Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Устойчивость мембран фотоавтотрофных термофильных организмов к действию высоких температур

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость мембран фотоавтотрофных термофильных организмов к действию высоких температур"



-ги-ч

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИИ. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИ! ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 677.352.32

КАУРОВ Юрий Николаевич

УСТОЙЧИВОСТЬ МЕМБРАН ФОТОАВТОТРОШЫХ ТЕР1ЮФИЛШВС ОРГАНИЗМОВ К ДЕЙСТВИЮ ВЫСОКИХ ТЕМПЕРАТУР

специальность 03.00.02. - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, эам.директора института

В.В.Климов,

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Н.Г.Бухов,

доктор физико-математических наук, нроф эссор

А.К.Кукушкин.

Ведущая организация: Институт биохимии им.Л.Н'.Баха РАН.

Защита состоится ' '1С/-6>/-Ш.~ Л993 г. чао,

на заседании Специализированного Ученого Совета Д.063.Об.БЗ при Московском государственном университете по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет (ЛИК).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослав "/У* 1993 г.

Ученый секретарь .• Специализированного совета, доктор биологических наук . профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность ьооблемы. Выяснение механизмов устойчивости термофильных фотосинтетических организмов к действию высоких температур . является одной из фундаментальных проблем в исследованиях принципов стабилизации биологических систем. Ее важное значение'обусловлено тем, что температура окружающей среды относится к числу постоянно действующих природных факторов, которые определяют эффективность и со^ .'ношение различных типов межмолекулярных взаимодействий, формирующих внутриклеточные системы . и организации клетки в целом. Интерес к исследованию термоустойчивости фотосинтетических организмов связан с естественным ходом развития представлений i физико-хими^ских. основах внутриклеточного метаболизма, - интенсификацией биотехнологических исследований и другими многоплановыми задачами практического характера. -

Первые реальные успехи в исследовании термофил i были достигнуты в 60-80 годах нашего столетия. Было показано, что адаптация бактерий и растений к повышенным температуре , а также переход от мезофильных к термофильным формам жизни бактерий и водорослей сопровождается изменением липидного состава мембран и повышением термоустойчивости белков. Общая тврмоустойчк°ость клеток в первую очередь определяется структурной и функциональной устойчивость» мембранных комплексов, в частности, термоустойчивость клеток фотоавтотрофов зависит от устойчивости лшопротеиновых мембранных комплексов ФСи (см., например, Singleton-and Amelunxen, 1973; Александров, 1975; Логинова, 1982; Qulnn and Williams, 1983; ¿еразга и Можаев 1985). Благодаря дальнейшим детальным . исследованиям стали в основном понятными конкретные механизмы структурной тврмоустойчивости белков и принципы влияния температуры на фазовое состояние искусствень_х мембран, построенных из индивидуальных лшшдов. Показано огромное разнообразив структурных перестроек мембран, начиная от появления микрогетерогенного (кластерного) распределения липицов до полного нарушения ламеллярной организации липидного олслоя. Однако-, остается неясным вопрос о роли и взаимосвязи различных структурных изменений белковых и липидных компонентов в обеспечении

функциональной устойчивости биомембран. Выяснение этого вопроса осложняется тем, что с помощью прямых традиционных методов исследования конформационных перестроек липидныт систем термоиду цировашг - э структурные сдвиги в лшшдном матриксе биомембран удается уветенно обнаружить только на стадии их полной фук .циональной деградации. В то же время появляется все больше косвенных данных о том, что значительные функциональные изменения происходят уже на самых ранних стадиях изменения структура мембран (см., например, Hauvax and laimoye, 1985s Terzaghi et al, 1989). Например, исследуемое с помощью электронной микроскопии термоинду дарованное расслоение липидов (образован э гексагональной фазы II) мембран хлоропластов начинает проявляться только после того, как происходит полное разобщение миграции энергии со светособиракщих антенн на реакционные центры й ингибирование электронного транспорта [Gounarie, at al., 19873. Таким образом, центральным вопросом проблемы термоустойчивости фотоввтотрофшх организмов можно считать вопрос о роли начальных термоиндуцированных структурных перестроек мембран * в функциональных нарушениях цепи * транспорта электронов. Перспективным подходом к решению, подобного рода задач является сочетание исследований температурных зависимостей функционального состояния цепи транспорта электронов и ее отдельных элементов, сопоставление этих . зависимостей с данными высокочувствительных методов изучения структурных переходов в биосистемах, а тага» выбор удачного об'екта, позволяющего использовать сравнительный анализ температурной чувствительности функциональных компонентов мембран термофильных и мезофильных организмов.

Наиболее интересным об'ектом исследования явления терыофиши фотоавтотрофных организмов, с нашей точки зрении, являются термофильные сине-зеленые водоросли (цианобактерии). Цианобактерии занимают промежуточное место в цепи эволюционного перехода от бактериального фотосинтеза к фотосинтезу высших растений. Структура их фотосинтетического аппарата имеет много общих черт как" с аппаратом бактерий, так' и высших растений. Это дает возможность-при проведении исследований на цианобактериях, с одной стороны, опираться на обширный экспериментальный и теоретический материал, накопленный при изучении структурно-функциональных;основ

бактериального фотосинтеза, а с другой стороны, экстраполировать получае ш результаты на высшие растения.

Вакно подчернить, что среди цианобактерий существуют виты, которые обладают экстремальной термоустойчивостью и способны расти при предельных дчя фотоавтотрофных организмов температурах (70-73°С). Исследование „мембран цианобактерий, относящихся к экстремальным термофилам, позволяет пидойти к р.шению вопроса о природе факторов, определяющих верхний предел температур роста, четп выраженный у фотоавтотрофных орган., ^ов.

Высокой термоустойчивости биомембран, кг- правило, сопутствует и их- высокая устойчивость к действию других физико-химических факторов. Поэтому, использование в качестве об'екта исследований термофильных цианобактерий позволяет резко расш-рить. границы экспериментальных воздействий на об'ект и использовать широкий арсенал методов анализа функционального состояния цепи транспорта электронов, в том числе чувствительные методы измерения спектральных характеристик V оценки скорости . эреноса электронов на искусственные акцепторы, изменение которых может быть опосредовано структурными изменениями в мембранах.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящего исследования состояла в выяснении природы структурно-функциональной устойчивости мембран термофильных цианобактешй к действию высоких температур.

Для достижения поставленной цели , в работе решались следующие экспериментальные задачи:

- исследовать функциональную термоустойчивость различных участков ФОН - наиболее тетзмолабильного звена цепи транспорта электронов мембран термофильных цианобактерий;

- провести сравнительное изучение физико-химических свойств . термолабильных и термостабильных участков ФСи цианобактерий и выяснить вклад различных механизмов структурной деградац м липопротеиновых. комплексов в процесс термоинактивации переноса электронов в мембранах;

выяснить природу - факторов, эффективно влияющих на . термостабильность ФОН цианобактерий;

.- исследовать структурно-функциональную термоустойчивость ФС1 - термостабильного компонента цепи транспорта электронов мембран

термофильных цианобактерий и определить возможный характер факторов, ограничивающих верхний предел температур роста фотоавтотрофных организмов.

Научная нох лзна. В диссертационной работе на термофильных цианобактерях показано, что все звенья цепи переноса электронов ФС^.1 от водоразлагаюшего комплекса до первичного хинона обладают сравнительно высокой термостабильностью. Эта группа переносчиков прочно связана с полипептидами реакционного центра, и их термоустойчивость, вероятно, обеспечивается устойчивостью самих полипептидов. Наибольшую термолабильность проявляют компоненты цепи транспорта электронов, расположенные на амепторной стороне ФСи цианобактерий. Они обеспечивают перенос электрона от хинона Од на а0 и далее в пул пластохинонов. Основной причиной низкой термоустойчивости этого участка является расслоение липидов, приводящее, вероятно, к оттоку хинонов от реакционного центра.

Показана важная роль гидратации мембран в регуляции термостабильности липидзависимого участка ФСи изолированных мембран цианобактерий. На' основании результатов исследования действия на мембраны соединений, влияпцих на состояние воды, высказано предположение, что роль регуляторов гидратации мембран в клетке могут выполнять полярные группы полипептидов, Сахаров и других соединений.

Впервые обнаружено явление термоиндукции рекомбинационной замедленной лшинесце "дай хлорофилла ФС1 цианобактерий и хлоропластов высших растений. Термоиндукция послесвечения ФС1, по-видимому, в значительной степени связана генерацией триплетных состояний в рекционном центре и в аэробных условиях сопровождается выцветанием хлорофилла и деградацией цепи траспорта электронов. Результаты анализа природы этих процессов легли в основу гипотезы о том, что верхний предел те.лературы роста фотоавтотрофных организмов (70-73°С) обусловлен

термоиндуцированной фотодинамической деструкцией пигмент-белковых комплексов.

Практическая значимость. Полученные в. работе экспериментальные результаты и теоретические обобщения расширяют представления о механизмах теплового повреждения и регуляции термоустойчивости фотосинтетических мембран, что .может быть

использовано для целенаправ пенного создания на основе изолированных мембранных комплексов устойчивых энергопреобразугацих систем. Эти систем могут лчть использованы в различных областях биоэлектроники. Обнаруженный а работе эффект термоактивации послесвечения фотосистемы I может быть применен для исследования механизмов прямого и обратного переноса электронов в реакционном центре, а также для дифференциальной Ьлспресс-о^ .ши стабильности различных фотосинтетических комплексов клеток растений и водорослей.

Разработаны методические подходы к получению функционально активных устойчивых фотосинтетических комплексов, реконструированных на основе искусственных лшидных матриц. Эти препараты отличаются высокой устойчивост*ю и могут быть. рспользоввны для исследований о помощью методов, требующих ^жесткой" подготовительной обработки об'ектов. В частности, цротеолипосомы с нат^ными комплексами фотосистемы II цианобактерий были'с успехом использованы для прямой регистрации фотопотенциала электродным методом.

Результаты работы и разработанные методики испол' чуются при выполнении научно-исследовательских- работ в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ и Институте биохимии им. Д.Н.Баха РАН.

Отдельные разделы работы используются в курсе лекций "Молекулярная организация биологических мембран" и на практикуме по биофизике Биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на рсесоюзных и Международных конференциях и с'ездах: 1 Всесоюзный риофизический с'езд (Москвы, 1982), 1 Всесоюзная конференция ^Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985), 1 Болгаро-Советский симпозиум "Свободные радикалы и биостабилизаторы" (София, 1987), 12 Всесс зное совещание по транспортным АТФазам "Ионный гомеостаз и влияние различных факторов внешней среды на жизнедеятельность клетки" (Иркутск, 1987), Совещание- семинар по молекулярной биофизике-(Воронеж, 1987), 6 конгресс федерации европейских обществ физиологов растений (Югославия, Сплит, 1988), 3 конгресс европейских обществ фотобиологов (Венгрия, Сегед, 1989), Международный кон-

гресс по применению Мессбауэровского аффекта (Венгрия, Будапешт» 1989), 2 Всесоюзный с'езд физиологов растений (Минск, 1990).-

Заключительный этап работы проводился по гранту Министерства науки, высшей г олы и технической политики России N 180-101-93.

