Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение новой osm-мутации гена proB Escherichia coli: клонирование, характеристика и использование гена proB osm

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение новой osm-мутации гена proB Escherichia coli: клонирование, характеристика и использование гена proB osm"

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОРПОРАЦИЯ "ФАРМИНДУСТРИЯ" НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 572.224.42

НЕУМЫВАКИН Леонид Власович

ПОЛУЧЕНИЕ НОВОЙ osm-МУТАЦИИ ГЕНА proB Escherichia coli: КЛОНИРОВАНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНА proB0Sm

03.00. IS —Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена б Отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Э.С.Пирузян. Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Н.И.Жданова, кандидат биологических наук Г. А. Великодворская. Ведущая организация: Кафедра генетика,

Биологический факультет МГУ.

Зашита состоится " Н 0 " ^^ОИХ 1992г. в часов на заседании Специализированного Ученого совета ДО 8.12.01, при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-1 Дорошый проезд, д1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЖ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан " Л'.1 " ¿ПущлХ 1992г.

Ученый секретарь

специализированного совета

кандидат биологических наук В.И.Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_теш.Изучение осмоусгойчивости бактерий имеет 1ьшое теоретическое и практическое значение. Актуальность данных следований заключается в том, что их результаты дают возможность, мть механизмы осмоустойчивости как бактерий, так и растительной " »тки. Многолетние исследования с использованием клеток :тений не. дали пока еще убедительных объяснений работы готического аппарата в условиях осмотического стресса. Только :ле того, как в 70-х годах било обнаружено, что клетки бактерий и ¡тений одинаковым образом реагируют на повышение осмолярности |дц. начались исследования молекулярно-генетических механизмов ютолерантности бактериальной метки как модельной системы.

. Осмотический стресс приводит к дегидратации клетки. Этот йкт аналогичен засухе. Потери сельского хозяйства от засухи и оления почв очень велики. Большие потери урожая происходят из-за тоянного засоления поливных и орошаемых земель. Проблема леделия на засоленных почвах стоит очень остро перед учеными и ктикоми всего мира,так как постепенное сокращение площади отных земель и рост народонаселения постоянно требуют разработки ¡х технологий сельскохозяйственного производства.

Большую помощь в разработке таких технологий могут оказать >да генной инженерии и биотехнологии. С помощью методов ¡тической инженерии необходимые нам гены, в том числе и гены

бактерий, могут быть введены в клетку растения. Метод биотехнологии позволяют получить целое растение из одной клетки Использование этих методов, в сочетании с методами традиционно селекции, открывает неожиданные перспективы для выведения новых высокопродуктивных сортов сельскохозяйственных растений.

Следствием воздействия осмотического шока на растительную бактериальную клетку является падение ее тургорного давления. Это, свою очередь, приводит к снижению активности внутриклеточны ферментов. Одним из механизмов поддерживания тургора являете повышение в клетке концентрации аминокислот-осмопротекторов Пролин-одна из таких аминокислот. Количество его резко возрастает растительной и бактериальной клетке в ответ на повышена осмолярности среды. Регуляция биосинтеза пролива у бактерий хорош изучена в то время как у растений ее механизм неизвестен. Фермент биосинтеза пролина у бактерий кодируют три гена ргоВАС. Пролин са регулирует свой биосинтез с помощью механизма "обратной связи Ключевым ферментом в этом механизме является 7 -.глутамилкиназа продукт гена ргоВ. Определенные мутации по данному гену приводят повышению синтеза пролина клеткой.

Шль_и_задачи__работы. Целью работы являлось получение

эцтеробактерии Escherichia coli спонтанной мутации в гене ргоВ обеспечивающей повышенный синтез пролина и осмоустойчивость, е клонирование, идентификация и использование. В соответствии с это основной гшлыо были поставлены следующие задачи: I) с помощь аналога пролина L - азетидин - 2 - карбоксиловой кислоты получит спонтанные мутанты, обеспечивающие повышенный синтез пролина; 2 отобрать среди полученных продуцентов пролина такой, котори обладает повышенной осмоустойчивостыо; 3) клонировать мутантш

кус; 4) с помощью секвенирования ДНК идентифицировать мутацию; изучить свойства клеток, содержащих мутантный локус; 6) перенести тантный локус в клетки бактерий Hhyzobium fredli с целью вышения их жизнеспособности и осмоустойчивости.

