования свидетельствовать о различном характере протеолиза нативных белков в пограничных слоях клеток Cyanidium и Galdieria.

В контроле и опыте получены спектральные характеристики клеток G.partita, G.maxima, G.sulphuraria и C.aldarium при записи спектров без поляризации светового потока и при параллельной и перпендикулярной ориентации электрического вектора поляризованного света. Обнаружены существенные различия спектров экспериментальных вариантов в области полос амид I и амид II в неполяризованном свете. Это свидетельствует, в первую очередь, об изменении размеров клеточных стенок, а также количественном изменении их биохимического состава. Значительно меняются значения дихроичных-соотношений полос амид I и амид II как для внешних

структур, так и для целой клетки. Эти данные указывают на изменения степени пространственной упорядоченности молекул биополимеров. На диаграммах рис.14 представлены результаты расчетов дихроичных отношений в спектрах полос поглощения амид I и амид II, отражающие реакции клеточных культур на фактор воздействия (пепсин). Как отмечалось, полоса амид I характеризует степень пространственной ориентации связи С=О, а полоса амид II - связи N-H в белковых структурах исследованных клеток.

Рис. 14. Диаграммы дихроичных соотношений спектральных характеристик клеток Cyanidiophyceae в опыте и в контроле: Клеточная стенка, полоса амид I; Клеточная стенка, полоса амид II, Суммарный клеточный белок, полоса амид I; Суммарный клеточный белок, полоса амид II.

-контроль

-изотропия

-опыт

Из диаграммы 1 следует, что связи С=О в клеточных стенках С. caldarium под действием пепсина теряют пространственную ориентацию: в исследованных образцах сильно выросла степень изотропии. По сравнению с ними, в пробах трех представителей рода Galdieria происходят противоположные процессы - в опыте возросла анизотропия поверхностных белковых структур.

Диаграмма 2 показывает, что сильное влияние пепсина на связи N-H в клеточных стенках отмечается только для 6. partita. Следует подчеркнуть, что это единственный случай, когда конформационные перестройки в пептидных связях

поменяли знак и изменили перпендикулярную ориентацию на параллельную. Для клеток остальных трех культур конформационные связи меняются незначительно.

Таким образом, выявлены достоверные различия в оптических свойствах поверхностных структур клеточных стенок в контрольных и опытных пробах, специфичные для каждого вида микроводорослей, особенно заметные при сравнении видов Galdieria с C.caldarium. Полученные результаты свидетельствуют о том, что структура клеточной стенки С. caldarium наиболее чувствительна к внешним воздействиям, что подтверждается видимыми изменениями ее поверхностной текстуры. Как показывают данные диаграмм 3 и 4, в отношении пространственной ориентации суммарного клеточного белка наиболее чувствительны клетки G. maxima, обладающие из всех изученных наиболее крупными размерами. Среди видов Galdieria наибольшие отклонения величин дихроичных отношений на всех диаграммах отмечаются у клеток 6. partita. Минимальные изменения в опыте по сравнению с контролем свойственны клеткам G. sulphuraria.

Полученные данные, характеризующие структуру белков клеток представителей изученных родов между собой существенно различаются, и это служит дополнительным свидетельством их таксономической самостоятельности. 5.3. Характеристики клеток Galdieria partita в различных условияхкультивирования

G.partita - новый вид одноклеточной термоацидофильной красной водоросли, выделенной из термальных источников полуострова Камчатка. Клетки имеют овальную форму, содержат один, состоящий из нескольких крупных долей, хлоропласт, окруженный одинарной мембраной. Наряду с автотрофным, G.partita способна к темновому и миксотрофному росту. Судя по реакциям клеток этого вида на внешние стрессовые воздействия (Гусев и др., 2004), их внутриклеточные мембраны и органеллы должны подвергаться наиболее заметным структурным перестройкам.

При переходе от автотрофных условий к гетеротрофным, в присутствии в среде 1% глюкозы, число тилакоидов в хлоропласте снижается. Пропорционально этому происходит уменьшение содержания хлорофилла а и фикобилипротеинов до 60 и 25 % от уровня этих пигментов в автотрофных клетках. Одновременно число митохондрий в гетеротрофных клетках возрастает в несколько раз. Размеры хемогетеротрофных клеток увеличиваются в 1,5, а миксотрофных - в 1.5-2 раза. Кроме того, к окончанию логарифмической фазы роста количество клеток в гетеротрофных культурах превышает число автотрофных почти на два порядка.

Для автотрофных клеток была характерна овальная форма со средними размерами 3,8x5,0 мкм. Клетки миксотрофной культуры становились более округлыми и отличались наибольшими размерами, имея в диаметре 5,7-7,5 мкм. Гетеротрофные клетки, приобретая, как и клетки миксотрофной культуры, округлую

Рис.15. Клетки G.partita в условиях фотоавто- (А), хемогетеро- (В) и миксотрофного (С) роста (N-ядро, Chl-хлоропласт, Т-тилакоиды, М-митохондрии). Масштабная линейка -1 мкм.