Структура и об'ем диссертации. Диссертационная работа В1 .ючает в себя следующие основныь разделы: "Введение", "Обзор литературы" (2 главы), "Материалы и метода исследований" (3 главы), "Результаты и их обсуждение" (5 глав), "Выводы" и список литературы. Общий об'ем работы составляет 248 стр., в том числе 77 рисунков и 8 таблиц.

Методические аспекты работы. В качестве об'ктов исследования были использованы клетки термофильных цианобактерий synechoooooue oiongatua (оптимальная температура роста в лабораторных условиях 55°С) и получаемые из них фотосинтетические мембраны, частицы. ФСНс активной кислородвыделяицей системой и фрагменты мембран, обогащенные ФС1 [Кауров я др. 1986]. Культура клеток в.oiongatua (N120, музей Института физиологии растений им.К.А. Тимирязева РАН) была любезно предоставлена Владимировой М.Г. В сравнительных экспериментах использовали хлоропласта гороха, которые выделяли по методу, описанному в работе [Семин и др., 1986]. Суммарные галактолипиды из клеток цианобактерий получали согласно методу [van Valraven et al., 19841; лецитин выделяли из желтков куриных яиц [Pangborn, 1951]. В качестве источника пластохинона использовали лиофилиз'тзованвде . хлоропласта шпината [Сох and Bendall, 1974]. \

Решение поставленных в работе задач потребовало привлечения широкого набора физико-химических, биофизических и биохимических методов, основные из которых перечислены ниже.

Мембраны, частицы ФСИ с активной кислородвыделяицей системой и мембранные комплексы ФСГ из клеток Synecho- >ссиа elongatue получали с помощью методов описанных в работах [Кауров и др. 1986, 1988].

Скорость выделения и поглощения кислорода мембранными препаратами определяли амперометрически с помощью электрода Кларка.

Стационарные и динамические оптические характеристики препаратов исследовали при комнатной температуре и температуре

жидкого азота на спектрофотометрах СФ-10, Hitaohi - 557 и спектро'луориметре MPF-2A.

Содержание, рьикционшс центров ФС1 оценивали с помг-'ью дифференциальных спектров "окисленный минус восстановленный" [Hiyama and . Ке,, 1972]. Концентрацию Р680 измеряли по фотоиндуцированному восстановлению феофитина в присутствии дитионита и метилвиологена [Klimov et al., 1980].

Регистрацию сигнала ЭПР от промежуточного донора z в частицах ФС1Т проводили на радиоспектрометре , .1Р-РЭ-130.

Быструю кинетику абсорбционных изменений препаратов исследовали на дифференциальном спектрофотометре, соединенным с регистратором переходных процессов dl 1080 (Англия).

Измерение трансмембранного фотоиндуцировэнного потенцигпа в. реконструированных липопротеиновых частицах ФОН проводили по методу, предложенному Драчевым [Draohev et al., 1988, 1989].

Калориметрические исследования были выполнены о помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-1М.

Мессбауэровские : спектры регистрировали на установке "Мессбауэровская лаборатория" с анализатором ИТА-1024.

Замедленную люминесценцию • регистрировали с помощью фотометрической установки, сконструированной на базе фосфороскопа со временным разрешением 1,5 мс. Кинетику затухания миллисектадной компоненты послесвечения • регистрировали с' помощью дискового фосфороскопа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Термоустойчивость цепи транспорта электронов фотосистемы II мембран термофильных цианобактерий.

Систематические исследования термоустойчивости

фотосинтетических мембран термофильных цианобактерий были начь.ы относительно недавно - 12-15 лет назад - в работах в основном японских исследователей [Yamaoka et al.,1978; Koike et al., 1980; Hirano et al., 1981 и др.]..Было показано, что также как у высших-растений у цианобактерий наибольшей устойчивостью к действию температута обладает цепь переноса электронов фотосистемы I. Температуры 50% инактивации ее отдельных компонентов меняются в

интервале от 78 до 91°С [Koike et al., 1982]. Однако в целом, к моменту начала настоящей работы картина термоиндуцированных сдвигов в мембранах, предшествующих их деструкции, оставалась далеко неполной. В частности, оставалось неясным, насколько цепь транспорта электронов XII однородна по термоустойчивости и какова природа наиболее термолабильных и термостабильных ее компонентов. Для выяснения етого вопроса нами было исследовано влияние температуры на физико-химические параметры, отражающие структурно-функциональное состояние различных участков цепи переноса электронов ФОН.

Необходимо специально отметить, что в коь^а 70-х и начале 80-х годов мембраны цианобактерий достаточно редко использовались для изучения фотосинтеза, поэтому все процедуры выращивания культуры клеток и получения нативных препаратов мембран представляли предмет для самостоятельных исследований. В.связи с этим на подготовительном этапе работы вами были отработаны условия интенсивного культивирования клеток a.eioneatua и метод получения фотосинтетических мембран.

Для оценки устойчивости различных участков цепи передачи анергии и переноса электронов ФОН цианобактерий нами были использованы в основном традиционные методы исследования фотосинтетического -аппарата. Анализ результатов изучения влияния температуры на спектры возбуждения и испускания флуоресценции изолированных мембран оказал, что наиболее быстро в процессе нагревания препаратов (спектры регистрировались при комнатной температуре после прогревания и быстрого охлаждени.. препаратов) уменьшается интенсивность полосы фикобилинов, представленных в основном аллофикоцианином. Температура 60* (Tggg) снижения интенсивности этой полосы составляет 65°С, а Т^ снижения вклада хлорофилла (^B03<j = 435 нм) и остаточ^^ых Яикобилинов ^возб = 660 в полосу флуоресценции при 680 нм равны Б7°и 70°, соответственно. Эти данные свидетельствуют, что термоустойчивость антенного звена ФОН снижается в следующей последовательности: комплексы антенного хлорофида,^ связанные непосредственно с реакционным центром, участок, ответственный за перенос энергии с терминальных фикобилипротеинов на антенный хлорофилл, и, наконец, сами фикобилипротеины.

— о

о

Среди компонентов цепи тр чспорта электронов ФСИ мембран . цианоОоктерий наибольшую термоустойчивость проявляет участок светозавиоимого переноса электронов от искусствен эго донора дифенилкарбазида через певичный донор о, РЦ Р680 и хиноны на акцептор класса II - ДХФИФ. Высокая устойчивость этого участка обнаруживается как при исследовании окислительно-восстановительных реакций, так и при изучении температурных зависимостей миллисекундной стационарной замедленной люминесценции, отражающей скорость рекомбинации в комплексе б+Р68См7 [Ьауоге1, 1975; Ма1Юп, 1977].

Существенно более низкую термостабильность мембраны цианобактерий проявляют в реакции восстановления ДХФИФ от воды. Температура 50% ингибирования (Тбож) этой реакции составляет 39°С.. Лимитирующим устойчивость цепи звеном в данном случав является водоразлагащий комплекс. Еща более низкую стабильность имеет4 звено цепи, донирущее электроны на полярный акцептор феррицианид' калия (ТБ0;6=47оС).'

Кроме различий в термоустойчивости участки восстановления феррицианида и ДХФИФ значительно отличаются по чувстви эльности к действию диурона (концентрации, вызывающие 50% ингибирование, в первом случае на порядок ниже), модификаторам гидрофобных взаимодействий (бензиловому спирту и детергенту ДЦА^) и соединениям, образующим комплексы с ионами поливалентных металлов (о-фенантролину и цитрату натрия). Эти данные позволяет предположить, что в мебранах термофильных цианобактерий участки, донирующие электроны на исследуемые акцепторы, имеют разную природу. Вероятно, восстанов."чние феррицианида происходит на уровне ОН^ и ов, а ДХФИФ - на уровне ад.В основе таких различий, по-видимому, лежат различная доступность доноров ФСИ для акцепторов I и • и класса. Следует отметить,что на хлоропластах гороха различий в скоростях восстановления использованных акцепторов нами'обнаружено не было. Эти данные свидетельствуют о существенно более плотной упаковке гидрофобного ядра ФСН мембран термофильных цианобактерий по сравнению с высшими ^астениями.

Сопоставление полученных на данном этапе работы результатов позволяв" считать, что тэрмоиндуцированннв изменения мембран, приводящие к быстрой инактивации восстановления феррицианида,могут

затрагивать два участка акцепторной стороны ФСи в.вгопвагиа. Первый участок - это звено переноса электронов на уровне 0А и <3В,* включающий лабильные ионы нсо^ и Ре2+. И второй участок - это пул подвижных хинопв, функционирование которого должно зависеть от термотропных свойств липидного матрикса мембран.

Приведенные выше результаты исследований влияния температуры на мембраны суммированы на схеме (см. рис. 1), из которой хорошо

Фико^илипротеины 65вС Е < 57'С

Антенный щорорилп-Кепкобый >70 С

комплекс

кМс^

Г^^мш?, рцн2

5ГС(Щ __ ,

ё | 73°С(б2°С) •

шт

Рис. 1. ТермоустоРчивость (Т50^) компонентов цепи транспорта электронов ФОН изолированных мембран и частиц термофильных цианобактерий a.вlongatшl. Параметры, характеризующие функциональное состояние компонентов, определяли при комнатной температуре после прогрева мембран при различных температурах в течение 5 мич.

видно, что ФОН изолированных мембран в.егопеагив в значительной степени неоднородна по. термоустойчивости. ТБ0Ж отдельных звеньев меняется от 47 до 73°С. Важно отметить, что термостабильность донорного и акцепторного участка цепи транспорта ФОН существенно снижается ; после выделения. Температуры их 50% ингибирйвания либо ниже, либо сопоставимы с оптимальными температурами роста кльгок э.еХопеагив (55-60°С для лабораторной культуры и до 70°С

для видов, растущих в природных условиях [Теней и Брок, 1981]). Этим ФС .1 резко отличается от ФС1 изолированных мембран, у которой Tggjg ингибирования всех учаг тсов цепи переноса выше 78°С [Kolk*- et а!.. 1982]. Наблюдаемая в эксперименте различная термоустойчивость компонентов цепи переноса ФОН и общее снижение устойчивости мембран tn uttro могут быть обусловлены изменением свойств среды, окружающей мембраны (рН, ионная сила, ионный состав, присутствие других полярных соединений) и влияющей на эффективность межголекулярных взаимодействий между ее отдельными элементами, или являться результатом потери в процессе их выделени кофакторов, стабилизирующих мембраны. . Такими кофакторами могут служить, в частности, различные полипептиды и низкомолекулярные полиамины [Nakamura, 1960; Praead & Maheswari, 19'3; Oshlma, 1 32],. компоненты цитоскелета [Фултон, 1987] или просто межмембранные взаимодействия. В таком случае уровень неоднородности и общая устойчивость цепей переноса ФОН должны зависеть от степени структурной интегрированности мембран. Ч связи с этим пред. гавляло ' интерес сопоставить термоустойчивость цепей переноса нефракционированных мембран и фрагментов мембран, i 1огащенных реакционными центрами ФОН.