Научная_новизна_и_практическая_ценн^ Получена

вая мутация гена ргоВ Е. coli, обеспечивающая 'клетке «устойчивость. Показано, что она отличается от всех полученных нее мутаций в гене ргоВ. Эти данные дают возможность более гально понять структуру функциональных участков глутамйлкйназы и канизм ее взаимодействия с пралшюм. Кроме того, получены новые щые о роли пролина в клетке и влиянии повышенного синтеза злина на жизнедеятельность клеток бактерий в нормальных и эессовых условиях. Практическая ценность работы заключается в «.что перенос мутантного гена proBosm в клетки Некоторых юбиальных бактерий приводит к повышению их жизнеспособности, а ». в свою очередь, может привести к повышению урожайности ¡тений - симбионтов. Клонирование данного гена в клетках растений 1Волит получить новые сведения о регулировании уровня пролина в тительной клетке в услових осмотического стресса.

Стщктура_и_объем_дассертации. Диссертация изложена на 130 аницах машинописного текста и состоит из введения, обзора ературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и ■ одов. Диссертация содержит 12 таблиц и 30 рисунков. Список ературы включает 158 наименования.

Апробация_работы. Материалы диссертации докладывались на союзной коференции " Регуляция микробного метаболизма " ( Пупшно ia - Оке, 1989г ), IV Всесоюзной школе молодых- ученых юкулярные механизмы биологических процессов " ( Минск, 1У«9г ),

Всесоюзной конференции " Новые направления биотехнологии " ( Пущино - на - Оке, 1990г ), III Всесоюзном симпозиуме " Клеточк механизмы адаптации " ( Чернигов, 1991 ), IV Всесоюзной конференщ " Микробиология сельскому хозяйству " ('Пущино - на - Оке, 1992 ) опубликованы в журнале " Генетика", 1990г.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Литературный обзор состоит из двух глав. В первой гла! рассматриваются механизмы осморегуляции живой клетки. Во втор главе рассматривается роль пролина в механизме осмоустойчиво! бактерий и растений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ООьект исслеаований.В работе использованы штаммы Е. со К12: KL 723 ( получен из Е. coll Genet Stok Centre ); KK 203i ( получен из музея ШМгенетики ); S If 1604 ( получен от H.Symonda) АВ 486-15; Ш ТТВ; НВ 101 ( получены из музея ИМГ РАН ) ; КК 2036 ( А. ) ( получен от Фонштейна M.D. из НИИгенетики ); TG ( получе] от Т. Джилсона, Кембриджский университет ).

Штаммы бактерий Hhyzoblum fredll: BD 32, MA 46, AS 47, TS I1 648a, OS 26 , 8725, Mil) 10 - получены из НИИ сои ДВО РАСХН.

Использовали_плазшды: pSC 101 ( Cohen S.N. et al. ); pT'Z ( Meed D. A. et al. ); pBR 322 ( Bolivar. E. et al. ); pUS 1' ( Yanlah - Perron et al. ); pCV 16 ( Таняшин B.H. и др. ); pBJ (Хургес и др. ); рНК 2013 { Hellnskl U.K. ); pVA 12-2 ( Денисов, др. ); фазмиду A.pSL 51 ( Фонштейн М.Ю. и др. )¡фаговые векторы М

;g 130 и MI3 tg 13.

Среду.В качестве полноценной жидкой и твердой ,( 1,5% агара ) ¡роды для выращивания Е. coli использовали L - среду, а для ¡ыращивания R. fredll использовали среду PI. В качестве минимальной ¡реды использовали для Е. coli среду М9, а для R. fredll -шнимальную среду PI. Для отбора спонташшх мутантов в среду юбавляли аналог пролина L - азетидин - 2 - карбоксиловую кислоту Azc ) и NaCl. Использовали антибиотики: рифампицин ( Rii ), :лорамфе никол ( Gm ), стрептомицин ( Str ), ампициллин (Ар ), •етрациклин ( Тс ).