форму, характеризовались размером 4,8-6,3 мкм. Автотрофные клетки содержали одиночный хорошо развитый стенкоположный хлоропласт, окруженный одинарной мембраной. Характерно отсутствие пиреноида. Число тилакоидов, лежащих параллельно друг другу, равнялось 8-12. Наружный тилако-ид имел кольцевую форму. В клетках отмечено 3-4 митохондрии размером 0,4x1,0 мкм, локализованных преимущественно на периферии клетки. У хлоропластов в клетках миксотрофной культуры тилакоиды укорачивались, а их число сокращалось в среднем до 5-7. Число митохондрий составляло 14-16, размером 0,2x0,4 мкм. В клетках присутствуют центральная вакуоль, заполненная электронно-плотным содержимым, многочисленные внутрицитоплазматические мембраны. В хлоропласте гетеротрофных клеток происходило набухание тилакоидов с увеличением внутритилакоидного пространства; тилакоидные мембраны были наиболее укорочены, а число тилакоидов было наименьшим - от 2 до 5. Вакуоль занимает большую часть объема клетки. По сравнению с фотоавтотрофной культурой число митохондрий увеличивается в два раза, а их размер уменьшается (рис.15).

Исходя из выявленных ультраструктурных особенностей клеток, изменений их размеров и скорости накопления биомассы, можно сделать вывод, что не фотосинтетический путь энергетического метаболизма G.partita более благоприятен, чем фотосинтетический, а сочетание обоих путей у фотогетеротрофной культуры является оптимальным.

5.4. Влияние глюкозы на пигментный аппарат фотосинтеза G.partita пригетеротрофномросте Метаболизм Сахаров у микроводорослей - факультативных гетеротрофов, обладающих наряду с фотосинтезом способностью использовать экзогенные углеводы в качестве энергетических ресурсов, представляет особый интерес. Известно 75 видов различных одноклеточных водорослей, способных к росту в присутствии глюкозы, что связано с сохранением в клетках водорослей системы клеточного транспорта экзогенных Сахаров и наличием всех ферментов,

участвующих в катаболизме углеводов (Droop, 1974). С поступлением углеводов происходит подавление фотосинтеза, и этот эффект считается определяющим в поддержании гомеостаза клеток водорослей. В темновых условиях, при полном переключении на органическое питание, содержание хлорофилла у факультативных гетеротрофов существенно снижается. В световых условиях количество хлорофилла у гетеротрофных водорослей, как и других пигментов фотосинтеза, становится большим, но остается ниже, чем у автотрофных водорослей. Подавление фотосинтетического аппарата под действием усваиваемых органических источников углерода является комплексным и не ограничивается снижением клеточной концентрации пигментов. Например, у Chlorella vulgaris переключение на гетеротрофное питание вызывает редукцию хлоропластов, ингибирование ферментов цикла Кальвина, падение выделения кислорода, уменьшение концентрации реакционных центров Р700 и др. (Зверева и др., 1980; Semenenko et al., 1984). Ингибирующее действие углеводов не зависит от их экзогенного или фотосинтетического происхождения. В последнем случае сахара осуществляют ингибирование в качестве конечных продуктов фотосинтеза по принципу отрицательной обратной связи. Существует ряд моделей регуляторного действия глюкозы и других углеводов, каждая из которых имеет свои обоснования, но ни одна не позволяет в полной мере объяснить многочисленные проявления глюкозной регуляции фотосинтеза (Taylor, 1997).

Исходя из предположения, что потеря пигментов при гетеротрофном питании водорослей может обусловливаться ингибированием глюкозой цепи биосинтеза хлорофилла, были изучены изменения, происходящие в пигментном аппарате у способных к гетеротрофии фотосинтетиков, и проведен поиск возможных экскретируемых ими порфириновых продуктов в различных условиях роста.

Рис. 1 б. Рост G.partita в авто-(1), миксо-(2) и гетеротрофных (3) условиях

Рис. 17. Содержание хлорофилла а, каротиноидов и фикобилипротеинов у О.раП'Ла в разных условиях культивирования. Числа на столбиках отражают содержание пигментов в мкг/109 клеток

Присутствие глюкозы в ростовой среде приводило к резкой интенсификации деления клеток. К концу логарифмической фазы роста число миксо- и гетеротрофных клеток превышало число автотрофных почти в 20 и 30 раз (рис.16).

Изменения в содержании пигментов проявлялись в перемене окраски клеток: автотрофная культура G.partita, имевшая сине-зеленую окраску, становилась светло-зеленой в миксотрофных и желто-белой - в гетеротрофных условиях (рис.17). Культуральная среда миксо- и гетеротрофных клеток G.partita обладала флуоресценцией, интенсивность которой росла с возрастом культуры. Подобные спектральные свойства характерны для порфиринов (Falk, 1964).

