Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование цианобактерий рода Prochlorothrix

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование цианобактерий рода Prochlorothrix"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

□ □345 13Э4

ВЕЛИЧКО Наталия Владиславовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИАНОБАКТЕРИИ РОДА PROCHLOROTHRIX

специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о екнет

Санкт-Петербург

2008

003451394

Работа выполнена в отделе Микробиологии Биологического НИИ Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Пиневич Александр Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Никитина Валентина Николаевна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Мамушина Наталья Сергеевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится «ffi» 2008 г. в ч

на заседании совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, СПбГУ, Биолого-почвенный ф-т, ауд. УЗЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «"/т» 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ///Ш Е.И.Шарова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Представители филы ВХ Cyanobacteria в эволюционном, экологическом и таксономическом плане являются одной из ключевых групп прокариотов. Их уникальность связана со способностью осуществлять оксигенную фототрофию, которую детерминируют консервативные гены фотосинтетического аппарата—psaA-M (ФС1), psbA-W (ФСП) и psbO (водоокисляющий комплекс). В то же время пигменты и апопротеины основного светособирающего комплекса (LHC) у оксигенных фототрофов могут варьировать. По типу LHC Cyanobacteria подразделяются на собственно цианобактерий (обладают гидрофильными эпи-мембранными фикобилисомами, ФБС) и на прохлорофитов (используют гидрофобные интегральные хлорофилл-белковые комплексы, CP). В отличие от собственно цианобактерий, прохлорофиты, или «другие цианобактерии», содержат хотя бы один вспомогательный хлорофилл — Ь, дивинил-а2/02, с или d (Пиневич и др., 2000).

Цианобактерии из группы прохлорофитов сравнительно недавно заняли место среди объектов бактериологии. Название «прохлорофиты» первоначально относилось к представителям ботанического отдела Prochlorophyta - прокариотам с набором вспомогательных пигментов, характерным для пластид высших растений и зеленых водорослей (Lewin, 1975). Согласно гипотезе симбиогенеза, предками хлоропластов эукариотной клетки были оксифототрофные бактерии, содержащие вспомогательный хл Ъ (Modern et al., 1992; Douglas, 1998). По современным данным, прохлорофиты не являются прямыми эволюционными предшественниками пластид, но вместе с ними относятся к филе ВХ Cyanobacteria (Wilmotte, Herdman, 2001). Во 2-м издании «Руководства Берги по систематике бактерий» (2001) прохлорофитов, как и остальных представителей этой филы, классифицируют на основе морфологических критериев (Castenholz, 2001).

Изучение этой группы цианобактерий позволяет пополнить сведения о цитологии, физиологии, а также организации фотосинтетического аппарата оксигенных фототрофов. Комплексная характеристика морфологических, хемотаксоно-мических и геносистематических признаков новых объектов позволяет определить их систематическое положение.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение и сравнение морфологических, цитологических, физиолого-биохимических, а также моле-кулярно-генетических свойств трихомных цианобактерий-прохлорофитов рода Prochlorothrix - Prochlorothrix hollandica РСС 9006 и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90.

Для этого сформулированы следующие задачи:

— описать морфологию и ультраструктуру;

— оценить влияние уровня солености среды;

—выяснить характер фотоиндуцированных процессов на уровне цитоплазма-тической мембраны по изменению внеклеточного pH;

— изучить состав фотосинтетических пигментов;

— охарактеризовать состав хлорофилл-белковых комплексов и полипептидов фотосинтетических мембран;

— определить мол% ГЦ-пар ДНК и степень ДНК-ДНК гибридизации;

— сопоставить полиморфизм Hip 1-последовательностей.

Научная новизна работы. Работа впервые дает комплексную характеристику представителя p. Prochlorothrix - Prochlorothrix sp. NIVA-8/90. Полученные результаты позволяют рассматривать его в качестве нового вида.

Практическая значимость работы. Предложения по пересмотру систематики цианобактерий учтены во 2-м издании «Руководства Берги по систематике бактерий» (Pinevich et al., 1997; Castenholz, 2001). Данные об экофизиологических свойствах могут быть использованы для предотвращения «цветения» цианобактерий в водоемах водоохранного назначения. Результаты работы используются в курсах лекций «Микробиология», «Систематика и биоразнообразие прокариотов», «Цитогенетика прокариотов», входящих в учебный план кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Апробация работы. Результаты исследований опубликованы в статьях, а также представлены на международных симпозиумах (III Intern. Lake Ladoga Symp., Petrozavodsk, 1999; I Intern. Symp. «Bio-Inert Interactions: Life and Rocks», Moscow, 2002; II Eur. Phycological Congr., Montecatini Terme, 2001; III INTAS Interdisciplinary Symp. «General Biochemistry, Biotechnology, and Environment», Moscow, 2000), международных конференциях (V Intern. Res. Conf. «Molecular Bioenergetics of Cyanobacteria», Gmunden, 1999; VI Intern. Cyanobacterial Conf. «Molecular Bioenergetics of Cyanobacteria: Physiological, Ecological, and Economical Implications», Obernai, 2001; VII Intern. Cyanobacterial Conf. «A Signal Event», Asilomar, 2001) и Всероссийских конференциях («Автотрофные микроорганизмы», Москва, 1996; 2000; «Микология и криптогамная ботаника в России: традиция и современность», С.-Петербург, 2000; «Принципы и способы сохранения биоразнообразия», Пущино, 2008).

Работа выполнена по программе грантов INTAS и РФФИ; поддержана стипендией Президента Российской Федерации и стипендиями Дж. Сороса, а также грантами для молодых ученых мэрии С.-Петербурга.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 20 печатных работ, в том числе 4 статьи и 16 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 4 глав («Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты и обсуждение»), заключения, выводов и списка цитированной литературы (226 названий, в том числе 211 на английском языке). Текст изложен на 153 страницах, содержит 4 таблицы и 50 рисунков.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Культуры Prochlorothrix hollandica РСС 9006 и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 были любезно предоставлены д-ром Матхайсом (H.C.P.Matthjis; отдел микробиологии Амстердамского университета, Нидерланды).

Условия культивирования. P. hollandica РСС 9006 и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 выращивали на минеральной среде wiBG-11 (Pinevich, 1996) при 18-24 °С и освещенности 700 лк.

Микроскопия. Прижизненные препараты просматривали в микроскопе Leica с фазовоконтрастным устройством (объективы х40 или хЮО, окуляр *15). Материал

для электронной микроскопии фиксировали глутаральдегидом/осмием, а затем обезвоживали в спиртах и заключали в полимеризационную смолу (Sommerville, Scheer, 1987). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом/цитратом свинца по Рейнольдсу. Для выявления запасных полисахаридов срезы инкубировали в парах J2. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе.

Иммуноцитохимия. Для детекции рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы/ оксигеназы (RuBisCO) материал фиксировали 1,5%-ным глутаральдегидом, инкубировали с 0,15%-ным глицином и заключали в полимеризационную смолу. Ультратонкие срезы обрабатывали поликлоиальными антителами кролика против L-субъединицы RuBisCO Synechococcus sp. РСС 6301, а затем антикроличьими антителами крысы, конъюгированными с частицами коллоидного золота.

Оценка влияния уровня солености среды. К посевному материалу в среде mBG-11 добавляли NaCl (конечной концентрации 50, 100, 200 и 400 мМ). Динамику роста оценивали по оптической плотности культуры при 600 нм.

Регистрация фотоиндуцированных изменений рН клеточных суспензий осуществлялась на модельной установке, состоящей из освещаемой термостати-руемой ячейки с электродной парой, присоединенной к самописцу. Уровень освещенности в пределах 300-3000 лк изменяли с помощью стандартных кварцевых светофильтров. Для установления причин кратковременных изменений внеклеточного рН использовали ингибитор Н+-АТФазы FoFprana - N, Ni-дицикло-гексилкарбодиимид (DCCD) и ингибитор карбоангидразы - сульфодиметоксин, а также релаксаторы протонного градиента - NH4CI и карбонилцианид /и-хлорфенил-гидразон (СССР).