ОШ§й0ление_солеустдйчивости_и_осмоуст ;леток проводили путем измерения скорости роста бактерий генерация в час ) на среде с различной концентрацией NaCl или

ч /

:ахарозы.

Отбор_о§ш_-_мутантов проводили по методу, описанному Csoncka Csoncka, 1981 ).

Конъюгацию_бактерий проводили по Миллеру ( Миллер, 1976 ).

Тест^на_"кормлени0" проводили как описано у Rushlow ( Rushlow t al., 1984 ).

В9йолб|ше_сушарной_бактериальной__ДНК проводили по методу

anter { Glover ( ed ), 1985 ).

Выделе™е__плазмидной__ЛШ проводили по методу Birnbolm Blrnboim, Dolll, 1979 ).

Вуделениенебольших_количеств__плазмидной__ДНК проводили по

етоду, описанному в методическом пособии ( Мазин и др., 1990 ).

Рестрикция. 1'естриктазы, использованные в работе, получены из 10 "Pennenlas" г.Вильнюс. Для работы каждого фермента рестрикции шользовяли условия, предлагаемые фирмой - изготовителем ( состав

буферной смеси, температура, pH ).

Лигирование. Полинуклеотидлигаза фага Т4 была получена из 1 "Fermentas" г.Вильнюс. Для лигирования использовали услови: предлагаемые фирмой - изготовителем.

Элющюваще_фрагмвнтов_ДНК из агарозного геля осуществл: центрифугированием с помощью колонки с фильтровальной бумагой, i описано в методическом пособии ( Маниатис, 1984 ).

Электрофорез нативной ДНК и рестриктов проводили в 0,4; О,' 1% агарозном геле в режимах, которые зависели от эксперименталы задач ( Маниатис, 1984 ).

• Трансформацию клеток Е. coll проводили по . модифицирован» методу Cohen ( Cohen ét al., 1972 ).

Трехродительское скрещивание проводили, как описано в книп ( Симаров и др., 1990 ).

D§E§§22—ffiffi__на__штроцеллюзние___фильтры и блоттинг

гибридизацию проводили по методу Саузерна ( Маниатис, 1984 ).

г Получение решшкативной и однонитевой формы ДНК фага MI3 130 и Ml3 ta 131 проводили, как описано в методическом пособии ( Мазин и др., 1990 ).

Секвенирование_5НК проводили по методу Сэнгера ( Маниат) 1984 ).

Электрофорез__в__секвенщ?ующем__геле проводили по мето.

описанному в методическом пособии ( Мазин и др., 1990 ).

Определение__количества___пролина в клетках Е. coll

питательной среде проводили по методу Bates ( Bates, 1973 ).

Определение _ актипности_ 7 - _глутамилкшазы проводили методу Хайзсра и Лезингера с модификациями, описанными в ( Нерси и др., 1986 ). .

в

РЕЗУЛЬТАТЫ

1 • __Escherichia__çollx__способного_

к свврхсштезу_пролвда^_устойчшогд_к_пош ции_НаС1.

На первом этапе отбора спонтанного мутанта Е. coll, собного к повышенному синтезу пролина ( ССП - мутанты ) и ладающего повышенной осмоустойчивостью, был отобран pro- -мм, который имел наименьший уровень синтеза пролина в клетке ле введения в него фактора f'104, содержащего оперон ргоВА. .

г

ользование фактора Р 104 с опероном ргоВА хромосомы Е. coll. бходимо для отделения мутаций в гене ргоВ от мутаций в гене Р, кодирующем пролиновую пермеазу , которые также возникают при ном методе отбора. Из пяти имевшихся в-нашей коллекции рго~-ммов мы выбрали штамм SU 1604/ р' 104 , который синтезирует 0,06 пролина на 1мг сырой биомассы и обладает наибольшей ствителыюстью к повышенной концентрации NaCl в среде. Его рость роста снижается на 50Ж при концентрации NaCl в среде 0,4

Получение ССП - мутанта, устойчивого к осмотическому стрессу, водили в 2 этапа ( Таблица 1 ). На первом этапе 5 х I010 клеток • viMa КК 2036 / f' 104 высевали на агаризованную минимальную среду С ), содержащую 50 мкг/мл Rlf и Azc , соответственно. Выросшие м ( 2,5 х I04 ) перепечатывали на газон клеток SU 1604, яшшх на МС, содержащую Сш и Azc.