Значения температур 50% инактивации цепи переноса электронов частиц ФОН, полученные при исследовании их термоустойчи^ости приведены также на том же рисунке (в круглых скобках). Как видно из схемы, фракционирование мембран приводит к снижению термостабильности всех исследованных звеньев; Т50г примерно одинаково на 11°С. Однако при этом не происходит уширения температурного интервала неоднородности устойчивости. Это означает, что по при фрагментации изолированных мембран не происходит потери каких-либо специфических компонентов мембран, . влияющих на устойчивость отдельных участков ФОН. Общее понижение устойчивости частиц скорее всего связано с хаотропнь.^, дезорганизующим действием детергента, одинаковым для всех звеньев ФОН. .

Отсутствие в мембранах a.olongutue структурных- . термостабилизирупцих кофакторов позволяет предположить, что и снижение устойчивости ФСН в условиях tu vi tro в первую очередь обусловлено изменением свойств среды,(рН, ионный состав и др.),

окружающей фотосинтетический аппарат термофилов в клетке. Ответ на этот вопрос также как и решение основной задачи настоящего исследования может быть получен при выяснешг' природы термолабильных компонентов ФОН, изолированных мембран, и факторов, влияющих на их устойчивость.

Необходимо отметить, что оценка устойчивости отдельных конкретных переносчиков, включенных в нативную цепь транспорта элек-тронов, задача достаточно сложная, с одной стороны, из-за взаимного влияния донорно-акцепторных пар и, с другой стороны, . из-за методических трудностей, обусловленных тем, что применение многих прямых методов регистрации скорости изменения состояния переносчиков требует жестко^ обработки препаратов. Например, по данным исследования температурных зависимостей секундной компоненты замедленной люминесценции мембран а.е1опваги> ' температура 50% инактивации водоразлагаицего комплекса при рН 7,4 составляет 50°С. Эта температура на 8° ниже, чем по данным измерения скорости восстановления искусственных акцепторов.По-видимому, на процесс температурного тушения - секундной компоненты люминесценции, прямо связанной с з-состояниями. водоразлагаицего комплекса, влияют и термоиндуцированные изменения состояния первичных и особенно вторичных хинонов, которые могут определять общую термоустойчивость цепи. Иная ситуация, например, .

складывается при определении устойчивости первичного донора ъ по. ЭПР-сигналу. У цианоба- ^ерий этот сигнал маскируется полосой от Р700, поэтому его удается регистрировать только на частицах ФОН. Температура 50% затухания его амплитуда составляет 50°С. Эта температура, вероятнее всего, ниже, чем у исходных мембран, поскольку, как было отмечено выше, их дезинтеграция приводит к общему понижению устойчивости •ФСЛ. '

В связи с этим основной подход при выяснении ¿.¿ичин понижения термоустойчивооти мембран должен состоять в исследовании физико-химических свойств термолабильных участков ФОН а.егоп&чиа.

II. Структурно-функциональная характеристика акцепторной стороны цепи переноса электронов' ФОН термофильных цианобактерий. Одним из возможных путей термоинактивации ФОН цианобактерий могут служить термоиндуцированные изменения структуры участков

- -

полипептидов и обеспечивающих перенос электронов между ад и <3В. Для проверки этого предположения нами было решено исследовать особенности структуры уЧа ;тка <зА-—ав и характера перен' "¡а электронов меаду хинонами. По времени этот этап работы совпал только, с началом 'ктивных йсследований акцепторной стороны ФОН фотоавтотрофов. Поэтому структура и функциональная роль звена, включающего в себя в качество возможных кофакторов Ре2+ и нсо^, как у высших, растений, так и у цианобактерий оставалась во многом нея ной. Наибольший прогресс в исследовании роли Ре2+ и НСО^ был достигнут при изучениии фотосинтетического аппар; а бактерий. Пое .¡¡полагалось, что архитектура хинонного участка зеленых растений и бактерий аналогична. Для более детального выяснения структуры этого звена у цианобактерий нами были изу- эны Мессбауэрс ские. спектры препаратов мембран и частиц ФСтт в.огопваыв, обогащенных изотопом "ре.

В этом разделе мы рассмотрим спектры частиц. ФОН, которые, как показали результаты работы, представляют наибольший интерес ' для решения задачи исследования.

Измерения спектров резонансного поглощения частиц ФОН били проведены в интервале температур 80-270К. При разложении спектров на три компонента удается выделить дублеты I, II и III, параметры которых приведены в таблице. Атом железа, обусловливающий кочпо-

Мессбауэровские параметры железосодержащих компонентов частиц ФОН термофильных цианобактерий

Образец Компо- Относи- Хим. Квадруполь- Валент-

нент тельное содерж. % сдвиг, в. мм с ное расщепление. Д, мм с ность Ре

Частицы ФОН I 62 0,40 0,85 3+

II 17 1 .35 2,35 2+

III 21 0,25 1,65 3+

Частицы ФОН,обра- I 60,5 0,40 0,85

ботанные формиатом - II 18,6 0,90 1,75

III 20,9 0,20 1,65

Частицы ФОН после I 66,6 0,40 0,85

удаления формиата II 15,6 1,35 2,20

III . 18 0,20 1/

- -

нент спектра ill, находится в низкоспиновом окисленном состоянии (S = 1/2) и по своим характеристикам соответствует -Мес-сбауэровским параметрам окисленной форды цитохрома Ъг g [Malkin and Vanngard, 1i"!0; Petrouleaa and Diner, 1982].

Соединение, обусловливающее дублет I, включает основное ко. лчество железа меморан и большую часть железа препаратов ФСИ. Параметры этого компонента характерны для белков с железосерными центрами.

Характеристики дублета II типичны для высокоспинового иона Ре2+, входящего в структуру солей РеС03 fGrenwood and Dibb, 1971], и хорошо соответствуют параметрам негемйновог железа в ФСН мутанта Chiamidomcmaa reinho.rd.tii [Petrouleae and Diner, 1982].

Температурные зависимости площадей под спектрами компонентов I, II и ill [s(T)] позволяют сделать некоторйе заключения о жесткости обусловливающих эти компоненты соединений. ФСН. Зависимость S(T) цитохрома ь559 свидетельствует о прочной структуре этого белка цианобвктерий.. Зависимость S(T) для компонента I является типичной для железосерных белков. И, наконец, самую сильную температурную зависимость S(T) имеет компонент негеминового железа. Это, с одной стороны, подтверждает предположение о соответствии компонента II слабосвязанному Fe2+ бактериальных центров и ФСН зеленых водорослей, а с другой -свидетельству ет о потенциальной возможности термоиндуцированных сдвигов в координационных взаимодействиях железа в мембранах при температурах роста термофилов.

• При анализе полученных результатов естествен то возникает вопрос о функциональной роли регистрируемого по резонансному поглощению негеминового железа (компонент II), Один из подходов к . решению этого вопроса состой™ в исследовании действия на Мессбауэровские спектры соединений, влияющих на ci <рость переноса электронов на участке ОдИ QB ФСН. К числу таких соединений относятся ионы бикарбоната, которые, как предполагается, облегчают протонирование восстановленного q|~ {Eaton-Rye et al., 1986].

Удаление бикарбоната из препаратов частиц ФСИ приводит к снижению на 65% скорости -выделения кислорода и одновременно вызывает существенное изменение Мессбауэровских параметров негиминового железа (см. табл.). Величины в и А двух, других компонентов не меняются. Вытеснение . формиата" бикарбонатом в процессе продувки препаратов частиц С02 полностью восстанавливает

скорость выделения кислорода и возвращает спектральные параметры .компонента II к исходным величинам (см. табл.). Следует отметить, что степень изменения величин квадрупольного расщепления и. .химического сдвига компонента ххпри обработках свидетельствует в пользу прямого взаимодействия бикарбоната с атомом железа. Подобные значительные изменения, например, наблюдаются при варьировании лигандов в шестом положении ^гома железа в гемоглобине [Мошковский, 1970]. Данные о прямом взаимодействии бикарбоната с атомом железа в РЦ ФСИ ианобактерий находятся в соответствии с предполагаемой на основе ячинокислотной последовательности структурой этого центра.

Учитывая задачи, настоящей работы важно еще раз подчеркнуть, что физико-химические параметры атома н^геминового ж^еза,. участвующего в пяти координационных связях с компонентами акцепторной стороны ФСП, проявляют достаточно высокую температурную лабильность. В связи с этим для получения наиболее полной картины структурно-функциональных свойств акце- "торного участка фотосистемы II необходимо было исследовать кинетические характеристики окислительно-восстановительных' "оевращений первичного и вторичного хинонов.

Для этой цели мы использовали метод прямой регистрации электрического потенциала, возникающего в результате трансмембранного фотозависимого разделения зарядов в реакционном центре, разработанный Драчевым с сотрудниками [Драчев и др., 1979а,б]. Помимо решения основной задачи, применение этого метода имело и самостоятельный интерес, поскольку ранее он использовался только для исследования бактериальных реакционных центров. Измерение фэтопотенциала на РЦ зеленых растений осложняется их низкой стабильностью. В связи с этим, учитывая термофильную природу частиц .ФСИ, можно было ожидать, что их РЦ выдержат достаточно жесткую подготовительную обработку образцов.

Ассоциированные с коллодиевой мембраной /протеолипосомы с частицами ФСИ в ответ на лазерную вспышку . давали 1 фотоэлектрический ответ. Его. типичная форма приведена на рис. 2а в-двух временных масштабах. Быстрая фаза ответа с характеристическим временем меньше, чем временное разрешение установки ( 100 не), видимому-, обусловлена переносом заряда от Р6§0 к QA. Это хорошо согласуется с известными данными абсорбционноГ спектроскопии 1 времени переноса электрона с Р680 через феофитин (3 пс) на qa.

которое составляет 200-550 пс.