Анализ пигментов. Гидрофобные пигменты разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). Спектры интактных клеток и бесклеточных препаратов регистрировали на спектрофотометрах Aminco DW-2000 или СФ-26. Флуоресценцию при комнатной температуре (или низкотемпературную) измеряли на спектрофлуориметре Aminco-Bowman АВ2. Для выявления фикобилипротеинов использовали модифицированный метод Глезера (Glazer, 1988).

Получение и разделение хлорофилл-белковых комплексов. Нативные хлорофилл-белковые комплексы получали экстракцией мембранного материала 0,3%-ным додецил-(3-мальтозидом. Неденатурирующий электрофорез в полиакрил-амидном геле (ПАГ) проводили по методу Марквелла с соавт. (Markwell et al., 1979).

Анализ полипептидного состава тилакоидов. Денатурированные мембранные препараты разделяли электрофоретически в ПАГ по методу Леммли (Laemmli, 1970).

Определение мол% ГЦ. ДНК выделяли модифицированным методом Мармура (Sambrook et al., 1989). Содержание ГЦ-пар определяли по кривым термической денатурации, полученным на спектрофотометре PYEUnicam SP1800. Нуклеотидный состав ДНК рассчитывали по Оуэну с соавт. (Owen et al., 1969).

Степень ДНК-ДНК гибридизации оценивали методом оптической реассоци-ации по Де Лею (De Ley et al., 1970).

Определение полиморфизма Hipl-последовательностей проводили при помощи полимеразной цепной реакции (PCR) с олигонуклеотидными Hipl-прайме-

рами (последовательность 5-GCGATCGC с двумя дополнительными варьирующими нуклеотидами на 3'-конце) по методу Смита с соавт. (Smith et al., 1998).

Статистическая обработка полученных данных. Результаты представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением. Достоверность различий устанавливали для уровня значимости р<0,05 с помощью i-критерия Стьюдента и дисперсионного анализа (Лакин, 1990).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Морфология и ультраструктура

Морфология и ультраструктура Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 описаны впервые. С помощью модифицированных методов фиксации получены новые сведения об ультраструктуре P. hollandica РСС 9006 в дополнение к ранее опубликованным (Burger-Wiersma et al., 1986; Golecki, Jürgens, 1989).

Форма и размер клеток; размножение. Длинные (>250 мкм) неветвящиеся трихомы Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Р. hollandica РСС 9006 состоят из цилиндрических недифференцированных клеток (рис. 1). Средний размер клеток Р. hollandica РСС 9006 составляет 11,8x1,6 мкм, а Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 — 7,4x2,1 мкм (соотношение длина/ширина 7,4 и 3,5 соответственно). Апикальные клетки по форме не отличаются от интеркалярных. В области межклеточных контактов диаметр клетки уменьшается на 15-20%.

Размножение цианобактерий р. Prochlorothrix происходит путем случайной фрагментации трихома или при помощи некридиев; гормогонии не образуются.

„ищи.........I mil um ............I I,, ШМЫАШ'ДЕКТЖззсзягжя»^^

A - Б -

Рис. 1. Световые микрофотографии P. hollandica РСС 9006 (А) и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 (Б). Масштаб: 10 мкм.

Общий план строения клетки. Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 имеют сходную ультраструктуру, характерными чертами которой являются центрально расположенная зона нуклеоида, периферическая система тилакоидов и полярные агрегаты газовых везикул (рис. 2А; Б).

Строение оболочки: деление. Клеточная оболочка состоит из наружной мембраны (~8 нм) и цитоплазматической мембраны (7,5-8 нм), между которыми находится периплазматическое пространство (~20 нм) с тонким муреиновым слоем. Таким образом, наряду с остальными цианобактериями, представители рода Prochlorothrix относятся к грамотрицательному морфотипу.

Деление клеток Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 происходит комбинированным способом перетяжки и септирования. Оно начинается совместной инвагинацией мембран клеточной оболочки в центральной части клетки, но затем продолжается без участия наружной мембраны. Нами отмечено, что между двумя цитоплаз-матическими мембранами образуется муреиновый слой, а затем центральная область цитоплазмы с тилакоидами рассекается фронтом септы (рис. 2В). Деление заканчивается образованием межклеточной перегородки.

6

Рис. 2. Электронные микрофотографии ультра тонких срезов Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 (А-В). Т - тилакоиды, N - нуклеоид, Сх - карбоксисома. Масштаб: 1 мкм (А); 0,1 мкм (В); 0,2 мкм (В),

Особенности ламелляриой системы и межмембранные структуры. В клетках Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 тилакоиды расположены периферически, по 5-12 слоев параллельно клеточной стенке. От одиночных тилакоидов собственно цианобактерий они отличаются способностью образовывать стопки. В случае P. hollandica PCC 9006 показано, что факторами адгезии тилакоидов служат апо протеины хл я/i>-б ел к о во го комплекса (van der Staay, Staehelin, 1999).

Отличительной особенностью тилакоидов Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 являются эпимембранные структуры (диаметром -10 км), регулярно расположенные с интервалом -20 нм (рис, ЗА). Мы предложили для них название «вир ид ос омы» (Pinevich et al., 1999). По форме и локализации они сходны с фикобилисомами собственно цианобактерий, но имеют размер в 5 раз меньше. По-видимому, «виридосомы» отражают ул ьтр аструктур и ы е особенности организации свето-собирающего комплекса Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и соответствуют его периферической части. У некоторых хромофитных водорослей и динофлагеллят описаны аналогичные структуры — «ксантосомы», содержащие хл а/с (Katoh et al., 1993; Green, Dumford, 1996).

В клетках Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 обнаружены два типа периферических межмембранных структур —контакты Байера и тилакоид-ные центры. Контакты Байера имеют размер -50 нм и выглядят как V-образные зоны адгезии между наружной и пито плаз мат и ческой мембранами (рис. ЗБ). В случае P. hollandica PCC 9006 они показаны на сферопластах с сохранившимися фрагментами муреинового слоя (рис. ЗВ).

Тилакоидные центры Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 выявлены как структуры на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны, от которых веерообразно расходятся тилакоиды (рис. ЗГ). Аналогичные образования описаны у некоторых цианобактерий (Kunkel, 1982). Предполагается, что тилакоидные центры участвуют в компартментализации и биогенезе тилакоидов (Peschek, 1999).

Включения. Агрегаты газовых везикул расположены у Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 на полюсах клеток в области межклеточных контактов (рис, 2Б). Отдельная газовая везикула цианобактерий p. Prochlorothrix представляет собой цилиндр 5Gx( 125-265) нм с коническими концами, образованный неунитарной мембраной.

Рис. 3. Электронные микрофото фа фи и ультратонких срезов ЙгосЬЬгоШх эр. М\/А-8/90 (А; В) и сферопластоа Р. ЬоНапсЛса РСС 9006 (В; Г). Стрелками отмечены контакты Байера и тилакоидные центры. Т - типа ко иды; СМ - цитоллазматичеокая мембрана; Р - мурей новый слой. Масштаб; 0,1 мкм (А-В) и 0,2 мкм (Г).

В клетках цианобактерий р, РгосЫого(кпх обнаружены карбоксисомы. При этом у Р. ЬоЯстсИса РСС 9006 они имеют типичную полиэдральную форму и окружены оболочкой (рис, 4А). В отличие от них карбоксисомы РгосЫого1кг\х ар. МГУ А-8/90, идентифицированные методом иммунохимическои детекции ключевого фермента цикла Кальвина — КиВ^вСО, имеют округлую форму и лишены ограничивающей иеунитарной мембраны (рис. 2А).