В дополнение к названным изменениям в условиях гетеротрофного роста происходит избирательное подавление ФСИ. Это следует из снижения интенсивности выделения кислорода по отношению к содержанию хлорофилла у миксотрофных клеток в 3 раза, а у гетеротрофных — в 8 раз, а также проявляется ультраструктурно в набухании тилакоидных мембран. Повышенная восприимчивость ФСИ к различным стрессовым воздействиям хорошо изучена, и аналогичные изменения, происходящие в условиях фото- и гетеротрофии, отмечены у ряда цианобактерий (Савельев, Селях, 2000) и других оксигенных фотосинтетиков -факультативных гетеротрофов (Vernotte et al., 1992).

В совместных экспериментах с И.Н.Стадничуком (ИБХ РАН им. А.Н.Баха) и ВАБойченко (ИФПБ РАН, г. Пущино) выявлен внутриклеточный механизм, вызывающий редукцию пигментного аппарата фотосинтеза у G.partita при гетеротрофном росте. Он заключается в ингибировании усваиваемой клетками экзогенной глюкозой биосинтеза хлорофилла и фикоцианобилина на стадии превращения их общего метаболического предшественника, копропорфириногена III, экскретируемого клеткой, в протопорфириноген IX. Блокирование биосинтеза приводит к уменьшению клеточного содержания хлорофилла и фикобилипротеинов и редукции числа и размеров тилакоидов. Свет в миксотрофной культуре действует противоположно глюкозе. Световое накопление пигментов при миксотрофном росте протекает одновременно с увеличением экскреции копропорфириногена III, поскольку световая индукция биосинтеза осуществляется на более ранней метаболической стадии (рис.18), чем воздействие глюкозы (Stadnichuk et al., 1998).

Активность копропорфириноген-Ш-оксидазы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, также экскретирующих копропорфириноген III, контролируется протогемом и кислородом на уровне транскрипции (Zagorec, Labbe-Bois, 1986). По аналогии с S. cerevisiae можно предположить, что у G. partita глюкоза контролирует данный фермент также на транскрипционном уровне.

Рис.18. Метаболический путь синтеза хлорофилла а и фикоцианобилина

Лабильностью мембранных систем объясняются легкие переходы (по сплошным стрелкам) различных типов метаболизма и энергетических процессов клеток G. partita в следующих направлениях:

Рис.19. Схема переходов типов питания у G partita

Способность к гетеротрофному питанию, характерная для Galdieria, составляет существенное отличие этого рода от других Cyanidiophyceae, характеризующихся строгой автотрофностью. В присутствии глюкозы клетки G. partita увеличиваются в размере. Благодаря этому накопление биомассы в условиях гетеротрофии идет еще более интенсивно, чем это следует из ростовых кривых (рис. 16). Представляется правильным говорить как об ингибирующем, так и об индуцирующем действии глюкозы на пластический обмен у факультативных гетеротрофов, поскольку подавление фотосинтетического аппарата сопровождается увеличением размеров клеток и возрастанием скорости роста культуры Аналогичные изменения скорости роста и величины клеток отмечены у зеленой водоросли Chi. vulgaris, сходной с G. partita по способности к смене типа питания. Если исходить из критерия нарастания биомассы водорослей, глюкоза как экзогенный органический субстрат у факультативных гетеротрофов, по-видимому, служит предпочтительным источником углерода по отношению к СОг, усвоение

которого при фотосинтезе требует использования более сложных метаболических путей.

Редукция пигментного аппарата фотосинтеза у G. partita при миксотрофном росте вызывает неполное ингибирование фотосинтетического аппарата. Сохраняющаяся его часть (20-30%) позволяет клеткам вернуться к фотоавтотрофному способу питания при удлинении логарифмической фазы Хемогетеротрофный тип энергетического метаболизма вызывает более глубокие структурные перестройки фотосинтезирующих мембран. Это затрудняет переход клеток к миксотрофному типу метаболизма и делает невозможным возврат культуры к фотоавтотрофии при длительном культивировании в темноте (рис. 19). В то же время образование гемов, входящих в состав дыхательной цепи митохондрий и обладающих общими метаболическими предшественниками с хлорофиллом а и фикоцианобилином, в гетеротрофных клетках не уменьшается. Это свидетельствует о том, что регуляторные процессы, зависимые от наличия экзогенной глюкозы в клетках факультативных хемогетеротрофов, являются высоко дифференцированными (Селях и др., 2000). Таким образом, при определенных условиях культивирования факультативный фототроф может стать облигатным хемогетеротрофом. Такой же характер переходов в смене типов питания присущ G maxima.

