Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование генов синтеза пролина proB и proA термофильной бактерии Thermus ruber, их характеристика и анализ кодируемых ими белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яклинчкин, Сергей Юрьевич, Москва



Q

' f «с

российская академия наук институт молекулярной генетики

На правах рукописи

якличкин

Сергей Юрьевич

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ СИНТЕЗА ПРОЛИНА ргоВ и ргоА ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ THERMUS RUBER, ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА И АНАЛИЗ КОДИРУЕМЫХ ИМИ БЕЛКОВ

03.00.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Л.В. Неумывакин

Москва-1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕРМОФИЛОВ.................................................................8

1.1. Понятие термофила и общая характеристика..................................................................8

1.2. Молекулярные особенности термофилов........................................................................И

1.2.1. Структура плазматической мембраны...........................................................................11

1.2.2. Структура ДНК генов термофилов..................................................................................И

1.2.3. Особенности белков термофилов....................................................................................13

1.2.4. Небелковые стабилизирующие факторы......................................................................14

ГЛАВА 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ БЕЛКОВ ................................................................................................................................................................18

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА THERMUS.....................................24

3.1. Экология бактерий рода Thermus.......................................................................................24

3.2. Идентификация бактерий рода Thermus...........................................................................25

3.3 Морфология и клеточный состав бактерий рода Thermus...........................................27

3.4. Физиология и метаболизм бактерий рода Thermus.......................................................28

3.5. Биотехнологическое применение термофильных микроорганизмов и бактерий рода Thermus......................................................................................................................................30

-33. 6. Использование различных генов в качестве маркеров для генной инженерии

растений и бактерий.......................................................................................................................34

ГЛАВА 4. БИОСИНТЕЗ ПРОЛИНА И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИ ................................................................................................................................................................35

4.1. Биосинтез пролина и его регуляция в клетках бактерий.............................................35

4.2. Картирование генов биосинтеза пролинаргоВ, ргоА иргоС эубактерий и их регуляция экспрессии.....................................................................................................................39

4.3. Использование генов биосинтеза пролина в промышленной и научной практике

................................................................................................................................................................46

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 46

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................48

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 6. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ СИНТЕЗА ПРОЛИНА PROB И PROA ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ THERMUS RUBER, ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА И АНАЛИЗ КОДИРУЕМЫХ ИМИ БЕЛКОВ.............................................................................53

6.1. Клонирование генов биосинтеза пролина proBA Thermus ruber...............................53

6.2. Определение и анализ нуклеотидной последовательности плазмиды рТР1..........53

-46.3. Характеристика генаproB и его продукта.......................................................................62

6.4. Характеристика генаргоАтл его продукта.......................................................................66.

6.5. Анализ аминокислотного состава ГК и ГФР..................................................................68

6.6. Вторичная структура белков РгоВ и РгоА................................;......................................74

6.7. Синтез белков РгоВ и РгоА в системе транскрипции-трансляции in vitro.............77

6.8. Определение активности ГФР и ГК...................................................................................77

ВЫВОДЫ...........................................................................................................................................80

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

81

ВВЕДЕНИЕ

Термофильные бактерии адаптировались к существованию в среде с высокой температурой. Температура среды их обитания составляет 50-100° С. Большинство известных термофильных бактерий имеют морское происхождение, некоторые обнаруживаются в континентальных гейзерах и горячих источниках. Белки и ферменты термофильных микроорганизмов функционируют в этих условиях оптимально и с большой эффективностью.

Термофильные микроорганизмы представляют большой интерес как с точки зрения фундаментальной науки, так и прикладных исследований. Фундаментальные исследования термофилов привели к открытию целого ряда новых закономерностей в формировании структуры биомолекул, позволяющей им существовать в условиях экстремальных температур. В связи с этим в молекулярно-биологических исследованиях некоторые белки термофилов выбраны в качестве модельных из-за их высокой стабильностью и удобством работы.