На периферии клеток Р. ко11апсИса РСС 9006 нами выявлены округлые электроноплогные включения диаметром -100 им (рис, 4Б). Цитохимическим методом установлено, что они содержат кр ах м ал о п о до он ы й полимер.

Рис. 4. Электронные микрофотографии ультра тонких срезов Р. ЫатЯеа РСС 9006 (А, В). Стрелкой отменены крахмалоподобные включения, окрашенные парами Масштаб: 0,5 мкм (А) и 0,1 мкм (Б).

Таким образом, особенностями ультраструктуры представителей р. РгосЫогЫкгйс являются взаимная адгезия тилакоидов и ассоциация тилакоидов с карбоксисомами. Характерными деталями внутриклеточного строения РгосЫргоИтх йр. Ы1УА-8/90 являются «виридосомы» и атипичные карбоксисомы. а в случае Р. ко11апсИса РСС 9006 — крахмалоподобные включения.

3.2. Экофизиологические признаки

В проведенном исследовании учитывались две экофизиологические характеристики — галотолерантность и характер обратимых фотоиндуцированных изменений внеклеточного pli.

Галотолерантность. Для оценки галотолерантности к суспензионным культурам Prochlarothrix sp, NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 добавляли NaC! до конечной концентрации 50, 100, 200 и 400 мМ. Согласно полученным данным, уровень солености >100 мМ NaCI приводит к подавлению роста Prochlorothrix spp. (рис. 5).

А Б

Рис, 5. Динамика роста Prochlorothrix. sp. NIVA-8/9Q (А) и Р. hollandica РСС 9006 (Б) в присутствии NaCt.

Полученные результаты подтверждают сообщение о том, что при добавлении в среду NaCI >50 мМ рост культуры Р. hollandica РСС 9006 подавляется из-за неспособности накапливать глюкозу (Burger-Wiersma et al., 1989). Сходной чувствительностью к повышению солености среды, связанной с ограниченной способностью синтезировать о см о протекторы, характеризуются стеиогалинные формы цианобактерий {Oren, 2007).

Фогоиндуцированные изменения внеклеточного pH. Данный параметр характеризует не только направленность фотозависимых фйзиолого-биохимических процессов, но и экологическую роль циан о бактерий. В частности показано, что необратимое защелачивание внешней среды цианобактериями является одной из причин образования карбонатных осадков (Kaplan, 1989).

У представителей р. Prochlorothrix впервые показана способность к фото индуцированному защелачиванию среды. В частности, установлено, что при культивировании >2 недель Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Р. hollandica PCO 9006 защелачивают среду mBG-11 до pH 9,6-10,4. При кратковременном освещении наблюдается фотоиндуцированное внеклеточное защелачивание, характер которого зависит от объекта, уровня освещенности и температурного перехода культивирование^опыт (рис. 6). Различия в динамике этого процесса в опытных и контрольных вариантах штаммоспецифичны.

□ Prochlorothrix. sp. NIVA-8/90 Ш Р. hollandica РСС 9006 А Б

5500 Z7P0 1300 700 Э» 5ЯЮ ' X 10» JM 300

Освешслпост*. лк OcjficuiHitcie7V л*

Рис. 6. Кратковременное фотоиндуцированное изменение рН клеточных суспензий при 22" С (А); 26°С (В) и при температурном переходе 26->23°С (В) и 22->26°С (Г).

Для выяснения причин кратковременного защелачивания среды цианобактериями р. РгосЫогоЛгЫ использовали ингибиторы Н -АТФазы (БССБ) и карбоадгидразы (сульфодиметоксин), а также релаксаторы протонного градиента (СССР и N^01).

7.4 -J

7,7 -,

7,0 -

Т. а.

7,4 J

н

В

I__J

2 мин

i I

2 мин

7,4

4 ;

t_i

2 мин

7,7 _

7,e -

X

а.

7.5 -

7,4 J

i \ i \

-.к

i *

i_i

2 мин

^-освещение вкл. на 2 мин (5500 л к); ^-освещение выкл, -----контроль (без добавления ингибиторов)

Рис, 7. Кратковременное фотоиндуцированное изменение внеклеточного рН РгосЫогоШпх Бр. МУА-8/90 в присутствии ингибиторов КГ-АТФаэы - РССО (А) и карбоангидраэы - сул ьфодим етоксина (Б), в также релаксаторов протонного градиента СССР (В) и ШаС1 (Г).

Установлено, что при добавлении 2 мМ БССО, 0,5 мМ СССР или 500 мМ Ш4С1 | способность к фотоиндуцировапному защелачиваниго сходным образом подавляется у I представителей р. РгосЬ1ого!Ьпх (рис. 7). В то же время сульфодиметоксин не , оказывает влияния на эту способность. Предполагается, что кратковременное фотоиндуцированное защелачивание среды циан о бактерия ми р. РгосМого{}тх связано с симпортом С02 за счет протонного градиента создаваемого Н+~АТФазой.

3.3. Особенности организации фотосинтетического аппарата

Пигментный состав. Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Р. hoilandica РСС 9006 содержат идентичный набор хлорофиллов и каротиноидов, включающий хл а, хл Ь, | /?-каротин и зеаксантин (рис. 8). Установлено, что по составу хлорофиллов предста-I вители р. Prochlorothrix сходны с зеленой водорослью Chlorella sp., а по количеству

И

Oscillatoria sp.

Jj

LA

Chlorella sp.

UJcJ

Lil

Prochlorothrix sp. NIVA-B/90

UUl

10

P. hollandica PCC 9006

^JU.

id

_L

3D

0 to 20

Время выхода пиков (мин) Рис. 8. HPLC-хроматограмма. Неоксантин (1); осциллахсантин (2); виолаксантин (3); антераксантин (4); пютеин (5); зеаксантин (6); хл b (7); хл а (8); а-каротик (9); /^каротин (10).

-РЮМИЯЙнЫ sp NIVA-8f90

.......Calothrix sp. PCC 7601

-■—Synechocystis sp. PCC ßfl03 -— Clorvlla sp.

Длина волны (нм) Рис. 9. Спектры поглощения интактных клеток. Хл — хлорофилл. ФЭ — фикоэритрин, ФЦ —фикоцианин.

^каротина — с цианобактерией Oscillatoria sp. Однако, соотношение хл a/b у трихомных прохлорофитов значительно ниже (1:15), чем у Chlorella sp, — 1:1.

Спектры поглощения интактных клеток Prochlorothrix sp. NJ VA-8/90, a также объектов сравнения Calothrix sp. PCC 7601, Synechocystis sp. PCC 6803 и Chlorella sp. представлены на рис. 9 (максимумы при 440 нм и 690 им соответствуют хл а, плечо при 465 нм и максимум при 655 нм —- хл Ь, пик при 560 нм — фикоэритрину (ФЭ), а при 625 нм —■ фикоцианину (ФЦ). Данные спектров поглощения интактных клеток, а также водных фракций клеточных гомогенатов и, наряду с этим, спектров возбуждения или эмиссии флуоресценции (рис. 10 и 11) Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 свидетельствуют об отсутствии ф и ко б ил и проте и нов (ФБП), как и у P. hollandica PCC 9006. Следовательно, функции LHC у представителей рода Prochlorothrix выполняет хл a/ö-белковы й комплекс.

Особенности организации LНС. Согласно полученным результатам, у Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 LHC преимущественно ассоциирован с ФСП, поскольку спектр эмиссии низкотемпературной флуоресценции (зарегистрированной при 77 °К) имеет максимум в области 685-695 нм, соответствующий ФСП/ЬНС, а спектры эмиссии ФСП и LHC, в отличие от Synechocystis sp. PCC 6803 совпадают (рис. 11).