5.5. Эволюция фототрофныхмикроорганизмов CYANOPHYTA и CYANIDIOPHYCEAE

Среди эволюционистов-микробиологов принято считать, что первые формы жизни существовали в древних горячих источниках. Наиболее примитивный эукариот Cyanidioschyzon merolae (Rhodophyta) дивергировал в результате деления простейших (Protozoa), но раньше Fungi, Animalia и Chlorophyta (Takahashi et al., 1995). Обсуждаются несколько вариантов филогении Cyanidiophyceae.

1. Клетки архей объединились с термофильными цианобактериями, обитавшими в нейтральных или кислых средах. Из этой ассоциации возникли первые Cyanidian, подобные Cyanidioschyzon. Внедрившаяся цианобактерия начала функционировать как фотосинтетическая органелла - хлоропласт. В дальнейшем некоторые из клеток Cyanidioschyzon дали начало C.caldahum, которые, в свою очередь, трансформировались в Galdieha, послужившие предками первых Rhodophyta (Seckbach et al., 1996,1997).

2. В соответствии с теорией компартментализации, эукариогенез осуществился прямым путем от бактерий или цианобактерий (Nakamura, Jensen, 1994; Seckbach et al., 1998).

3. Симбиотическая ассоциация цианобактерий с бесцветными простейшими привела к возникновению Cyanidium (Castenholz, 1979; Kremer et at., 1983).

Анализ характеристик самих представителей Cyanidiophyceae позволил разместить их по уровню организации в таком ряду (Seckbach et al., 1994):

C.merolae-+C.caldarium->G.sulphuraiia->Rho<iophyta~*Cbromopbyta.

Проведенный нами кариологический анализ вносит следующие изменения в эту последовательность:

C.merolae->G.sulphuraria->C.caldarium->G.partita-+G.maxima-*

Первые три вида из этой последовательности по своим физиолого-биохимическим характеристикам ближе к фототрофным цианобактериям, четвертый и пятый виды - факультативные хемогетеротрофы. В литературе до сих пор открытым остается вопрос о процессе перехода прокариотных клеток к эукариотическим. Гипотетические организмы, которые могли бы стать связующим звеном между цианобактериями и водорослями, способными к митозу, были названы праводорослями. Некоторые авторы (Klein, Cronquist, 1967) утверждали, что такими организмами могли бы быть Cyanidium и Cyanophora, сходные по своим пигментным характеристикам с цианобактериями. Однако поиски праводоросли не сложились в какую-то определенную схему, не увенчались успехом и окончательно привели к признанию эволюционного разрыва между цианобактериями и всеми эукариотными водорослями. Утвердилось мнение, согласно которому промежуточные формы между фотосинтезирующими прокариотами и эукариотами либо вымерли, либо никогда не существовали (Маргелис, 1983).

Проведенные нами исследования обосновывают следующее предположение: у примитивных красных водорослей (G.partita, G.maxima), способных к осуществлению разных путей энергетического метаболизма наряду с получившим преимущественное развитие миксотрофным типом питания, в соответствующих экологических условиях обособились две группы клеток. Одна из них - с фототрофным типом питания - дала начало высшим Rhodophyta. Другая группа перешла на облигатно-хемогетеротрофный тип питания. Появились организмы с качественно новой структурой и исключительно митохондриальным типом энергообеспечения в связи с деградацией фотосинтезирующих мембран, вплоть до их полного исчезновения. Нами экспериментально показана необратимость такого перехода и невозможность возврата таких организмов к фотоавтотрофному способу существования. Таким образом, микроводоросли рода Galdieria, делящиеся митотически и способные к смене метаболизма, можно считать недостающим эволюционным звеном, и ныне живущей праводорослью. В свою очередь эта праводоросль могла послужить отправным организмом как в развитии фотосинтезирующих эукариот, так и гетеротрофных форм, появившихся в результате редукции фотосинтетического аппарата и давших начало первым гетеротрофным организмам - предкам грибов и животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Только на основании изучения ультраструктурной организации клеток цианобактерий нельзя делать вывод о степени их эволюционного развития по

сравнению с остальными прокариотами, а также другими фотосинтезирующими организмами. Основным методом, на основе которого в настоящее время судят о специфике внутриклеточных мембран, является препаративное разделение. На интактной прокариотной фотосинтезирующей клетке с развитой системой внутрицитоплазматических мембран, о специфике тилакоидов по сравнению с ЦПМ можно судить лишь с применением ультрацитохимических методов, позволяющих оценивать уровень активности и выяснять степень дифференцированное™ мембран в отношении осуществляемых ими функций и локализацию на них специфических ферментативных реакций.