С позиций биотехнологии термофилы вызывают интерес в связи с тем, что они являются источниками уникальных ферментов, обладающих чрезвычайно высокой термостабильностью. Это свойство данных ферментов позволяет решать ряд биотехнологических задач, где использование ферментов мезофильных организмов весьма затруднено или практически невозможно. Так представляется перспективным их использовать для высокотемпературных ферментаций, а также для переработки промышленных отходов, минералообразования, получения суперпродуцентов целого ряда ценных биологических продуктов (аминокислот, жирных кислот, белков и т.д.).

Широкое распространение получили ферменты термофилов в исследовательской практике и медицинской диагностике ( ДНК-полимеразы, ДНК- лигазы, некоторые рестриктазы ). На основе необычных свойств этих ферментов разработаны новые методы исследований (полимеразная цепная реакция).

Сравнительно недавно ферменты термофилов стали использовать в качестве маркеров в исследовательской работе по генной инженерии микроорганизмов и растений. Простота тестирования ферментов термофилов в мезофильном организме позволяет надеяться, что белки термофилов будут широко использоваться в мониторинге трансгенных микроогранизмов и растений при переносе их в окружающую среду. Так, простой прогрев экстракта клеток мезофила позволяет

инактивировать практически все ферменты, не затрагивая активность и стабильность фермента термофила. Для решения этой и целого ряда других задач было проведено данное исследование.

За последнее десятилетие клонированы более сотни генов термофилов и охарактеризовано множество кодируемых ими ферментов. В настоящее время завершено секвенирование генома гипертермофильной бактерии Aquifex aeolicus и ряда термофильных архебактерий. Продолжается определение нуклеотидной последовательности генома гипертермофила Termatoga martima.

В данной работе мы клонировали и секвенировали оперон ргоВА биосинтеза пролина термофильной бактерии Thermus ruber. Пролин является осмопротектором в клетках бактерий и растений. Он повышает устойчивость клетки к различным стрессовым воздействиям окружающей среды. У бактерий в биосинтезе пролина участвуют продукты трех генов: ргоВ, ргоА и ргоС. Продукт гена ргоВ (у-фосфоглутамилкиназа) (ГК); АТФ:-Ь-глутамат-5-фосфотрансфераза, ЕС 2.7.2.11) является ключевым ферментом пути биосинтеза пролина. ГК взаимодействует с пролином и регулирует его биосинтез по принципу обратной связи. ГК действует в комплексе с белком РгоА (у-глутамилфосфатредуктаза; (ГФР) Ь-глутамат-5-полуальдегид: NADPH+ оксидоредуктаза, ЕС 1.2.1.41). Оба гена в хромосоме бактерий организованы в единый оперон.). У растений эти оба гена встречаются в 2х различных формах. У таких растений как томат, (Fujita et al.,1998) обнаружены оба гена ргоВ и ргоА, объединенные в один оперон, но и имеется и другая форма, представляющая собой единый ген, кодирующий бифункциональный фермент Д1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазу (П5КС). Этот белок содержит N-концевую часть белка РгоВ и С-концевую часть белка РгоА. Показано, что гены бактерий могут экспрессироваться в растительной клетке У растений Vigna aconitifolia и Arabidopsis thaliana два гены слиты и кодируют П5КС.

В настоящее время гены синтеза пролина привлекают большое внимание генных инженеров, так как их клонирование в растениях и бактериях может дать большой хозяйственный эффект, выражающийся в повышении осмоустойчивости хозяйственно полезных бактерий и растений, улучшения их приспособленности к стрессовым условиям обитания, увеличения урожайности растений.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было выделение генов бисинтеза пролина ргоВА термофильной бактерии Thermus ruber и изучение некоторых свойств ферментов, кодируемых генами данного оперона. Исходя из поставленной цели, быгш определены следующие задачи работы:

1. Клонирование оперона ргоВА биосинтеза пролина Thermus ruber.

2. Определение нуклеотидной последовательности оперона и соответствующей аминокислотной последовательности кодируемых им белков.

3. Анализ особенностей нуклеотидной последовательности генов ргоВА Thermus ruber и первичной структуры продуктов генов.