Напротив, у P. hollandica PCC 9006 в сходных условиях преобладает флуоресценция ФО/LHC, т.е. LHC преимущественно ассоциирован с ФС1 (van der Staay et al., 1992; Bumba et ah, 2005).

-Prochtamlhnx sp. NIVA-8/ЭО

.......Synecftocys/is sp. PCC 6803

---CalolMx sp. PCC 7601

Рис.10. Спектры возбуждения флуоресценции.

A

Б

Рис. 11, Спектры эмиссии флуоресценции Prochlorothrix sp. NIVA-&90 (А) и Synecho-cystis Sp. PCC 6803 (Б) при 77 "К.

Для сравнения молекулярной организации LHC Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P.hollandica PCC 9006, анализировали электрофореграммы меде 11 атурировaim ых CP и денатурированных препаратов тилакоидов. В частности, обнаружили, что набор CP у представителей p. Prochlorothrix различается по составу - у Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 выявлен дополнительный высокомолекулярный комплекс СР1а, а также по электрофоре™ ческой подвижности комплексов СР4/СР5 (рис. 12; I).

В дополнение к этому, на электро-фореграммах денатурированных препаратов тилакоидов у представителей p. Prochlorothrix обнаружены различия по электрофоретической подвижности полипептидов в области 28-40 кДа (рис. 12; II). Ранее показано, что у P. hoilandica пол и пептиды молекулярной массой 32, 33,5 и 35-38 кДа принадлежат LHC/ФСП (Post et al., 1994; van der Staay, Staehelin, 1994).

По-видимому, характер спектров эмиссии низкотемпературной флуоресценции, совместно с различиями в наборе CP и тилакоидиых полипептидов в области 28-40 кДа свидетельствуют об особенностях молекулярной организации LHC и/или разных типах ассоциации LHC с ФС1/ФСП у циан о бактерий p. Prochlorothrix.

В настоящее время имеются сведения дополняющие данные о поливариантности периферических антенных РсЬ-суперкомплексов у циано-б актер и й из группы прохлор офитов (Bumba et al., 2005).

Таким образом, циан о ба ктер и и p. Prochlorothrix идентичны по пигментному составу, но различаются молекулярной организацией LHC.

в

■ СР1 Щ «w-66kD

■СР1а - ЯМ — 45 kD

¡1

'СР2 Н fcU 36 к° Рис. 12. Э л ектрофор е гра м м ы

■ СРЗ fcgl РЦ » — 29 kD хлорофилл-белковых комплексов (I)

СР4 24 KD и типакоидных полипептидов (I!).

' СР5 т — 20 kD А—P. hollandica РСС 9006;

■ СР6 Б — Prochlorothrix sp, NIVA-8/90;

В — маркерные полипептиды.

— СР7 Щ | И— 14 kD

— FP

jjjpjjB

II

3.4. Гсносистематические признаки

Для сравнения м Ол екул ярно -ге нети чес ких признаков Prochlorothrix sp, NIVA-8/9О и Р. hollandica РСС 9006 определяли мол% ГЦ, степень ДНК-ДНК гибридизации и полиморфизм Hipl-последовательностей.

Методом термической денатурации установили, что температура плавления ДНК составляет для Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 78,9+0,9 °С, а для Р. hollandica РСС 9006 75,7±1,1 °С. В соответствии с этим, мол% ГЦ для Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 -—-57,6±1,8, а для Р. hollandica РСС 9006 -— 51,0+2,4. Обнаруженное различие составляет 6,6 мол% ГЦ и свидетельствует о принадлежности представителей рода Prochlorothrix кразным видам (Wilmotte, Golubic, 1991).

Более надежным критерием внутриродового различия и видового сходства служит степень ДНК-ДНК гибридизации (Wilmotte, 1994). В случае Р. hollandica РСС 9006 и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 она составляет 17,9%. Согласно рекомендации Международного комитета по систематике бактерий (ICSB), степень ДНК-ДНК гибридизации <30% свидетельствует о генетическом различии объектов на видовом уровне (Rosell6-Mora, Amann, 2001).

В качестве м о леку лярно -ген етич е с к о го признака, характеризующего инфраструктуру генома, широко используется полиморфизм Hipl-последовательностей (Robinson et al,, 1995). ДНК представителей р. Prochlorothrix картировали Hipl-пр а им ерам и и установили, что наборы Hipl-последовательностей Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 различаются по спектру амнлификонов с тремя прайм ерам и — HipAT, HipCA и HipTG (рис. 13), что служит достоверным геносистематическим различием на видовом уровне.

M AT СА TG

AT CA TG

6 КО—

ГЧ

Рис, 13, Эпекгрофореграммы ДНК-амплифи-конов P. hollandica РСС 9006 и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90.

1 kd —

'1 — n

AT — HipAT; CA — HipCA; TG —HipTG; M — маркерная ДНК Бактериофага К

150 Ьв

Prochlorothrix sp, NIVA-8/90

P. hollandica PCC 0006

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе изучены биологические особенности нового представителя трихомных прохлорофитов, относящихся к роду Prochlorothrix —Prochlorothrix sp. NIVA-8/90. Получены новые данные о ранее описанном виде — P. hollandica РСС 9006 (Burgcr-Wiersma et al., 1989), что в целом существенно дополняет имеющиеся сведения о биологии и разнообразии цианобактерий-прохлорофитов.

Показано, что трихомпые прохлорофиты p. Prochlorothrix морфологически сходны с осциллаториевыми цианобактериями. В связи с этим, согласно нашей рекомендации (Pinevich el aL, 1997}, во 2-м издании «Руководства Берги...» циа-нобактерии рода Prochlorothrix помещены в Субсекцию III Oscillatoriales филы ВХ Cyanobacteria (Castcnholz, 2001), Однако, при общем плане строения, Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 различаются линейными параметрами клеток и некоторыми ультраструктурными и физиолого-биохи м ическими особенностями.

Представители p. Prochlorothrix имеют одинаковый пигментный состав — хл alb, /?-каротип и зеаксантин, но не образуют ФБП. Функции LHC у трихомных прохлоро-фитов выполняет хл «/¿-белковый комплекс. Наряду с этим, обнаруженные отличия r наборе хлорофилл-белковых комплексов, а также полипептидов фотосинтетических мембран (в области LHC/ФСП), свидетельствует о различиях молекулярной организации LHC у Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006.

Согласно принятому Международным комитетом по систематике бактерий консенсусу, разными видами являются штаммы у которых различие ГЦ-пар составляет более чем 5 мол%, а степень ДНК-ДНК гибридизации менее 30%. Подученные значения стандартных геносистематических признаков (Д мол% ГЦ=6,6; степень ДНК-ДНК гибридизации — 17,9%), а также различия в спектре Hipl-амшщфивднов указывают на то, что штаммы Prochlorothrix sp, NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 относятся к разным видам.

Таким образом, по совокупности морфологических, ультрасгруктурных, эко-физиологических и молекулярно-генетических особенностей рекомендуется рассматривать штамм Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 в качестве нового вида рода Prochlorothrix с предварительным названием «Prochlorothrix scandica» (см.: Pinevich et al., 1999).

выводы

1. Впервые дано комплексное описание морфологических, экофизиологических и молекулярно-генетических признаков нового представителя рода Prochlorothrix -Prochlorothrix sp. NIVA-8/90.

2. Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 имеют сходную морфологию, но достоверно различаются линейными параметрами клеток.

3. Особенностями внутриклеточной организации представителей рода Prochlorothrix являются способность тилакоидов к адгезии и пространственная ассоциация тилакоидов и карбоксисом. Для ультраструктуры Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 характерны регулярно расположенные на поверхности тилакоидов структуры диаметром ~10нм и атипичные карбоксисомы, а для P. hollandica PCC 9006 — крахмалоподобные включения.