Главные различия в строении клеток цианобактерий обуславливаются строением тилакоидов. Они представляют собой наиболее лабильный тип мембран, меняющий свои характеристики в зависимости от условий роста и физиологического состояния клеток. Использование известных в цитохимической практике индикаторов дегидрогеназной и цитохромоксидазной активностей позволяет на неразрушенных клетках оценивать уровень и локализацию компонентов фотосинтетического и дыхательного электронного транспорта (Costerton, Marks, 1977). Нами показана преимущественная локализация дегидрогеназной активности на тилакоидах и в меньшей степени на ЦПМ. Характер отложений формазана зависит от объема внутритилакоидного пространства. Это позволяет оценивать его роль и конфигурацию тилакоидных мембран как показателя в клеточном метаболизме и его связи с активностью некоторых ферментов (например, сукцинатдегидрогеназы). Роль ЦПМ в процессах транспорта электронов незначительна у облигатных фототрофов и более выражена у факльтативных хемогетеротрофов, но так или иначе ее нельзя игнорировать. Это более реальная картина, так как исследования других авторов либо преувеличивали, либо отрицали роль ЦПМ как энергодающей структуры.

Известно, что тилакоиды цианобактерий выполняют не только фотосинтетические, но и дыхательные функции: их электронтранспортная цепь бифункциональна. ЦПМ проявляет дыхательную активность, не осуществляя окислительного фосфорилирования, которое является функцией тилакоидов. Образуемый дыхательной цепью используется преимущественно для

обеспечения энергией транспортных процессов (Jeanjean et at., 1990). Таким образом, тилакоиды считаются единственной структурой, генерирующей энергию в клетке (Peschek et al., 1988). Исходя из этого у цианобактерий исключена возможность полной редукции тилакоидов в онто- и филогенезе (Пиневич, 1991). Все изменения, происходящие с тилакоидными мембранами, приводят либо к гибели клетки при превышении предела толерантности, либо к возврату в исходное состояние при прекращении действия индуктора.

Если рассматривать микроводоросли класса Cyanidiophyceae как организмы, связанные с переходным этапом в эволюции низших фототрофов, то наличие у них

даже в минимальном количестве энергопреобразующих органоидов (1 митохондрия и 1 хлоропласт) позволяет жертвовать одним их них для выживания в определенных условиях. У примитивных красных водорослей деградация фотосинтетического аппарата обуславливает переход клеток на качественно новый тип энергообеспечения, не приводящий к гибели культуры.

Данные, полученные с помощью ультрацитохимических и электронномикроскопических исследований могут быть использованы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов функционирования энергопреобразующих мембран у фотосинтезирующих групп организмов.

Выводы

1. Подобраны условия для ультрацитохимических реакций в клетках цианобактерий и предложены новые методы фиксации для примитивных красных водорослей, позволившие выявить у них неизвестные ранее детали строения и описать ультраструктуру нового вида.

2. В клетках цианобактерий, различающихся уровнями морфологической организации и способами получения энергии, выявлена видоспецифическая и физиологическая специализации отдельных участков мембранного аппарата для осуществления процессов фотосинтеза и дыхания.

3. Роль ЦПМ в процессах транспорта электронов у цианобактерий связана с метаболическими особенностями культур. Метаболизм хемогетеротрофного типа повышает ее удельный вес в энергетике клетки. Степень функциональной дифференцированности тилакоидных и цитоплазматической мембран в клетках цианобактерий такова, что их можно рассматривать как мембраны разного типа.

4. В клетках примитивных красных водорослей, способных к осуществлению метаболизма различного типа, переход к гетеротрофии вызывает перестройку метаболизма, приводящую к изменению структуры энергопреобразующих органелл и редукции пигментного аппарата.

5. Выявлен внутриклеточный механизм, вызывающий редукцию пигментного аппарата фотосинтеза у G.partita при гетеротрофном росте. Показана дифференцированность регуляторных процессов в отношении функционирования фотосинтезирующих и дыхательных органелл.

6. Наиболее лабильным типом мембран у цианобактерий и примитивных красных водорослей следует считать тилакоидные мембраны. При этом у цианобактерий невозможна их полная редукция без потери жизнеспособности. У примитивных фасных водорослей деградация фотосинтетического аппарата обуславливает переход клеток на качественно новый тип энергообеспечения, не приводящий к гибели культуры.

7. Определены числа хромосом для видов Galdieria и Cyanidium. Установлены кариологические различия между родами. Размер генома Cyanidiophyceae позволяет считать их наиболее примитивными из всех фотосинтезирующих эукариот.

8. Экспериментально показана возможность обратимой и необратимой смены

типов метаболизма у двух видов Galdieria. Факт деградации фотосинтетического

аппарата служит основой для рассмотрения путей редукционной

морфофункциональной эволюции эукариотной клетки.

Список публикаций по теме диссертации

1. Селях И.О.,Романова Н.И., Баулина О.И., Минеева ЛА, Гусев М.В. (1981) Изучение мембранных структур клеток Cyanidium caldarium с применением различных методов фиксации. Физиология растений, т.28,вып.6, с.1210-1215.