о.

Среди полученных ССП - мутантов ( 1 х 10 ) отбирали клетки,

Таблица I. Этапы получения мутанта SU 1604/ ï 104S.

» этапа. Штамш и операции с ними Селективная среда Кол-во клеток посеяно Кол - во клонов отобрано

КК 2036/ Р'ЮА агаризованная МС, Rii. Агс 50 мкг/мл 5 х 10i0 (250 чашек по 10^ клеток на каждой ) 2,5 х IÖ4.

g КК 2036/?'104 х ви 1604 агаризованная МС, Сш « Azc 50 мкг/мл 2,5 х IÖ4 1,2 х I03

ь m к Эи 1604/Р'104 агаризованная МС, Сш, 0,8М NaCI 1,2 х I03 12

§ «з i Определение скорости роста в 0,0 М КаС1 и количества про-лина, синтезированного клетками жидкая МС, Str с и без 0,5 Ы ЮаС1 12 I ( SU 1604/Р1104W )

30 1604/ Р' 104^? агаризованная МС, str, Агс 300 мкг/мл 2,5 х Ю11 (250 чашек по Ю^ клеток на каждой) 2,5 х I05

эи 1604/ Р* 1041* х КК 2036 агаризованная МС, Rlf, Агс 300 мкг/мл 2,5 х I05 456

s КК 2036/ Р*104* жидкая МС, Rit ,0,6MNaGl 456 65

0 s КК 2036/ У*Ю44 х эи 1604 агаризованная MC,Str Azc 300 мкг/мл 65 65

CL. О S КК 2036/ Р' 104ff.SU 1604/Р*104* жидкая МС, Rif ,0,5 M NaCI , Str ,0,5M NaCI 65 9

Определение скорости роста в 0,6М НаС1 и количества пролина. жидкая MC.Rif или str с и без 0,6 M NaCI 9 I ( SO 1604/Р1104s)

мюсобнне расти на МС с повышенной концентрацией NaOl. Отобрали 12 ;ло1юн, способных расти на агаризованной среде с и,8 М NaCi, 'вотировали их на " кормление " pro-- штамма, измеряли скорость юста в жидкой МО с NaC] и определяли количество пролила, которое ни синтезируют в МО с HaUl и без Nací. Установили, что отобранные :ами мутант!ше клетки обладают незначительной осмоу.стойчивостью но равнению с контрольными клетками. Мы выбрали среди отобранных утантов один, который обладал самой высокой' осмоустойчивостью и родукциеН пролина, обозначили его SU 1604 / F'l04 W ( WeaK-слабый ) использовали для второго этапа отбора мутанта.

На втором этапе отбора нужного нам мутанта 2,5 х 1011 клеток U 1м)4 / у 104 W высевали на агаризованную среду МО, содержащую

о

tr ( 100 мкг/мл ) и Azc ( 300 мкг/мл ). Выросшие 2,5 л 10 клонов ерепечатывали на газон клеток КК 2036. Выросшие после конъюгации 35 клонов проверяли на способность расти в жидкой МС с 0,6 м NaOl ИИ. отобранные 65 клонов скрещивали с клетками SU 1604 и вели гбор по интенсивности роста ь МО с 0,5 М NaoJ. Отобрали 1 клон, у эторого устойчивость к соли и количество синтезированного пролина казались максимальными. Клон обозначили SU 160.1 / F 104 S ( strung сильный ).