4. Рост Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 полностью подавляется при уровне солености среды >100 мМ NaCl, что позволяет рассматривать их как стеногалинные формы.

5. Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 вызывают видоспецифич-ное кратковременное фотоиндуцированное защелачивание среды, которое блокируется ингибитором Н+-АТФазы (DCCD) и релаксаторами протонного градиента (СССР и NH4CI), но не чувствительно к ингибитору карбоангидразы (сульфодиметоксину); по-видимому оно происходит в результате импорта СО2 за счет протонного градиента, создаваемого Н+-АТФазой.

6. Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 имеют одинаковый набор хлорофиллов (хл alb) и каротиноидов (ß-каропт и зеаксантин) и не содержат фикобилипротеинов.

7. Различия в составе и электрофоретической подвижности хлорофилл-белковых комплексов (CP 1а и СР4/СР5), а также наборе тилакоидных полипептидов (2840 кДа), совместно с данными о типе преимущественной ассоциации LHC с фотосистемами свидетельствуют о поливариантности молекулярной организации LHC у представителей p. Prochlorothrix.

8. Морфофизиологические особенности и стандартные геносистематические критерии видового отличия (Амол% ГЦ=6,6; степень ДНК-ДНК гибридизации 17,9%), а также различия в спектре Hipl-амплификонов указывают на то, что Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 относятся к разным видам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Пииевич А.В., Величко Н.В., Базанова А.В. Прохлорофиты двадцать лет спустя // Физиология растений. 2000. Т.47, С. 1-5.

2. Pinevich А.V., Skulberg О.М., Matthijs Н.С.Р., Shubert H., Willen E., Gavrilova O.V., and Velichko N.V. Characterization of a novel chlorophyll ¿-containing Prochlorothrix species (Prochlorophyta) and its photosynthetic apparatus // Microbios, 1999. V.100, P.159-174.

3. Pinevich A.V., Averina S.G., and Velichko N.V. Another view on the role of photosynthetic pigments in taxonomy of oxygenic-phototrophic bacteria: a proposed rejection of order Prochlorales Florenzano, Balloni, and Materassi 1986 (emend. Burger-Wiersma, Stal, and Mur 1989), family Prochloraceae Florenzano, Balloni, and Materassi 1986, and family Prochlorotrichaceae Burger-Wiersma, Stal, and Mur 1989 // Intern. J. Syst. Bacterid. 1997. Vol.47, P.1264-1267.

4. Pinevich A.V., Matthijs H.C.P., Gavrilova O.V., Averina S.G., and Velichko N.V. New ultrastructural aspects of membranes and cell inclusions in Prochlorothrix hollandica (Prochlorales, Cyanobacteria) // Microbios. 1996. Vol.87, P.217-225.

Тезисы:

1. Величко H.B. Биоразнообразие цианобактерий из группы прохлорофитов // Материалы III Всероссийской научн. конф. «Принципы и способы сохранения биоразнообразия», Пущино. 2008. С.54.

2. Pinevich A.V., Bazanova A.V., Velichko N.V. Occurrence and mechanisms of the extracellular calcium deposition (environmental biomineralization) mediated by cyanobacteria // Abstr. I Intern. Sympos. «Bio-Inert Interactions: Life and Rocks», Moscow. 2002. P.108-112.

3. Velichko N.V., Pinevich A.V. Diversity of LHC in cyanobacteria and prochloro-phytes // Abstr. VII Intern. Cyanobact. Conf. «А Signal Event», Asilomar. 2001. P.23.

4. Pinevich A.V., Velichko N.V. Light-harvesting antennal systems of cyanobacteria and plastids: principles and (evolutionary) diversity // Abstr. VI Eur. Res. Conf. «Molecular Bioenergetics of Cyanobacteria: Physiological, Ecological, and Economical Implications», Obernai. 2001. P.25-26.

5. Velichko N.V. Structural and molecular criteria of species delimination in filamentous prochlorophytes // Abstr. II Eur. Phycol. Congr., Montecatini Terme. 2001. P.32.

6. Величко H.B., Пиневич А.В. Пигмент-белковые комплексы и полипептиды тилакоидов двух представителей нитчатых Oxyphotobacteria // Материалы межд. конф. «Автотрофные микроорганизмы», Москва. 2000. С.37.

7. Величко Н.В., Пиневич А.В. Фотоиндуцированные изменения внеклеточного рН в культурах цианобактерий рода Prochlorothrix // Материалы межд. конф. «Автотрофные микроорганизмы», Москва. 2000. С.35.

8. Величко Н.В., Пиневич А.В. Использование метода «зеленых гелей» при сравнительном анализе фотосинтетического аппарата нитчатых прохлорофитов // Материалы межд. конф. «Микология и криптогамная ботаника в России: традиция и современность», С.-Петербург. 2000. С.409—411.

9. Gromov B.V., Velichko N.V., Batov A.Y., Bazanova A.V., and Pinevich A.V. Transient extracellular light-induced pH shifts in resting cultures of cyanobacteria from the genus Prochlorothrix II Abstr. Ill INTAS Interdiscipl. Symp. «General Biochemistry, Biotechnology, and Environment», Moscow. 2000. P.44-45.

10. Velichko N.V., Pinevich A.V. Lacustrian habitats of chlorophyll ¿-bearing oxyphotoprokaryotes (results and perspectives) // Abstr. Ill Intern. Lake Ladoga Symp., Petrozavodsk. 1999. P.72.

11. Velichko N.V., Pinevich A.V. The specifity of LHCII in Prochlorothrix «scandica» (ultrastructural and spectroscopic data) // Abstr. V Eur. Intern. Res. Conf. «Molecular Bioenergetics of Cyanobacteria», Gmunden. 1999. P.98.

12. Pinevich A.V., Velichko N.V., Basanova A.V., Usova T.V., and Averina S.G. The occurrence, cell biology and pigment composition of rare oxyphotoprokaryotes in North European Lakes // Proc. Ill Intern.Lake Ladoga Symp., Petrozavodsk. 1999. P. 136-141.

13. Базанова A.B., Величко H.B., Усова T.B., Пиневич А.В. Новое направление в изучении фотоакклиматизации бактериопланктона // Седьмая ежегодн. научн. конф. «XXI век: молодежь, образование, экология, ноосфера», С.-Петербург. 1999. С.24.

14. Величко Н.В. Ультраструктура Prochlorothrix hollandica и Prochlorothrix nordica (Prochlorophyta): новые сравнительные аспекты // Материалы межд. конф. «Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI в.», С.-Петербург. 1998. С.88.

15. Величко Н.В. Особенности антенного комплекса нового представителя прохлорофит - Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 // Труды победителей конкурса грантов для студентов, аспирантов и молодых ученых Санкт-Петербурга, С.Петербург. 1998. С.44-45.

16. Громов Б.В., Гаврилова О.В., Аверина С.Г., Величко Н.В., Усова Т.В., Пиневич А.В. Коллекция культур атипично пигментированных пресноводных и почвенных цианобактерий с коротковолновым максимумом основного светособи-рающего комплекса // Тезисы докладов Всерос. конф. «Автотрофные микроорганизмы», Москва. 1996. С.32.

Подписано в печать 13.10.2008 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 922.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Величко, Наталия Владиславовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. История открытия цианобактерий-прохлорофитов и их распространение.

1.1.1. Представители р. Рноснюлом.

1.1.2. Представители р. Ркоснюиотешх.

1.1.3. Представители р. Ркоснююсосст.

1.1.4. Представители р. Асаягосншшб.

1.2. Метаболизм цианобактерий-прохлорофитов.

1.3. Экофизиологические условия обитания цианобактерий-прохлорофитов.

1.4. Морфология цианобактерий-прохлорофитов.

1.5. Внутриклеточное строение цианобактерий-прохлорофитов.