2. Селях И. О (1983) Темновое поглощение молекулярного кислорода факультативно фототрофной синезеленой водорослью Chlorogloea ^^Ьш. Материалы IV республиканской конференции «Микробиология и научно-технический прогресс». Киев, с. 131-132

3. Селях И.О Минеева Л.А. (1983) Цитохимическое изучение дегидрогеназной активности в клетках синезеленой водоросли Chlorogloea М^сЫи. Материалы I Всесоюзного совещания молодых ученых по физиологии растительной клетки, Москва, с. 17.

4. Селях И.О., Романова Н.И., Минеева Л.А. (1983) Ультраструктура клеток Cyanidium caldarium в экстремальных условиях кислотности среды. Материалы V Всесоюзного симпозиума по ультраструктуре растений, Кишинев, с. 49.

5. Селях И.О., Минеева ЛА, Гусев М.В. (1984) Особенности ультраструктуры клеток Cyanidium caldarium на разных стадиях роста периодической культуры. Известия АН СССР, сер. Биол., в.1, с. 74-81

6. Семенова Л.Р., Баулина О.И., Селях И.О., Минеева Л.А. (1984) Влияние адаптации к сахарозе на ультраструктуру цианобактерий. Материалы. 1 Всесоюзного совещания "Цитология микроорганизмов", Пущино, с. 59-60.

7. Минеева ЛА, Селях И.О. (1984) Электронно-микроскопическое изучение локализации окисленного диаминобензидина в клетках цианобактерий. Материалы. 1 Всесоюзного совещания "Цитология микроорганизмов", Пущино, с. 65-66.

8. Селях И.О., Минеева Л.А. 1984 Влияние суммарной и субстратспецифической дегидрогеназной активности в клетках цианобактерий методом электронно-микроскопической цитохимии. Материалы. 1 Всесоюзного совещания "Цитология микроорганизмов", Пущино, с. 66-67.

9. Селях И.О. (1985) Влияние ингибиторов на окисление диаминобензидина в клетках цианобактерий. Материалы VII съезда Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, с. 134.

10. Минеева ЛА, Селях И.О., Макарьева Е.Д., Баулина О.И., Гусев М.В. (1985) Выявление суммарной дегидрогеназной активности в клетках цианобактерий Chlorogloeopsis М^сЫи методом электронно-микроскопической цитохимии. Микробиология, т.54, в.5, с. 577-581.

11.Stadnichuk I.N., Romanova N.I., Selyakh 1.0 (1985) A phycourobilin-containing phycoerythrin from the cyanobacterium Oscillatoha sp. Archives of Microbiology v. 143, p. 20-25.

12.Минеева Л.А., Селях И.О., Романова Н.И. (1985) Об адаптации красной водоросли Cyanidium caldarium к высокой кислотности среды. Материалы II Всесоюзного совещания "Клеточные механизмы адаптации", Москва, с. 37.

13.Селях И.О., Минеева Л.А., Гусев М.В. (1988) Функциональная дифференцировка мембран цианобактерий. VI Всесоюзный симпзиум "Ультраструктура растений", Киев, с. 42.

14. Минеева Л.А., Селях И.О. (1988) Локализация пероксидазной активности в клетках цианобактерий. VI Всесоюзный симпозиум "Ультраструктура растений", Киев, с. 39.

15.Kalebina T.S., Rudenskaya G.N., Selyakh I.O., Khodova O.M., Chestukhina G.G., Stepanov V.M., Kulaev I.S. (1988) Serine proteinase from Bacillus brevis: lytic action on intact yeast cells. Applied Microbiology and Biotechnology, v.28, p. 531 -536.

16.Воронцова Г.В., Романова Н.И., Постнова Т.И., Селях И.О., Гусев М.В. (1988) Биостимулирующий эфсрект цианобактерий и пути его повышения. I. Использование мутантов - суперпродуцентов аминокислот. Вестник МГУ, сер. Биол., N3, с. 15-19.

17.Баулина О.И., Селях И.О., Горелова О.А. (1989) Строение клеточной оболочки как фактор гетероморфных изменений цианобактерий. Всесоюзная конференция "Регуляция микробного метаболизма", Пущино, с. 9-10.

18.Селях И.О., Семенова Л.Р., Романова Н.И., Карпова О.В. (1990) Изучение структурно - функциональных особенностей мутантных штаммов цианобактерий в ходе онтогенеза. IV Республиканская конференция по электронной микроскопии, Кишинев, с. 102.

19.Селях И.О., Семенова Л.Р., Романова Н.И., Карпова О.В., Гусев М.В. (1990) Электронно-микроскопическое изучение мутантных штаммов цианобактерий -продуцентов незаменимых аминокислот. IV Республиканская конференция по электронной микроскопии, Кишинев, с.101.