В поисках подтвервдения того, что регистрируемый фотоответ протеолипосом обусловлен функционированием РЦ ФОН, нами было изучено влияние на исследуемый процесс соединений, действующих .на водоразлагающий комплекс. Как видно из рис. 2а,б добавление

мв

Вт

-10-

-I—I—I-1-1—«—I-Г-I-1 11111111111

" 408 ИКС 4*20 иН г 408 ИКС +20 М(Н ДУ, мВ ДЯ|/", мВ

-5-

Рис. 2. Кинетика образования фотопотенциала на мембранах реконструированных частиц ФОН в отсутствие (а) и присутствии 1 мМ МпС12 (б) и дополнительно 2 мМ нн2он (б; г - разность фотоэлектрических, ответова и б)

мпС 2 к препаратам протеолипосом снимает, микросвкундную компоненту (т 50 икс) темновой релаксации ДФ, (см. график г) обусловленную возвратом электронов на Р680+ в РЦ, -у которых, по-видимому,

отсутствует iln, вследствие чегг они не могут восстановиться за наносеклда. Это хорошо согласуется с данными абсорбционных изменений Р680: введение MnC.i2 в препараты также устра: ют микросекундную кинетику затухания сигнала от Р680.

В дамках предплагаемого механизма разрядки мембран находятся также результаты исследования влияния гидрокскламина (см. рис. 2) , который снимает эффект действия Мп, приводя к росту амплитуды микросекундного компонента электрического фотоответа, а также к поя лению медленной кинетики (г 200 мкъ ¡ абсорбционных изменений Р680.

По данным окислительно-восстановительного титрования излом кривой изменения амплитуды быстрой фазы фотоэлектрического ответа приходится на . редокс-потенциал близкий к Э мВ. Это : рошо. соответствует значению среднеточечно^о потенциала первичного хинона ФСН, опреленному методами регистрации электрохромных свойств пигментов, индукции флуоресценции, ЗПР и .др. [Horton and Сгове, 1979; Diner' and Delosme, 19ВЗг b; Rutherford and Kathie, 19831.

Таким образом, приведенные выше результаты свидетс 1ьствуют о том, что наблюдаемые- нами на протеолипосомах фотоэлектрические ответы обусловлены функционированием РЦ ФС11, причем основной вклад в регистрируемый сигнал вносит разделение зарядов между Р680 hqa.

При рассмотрении полученных результатов обращает на се"т внимание отсутствие медленных стадий формирования фотопотенциала, соответствующих микросекундному компоненту кинетики восстановления Qjj. Кроме.'того, необходимо отметить, что временные зависимости фотоответа протеолшгасом с ФСН s.<?iongatue не чувствительны к диурону. Это, вероятно, обусловлено тем, что в процессе . реконструкции частиц ФСН и посада? липосом на коллодиевую мембрану, пропитанную липидом, происходит выход подвижных хиноьов а экзогенный гидрофобный метрике. Подобная "утечка хинонов" обычно наблюдается при работе с бактериальнчми реакционными центрами.

Таким образом, частицы ФСП термофильны' цианобактерий • з.еlongatue в отличие от аналогичных препаратов высших растений збладают достаточной устойчивостью'и могут быть использованы для дальнейшего исследования электрогенных стадий в РЦ ФСН. Кроме гого, приведенные выше результаты позволяют сде-.dfb определент тключения о свойствах акцепторного участка • ФСН. Прежде всего

следует отметить высокую текучесть пула подвижных хинонов. Решающую роль в определении скорости утечки пластохинонов в экзогенный гидрофобный матрикс (мицеллы детергента, липосомы, липиды коллодиечой мембраны), по-видимому, играет температура. Наибольшая скорость процесса должна иметь место при посадке пр'теолипосом на коллидиевую мембран., которая проводится при 25°С в течение 1-2 часов. .

Отток хинонов в липидный матрикс, вероятно, определяет и .снижение скорости переноса электронов к K3Fe(0N)6 на 20-26* частицами ФСИ после реконструкции или просто инкубации с липосомы.,и (15-20 мин.). Похожий аффект проявляется также и на препаратах ФСИ высших растений при добавлении к ним лтаосом из тилакоидных липидов [Gounarie and Whitford, 1903). Эти результаты служат аргументом в пользу предположения о. том,'что лабильность цепи мембран s.eiongatue в реакции' восстановления феррицианида калия может быть обусловлена термоиндуцированными сдвигами в структуре лшшдного матрикса мембран.

В связи с этим в последующей работе вами была исследована роль фазового состояния липидов в процессах переноса электронов в ФСИ и его влияние на структурно-функциональную устойчивость мембран B.elongatua, ' ' -

III. Термотропный полиморфизм мембранных липидов и транспорт электронов в ФСИ термофильных цианобактерий.

К настоящему времени опубликованы результаты лишь единичных работ, посвященных изучению структуры изолированных фотосинтетических мембран методом дифференциальной калориметрии [Cramer et al., 1981; Ананьева И др., 1983; Thompson et al., 1986]. В исследованиях текучестг липидов изолированных мембран использовались в основном косвенные методические подхода, основанные на изучении характера температурных зависимостей различных структурно-функциональных параметров. Получаемые при этом результаты могут зависеть от условий выращивания цианобактерий, в частности, от присутствия в культуральной среде ионов железа [Hirano et al.,' 1981].

В связи с этим при изучении возможной взаимосвязи изменения текучести липидов и термоустойчивости акцепторного участка ФСИ мембран s.eionaratue представляло интерес более детально исследовать с помощью метода дифференциальной сканирующей

- 1Е -

калориметрии особенности структурных липидных переходов в изолирозанных мембранах и их функционально активных компонентах -ОСИ и ФС1.

. Как видно из рис. 3, термограмми мембран из клеток

лСр, отнед-

V ^

Рис. 3.Температурные зависшости теплоемкости (ЛС ) препаратов мембран из клеток з.-*гопеаьив, выращенных при температуре 55 (1) -и 40°С (3) после первого (1,3) и второго (2) прогрева.

в.огопдаию, 'выращенных при 55 С, содержат три полосы (кривая 1). Низкотемпературная полоса с максимумом 30°С соответствует эндотермическому■ фазовому переходу липидов. Она термообратима и воспроизводится при повторном нагреве образца (кривая 3). Кроме этого, снижение температуры роста культуры клеток ".«гопгсаиэ с 55-до 42°С приводит к характерному для микроорганизмов сдвигу полосы на 4 - 5°Ч в область более низких температур (кривая 3). Пики при температурах выше 60°С обусловлены необратимой денатурацией белковых компонентов мембран. По температурной.,/ "интервалу о; соответствуют широкой полосе денатурации суммарной фракции

фикобилисом, получаемой при выделении мембран, и их амплитуда значительно ниже на термограммах частиц ФСН и ФС1.

В отличие от целых клеток и изолированных мембран з.егопвсчиа частицы ФСП и ФС1 имеют липидный фазовый переход при температурах 44 и 40°С, соответственно. Этот, сдвиг может быть обусловлен гетерогенностью липидного .остава мембранного матрикса, окружающего реакционные центры ФИ и ФСН. Однако, основная причина, определяющая повышение температуры переходов, по-видимому, состоит в преимущественной экстракции легкоплавких липидов детергентом при выделении ФС1 и ФСН. В пользу этого свидетельствует постепенное восстановление и повышение температуры .шпидного перехода в мембранах, обогащенных ФС1, в процессе их отмывки от детергента. '

Таким образом, липидаая фракция мембран клеток з.вголвапю, растущих при. 55°С, содержит компоненты, претерпевающие фазовый переход в. достаточно широком интервале температур от 15 до 44-4в°С. Это обстоятельство в первую очередь, вероятно, определяет растянутость по температура и низкую степень кооперативное™ основного фазового перехода мембран (15-50°С). Мембраны з.егопвсиив, по-видимому, содержат ^локусы, объединяющие липида, фазовые переходы которых происходят при различных температурах и достаточно независимо друг от друга.

Возвращаясь к рассмотрению вопросов, связанных. с термоустойчивостью мембпан в.вгопвата, следует отметить, что полученные в настоящем разделе результаты позволяют высказать предположение о характере термоиндуцированных процессов, определяющих термолабильность акцепторной стороны ФСН. По-видимому, в изолированных мембранах при по'вышении температуры происходит локальное расслоение, которое вызывает отток в образовавшиеся липидные кластеры подвижных хинонов. ... .

. Для проверки этого предположения необходимо было выявить структурные сдвиги в мембранах в.вгопеагив, температурный диапазон, в котором они могут цроисходить, и оценить их возможное влияние на процессы переноса электронов в ФСН.

Образование регулярных. небислойных структур в мембранах растений, регистрируемое обычно с помощью электронной микроскопии, соответствует стадии их полной деградации (Соипаг1в вt а1.,< 19841. Очевидно, что серьезные нарушения цепи: транспорта электронов должны иметь место уже на ранних этапах температурной модификации

мембран, которая может быть зарегистрирована более чувствительными методами. К числу, тают- методов относится метод регистрации замедленной люминесценции [Pork et 1979,_ 1985;' Hauvax &

lannoye,. 1983, 1985; Маторин л др., 1985; Рубин и др., 1987; Веселовский и Веселова, 1983, 1990].

Учитывая сказанное выше,- в последующей работе мы более детально исследовали температурные зависимости стационарного уровня замедленной люминесценции хлорофилла ФСП мембран 9. а ¡or.ga.tua. Следует подчерпуть, что исследования имен,-о изолированных мембранных систем представляют интерес еще и в связи, с тем, . что информация, получаемая с помощью замедленной люминесценции на интактных организмах часто трудно поддается интерпретации из-за высокой чувствительности послесвечения к изменениям состояшю различных регуляторных систем растительной клетки.

Рис. 4. Температурные зависимости замедленной люминесценции хлорофилла изолированных мембран при рН 7,5 (1) и 5,5 (2) и целых клеток (3, За) термофильных цианобактерий з. егопваъи-в.

На.рис. 4 приведены типичные температурные зависимости после свечения целых клеток и изолированных мембран з.егапваьив. Эти

%

кривые имеют основные максимумы при 59°С для ■ клеток и 54°С для изолированных мембран, что .характерно для интактных клеток водоро- ■ слей и листьев высших растений.

Существенным отличием термоиндуцированного послесвечения , цичнобактерий является присутствие высокотемпературной полосы с максимумом при 78°". Она отчетливо выражена у мембран, и имеет значительно более низкую относительную интенсивность у целых клеток (рис. 4, За). Как показали результаты последующих исследований, это послесвечение обусловлено рекомбинационными реакциями в .ФС1. К более подробному обсуждению его природы мы вернемся ниже в разделе 5.

.На стадии активации по. лесвечения' температурные .зависимости мембран и клеток a.eiangatue при температурах 30-40°С испытывают слабо в..раженный излом. В случав мембран плечо на термограылах при 30-40°С начинает отчетливо проявляться при снижении рН среды (см. рис.4, кривая 2). ' Интенсивность этой полосы замедленно! люминесценции в отличив от основной полосы уменьшается в присутстви" диурона, и при низких температурах увеличивается в присутствии микромолярных концентраций феррицианида. Основной вклад в общую интенсивность регистрируемого при различных генераторах послесвечения ФСН вносит долгокивущий компонент.