1.5.1. Клеточная оболочка

1.5.2. ИНТРАЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ

1.5.3. Зона нуклеоида.

1.5.4. Включения.

1.5.5. Покровные структуры.

1.6. Способы подвижности цианобактерий.

1.7. Особенности организации фотосинтетического аппарата цианобактерий и прохлорофитов.

1.7.1. Пигментный состав.

1.7.2. Состав и структура фотосинтетического аппарата.

1.8. Систематика и филогения представителей филы ВХ Суаиовастеша.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование цианобактерий рода Prochlorothrix"

Фила ВХ Cyanobacteria является одной из наиболее архаичных ветвей эволюционного древа Bacteria. В ее состав входят оксигенные фототрофные бактерии QCyanobacteria), облигатные эндоцитобионты Glaiicocystophyceae (цианеллы), а также пластиды высших растений и зеленых водорослей (Castenholz, 2001). Наряду с этим их объединяет способность осуществлять оксигенную фототрофию, которую детерминируют консервативные гены, кодирующие апопротеины фотосистемы I (psaA-M), фотосистемы II (psbA-fV) и Мп-стабилизирующий белок водоокисляющего комплекса (psbO) фотосинтетического аппарата. В то же время состав пигментов и апопротеинов светособирающих комплексов у окси-генных фототрофов варьирует (Пиневич, Аверина, 2002).

В зависимости от типа основного светособирающего комплекса (англ. light harvesting complex, LHC) оксигенные фототрофные бактерии подразделяются на собственно циа-нобактерий и прохлорофитов, или «других цианобактерий» (Matthijs et al, 1994). Собственно цианобактерии обладают эпимембранными гидрофильными LHC — фикобилисомами (ФБС), содержащими фикобилипротеины (ФБП). Прохлорофиты имеют интегральные гидрофобные мультимерные хлорофилл-белковые комплексы. В' отличие от цианобактерий sensu stricto прохлорофиты содержат хотя бы один вспомогательный хлорофилл (Пиневич и др., 2000). Данные последних лет расширили представления о разнообразии вспомогательных пигментов у прохлорофитов. Помимо хлорофилла (хл) Ъ к ним относятся дивинил-хл alb (ailbi), хл^ и хл с-подобный пигмент (Chisholm et al., 1992; Larkum et al., 1994; Miyashita et al., 1995). Оказалось также, что у прохлорофитов ФБП могут сосуществовать с хл d, как у Acaryochloris marina (Marquardt et al., 1998) или с хл а^Ьг, как у Prochlorococcus marinus (Hess et al., 1996).

В первом издании «Руководства Берги по систематике бактерий» прохлорофитов диагностировали по наличию/отсутствию вспомогательного хл b (Castenholz, Waterbury, 1989). На основании этого хемотаксономического критерия в секции Oxygenic Phototrophic Bacteria (Оксигенные Фототрофные Бактерии) для представителей прохлорофитов выделили'порядок Prochlorales. Согласно последнему изданию «Руководства Берги по систематике бактерий» прохлорофитов, как и прочих представителей филы ВХ Cyanobacteria, классифицируют с помощью морфологических критериев (Castenholz, 2001). В соответствии с этой фенотипической классификацией одноклеточные бинарно делящиеся прохлорофиты Prochloron didemni, Prochlorococcus marinus и Acaryochloris marina относятся к Субсекции I (ранее пор. Chroococcales), а трихомные прохлорофиты рода Prochlorothrix — к

Субсекции III (ранее пор. Oscillatoriales). По результатам секвенирования 16S-pPHK установлено, что прохлорофиты полифилетичны, но все они располагаются на дендрограмме филы ВХ Cyanobacteria (Urbach et al., 1992; Wilmotte, Herdman, 2001).

В настоящее время основной акцент изучения цианобактерий из группы прохлоро-фитов сместился из области клеточной палеонтологии и эволюции пластид в область молекулярной эволюции апопротеинов светособирающих комплексов, а также их участия в распределении энергии между фотосистемами (Lewin, 1981; Wolfe et al., 1994; McFadden, 1996; Bibby et al., 2003a; Boichenko et al., 2007). Изучение биологического разнообразия Cyanobacteria позволяет выявить новые аспекты организации фотосинтетического аппарата оксигенных фототрофов и реконструировать пути эволюции их антенных систем (Chen et al., 2005b). Особый интерес представляет сравнительный анализ морфологических и моле-кулярно-генетических признаков, а также экофизиологических особенностей новых представителей цианобактерий из группы прохлорофитов.

В данной работе предпринято исследование цианобактерий-прохлорофитов p. Prochlorothrix — Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Prochlorothrix hollandica PCC 9006. Полученные результаты рассматриваются в свете общих вопросов проблем классификации цианобактерий.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Величко, Наталия Владиславовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые дано комплексное описание морфологических, экофизиологических и молекулярно-генетических признаков нового представителя рода Prochlorothrix — Prochlorothrix sp. NIYA-8/90.

2. Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Р. hollandica PCC 9006 имеют сходную морфологию, но достоверно различаются линейными параметрами клеток.

3. Особенностями внутриклеточной организации представителей рода Prochlorothrix являются: способность тилакоидов к адгезии и пространственная ассоциация тилакоидов и карбоксисом. Для ультраструктуры Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 характерны регулярно расположенные на поверхности тилакоидов структуры диаметром —10 нм и атипичные карбокси-сомы, а для Р. hollandica PCC 9006 — крахмалоподобные включения.

4. Рост Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Р. hollandica PCC 9006 полностью подавляется при уровне солености среды >100 мМ NaCl, что позволяет рассматривать их как стеногалинные формы.

5. Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Р. hollandica PCC 9006 вызывают видоспе-цифичное кратковременное фотоиндуцированное защелачивание среды, которое блокируется ингибитором Н+-АТФазы (DCCD) и релаксаторами протонного градиента (СССР и NH4CI), но не чувствительно к ингибитору карбо-ангидразы (сульфодиметоксину); по-видимому оно происходит в результате импорта СО2 за счет протонного градиента, создаваемого Н+-АТФазой.

6. Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Р. hollandica PCC 9006 имеют одинаковый набор хлорофиллов (хл а/Ь) и каротиноидов (уЗ-каротин и зеаксантин) и не содержат фикобилипротеинов.

7. Различия в составе и электрофоретической подвижности хлорофилл-белковых комплексов (СР1а и СР4/СР5), а также наборе тилакоидных полипептидов (28—40 кДа), совместно с данными о типе преимущественной ассоциации LHC с фотосистемами свидетельствуют о поливариантности молекулярной организации LHC у представителей р. Prochlorothrix.

8. Морфофизиологические особенности и стандартные геносистематические критерии видового отличия (Дмол% ГЦ=6,6; степень ДНК-ДНК гибридизации 17,9%), а также различия в спектре Hipl-амплификонов указывают на то, что Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Р. hollandica PCC 9006 относятся к разным видам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В круг проблем систематики прокариотов традиционно входит вопрос определения вида (Пиневич, 1999; Bull et al., 2000; Geyers et al., 2005; Cohan, 2006). Понятие вида является устойчивым у эукариотических организмов (Мауг, 1988). В то же время в микробиологии общепринятого определения вида до сих пор не существует. В ряде случаев, под понятием вида у прокариотов, подразумевают «группу штаммов, проявляющих высокую степень сходства и отличающихся от подобных групп штаммов по многим независимым характеристикам» или «группу штаммов общего происхождения, сходных между собой в большей степени, чем с любыми другими штаммами» (Palleroni, 1983; Rosellö-Mora, Amann, 2001; Пиневич 2007). При этом, классификация цианобактерий усложняется тем, что отдельные признаки объектов (такие как наличие капсулы, чехла или окраска) не являются постоянными и могут исчезать или изменяться при лабораторном культивировании. Вследствие этого, появилась необходимость комплексного подхода в классификации цианобактерий по совокупности фенотипических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических признаков (Wil-motte, Herdman, 2001).