20. Селях И.О., Гусев М.В., Минеева Л.А. (1990) Дегидрогеназная активность клеточных мембран фототрофных культур цианобактерий. Микробиология.т. 59, в. 4, с. 575-582.

21.Гусев М.В., Минеева Л.А., Селях И.О., (1990) Электронно-цитохимическое изучение субстратспецифической дегидрогеназной активности клеток цианобактерий. Микробиология,т.59, в.5, с. 863-870.

22.Селях И.О., Минеева Л.А., Гусев М.В. (1990) Локализация продукта окисления 3,3'-диаминобензидина в клетках цианобактерий. Микробиология,т.59, в.6, с. 1032-1037.

23.Карпова О.В., Постнова Т.И., Романова Н.И., Селях И.О., Гусев М.В. (1990) Устойчивые к 5-фтор триптофану мутанты цианобактерий Anabaena vahabillis -

продуценты ароматических аминокислот и ауксина. Прикладная биохимия и микробиология, т.26, в.6, с.784-788.

24. Гусев М.В., Селях И.О., Минеева ЛА (1991) Природа акцепторов, взаимодействующих с З.З'-диаминобензидином в клетках цианобактерий. Микробиология.т.60, в. 1, с. 34-40.

25. Камзолкина О.В., Дмитриева СВ., Селях И.О., Семенова Л.Р., Даниленко В.Н. (1992) Регенерация протопластов у Streptomyces. Материалы Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков. Генная инженерия культур, продуцирующих антибиотики. Т. 21, с. 111-128.

26. Романова Н.И., Селях И.О., Семенова Л.Р. (1996) Влияние ароматических аминокислот и ауксина на цитодифференцировку и нитрогеназную активность цианобактерий. В сборнике "Эколого-физиологические исследования водорослей", Ярославль, с. 164-165.

27. Селях И.О., Рахимбердиева М.Г., Болычевцева Ю.В., Юрина Н.П., Стадничук И.Н., Карапетян Н.В. (1996) Развитие одноклеточной красной водоросли Galdieria partita в автотрофных, фотогетеротрофных и хемогетеротрофных условиях. В сборнике "Эколого-физиологические исследования водорослей", Ярославль, с. 168.

28.Селях И.О., Семенова Л.Р., Карпова О.В., Романова Н.И., Гусев М.В. (1996) Морфоструктурная характеристика мутантов цианобактерий, устойчивых к аналогам аминокислот. Микробиология,т.65, N4, с.505-511.

29.Калебина Т.е., Чжан Сипин, Селях И.О., Чертов О.Ю., Алексеева О.В., Кулаев И.С. (1997) Субтилизины.трипсин и проназа в исследованиях клеточной стенки дрожжей Candida utilis. Материалы IV симпозиума "Химия протеолитических ферментов", Москва, с. 130.

30.Stadnichuk I.N., Rakhimberdieva M.G., Bolychevtseva Yu.V., Yurina N.P., Karapetyan N.V., and Selyakh I.O. (1998) Glucose inhibits chlorophylls and phycocyanobilin biosynthesis in the unicellular red alga galdieria at the stage of coproporphyrinogen III formation. Proceedings of the Xlth International Congress on Photosynthesis, Budapest, Hungary, p. 2789-2792

31.Stadnichuk I.N., Rakhimberdieva M.G., Bolychevtseva Y.V., Yurina N.P., Karapetyan N.V., Selyakh I.O. (1998) Inhibition by glucose of chlorophyll a and phycocyanobilin biosynthesis in the unicellular red alga Galdieria partita at the stage of coproporphyrinogen III formation. Plant Science, v.136, p.11-23

32. Семенова Л.Р., Селях И.О., Романова Н.И. (1998) Секреция аминокислот мутантными штаммами цианобактерий Calothrix PCC 7102. Вестник МГУ, сер. Биол., N2, с. 12-15.

33. Селях И.О., Стадничук И.Н. (1998) Изменение ультраструктуры и пигментного состава у одноклеточной термоацидофильной красной водоросли Galdieria partita в гетеротрофных условиях. Труды Международной конференции «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии», Москва, с. 354-355.

34.Калебина Т.С., Селях И.О., Лауринавичюте Д.К., Алексеева О.В., Сипин Чжан,

Руденская Г.Н., Соколов С.С., Шевелев А.Б., Фоминов Г.В., Левитин Е.И., Кулаев И.С. (1998) Структурная роль белков клеточной стенки дрожжей. Труды Международной конференции «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии», Москва, с. 220-221.

35. Семенова Л.Р. Селях И.О. (1998) Фотопродукция аминокислот мутантными штаммами азотфиксирующих цианобактерий. Труды Международной конференции «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии», Москва, с. 356-357.

36.Stadnichuk I.N., Selyakh I.O., Muravenko O.V., Kononenko N.V. (1999) Chromosome numbers and nuclear DNA contents in Cyanidium caldarium and three species of Galdieria. 2-nd European Phycological Congress. Book of Abstracts. Italy, p. 154.