Вопрос о влиянии рН на стационарную .замедленную люминесценцию хлоропластов неоднократно pact ¡атривался в литературе [Venediktov & Krivoeheyeva, 1984; Рубин и др., 1987§. Однако, в настоящее время отсутствуют четкие представления о природе этого явления. Высокая чувствительность замедленной люминесценции мембран -из s.eiongatua к действию микромолярных концентраций фе^рицианида калия и диурона позволяет предположить, что .f основе эффекта стимуляции люминесценции при покислении среды лежит рН-зависимоэ изменещге скорости переноса электронов от первичных и вторичных акцепторов вокру ФС11. Например, увеличение интенсивности низкотемпературной полосы послесвечения типа утечки мембран s.eiongatuo может быть обусловлено увеличением скорости оттока электронов от реакционного, центра за счет сдвига равновесия вправо . в реакции. [Рубин и др., 1987):.

р ' -р92-1 +гн+„ Q,QR-----Q.QR ----------- Q .

. А В * В +PQH; -2Н А

Аналогичным образом можно об'яснить и рН-стимул^цию дезактивационной замедлен! >й флуоресценции основного пика мембран s.eiongatue, если предположить, что снижение рН ускоряет отток электронов от первичного акцептора ФСп (Фф~).

Эти процессы, по-видимому,,во многом определяют и характер температурных зависимостей послесвечения ФСН s.eicmgatua. Характер нарастания замедленной . люминесценции утечки при нагревании (15-27°С) может быть тоже обусловлен температуро-зависимым ростом скорости переноса электронов в РЦ. Однак., основную роль в термоактивации послесвечения утечки, гго-видамому, играет увеличение текучести липидов, которое у мембран s.eiongatue в условиях наших экспериментов начинает регистрироваться при 15°С и должно сопровождаться ростом скорости оттока электронов через пул 0Н2 вокруг ФСН. Кроме этого, как известно, цианобактории s.eiongatua относятся к облигатным термофилам, т.е. они не растут при температурах ниже _ 42°С. Это означает, что в интервале температур от 30°С (температура основного фазового переход.) до примерно 40°С мембраны S.elongatua находятся в условиях, соответствующих условиям холодового шока, целых i :еток. Поэтому увеличение подвижности липидов с ростом., температуры должно также .сопровождаться увеличением скорости расслоения мембран. Отток хинонов в формирующиеся при этом липидные кластеры неизбежно вызовет нарушение обратимых взаимодействий пластохинонов с РЦ ФСП. ....

Таким образом, переход липидов в жидко-кристаллическое состояние в процессе фазового перехода, с одной стороны, приводит к увеличению скорости оттока электронов .от- РЦ через пул пластохинонов, но, с другой зторойы, за счет активации расслоения мембран делает отток самих хинонов необратимым. Эти две стороны одного процесса, • .по-видимому, и определяют излом кривых замедленной люминесценции при 27-40°С. Можно было ожидать, что изменение температуры или _ снижение крутизны фазового перехода должно привести к изменению параметров низкотемпературной полосы послесвечения мембран s.eioneatue. Эти изменения действительно наблюдаются как при уменьшении температуры перехода липидов до 25°С в результате снижения температуры роста клеток до 42°С, так и при ее увеличении до 44% в мембранах частиц ФСН (см.рис. б). В первом случае обнаруживается существенное увеличение интенсивности

Рис. б. Температурные зависимости интенсивности замедленной

люминесценции (I) мембран до (1,2) и после (3) обработки детергентом, и частиц ФОН (4) цианобактерий 8.е1оп£агив. Препараты мембран (1,3) и частиц ФОН (4) выделены из клеток, выращенных при 55°С; препараты мембран (2) выделены из клеток, выращенных при 42°.

низкотемпературной полосы, особенно при 1Б-30°0, а во втором случав тлеч^ на термограммах проявляется при 45°С. Крок этого обработка обработка мембран детергентом ЛДАО (хлорофилл детергент 1/3, по . весу), которая по калориметрическим данным снимаем основной фазовый переход, снимает также излом термограмм замедлен.юй люминесценции.

При исследовании взаимосвязи термотропных фазовых переходов и переноса электронов в ФСП з.вгоп&агиа наряду с изучением зак' дленной люминесценции нами были также ' исследованы температурные зависимости скоростей реакций восстановления искусственных акцепторов.Как показали результаты этой работы, аррениусовская температурная зависимость скорости восстановления . ДХФИФ в ФСи мембран а.вгопе^ив претерпевает характерный для мембрансвязаш. л реакций излом, свидетельствующий о снижещш энергии активации при температурах выше 37°С. Аналогичный, но противоположна направленный излом температурной зависимости наблюдается и в случае реакции восстановления феррицианида. Температура, излома аррениусс^ских крк.-ых в обоих случаях не ' ' соответствует температуре основного фазового перехода липидов мембран з.огопесчив, но совпадает с температурой фазового перехода суммарных галактолипидов и липидов после повторного прогрева мембран.(см. рис. 3). Она также входит в температурный интервал, в котором происходит излом термограмм послесвечения ФОН мембрш З.еХопваХиа (см. рис. 4).

Все эти совпадения, вероятно, не случайны и обусловлены, скорее сего,одним и тем че процессом - фазовым расслоением фракции липидов, влияющим на перенос электронов в акцепторной

части ФСИ. В случае восстановления ДХФИФ такой структурный ^двиг в мембране, приводит к снижению уровня ограничений диффузии акцептора в гидрофобный матрикс РЦ ФСИ. А в случай переноса электронов на полярный акцептор к3Ре(СЫ)6, наоборот, затрудняет его диффузию к донорному звену цепи ФСИ. При температуре около 37°С, по-видимому, происходит "переключение" участка восстановления Кз?е(С11)6 с пула' подвижных хинонов, функционирование которого нарушается в фоцессе расслоения мембран, на пул жестко связагшх в гидрофобном ядре первичь.х хинонов.

Таким образом, приведенные в настоящем разделе результаты свидетельствуют о том, что низкая термоустойчивость акцепторной сторона ФС11 изолированных мембран з.ехопея^а по сравнению с целыми клетками. обусловлена, в первую очередь,

термоиндуцированными изменениями специфической гетерогенности липидного окружения ФСи. В основе этого явления, вероятно, лежит изменение в области 35-37°С фазового состояния одного или нескпьких липидных компонентов, которое может запускать скачкообразное изменение . - липид-липидных- и лшшд-белковых взаимодействий и . приводить к оттоку ' подвижных хинонов от реакционного центра. Подобные, структурные переходы в гидрофобном матриксе не обяз' 'ельно должны быть. Они могут затрагивать лишь небольшие участки мембран и практически не влиять на транспорт электронов на донорной. стороны ФСИ.

IV. Термостабилизация фотосинтетических мембран соединениями влияющими на состояние воды.

Хорошо известно, что функциональная активность и стабильность фотосинтетических мембран ы иаго зависит .от..многих факторов: рН, ": ионная сила, ' ионный состав, и осмомолярность среды и др. Большинство из них поддерживают в активном состоянии определенные группы или липид-белковые комплексы. Например, с .помощью рН и--ионной силы можно регулировать поверхностный заряд мембран и изменять скорость восстановления полярных акцепторов (И;о)1, 1970, 1978; КсЛ & ШвМтшга, 1977), а ионы 0а2+. и 01" стабилизируют нативную конформацию полипептидов водоразлагающего комплекса (С0У1П(%ее еЬ а1., 1985; П^втикев, 1986; Ноттап, 1987). То есть внешние факторы могут оказывать специфическое действие на мембраны, которое, как правило, обнаруживается при низких

концентрациях реагентов. •

В то же время наряду со специфическими взаимодействиями в •" присутствии высоких концентраций таких соединений как: сахароза, гли .эрин, полиэтиленгликоль, фосфорнокислый натрий, цитрат натрия, по-видимому, могут проявляться взаимодействия, имеющие неспецифический хгпактер. Шспецифические взаимодействия хорошо исследованы на примере растворов макромолекул и высоких концентраций,так называемых, соединений лиотропного ряда (йтпгаль и Шлейх, 1973). Действие этих соединений не связано с их полярностью,, способностью образовывать комплексы или какими-то другими специфическими свойствами молекул, а опосредовано их влиянием на структуру вода; Неспецифический механизм регуляции стабильности макромолекул обладает высокой эффективностью. В случае сложоых мембранных комплексов действие высоких концентраций различных соединений исследовано значительно слабее. Тем не менее показано; например, что высокомолекулярный полиэтиленгликоль предотвращает отщепление фикобилисом при выделении мембранных везикул т цианобактерий и водорослей (Yamaoka et al., 1978; Katoh & Gantt, 1979; Fujita & Suzuki, 1979; Gantt & Olement-lietral, 1983), а цитрат натрия и фосфорнокислый натрий активизирует перенос электронов в хлоропластах. шпината (Stewart, 1982; Thomasaet et al., 1984). Это позволяет ' считать, что неспецифические взаимодействг , по-видимому, играют важную роль в стабилизации мембран.

Для подтверждения этого положения нами было , исследовано влияние ПЭГ—* ООО и цитрата натрия на различные структурно-функциональные характеристики мембран a.eiongatue.

Как показали результаты этой работы г оба соединения значительно увеличивают термоустойчивость всех исследованных звеньев цепи переноса Ф01Х и особенно наиболее термолаби-ьного участка восстань тления феррицианвда. Его Т50^ возрастает на 1&-17°С. При этом отчетливо нивелируются различия в устойчивости отдельных звеньев цепи и наблюдается общее повышение устойчивости фотосистемы. . Например, • значительно снижается чувствительность реакций восстановления ДХФ&й. и K^PeiCNJg к действию гидрофобш модификаторов: детергента ДЦАО и бензолового спирта, увеличивается вклад в спектры возбуждения хлорофилла более г чрот. волновых компонент с -та очной фикобилиновой антенны и резко возрастает втэёмя старения препаратов мембран. Добавление ПЭГ-4000

и цитрата натрия к образцам мембран увеличивает с 70 до 75 77°С температуру денатурации ■ элковых компоненты; ПЭГ-4000 более, чем на порядок увеличивает концентрации даурона, вызывающие 50% ингибирование транспорта электронов ФСН.

- Таким образом, как цитрат натрия, так и ПЭГ-4000 оказывают стабилизирующее действие на различные компоненты изолированных мембран . з.eiongatue, что и является, свидетельством их неспецифического влияния, опосредованного, вероятнее всего, изменением характера взаи- ^действия мембран с воде Рассматриваемые соединения заметно влияниют на время спин-спиновой релаксации протонов воды (Т2). Эффективность влияния ГОГ различной молекулярной массы на скорость переноса электронов зависит преимущественно от концентрации мономерных звеньев этиленгликоля. Этиленгликолъ, который часто используется в качестве криопротектора,. как известно, разрушает структуру воды [Sen et al., 1981, 1982], Поэтому снижение времени релаксации протонов в присутствии ПЭГ можно об'яснить только "замораживанием" во^и в гидр' тных оболочках спиртовых групп.