4. Изучение некоторых физико-химических свойств термостабильных ферментов у-глутамилкиназы и у-глутамилфосфатредуктазы.

Научная значимость и новизна работы.

В настоящей работе впервые был клонирован оперон ргоВА биосинтеза пролина термофильной бактерии Thermus ruber. Определена нуклеотидная последовательность оперона. Проведен анализ нуклеотидной последовательности оперона и аминокислотной последовательности кодируемых генами ргоВА у -глутамилкиназы и у -глутамилфосфатредуктазы (ГК, ГФР). Изучены такие свойства ГК и ГФР как термостабильность, температурный оптимум активности, оптимум рН, а также влияние концентрации различных ионов в среде инкубации на активность фермента.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕРМОФИЛОВ 1.1. Понятие термофила и общая характеристика.

В зависимости от температуры оптимального роста различают три следующих обширных класса организмов: психрофилы, растущие при низких температурах, мезофилы, живущие в температурном диапазоне от 25°-45°С, термофилы, способные расти от 55° С до температуры кипения воды и выше. До сих пор не существует универсального общепринятого определения термина термофил. Одно из определений термофила- организм, способный жить при максимальных температурах, известных для организмов отдельной таксономической группы (Brock, 1986). В соответствии с этим определением термофильными позвоночными будут те, которые живут при температуре около 37° С, термофильные грибы - при 60° С, термофильные цианобактерии- температуре около 70°С.

Способность жить при высоких температурах находится в обратной зависимости от уровня организации организмов. Для многоклеточных растений и животных верхней температурной границей является 50°С. Эукариотические микроорганизмы также ограничены в температурном диапазоне по сравнению с прокариотами.

По Броку (Brock, 1986) температурная граница существования термофильных бактерий, отделяющая их от других организмов могла бы отвечать температуре 5560° С (см. Рис.1). Объясняется это как с экологической, так и эволюционной точки зрения. Температуры ниже 50° С широко распространены в биосфере, и ассоциируются с местами обитания, нагреваемыми солнцем, тогда как температуры выше 55-60° С связаны с геотермальными источниками. Другая причина для определения температурной границы термофильных бактерий в пределах 60й С связана с тем, что данная температура является верхней температурной границей существования эукариотических организмов. Автор указывает на условность данных температурных границ термофильных микроорганизмов, подчеркивая большую значимость температурного континуума, поскольку температурный оптимум роста во многом зависит от условий, в которых организм развивается (Brock, 1986).

Граница термофилии (50-60° С)

св H о о а.

л

н

о

о

su

о

X

U

Термотолерангный организм

Факультативный (умеренный) термофил

Облигатный (экстремальный)

\ термофил

Температура ( С)

Рис. 1. Взаимосвязь между скоростью роста и температурой у различных бактерий.

Изначально по оптимальной температуре роста среди термофилов выделяли три группы (Farrell and Campbell, 1969): облигатные термофилы, имеющие оптимум роста при 65-70° С, но не растущие ниже 40-42° С; факультативные (умеренные) термофилы, растущие оптимально при 50-60° С, а также способные расти при комнатной температуре; термотолерантные бактерии, растущие при 45-50° С и комнатной температуре. Позже были открыты так называемые кальдоактивные или экстремальные термофилы, которые имеют максимум роста выше 70° С, оптимум выше 65° и минимум выше 40° С (Williams, 1975). Наиболее высокотемпературными микроорганизмами является группа гипертермофильных микроорганизмов, живущих в диапазоне температур от 80 до 100° С.