37. Семенова Л.Р., Селях И.О. (1999) Гормоноподобные соединения цианобактерий. Тезисы докладов пятой Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений»,, Москва, часть 2, с.341

38. Барский Е.Л., Селях И.О., Семенова Л.Р. (1999) Изменения физико-химических свойств среды культивирования A. variabilis Ktitz (Cyanophyta) - продуцентов триптофана., Альгология, т.9, №2, с. 12-13.

39.Селях И.О., Семенова Л.Р. (2000) Влияние экзогенных аминокислот и фитогормонов на рост и структурные особенности цианобактерий. Труды научной конференции "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов", Москва, с. 94.

40. Селях И.О., Семенова Л.Р., Стадничук И.Н. (2000) Ускорение деления клеток гетеротрофных одноклеточных водорослей стимуляцией митохондриального дыхания. Материалы Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода», Пущино, с. 135.

41. Савельев И.Б., Селях И.О. (2000) Влияние ионов цинка на морфологию и ультраструктуру клеток цианобактерий Anacystis nidulans. Вестник МГУ сер. Биол. № 3, с. 39-44.

42. Савельев И.Б., Селях И.О. (2000) Вляние ионов цинка на морфологию и ультраструктуру клеток цианобактерий. Материалы Международной конференции «Автотрофные микроорганизмы», Москва, с. 159-160.

43.Селях И.О., Семенова Л.Р. (2000) Синтез и секреция гормоноподобных соединений у цианобактерий. Материалы Международной конференции «Автотрофные микроорганизмы», Москва, с. 163-164.

44. Селях И.О., Муравенко О. В.,. Кононенко Н. В, Стадничук И. Н. (2001) Хромосомные числа и содержание ядерной ДНК у красных микроводорослей Cyanidium и Ga/d/ег/а.Труды IV Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Москва - Пущино, с. 302-304.

45. Muravenko O.V., Selyakh I.O., Kononenko N.V., Stadnichuk I.N. (2001) Chromosome numbers and nuclear DNA contents in the red microalgae Cyanidium caldarium and three Galdieria species. European Journal of Phycology, v.36, p.227-232.

46. Егоров С.Н, Селях И.О. Савельев И.Б. (2001) Использование спектрофотометрических методов в анализе состояния фототрофных микроорганизмов при воздействии тяжелых металлов. Труды VI Международной конференции "Оптические методы исследования потоков", Москва, с.388-391.

47.Калабеков А.Л., Селях И.О., Савельев И.Б., Королев Ю.Н. (2001) Особенности определения оптических постоянных целых клеток. Труды VI Международной конференции "Оптические методы исследования потоков", Москва, с.392-395.

48.Селях И.О., Воронцова Г.В., Голиченков М.В. (2001) Поляризация источника излучения и спектры целых клеток. Труды VI Международной конференции "Оптические методы исследования потоков", Москва, с. 402-405.

49.Калабеков А.Л., Селях И.О., Савельев И.Б., Королев Ю.Н. (2001) Методические возможности исследования биологических объектов в сложных средах. Труды Международной конференции. «Река Ока — третье тысячелетие», Калуга, с. 230232.

50.Селях И.О., Семенова Л.Р., Королев Ю.Н., Савельев И.Б. (2003) Особенности организации белковой компоненты клеточных стенок фасных микроводорослей класса Cyanidiophyceae. Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков", Ярославль, с. 50-51.

51. Савельев И.Б., Селях И.О. (2003) Экспериментальное изучение действия ионов тяжелых металлов на цианобактерии. Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков", Ярославль, с. 126-127.

52. М.В. Гусев, И.О. Селях, Ю.Н. Королев, Л.Р. Семенова, И.Б. Савельев (2004) Неинвазивное исследование белковой компоненты клеток красных микроводорослей класса Cyanidiophyceae. Вестник МГУ сер. Биол. № 4, с. 3-12.

53. Селях И.О. (2004) Типы метаболизма и ультраструктура энергопреобразующих органелл в клетках термоацидофильных красных микроводорослей. Ecological Studies, Hazards, Solutions, v.10, p. 86-90.

54. Селях И.О. (2004) Эволюционный переход от фотосинтезирующих прокариот к эукариотам: поиск недостающего звена. Ecological Studies, Hazards, Solutions, v.10, p. 91-94.

55. Селях И.О (2005) Микроводоросли класса Cyanidiophyceae как переходные организмы в эволюции от фотосинтезирующих прокариот к эукариотам. Вестник МГУ сер. Биол. № 1, в печати.

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338 Заказ № 75 тираж 100 экз. Подписано в печать 21.10.2004 г.

Информация о работе

Селях, Ирина Олеговна
доктора биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.25

Автореферат

Похожие работы