Cpíiuii'iuw »¡которых свойств мутантних и немутантошх клеток мведено в таблиц.* 2. Из таблицы видно, что в МО без Naül /тантные клетки несколько отстают в росте от немутантвих клеток, щако в МС с 0,6 М NaOl иемутантные клетки ни растут, а мутантшм «тут со скоростью 0,25 генерации в час. Максимальная концентрация ■л, на которой растут мутантные клетки, составляет 500 мкг/мл, а' bi немутантних она состаляет 20 мкг/мл. Количество причина в тан'пшх клетках в МО б>*з NaOl в 10 раз прмишмт таково» в

сл С —» о Ч) о -рее сл CJ о ч о ® -в ж К

0,54 о ч? сл Скорость роста в МС 6e3Nafl ( генерация/час )

0,25 \ 1 Скорость роста в МС с 0,6 М NaCl ( генерация/час )

сл 8 го о Максимальная концентрация Azc мкг/мл, на которой растут клетки ( МС агаризованная )

0,63 0,06 Количество пролина в клетках ( мкг/мл ) в МС без NaCl

3,50 0,12 Количество пролина в клетках ( мкг/мл ) в МС с 0,5 М NaCl

150,0 о Количество прлина ( мкг/мл ) в МС без NaCl (экскреция )

о о Количество пролина { мкг/мл ) в МС с 0,5 М NaCl (экскреция)

0,9 М 0,6 М Концентрация NaCl в МС, при которой клетки прекращают рост

+ 1 Тест на кормление

+ 1 Рост на 0,7% сахарозе

&

!* X

ё

ГО

•s

CD

Ж ®

о «

о я о ►3

я

S» (V

о я

и

а

<г> о

Ч)

о

СП

с

СЧ

о

о сд

немутшгпшх клетках, кроме того до 150 мкг/мл пролина экскретпруетоя в среду. В МС с NaCL мутантные клетки но экскретируют пролин в среду и содержат в 30 раз больше пролина, чем немутантные клетки. Мутачтние клетки прекращают рост только при концентрации NaCl О.У м, осуществляют " кормление " рго~ - клеток на агариаованной МС и растут на МС с 0.7% сахарозой.

2.Клонирование мутаитного_гена_ргоВодп1 и_локализация_мутации.

Клонирование ген;) proBosm, в составе оперона proBosmproA, ,на

МНОГОКОПИЙ1ШХ векторах pBR 322, рВН325 и рис 18 оказалось

»

безуспешным. В связи с зтим, для клонирования фрагмента ДНК !•' 104, кодирующего оперой proBosmproA, использовали фазмиду A.pSL 51. Схема клонирования и реклонирования приведена на рисунке 1.

Для клонирования суммарную ДНК мутантннх клеток К. со И расщепляли с помощью рестриктавы Eco RI и проводили лигирование с расщеплешюй этой же рестриктазой фазмидой XpSL 51. Полученная гибридная фмзмида XpSL 51M имеет размер 45 т.п.н. и содержит фрагмент хромосомной ДНК размером 10,5 т.п.н., содержащий оперон proBoamproA. Для минимизации и реклонирования данного фрагмента использовали рестриктазу í'st I и векторную плазммду pjjj 1.

Ьгкт^рную плазмиду pLM 1 получали путем переноса гена устойчивости i; ампициллину ( bla ) из плазмидн pOV 16 в малокопийную пла -миду pSO 101. 1'ен bla вырезали с помощью рестриктазы Ксо RI. Схема получения плазмвдй pIJí 1 приведена на рисунке 2.

1Ч1бридиая нлазмида pNUí, полученная в результате клонирования оперона proBosmproA в составе плазмида pJM 1, имеет размер 1-1,7

и

Рис. I . Схема клонирования и реклонировакия оперона

ргоВоаш РгоА-

.п.». и содержит клонированный фрагмент ДНК F 104 размером ЗОН . н. ( см. рисунок 1 ).

Для проведения контрольных экспериментов мы клонировали порон ргоНА дикого типа в составе плазмпди pLM 1. Этот оперон был еклонирован с помощно рестриктазы i'at I из плазмидц рв.) ЗТ. Схема еклонировашм и получения плазмиди pLM^ro приведена на рисунке 3.