Исходя из этого можно предположить,- что стабилизирующее действие ПЭГ на мембраны реализуется ■ по' принципу "исключенного , оСема" [Кантор и Шиммел, 1984]. Суть этого принципа состоит в том, что высокие жцентрации полимерных молекул образуют вместе с гидратированной водой самостоятельную фазу и тем самым могут вытеснять резко _ отллчающиеся по природе другие полимерные компоненты в самостоятельные фазы с собственной связанной водой. Этот механизм похож по конечному результату на "высаливание", но вытесненные компоненты могут остаться в об'еме микрофаз и долгое время не выпадать в осадок. ВажнЬ отметить, что рассматриваемое действие ПЭГ неизбежно должно сопровождаться существенными ■ изменениями в -характере взаимодействий мембран с водой. Последние в силу явления лиотропного полиморфизма липидов могут значительно влиять на фазовое состояние и гидрофобные взаимодействия в мембранах в целом. На этом, по-видимому, основано стабилизирующее влияние высоких концентраций ПЭГ на мембранные препараты. Увеличение термоустойчивости цепи переноса электронов ФСП на феррицианид, опосредованного подвижными хинонами, должно быть обусловлено снижением в присутствии ПЭГ-4000 степени .. тормоиндуцированного расслоения липидного матрикса мембран.

Аналогичный механизм, основанный на явлении лиотропного

полиморфизма, в конечном счете, должен определять и действие высоких концентраций цитрата натрия. Однако цитрат натрия в отличие от ГВГ-4000 не разрушает структуру воды, а, : эоборот, .повышает ее структурированность. Это связано с тем, что цитрат-ион так же, как и другие ионы лиотропного ряда, хорошо встраивается в пространственную ст>„-ктуру кластеров молекул воды, и поэтому может служить центром ее кристаллизации (Хиппель и Шлейх, 1973). Особенности взаимодействия -цитрата натрия с водой, отчечливо проявляющиеся, как было отмечено выше, по относительно более слабому влиянию на время спин-спиновой релаксации протонов, вероятно, определяют и особенности его влияния на мембраны в.вгопвагие. Например, он зн-яггельно слабее по сравнению с ПЭГ влияет на чувствительность цепи транспорта электронов ФОН к детергек^у или существенно (в 2 разе) ускоряет скорость Переноса электронов при комнатной температуре (рис. 6). Кроме того, цитрат натрия помимо неспецифического действия на мембраны проявляет 1 низких концентрациях часто встречающееся у лиотропных солей специфическое влияние. Так при концентрациях 50-60 мМ он вызывает необратимое и полное ингибирование переноса электронов к феррицианиду и частичное ингибирование переноса к ДХФИФ (см. рис.<5). Такое действие цитрата, вероятно, связано в первую очередь

Рис.6.Концентрационные зависимости действия цитрата натрия на скорость (V) восстановления феррицианида (1) и ДХФИФ (2)- в ФС11 мембран те^ «юфильных цианобактерий . з.в1ол«а*ив. у=юоЖ соответствует скорости восстановления акцепторов в отсутствие цитрата. Измерения проводили при комнатной температуре.

с его способностью образовывать комплексы. с поливалентными ионами металлов. В условиях наших экспериментов анионы трехзамащенной соли 'цитрата натрия могут связывать ионы Мвг+, которые при не'тральпых рН необходимы д.. л поддержания активности цепи транспорта электронов. В пользу этого свидетельствуют данные о

зависимости эффекта ингибирования цитратом от рН, снк шие которого приводит к восстановлению функциональной активности как за счет протонирования • мембран, Т' ч, вероятно, и за счет увеличения константы нестойкости комплекса цитрата с Mg2+ при протонировашш. Однако, в отличие от действия стандартного комплексом - натриевой соли ЭДТА,действие цитрата натрия на цепь 'переноса электронов растянуто во времени. Так, если эффект ингибирования транспорта электронов ЭД^-На в мембратах з.oiongatuB реализуется пр хтически за время подготог- -л препаратов к измерениям, то действие цитрата натрия в зависимости, от концентрации растягивается на десятки минут. Это означает, что скорость реакции ингибирования цитратом, скорее всего, лимитируется скоростью диффузии заряженного аниона цитрата в гидрофобную зону ФОН. Учитывая его различное влияние на участки восстановления феррицанида и ДХФИФ можно предположить,что он взаимодействует с ионами железа в ршонном комплексе на акцепторной стороне реакционного центра.. Косвенным свидетельством в пользу этог служит необратимый характер Действия цитрата. Такое же влияние на мембраны оказывает рпецифичнный ' на Ft-ион комплексон о-фенантролин.

■ Таким образом, полученные в настоящем разделе работы результаты позвол. .¿от считать, что снижение устойчивости мембран в процессе выделения из клеток термофильных цианобактерий в целом не связано с потерей каких-либо специализированных стабилизирующих соединений или нарушением нативной упаковки мембран в клетке. Главным фактором, определяющим этот процесс, является изменение характеравзаимодействия мембран с водой. В первую очередь изменение гидратации мембран проявляется на уровне липид-липидных и липид-белковых взаимодействий, определявдих специфическую гетерогенность' структуры липидного матрикса. Гидратация мембран, как известно, лежит в основе явления лиотропного полиморфизма и в зависимости от температуры влияет на вероятность существования различных групп липидов в виде ламеллярной и гексагональных структур. В случае ФОН цианобактерий изменение уровня гидратации приводит даже. при невысоких температурах к расслоению мембран и нарушению функционирования пула подвижных хянонов. Неблагоприятное влияние температуры . или других факторов (гидрофобных модификаторов, ингибиторов) на изолированные из клетки мембраны можно в условиях in vitro значительно снизить с помощью высоких

концентраций агентов, эффективно действующих на структуру вода. В качестве таких агентов в настоящей работе были использованы полиэтиленгликоли и цитрат натрия. В присутствии высоких конц нтраций этих соединений значительно возрастает общая стабильность мембран, а их термоустойчивость увеличивается' практически до уро 'я целых клеток. Температура 50% инактивации выделения кислорода мембранами в присутствии ПЭГ-4000 составляет 64°С, а целыми клетками 67°С.

Несомненно, что аналогичное влияние на мембраны могут оказывать и внутриклеточные полярные компоненты, в первую очередь белки и углевода, обладающие способностью снижать свободную энергию взаимодействия мемс^ ан с водой. Суммарное. содержание полярных групп в клетке может достигать молярных значений и они могут и. рать определяющую роль в матричном механизме стабилизации мембран. Эти представления хорошо согласуются с тем фактом, что в клетках термофильных бактерий практически нет осмотически активно;"! вода [Амелунксен и Мэдок, 1981] .

V. Активация замедленной люминесценции и деградация фотосистемы 1 мембран цианобактерий при высоких температурах.

В предыдущих разделах наш было показано, что неспецифические взаимодействия фотосинтетических мембрац с водой играют' важную роль в их стабилизации в ус. эвиях tu vttro. Наряду с другими факторами эти взаимодействия могут принимать участив и в стабилизации мембран in viva, обеспечивая их функциональную активность в определенном для каждого вида "фотосинтетичаского организма диапазоне температур • роста. В послед ив • года сформировались представления, согласно .которым нижний температурный предел роста холодоустойчивых растений фактически ограничивается . температурой замерзания внутриклеточной вода, а теплолюоивых раст чий - температурой холодового шок", которая вызывает фазовое расслоение липидов мембран. Эта температура, как правило, выше температуры основного фазового перехода липидов (см. например, Murata and Nishida, 19S7). Предполагается, что процесс расслоения липидов определяет и верхнюю температурную границу роста ' мезофильных фотосинтезируяцих организмов. Что касается экстремальных термофилов-фотоавтотрофов, то их верхний предел те-'пера1.,р роста резко огра-цчс л 70°С. В то же время, например, гетеротрофные бактерии могут pacía при температурах вплоть до

90-95°С и даже выше при повышенных давлениях (Амелунксен и К'-док, 1981). То есть липопротег '.овне мембранные комплексы сохраняют свою активность и при температурах более 70°С. В связи с этйм остаются непонятными причины, ограничивающие возможность роста фотоавтотрофов температурой 70°С.

В поисках ответа на этот вопрос мы обратили внимание на впервые обнаруженный нами эффект ' активации замедленной люминесцинции хлорофилла мембран з.atongat.a при температурах 70-80°С (см. рис.4, кривая "). Более подробные исследовдь обнаруженного явления показали, что высокотемпературная замедленная люминесценция. мембран s.»iongatue прямо связана с функциональной активностью ФС1 и имеет рекомбинационную природу. Она отсутствует у . частиц ФС11 и сохраняется у мембранных фрагментов, обогащенных ФС1, активируется в присутствии восстановленного ДХФИФ, донируюцего электроны на Р700, и тушится в присутствии метилвиологена. Интенсивность послесвечения ФС1 практически не меняется при ингибировании, водоразлах ^идего комл-экса обработкой 0,8 M Трис-нсх или при блокировании цепи транспорта электронов в ФОН диуроном, а также пр, воздействии на ФОН реагентов, ускоряющих дезактивацию' и модифифицирувдих . s-состояния (CICCP и ЯН4С1).

Время затухг чя люминесценции ФС1 s.eiongatua при температуре 78°С, по нашим оценкам, не превышает 6 мс. У. высших растений и водорослей миллисеку«дная замедленная люминесценция ФС1 при комнатных температурах может быть обусловлена двумя компонентами с равными Б-20 мс (Шувалов и др., 1976; Вашакмвдзе 1985; vos, van Gorkom, 1988) И 70 мс (Vos, van Gorkom-, 1988), которые, вероятно, связаны с обрат: ам переносом зарядов с яелезосерных центров РА и F0. По времени затухания высокотемпературная замедленная % люминесценция з.aiongatue наиболее близко соответствует рекомбинации в паре Р700РД. Кроме того, термоиндуцированная люминесценция ФС1 з.вlongatue также неоднородна и... содержит, как минимум два различающиеся по термостабильности компонента. Они отчетливо выявляются при восстановлении Р700 мембран и препаратов ФС1 ДХФИФ. Расщепление полосы ФСХ в присутствии восстановленного ДХФИФ, вероятно, происходит в результате изменения стационарного распределения зарядов между вторичными акцепторами при увеличении их заселенности электронами.

• В присутствии ДХФИФ-Н2 происходит также исчезновение медленной секундной компоненты кинетики индукции замедленной лкминесценции ФС1. и условиях низкой восстановленвдсти Г*00 эта кине: жа, по-видимому, отражает процесс установления стационарного равновесия распределения зарядов в ответ на включение света.