В случае p. Prochlorothrix, исследовались два известных изолята, происходящих из географически разных мест Северной Европы — озер Швеции и Голландии.

Согласно морфологическим признакам, цианобактерии р. Prochlorothrix относятся к Субсекции III, Oscillatoriales (Castenholz, 2001). Они имеют прямые неветвящиеся трихомы без чехла. Трихом состоит из недифференцированных цилиндрических клеток с неглубокими межклеточными перетяжками (1/5-1/8 диаметра клетки).

Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 имеют сходный план клеточного строения: центральное положение зоны нуклеоида, полярные агрегаты газовых везикул, параллельно-периферическое расположение тилакоидов. Среди общих деталей ультраструктуры Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 отмечены: способность тилакоидов к образованию стопок, пространственная ассоциация карбоксисом с тилакоидами, а также контакты Байера и тилакоидные центры.

При сходной морфологии, Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 различаются размером клеток и деталями внутриклеточной организации.

В частности, у Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 карбоксисомы не имеют характерной полиэдральной формы и ограничивающей мембраны, а на поверхности тилакоидов обнаружены регулярно расположенные эпимембранные структуры (размером -10 нм). У P. hollandica РСС 9006 выявлены включения крахмалоподобного полисахарида.

Представители p. Prochlorothrix характеризуются сходной чувствительностью к незначительному повышению уровня солености среды, что характеризует их как стеногалинные формы. При повышении уровня солености среды свыше 100 мМ NaCl рост Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 подавляется.

У цианобактерий p. Prochlorothrix описана способность к фотоиндуцированному заще-лачиванию среды, связанная с ассимиляцией СОг- Показано, что характер кратковременного фотоиндуцированного защелачивания различается у - Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 и зависит от освещенности и температуры (культивирования и опыта). Установлено, что кратковременное фотоиндуцированное защелачивание среды представителями p. Prochlorothrix подавляется в присутствии ингибиторов Н+-АТФаз FoFi-типа и релаксаторов протонного градиента.

Представители p. Prochlorothrix обладают идентичным хлорофилл-каротиноидным составом, который включает хл а!Ъ (в соотношении 1:15), /2-каротин и зеаксантин. Результаты спектроскопии и спектрофлуориметрии свидетельствуют об отсутствии ФБП у Prochlorothrix sp. NIVA-8/90, а функции основного светособирающего комплекса у представителей p. Prochlorothrix выполняет хл alb-LHC. Результаты электрофоретического разделения денатурированных и неденатурированных тилакоидных препаратов свидетельствуют о том, что молекулярная организация LHC у представителей p. Prochlorothrix различается.

Результаты, полученные с помощью молекулярно-генетических методов анализа подтверждают принадлежность Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 к p. Prochlorothrix. Наряду с этим, значения А мол% ГЦ и степени ДНК-ДНК гибридизации, а также различия в наборах ITS и Hip 1-последовательностей свидетельствуют о видовом уровне геносистематических отличий представителей p. Prochlorothrix.

Таким образом, по совокупности морфологических, ультраструктурных, экофизиоло-гических и молекулярно-генетических особенностей рекомендуется выделить Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 в качестве самостоятельного вида p. Prochlorothrix с предварительным названием «Prochlorothrix scandica».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Величко, Наталия Владиславовна, Санкт-Петербург

1. Громов Б.В. Ультраструктура сине-зеленых водорослей.—JL: Наука, 1976. —89с.

2. Громов Б.В. Положение сине-зеленых водорослей в системе прокариот // Вестник ЛГУ. — 1981. — С. 100-105.

3. Громов Б.В. Цианобактерии в биосфере // Сор. обр. журн. — 1996. — С.33-39.

4. Гусев М. В., Минеева Л.А. Микробиология. — М.: Изд-во «Академия», 2006,—464с.

5. Еленкин A.A. Сине-зеленые водоросли СССР. Специальная (систематическая) часть // М.-Л., 1936. — 984с.

6. Кондратьева E.H. Автотрофные прокариоты. — М.: Изд-во МГУ, 1996. — 302с.

7. Кондратьева Н.В. Современные подходы к разработке систематики Cyanophyta II Альгология. — 1997. — Т.7. — С.409^118.

8. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Изд-во Высш. школа, 1990. — 352с.

9. Пиневич А. В., Чунаев A.C. Проблема таксономии и филогенеза прохлоро-фит — прокариотических организмов, имеющих хлорофилл b II Журн. общ. биол. — 1985. — Т.46. — С.535-540.

10. Пиневич A.B., Протасов Е.А. Компартментализация Н* -транслоцирующих интрацитоплазматических мембран цианобактерий: данные изучения фото-индуцированного снижения pH клеточных суспензий // Вестник ЛГУ. — 1991. — С.77-84.

11. Пиневич A.B. Проблемы классификации цианей и других прокариотных ок-сифотобионтов // Ботан. журн. — 1999. — Т.84. — С. 1-19.

12. Пиневич A.B. Прохлорофиты двадцать лет спустя / A.B. Пиневич, Н.В. Величко, A.B. Базанова// Физиол. раст. — 2000. — Т. 47. — С. 1-5.

13. Пиневич A.B. Оксигенная фототрофия / A.B. Пиневич, С.Г. Аверина. — СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2002. — 236с.

14. Пиневич A.B. Микробиология. Биология прокариотов. Т.1. — СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2006. — 352с.

15. Пиневич A.B. Микробиология. Биология прокариотов. Т. 2. — СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2007. — 331с.

16. Alberte R. S., Cheng L., Lewin R.A. Photosynthetic characteristics of Prochloron sp./ascidian symbioses // Marine Biology. — 1986. — Vol.90. — P.575-587.

17. Allakhverdiev S.I. Genetic engineering of the unsaturation of fatty acids in membrane lipids alters the tolerance of Synechocystis to salt stress // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol.96. — P.5862-5867.

18. Anagnostidis K., Komarek J. Modern approach to the classification system of cyanophytes. 3. — Oscillatoriales II Arch. Hydrobiol. / Suppl., Algol. Stud. — 1988. — V.50-53. — P.327-472.

19. Badger M.R., Price G.D. CO2 concentrating mechanisms in cyanobacteria: molecular components, their diversity and evolution // J. Exp. Bot. — 2003. — V.54. — P.609-622.

20. Barber J., Kiihlbrandt W. Photosystem IIII Curr. Opin. Struct. Biol. — 1999. — V.9. — P.469—475.

21. Bartlett S.G., Mitra M., Moroney J.V. CO2 concentrating mechanisms // In: R.R. Wise, J.K. Hoober (eds). The Structure and Function of Plastids. — Netherlands, Dordrecht e.a.: Springer, 2006. — P.253-271.

22. Bayer M.E. Zones of membrane adhesion in cryofixed envelope of Esherichia coli //J. Struct. Biol. — 1991. —Vol.107. —P.268-280.

23. Bertocchi C., Navarini L., Cesaro A., Anastasio M. Polysaccharides from cyanobacteria // Carbohydr. Polym. — 1990. — Vol. 12. — P. 127-153.

24. Bibby T.S., Nield J., Barber J. A photosystem II-like protein, induced under iron-stress, forms an antenna ring around photosystem I trimer in cyanobacteria // Nature. — 2001. — Vol.412. — P.743-745.

25. Bibby T.S., Nield J., Chen M., Larkum A.W.D., Barber J. Structure of a photosystem II supercomplex isolated from Prochloron didemni retaining its chlorophyll alb light-harvesting system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003a. — Vol.100. — P.9050-9054.

26. Bibby T.S., Mary I., Nield J., Partensky F., Barber J. Low-light-adapted Prochloro-coccus species possess specific antennae for each photosystem // Nature. — 2003b. — Vol.424. — P.1051-1054.