Видовое разнообразие бактерий, живущих при высоких температурах, поразительно велико: sulfur, hydrogen - oxidizing bacteria, облигатные анаэробные и аэробные гетеротрофы. Некоторые бактерии не только являются экстремальными термофилами, но и кислотофилами. На сегодняшний день из термофильных аэробных эубактерий наиболее хорошо изучены виды бактерий родов Bacillus, Thermus, Thermomicrobium (Brock, 1986). Из рода Bacillus лучше всего изучена термофильная бактерия Bacillus stearothermophilus. Этот микроорганизм относится к умеренным термофилам, растет при температуре 50-65° С. В. caldolyticus, В. caldovelox живут при более высоких температурах 75-85° С. В. acidocaldarius, термофил, растет оптимально в диапазоне 60-65° С, предпочтительно в кислом диапазоне pH от 2 до 6, имеет

оптимум рН-3. Из рода Thermus наиболее хорошо изучены Т. thermophilus Т. aquaticus, Т. flavus. Данные бактерии являются грам-отрицательными, имеют палочковидную форму, не образуют споры. Бактерии Т. aquaticus, Т. flavus растут оптимально при 70° С, в то время как Т. thermophilus имеет несколько более высокий оптимум роста 75° С. (Более детальное описание бактерий данного рода можно прочитать в главе 3.).

Исследованные анаэробные термофильные эубактерии представленью бактериями рода Clostridium: С. tartarivorium и С. thermosaccharolyticum - являются умеренными термофилами, растущие оптимально при 55-60°С. С. thermocellum хорошо растет в диапазоне 55-60°С.

Другое царство термофильных микроорганизмов - архебактерии. Изученные рода термофильных архебактерий включают Thermoplasma, Sulfolobus, Methanobacterium, Methanothermus и др. (Brock, 1986).

Проблема происхождения термофильных микроорганизмов остается не решенной по сей день. Были предложены две основные гипотезы (Brock, 1985): 1) первые организмы возникли в высокотемпературной среде, поэтому термофильные организмы являются родоначальниками последующих организмов, которые отделились в процессе эволюции; 2) первоначальные организмы не были термофилами и существовали в умеренных температурных условиях. В последующем термофильные организмы эволюционировали как от психрофильных, так и мезофильных организмов. По мнению Брока (Brock, 1985), если термофилы произошли от мезофилов, то многие генетические изменения должны были бы произойти более или менее мгновенно, что крайне сложно представить. Если же предположить происхождение мезофилов от термофилов, то мутации приводящие к появлению температуро-чувствительного мутанта (не способного расти при высоких температурах) кажутся более реальными. Тем не менее при принятии данной точки зрении, возникает сложность в объяснении множества филогенетических ветвей бактерий. Поэтому, если термофилия имеет один источник, то общий организм-предшественник должен был дать начало всем формам жизни. Решение этой непростой проблемы может быть достигнуто при получении новых данных по термофилам и мезофилам.

-111.2. Молекулярные особенности термофилов

Термофилы эволюционно выработали комплекс приспособительно-механизмов, которые позволяют им жить в экстремальных условиях. Эти механизмы непосредственно связанны с особенностями клеточной и молекулярной организации, некоторые из которых будут рассмотрены в этой главе.

1.2.1. Структура плазматической мембраны.

Плазматическая мембрана является уязвимым клеточным компонентом и поэтому должна обладать высокой стабильностью, поскольку её поверхность непосредственно с соприкасается с высокотемпературной окружающей средой.

Было показано преобладание содержание жирных кислот с разветвленными боковыми цепями в мембране многих термофильных бактерий (Daron, 1970). Brock (Brock, 1967) предположил, что увеличение содержания насыщенных жирных кислот с разветвленными боковыми цепями в мембране термофилов может обеспечить её стабильность при увеличении температуры окружающей среды. В составе липидов плазматической мембраны бактерий рода Thermus (Hughes and Shaw, 1982) обнаружено исключительно высокое содержание углеводов. Предполагается, что это придает ей высокую стабильность.

1.2.2. Структура ДНК генов термофилов.

Генетический аппарат термофильных бактерий рода Thermus достаточно плохо изучен. Регуляция и экспрессия генов термофилов исследована лишь для скудного их количества. Наиболее изучаемые бактериальные объекты рода Thermus представлены микроорганизмами- Т. thermophilus, Т. aquaticus и Т. flavus. Изучены гены метаболических путей