Температурный ] ст послесвечения ФС1 обусловлен, по-видимому., термозависимым увеличением скорости рекомбинационных процессов в реакционном центре, которые имеют достаточно высокую энергию активации.

При анализе других возможных причин температурной индукции послесвечения обращает на себя внимание то, что удаление воздуха из препаратов мембран резко ^еличивает интенсивность замедленной люминесценции (в 5-10 раз), делает ее в значительной степени тбрмообрлтимой (см. рис. 7), а кроме того вызывает увеличение термостабильности цепи транспорта , электронов и полностью предотвращает выцветание хлорофилла. Влияние анаэробных условиГ

.вероятно связано со снижением уровня окислительной деградации функционально-активных компонентов ФС1, В то же время действие кислорода на замедленную люминесценцию, по-видимому, не ограничивается только этим механизмом. Как известно, основной вклад в окислительную фотодинамическую деструкцию хлорофилла так же, как и других пигментов, вносят взаимодействия с возбужденными . го тоянилми молекул и, • .ервую очередь, с триплетными состояниями. Следовательно, снижение концентрации кислорода в

200

100

Рис.7. Температурные зависимости замедленной люминесценции мембран цианобактерий в.егопеагчо в аэробных (1) и анаэробных условиях при первом (2) и повторном (2а)'прогреве образца.

М 50 70 90 °С

- -

среде должно вызывать рост стационарной концентрации трипле юго хлорофилла. В пользу пг.»дположэния осуществовании взаимосвязи между термоиндукцией замедленной л1 'шнесценции и 'генерацией триплетного хлорофилла в мембранах з.вгопеа^а служат результата исследования влияния на нее анионов галогенного ряда и ионов N0^. В отличие от других использованных в работе ионов золей эти анионы резко снижают интенсивность послесвечения. Эффективность действия галоген-ионов увеличивается с ростом атомний массы частиц, и концентрационные зависимости ;влияния в координатах Штерн -Вольмера имеют линейный характер. Эти данные хорошо согласуется с. представлениями о способности ионов галогеного ряда и нитрат ионов дезактивировать триплетно-возбуаденные возбужденные состояния пигментов (Теренин, 1967). Появление при высоких температурах предполагаемой взаимосвязи замедленной люминесценции с генерацией триплетного хлорофилла может быть обусловлено термоиндуцированным снижением эффективности тушения каротиноидами образующихся в процессе рекомбинации зарядов триплетных состояний первичного доно; 1 реакционного центра ' ФС1. Уве'личение времени жизни триплетных состояний должно приводить к увеличению вероятности их конверсии в синглетное. состояние и ройту выхода замедленной • .люминесценции.В нативных мембранах хлорофилл" липид-белковых комплексов антенн и реакционного центра находится в гидрофобном окружении и, вероятно, слабо доступен для экзогенных заряженных тушителей. Однако, при высоких температурах их вклад в процессы дезактивации хлорофилла может значительно возрастать.

Таким образом, явление термоактивации миллисекундной замедленной люминесценции ФС1 мембран термофильных цианобактерий, по-видимому, обусловлено ^умя Ьзвимосвязанными процессами. С одной стороны, увеличением скорости рекомбинации зарядов в • реакционном центре-и. с другой стороны, снижением эффективности взаимодействия каротиноидов и хлорофилла, приводящим, в конечном счете, к увеличению выхода синглетно-возбужденных состояний первичного донора в реакциях обратного переноса.

Теромоиндуцированное увеличение выхода люминесценции ФС1 характерно не только для цианобактерий, но и для хлоропластов высших растений. Так на хлоропластах гороха в анаэробных условиях в присутствии дитионита натрия при 56°С также наблюдается дополнительный пик послесвечения. Этот пик- относится к ФИ, поскольку он тушится метилвиологеном и сдвинут в область высоких

температур на 20-22°С, что хорошо соответствует »различию термостабильности ФС1 и ФСН хлоропластов.

Пик замедленной люминесценции ФС1 цианобактерий соответствует .температурам, при которых происходит ингибирование функциональной активности фотосистемы. Об этом свидетельствует, . например, снижение на 80% скг -ости переноса электронов фотосистемой 1 от восстановленного ДХФИФ на метилвиологен при темепратуре 78°С. В. более ранней работе было показано также, что 50S инактивация окислительно-восстановительных превращений переносчиков Ag и Р430 ФС1 synechocopcua ер. происходит при температуре 81°С [Kolke et al., 1982]. Таким образом обнаруженная нами высокотемпературная замедленная люминесценции, по видимому, может служить индикатором термоиндуцированных структурных сдвигов в реакционном центре ФС1. Как былс показано в предыдущем разделе, устойчивость ФСН ¡..;мбран s.eiongatue может быть существенно увеличена модификаторами структуры воды: ПЭГ-4000 и цитратом натрия. В связи с этим можно было ожидать, ( что с помощью перечисленных соединений удастся увеличить тярмоустойчивость ФС1. При атом пик послесвечения, ее пигментов должен сдвинуться в область высоких температур. Этот сдвиг действительно имеет место, однако, он составляет всего 2-3°,. В то же время пик ФСН сдвигается на 6-7°С. Низкий стабилизирующий еффэкт действия ПЭГ и цитрата натрия свидетельствует, скорее всего, г- том, что при температурах 65-80°С уже невозможно обеспечить эффективную работу механизма регуляции реакций образования триплетных состояний пигментов. Все это должно приводить к Ija неконтролируемому фотодинамическому окислению. По-видимому, при температурах выше 70°С сложные пигментированные мембранные системы фотосйнтетиков могут функционировать только в анаэробных условиях. Совокупность этих данных приводит нас к выводу,.что именно фотодинамичсокая деструкция и есть тот процесс, который • ограничу-зет верхний предел температур роста фотоавтотрофвых организмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

' При исследовании изолированных мембран цианобактерий с помощью различных физико-химических и биофизических методов оценки скг поста переноса электронов " функционального состояния отдельных участков электронтранспортной цепи показано, ' что различные

компоненты ФСН значительно отличаются по термоустойчиг лсти. Сравнительно высокой т. рмостабильностыо обладают звенья цепи переноса электронов от водоразлагаюш^о комплекса до 'первичного хинона. Эта группа переносчиков прочно связана с полипептидами реакционного центра, и их термоустойчивость, вероятно, обеспечивается устойчивостью • самих полипептидов. Наибольшую термолабильность проявляют звенья цепи транспорта электронов, расположенные на акцепторной стороне ФСН цианобактерий. Они обеспечивают перенос электрона эт. хинона 0Д в пул пластохиноног и включают, вероятно, в качестве кофакторов ионы Ре2+ и НСОд.

Результаты изучения физико-химических свойств этих звеньев методами Мессбауэровской спектроскохпщ и прямой регистрации фотоэлектрического мембранного потенциала свидетельствуют в пользу того, что термолабильность цепи переноса электронов акцепторного участка ФСН определяется в первую очередь термоиндуцированными изменениями структуры дипидного матрикса изолированных мембран цианобактерий. Это предположение хорошо, согласуется с данными изут ния термотропных фазовых переходов "липидов мембран методами дифференциальной сканирующей . калориметрии, регистрации термоиндуцированной замедленной ^люминесценции. хлорофилла и Аррениусовских зависимостей скорости ' реакции восстановления искусственных акцепторов. Температурные зависимости характеристических параметров, полученные этими методами, резко измененяются в .интервале температур, инактивирующих реакции переноса заряда на акцепторной стороне ФСН.. Такие изменения обычно происходят при фазовых переходах липидов Сиомембран.

Результаты, свидетельствующие в пользу -определяющей роли термоиндуцированных изменений структуры липидов в процессе термоинактивации акцепторной стороны ФСн цианобактерий, были получены нами- при -исследовании действия на термостабильность мембран', соединений, ; изменяющих степень их гидратации, полиэталенгликолей и цитрата натрия. Эти соединения в высоких концентрациях связывают воду или повышают структурированность водных кластеров и. тем самым эффективно влияют на гидратацию суспендированных в воде полимолекулярных комплексов. В этой работе мы прежде всего опирались на хорошо известный факт, что структурное состояние бинарных систем 'индивидуальные лгошда -вода1 однозначно описывается фазовыми диаграммами в координатах температура - степень гидратации липидных молекул. Введение

полиэтиленгликолей или цитрата натрия в препараты мембран цианобактерий . увеличивает, термоустойчивость цепи транспорта • электронов ФСИ в целом и снижает различия термоста^ильности • отде ьных компонентов. Наиболее значительно увеличивается . теомоустойчивость акцепторной стороны ФОН.

Совокупность результатов комплексного. исследования . термоустойчивости отдельных компонентов цепи транспорта электронов и физико-химических характеристик мембран термофильных цианобактерий позволяет считать, что термолабильность акцепторного участка ФСИ. определяется в первую очередь термоиндуцированными изменениями структуры липидного матрикса мембран. В их основе, по-видимому, лежит расслоен э липидов, приводящее к нарушению специфической организации , липидного окружения- ФСИ и оттоку подвижкх хыюнных переносчиков во вновь образующиеся ../¡пидные агрегаты.

Таким образом, как показали результаты прове денны" исследований, термоустойчивость цепи транспорта электронов ФС11 изолированных мембран термофильных цианобактерий определяется устойчивостью двух ее основных компонентов. Наиболее термоустойчивые компоненты прочно связаны с полипептидами реакционного центра. Их термостабильность слабо зависит от свойств водной фазы (рН, ионный состав, присутствие полярны соединений и др.) и обеспечивается, очев;-що, внутренней термоустойчивостью белков. С другой стороны, термолабильные компоненты связаны с липидным матриксом. Устойчивость этих звеньев к действию темепаратуры определяется фазовым состоянием липидов и - в значительной степени зависит от присутствия в войной • фазе соединений, влияющих на гидратацию мембран.

■ Полученные В работе результаты свидетельствуют о важной роли гидратации в механизме термостабилизации изолированных ме..;бран термофильных циаглбактерий. хп ьаго ее можно регулировать с помощью соединений, влияющих на состояние свободной воды. Такую роль в клетке, вероятно, могут выполнять полярные группы полипептидов, Сахаров и других соединений. Поэтому не удивительно, что в клетках термофильных микроорганизмов практически отсутствуе осмотически активная вода.-

При исследовании термоустойчивости наиболее стабильного ацвна , мембран цианобактерий - ФСТ и выяснении возможных причин, резко, ограничивающих верхний предал темрератур роста фотоавтотрофных

термофильных организмов, нами был впервые обнаружен г $ект активацт"! замедленной ..шинесценции хлорофилла мембран' при температурах, соответствующих верхней границе термоустойчивости ФСХ. Как показали результаты изучения механизма активации этого послесвечения при высоких температурах, оно представляет собой рекомбинационную люминесценцию, обусловленную функциональной активностью реакционного центра Р700. Параллельно с термоактивацией замедленной люминесценции в ьрисутствии кислорода наблюдается ингибирование цепи транспорта электронов и внцветак-д полосы поглощения хлорофилла мембран. Анализ природы этих явлений, позволяет высказать предположение о том, что верхний- предел температур роста фотоавтотрофннх термофильных организмов (70°С) ограничен термоактивацией фото динамической деструкции хлорофилла. По-видимому, уровень эффективности межмолекулярных взаимодействий при температурах 70-73°С не позволяет природе сохранить результативный механизм, препятствующий развитию светозависимых окислительных реакций.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что отдельные участки цепи переноса электронов ФС11 изолированных ме Зран термофильных цианобактерий зупеснасассив егапеагив значительно отличаются по термоустойчивости. Наиболее устойчивыми к , действию температуры являются . компоненты, относительно плотно связанные с полипептидами рекционного центра ФС11. Наиболее термолабильное звено локализовано на акцепторной стороне ФС1Г и связано с пулом подвижных хинонов-.