27. Bradley P. M. Protoplasts and spheroplasts of cyanobacteria // Int. Rev. Cytol. — 1983. — №16 (suppl.). — P.5-19.

28. Britt R.D. Oxygenic photosynthesis: the light reactions // In: D.R. Ort, C.F. Yocum (eds.). Oxygen Evolution. — Netherlands, Dordrecht e.a.: Kluwer Acad. Publ., 1996. —P.137-164.

29. Boichenko V.A., Klimov V.V., Miyashita H., Miyachi S. Functional characteristics of chlorophyll ¿/-predominating photosynthetic apparatus in intact cells of Acaryochloris marina II Photosynth. Res. — 2000. — Vol.65. — P.269-277.

30. Boichenko V.A., Pinevich A.V., Stadnichuk I.N. Association of chlorophyll alb-binding Pcb proteins with photosystems I and II in Prochlorothrix hollandica II Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 2007. — Vol.1767. — P.801-806,

31. Bryant D.A. The cyanobacterial photosynthetic apparatus: comparison to those of higher plants and photosynthetic bacteria // Can. Bull. Fish. Aquat. Res. — 1986. — Vol.214. — P.423-500.

32. Bull A.T., Ward A.C., Goodfellow M. Search and discovery strategies for biotechnology: the paradigm shift // Microb. Mol. Biol. Rev. — 2000. — Vol.64. — P.573-606.

33. Bullerjahn G.S., Matthijs H.C.P., Mur L.R, Sherman L.A. Chlorophyll-protein composition of the thylakoid membrane from Prochlorolhrix hollandica, a pro-karyote containing chlorophyll b II Eur. J. Biochem. — 1987. — Vol.168. — P.295-300.

34. Bullerjahn G.S., Jensen T.S., Sherman D.M., Sherman L.A. Immunological characterization of the Prochlorothrix hollandica and Prochloron sp. chlorophyll alb antenna proteins 11FEMS Microbiol. Lett. — 1990. — Vol. 67. — P.99-106.

35. Bumba L., Prasil O., Vacha F. Antenna ring around trimeric photosystem I in a pho-tosynthetic prokaryote Prochlorothrix hollandica II Biochim. Biophys. Acta. — 2005. — V.1708.— P.l-5.

36. Burger-Wiersma T., Veenchuis M., Korthals H.J. A new prokaryote containing chlorophylls a and b II Nature. — 1986. — Vol.320. — P.262-264.

37. Burger-Wiersma T., Post A.F. Functional analysis of the photosynthetic apparatus of Prochlorothrix hollandica (.Prochlorales), a chlorophyll b containing prokaryote // Plant Physiol. — 1989. — Vol.91. — P.770-774.

38. Burger-Wiersma T. Prochlorothrix hollandica: a filamentous prokaryotic species containing chlorophylls a and b II Algol. Stud. — 1991. — Vol.64. — P.555-558.

39. Castenholz R.W. General characteristics of the cyanobacteria // In: Boone D.R., Castenholz R.W. (eds.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd ed.). — New York e.a.: Springer-Verlag, 2001.

40. Carr N.G., Mann N.H. The oceanic cyanobacterial picoplankton // In: D. A. Bryant (ed.). The molecular biology of cyanobacteria. —Netherlands, Dordrecht e.a.: Klu-wer Acad. Publ., 1994. — P.27-48.

41. Cepak V. Variability of nucleoid morphology of some cyanophytes growing under various growth conditions // Algol. Stud. — 1996. — Vol.81. — P.39-52.

42. Chen M., Quinnell R.G., Larkum A.W.D. The major light-harvesting pigment protein oi Acaryochloris marina IIFEBS Lett. — 2002. — Vol.514. — P. 149-152.

43. Chen M., Bibby T.S., Nield J., Larkum A.W.D., Barber J. Iron deficiency induces a chlorophyll ¿/-binding Pcb antenna system around photosystem I in Acaryochloris marina II Biochim. Biophys. Acta. — 2005a. — Vol.1708. — P.367-374.

44. Chen M., Hiller R.G., Howe C.J., Larkum A.W.D. Unique origin and lateral transfer of prokaryotic chlorophyll-6 and chlorophyll-c/ light-harvesting systems // Mol. Biol. Evol. — 2005b. — Vol.22. — P.21-28.

45. Chisholm S.W., Olson R.J., Zettler E.R. A novel free-living prochlorophyte abundant in the oceanic euphotic zone // Nature. — 1988. — Vol.334. — P.340-343.

46. Chisholm S.W., Frankel S.L., Goericke R. Prochlorococcus marinus nov. gen. nov. sp.: an oxyphototrophic marine prokaryote containing divinyl chlorophyll a and b II Arch. Microbiol. — 1992. — Vol.157. — P.297-300.

47. Codd G.A., Marsden W.J.N. The carboxysomes (polyhedral bodies) of autotrophic prokaryotes // Biol. Rev. — 1984. —V. 59. — P.380-422.

48. Codd G.A. Carboxysomes and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase // Adv. Microbiol. Physiol. — 1988. — V.29. — P. 115-162.

49. Coleman A.W., Lewin R.A. The disposition of DNA in Prochloron (Prochloro-phyta) // Phycologia. — 1983 — Vol. 22. — P.209-212.

50. Coleman M.L., Sullivan M.B., Martiny A.C., Steglich C., Barry K,, De Long E.F., Chisholm S.W. Genomic islands and the ecology and evolution of Prochlorococcus II Science. — 2006. — Vol. 311. — P. 1768-1770.

51. Cohan F.M. Towards a conceptual and operational union of bacterial systematics, ecology, and evolution // Philosoph. Trans. R. Soc. B. — 2006. — Vol.361. — P.1985-1996.

52. Cox G. Comparison of Prochloron from different hosts // New Phytol. — 1986. — Vol.104. —P.429-445.

53. Dembinska M.E., Allen M.M. Cyanophycin granule size variation in Aphano-capsa H J. Gen. Microbiol. — 1988. — V.134. — P.295-298.

54. De Ley J., Cattoir H., Reynarts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates // Eur. J. Biochem. — 1970. — Vol.12. — P. 133 — 142.

55. Doty P., Marmur J., Einger J., Schildkraut C. Strand separation and specific recombination in deoxyribonucleic acids: physical chemical studies // Biochemistry. — 1960. — Vol.46. — P.461—476.

56. Douglas S. Plastid evolution: origins, diversity, trends // Curr. Opin. Gen. Dev. — 1998. — Vol.8. — P.655-661.

57. Dufresne A. et al. Genome sequence of the cyanobacterium Prochlorococcus mari-nus SSI20, a nearly minimal oxyphototrophic genome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003. — Vol. 100. — P. 10020-10025.

58. Fredrick J.F. The or-l,4-glucans of Prochloron, a prokaryotic green marine alga // Phytochemistry. — 1980. — Vol.19. — P. 2611-2613.

59. Fromme P. Structure and function of photosystem I // Curr. Opin. Struct. Biol. — 1996. — Vol.6. — P.473—484.

60. Gantt E. Supramolecular membrane organization // In: D.A. Bryant (ed.). The Molecular Biology of Cyanobacteria. —Netherlands, Dordrecht e.a.: Kluwer Acad. Publ., 1994. —P.l 19-138.

61. Garczarek L., van der Staay G.W.M., Thomas J. C., Partensky F. Isolation and characterization of Photosystem I from two strains of the marine oxyphotobacte-rium Prochlorococcus II Photosynth. Res.— 1998. — Vol.56. — P. 131-141.

62. Garczarek L. et al. Multiplication of antenna genes as a major adaptation to low light in a marine prokaryote // Proc Natl. Acad. Sci. USA / 2000. — Vol. 97. — P.4098-4101.71.