2. Результаты исследования физико-химических характеристик акцепторной стороны ФОН з.вгопеаьш» позволяют считать, что ее низкая термоустойчивость обусловлена расслоением липидов мембран (образованием инвертированных мицелл). Предположено, что это приводит к оттоку подвижных хинонов в. инвертированные мицеллы.

3. Установлено, что высокие концентрации полиэтиленгликолей и соли лиотропного ряда - .цитрата натрия увеличивают общую термоустойчивость изолированных мембан цианобактерий; наиболее значительно возрастает термоустойчивость акцепторной стороны ФС11. Результаты исследования особенностей действия этих соединений на мембраны свидетельствуют о важной роли гидратации в обеспечении термоустойчивости липидзависимого звена цепи переноса

электронов ФС11.

4. При исследовании термоустойчивости ФС1 мембран термофильных цианобактерий обнаружен эффект термоиндукции рекомбиг ационной . замедленной люминесценции хлорофилла этой фотосистемы. Процесс теDMoиндукции послесвечения ФС1 сопровождается инактивацией цепи транспорта электро: в и выцветанием хлорофилла и, вероятно, связан с нарушением структуры пигмент-белковых комплексов. Б. На основании результатов анализа природы высокотемпературной замедленной люминесценцию! ФС1 s oiongatua вывинута гипотеза о том, что верхний предел температур роста фотоавтотрофных организмов определяется темоиндукцией фотоцинамической деструкции; пигментов.

6. Совокупность полученных в работе данных позволяет считать, что важную i эль в механизме формирования высокой термоустой ^шости мембран в клетках термофильных фотосинтетических организмов играют взаимодействия липидных компонент е молекулами воды.

7. Обнаружено, что Мессбауэровские спектры частиц ФСН содержат компоненты, характерные для негеминового железа реакционных центров ФОН зеленых водорослей. Установлено, что одним из лигандов негеминового железа является ион бикарбоната, связанный с ним дос.^точно прочными координационными связями.

8. Методом прямой электрометрии вцервые зарегистрировано образование фотоиндуцирован эй трансмембранной разности потенциалов • на реконструированных частицах ФСН цианобактерий. Кинетика формирования потенциала содержит только быстрый компонент, свяьешный с переносом заряда в паре P680QA. Отсутствие медленного компонента нарастания фотопотенциала, обуаг. елейного переносом электрона на QB, по-видимому,. связан: с необратимым оттоком электронов в экзогенный гидрофобный матрикс.

Спис ч публикаций по теме диссертации

1. Кауров D.H. .Белявская Г.К., Ловягина Е.Р. Частицы ФСН с активной кислород-выдэляюцей системой из одноклеточных сине-зеленых водорослей Syneohoooocus »iorvgatus// I Все СОЮЗНЫЙ бИОфИЗИЧЭСКИЙ с'езд, . Москва 1982, с.ЗЗЗ.,

2.Mei-zlak M.N., Kovrizhnih V.A., Kaurov Yu.N. Improved solvent eyetem' for plant pigmént separation on eilioa gel thin layers// J.C'iromal. 1983, V.262, p.331 33,.

3. Кауров D.H., Ловягина.E.P., Белянркая Г.К., Иванов И.И., Иссле-

- ■ —

дованив факторов, влияющих на структурно-функциональные сЕ Йства частиц <*тгосистемы II с . .стивной водоразлагающей системой из мембран термофильных цианобактерий Зупе~Кососсив elongatue// биол. мембраны 1986, т.З, »3, с. 27Ь-281.

4. Кауров Ю.Н., Белянская Г.К., Ловягина Е.Р. Изучение механизма активации цитратом электронного транспорта в пигмент-белковых комплексах ФСН СИНв—ЗеЛвННХ водорослей ЗупесНососсиз elongatue// 1 Всесоюзная конф. "Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях" Вильнюс 1985, с. 87.

5. Чудиновских М.Н., Кауров Ю.Н., Семин Б.К., Иванов И.И. Термо-. устойчивость транспорта электронов в фотосистеме II мембран термофильных цианобактерий Synechocoooue erlongatue// ФИЗИОЛ. растений 1987, т. 34, ВЫП. 5„ с. 1073-1077.

6. Квуров Ю.Н., Белянская Г.К-., Ловягина Е.Р., Иванов И.И.-,. Рубин А.Б. Физико-химический механизм термостабилизации изолированных мембран термофильных цианобактерий// 1 Болгаро-Советский симп. "Свободные радикалы и биостабилизаторы",София 1987, е..'1-72.

7. К уров Ю.Н., Белянская Г.К., Иванов И.И., Тимофеев К.Н., Рубин А.Б. Тврмостабильность электронного транспорта в мембранах и ЧвСТИЦаХ ФС II ИЗ ТерМОфИЛЬНЫХ ЦИаНОбаКТерИЙ Blneohooaoa ua eloneatue// Биол. мембраны 1988, т. б, #1, с. 18-26.

e.Kaurov Yu.N., elyanekaya G.K. Termal stability of isolated membraneв of thermophylio oyanobaoteria// 6-th.oongress federation of European Booietiee of plant phyzyology, Yugoslavia, Split 1988, v.2, p.35.

9. Кауров Ю.Н., Белянская Г.К., Иванов И.И., Васильев И.Р., Рубин А.Б. Механизм действия цитрата на транспорт электронов в мембранах термофильных циолобактёрий зупоснососсив elongatue// Биол. мембраны 1988, т. 5, *8, с. 857-866.

10. Кауров Ю.Н», -Аксенова Г.Е., Ловягина Б.Р., Иванов И.И., Рубин А.Б. . Термоиндуцированная замедленная флуоресценция хлорофилла фотосистемы I и II мембран термофильных цианобактерий seneoKooocoue oion&xtua// Биол. мембраны, 1988, т. 5, «12, с. 1289-1296.

11. Kaurov Yu.N., Akeyonova О.Е., Lovyagina E.R. Thermally-induoed delayed fluorescence of ohlorophyll of photoeys terns 1 and 2 of thermophylio oyanobaoteria// Third Congress of the European Society for Photobiology, 27 Aug.-Э Sept. 1989, Budapest, Hungary, p.267.

12. Aleksandrov A.Yu., Novakova A.A., Semin B.K., bovyagina E.R., Kaurov Yu.N. A Moesbauer spectroscopy study of iron-oontaining electron carriers oj.' photosyetem II of thermophilic gr-en-blue

- algae'/ International Conf erenoe on the Applioations of the Moeebauer Effeot (ICAME), Hungary, 4-8 Sept. 1989, v.2,. p.13.2.

13. Kaurov Yu.N., Be"тапвкауа G.K., Ivanov I.I. Rubin A.B. Thermal stability of electron transport in PSII membranes and patioles from thermophilic) oyanobaoteria// Gen. Phyeiol. Biophie. 1990, v.9, p.189-202.

14. Semin B.K., bovyagina E.R., Alekeandrov A.Yu., Kaurov Yu.N., Novakova A.A. Effeot of fonnate on lloeebauer parameters of the non-heme iron of PSII parti .ев of oyanobaoteria// FEBS Lett., 1990, v.270, p.184-186.

15. Аксг гова Г.Е., Ловягина E.P., Aick Г.Я., Кауров Ю.К Роль кислорода в процессах термоактивации замедленной люминесценции ФС1 мембран термофильных цианобактерий// Докл. МОИП, Общая биология,М. 1992, Наука, с.73-76.

16. Ловягина Е.Р., Семин Б.К., Александров А.Ю., Кауров D.H., Новакова А.А. Влияние формиата на мессбауэровские параметр! неге-мового железа в частицах ФСИ цианобактерий// Физиол. растений 199L, т.39, вып. 1, с.66-72.

17. Кауров Ю.Н., Аксенова Г.Е., Ловягина Е.Р., Веселова Т.В.< Иванов И.И. О природе термоинд дарованной замедленной флуоресценции ФС1 мембран термофильных цианобактерий// Биол. мембраны 1992, Т.9, *8, с.845-857.

18. Кауров D.U., Акк Г.Я., Ловягина Е.Р. Термоиндуцированная замедленная люминесценция хлорофилла фотосистемы I хлсюшгастов гороха//Биол. мембраны 1992, т.9, «8, с.в58-861 .•

19. Kaurov Yu.N.", Akeyonova G.E., lovyagina E.R., Ivanov I.I., Rubin A-B. Theiroally-induoed dolayed flu^reeoenoe of photosyetem I and II ohlorophyl* in thermophilio oyanobaoterium Bynoohoooooue elongatue// Gen. Phyeiol. Biophys. 1992, v.11, p.229-239.

20. Кауров D.H., Аксенова Г.Е., Ловягина Е.Р., Иванов И.И. Исследование природы рН-индуцированной неоднородности температурных зависимостей замедленной люминесценции ФСИ мембран термофильных цианобактерий// Физиол. растений 1993, т.40, вш.2, с. 192-197.

21. Айк Г.Я., Ловягина Е.Р., Кауров Ю.Н. Интенсивность термоинду-нированниЛ замедленной лшин^сц щии хлорофилла ФС1 целых клеток термофильных цианобактерий зависит, от присутствия кислорода и

степени восстановленное™ Р700// Физиол. растений 1993, -.40, вып.З.в лечати.

22. Kaurov Yu.N., Aksyonova Q.E., Lovvagina E.B., Vesfilova T.V., Ivanov I.I. Thermally-induced delayed lumineeoenoe from PSI in membranes of thennophilio oyanobaoteria// Bioohim.Biophys.Aota 1993, in preea.

23. Kaurov Yu.N.,Akk 0., Lovyagina E.R.' Thermaly-induced delayed luainesoenoe of photosystem I ohlorophyll from pea ohloroplasts// Bioohim. Biophya. Aota 1993, ii press.

Подписано в печать 14.05.1993 г. Зая.770 Формат 60x84/16. Тир. 50

Ыоснва. Типография РАС HI