Локализацию мутации осуществляли с помощью получения ибридных оперонов и секвенирования. Для получения гибридных поронов клонированные фрагменты ДНК. содержащие опешны ргоИочтргоА ргоВА, разрезали с помощью рестриктызы Sal Gl. Длина рестриктов оставляет п.н., JbOí» п.н. и 937 ii.it. Гибридаше опероны .»держали 2 Фрагмента оперона дикого типа и 1 фрагмент мутантного '

теронау. Установили, что гибридный оперон, содержащий фрагмент

«

ммиром Í395 п.н., который содержит Ь - конец мутантного гена -'OB ,1|П, обеспечивает осмоусто.Ччивость и устойчивость клеток К. Dil к Ar,с. О помощью рестриктазы Ксо RV мы минимизировали данный эагмент для секвенирования и клонировал» его в составе ДНК двух згов М 13 ta 130 и М 13 ts 131. Эти фаги имеют противоположную эиентацию праймеров считывания. Сиквенс вели по двум нитям. При "тг-ненш последовательности данного фрагмента гена ргоВод с шестной аналогичной последовательностью гена ргоВ обнаружили мону Aj4j1 на Т в нуклоотидной последовательности гена proBosm. •а замена основания в ДНК приводит к замене Лей65 на Гли в ;ьшо кислот ной последовательности мутантной глутамилкиназы.

Изучили некоторые свойства клеток Е. coli HB 101, несущих тированный оперон pruBosmproA, в сравнении с клетками Е. coli HB 1, несущими клонированный оперон ргоВА. Определили влияние лишенной концентрации NaCL на скорость роста обоих типов клеток.

Во,„III

\ Шг. с1 Ш

Заедг \ | ^ЕеоН

Есой! н(п4Ш I атШ

Рис . 2 . Схема конструирования векторной плазмиды р ьм, 1

Ее о И

Рис. 3 . Схема клонирования опврона рго ВЛ.

олученныо результаты показаны на рисунке 4.

Врепо(чис)

Рис.4 . Рост клеток Е. coll НВ 101 с тслошфовашшми оноронами ргоВ ргоА и ргоВА в МС без NaCL и о 0,5 М NaOl.

1 - НВ 101 ( ргоВА ) в МС без NaCl,

2 - НВ 10! ( proBosmpr6A ) в МС без'ЪюЧ,

3 - НВ 101 ( proBosmproA ) в МС с 0.5 М NaCl,

4 - НВ 101"( ргоВА ) в МС с 0,5 М NaCl.

На рисунке видно, что клонирование мутантного и немутантного енов на малокопийном векторе не изменяет характер их роста по равнению с клетками, в которых геи proBQsm и ген ргоВ присутствуют составе фактора I' 104 ( см. табл. 2 ). В МС без NaCl клетки НВ 01 ( pvoBot.p ргоА ) несколько отстают в скорости роста от клеток, НВ О! ( pro НА ). Однако в МС с 0,5 М NaCl скорость роста первых и.viiii "льно превышает скорость роста вторых.

I Изучили влияние повышенного синтеза пролила на рост бактерий >и к-1 'Л,'! иной ( мР С ) и пониженной т'.'мпорчтур^ ( 28° С ) в МС

оси NaOl 11 о i),5 M NaOl. Результаты выращивания рекомбинантны бактерий при температуре 4;-и С показаны на рисунке Ь.

Времи (час)

И1С.&- Рост клеток Е. со! 1 НВ 101 с клонированными генам

proBûamproA и ju'i.iBA в МО при температуре 42° 0 Ое

NaOl и с 0,b M Naui.

1 - Hh 101 ( probos|)|f)foA ) в МО без NaOl,

2 - 11В 101 ( proBA ) и МО 01.3 NaOl,

3 - 11В 101 ( ргоВОНГ(|ргоА ) В МО с О.Ь M NaOi,

4 - 11В 101 ( proBA ) В МО с О.Ь M NaO.l.

lia рисунка видно, что при повышенной температуре среды клетк ИВ 101 ( рп,В(1 ргоА ) лишь незначительно опережают в росте клетк НВ 101 ( ргоВА ) ь МО без fUiCl. После добавления в сроду NaOl д концентрации 0,i> M скорость роста клеток НВ 101 i ргоВА ) надае почти до нуля, а скорость роста клеток НВ нн ( pinB ргоА снижается только в '>. раза. Аналогичные разул! таты оыли получены при температуре О .

Определили концентрацию пролинв, которая ингибирует на 50% тивность мутантной и немутантной 7 - глутатамилкиназы. тановили, что для мутантной у - глутамилкиназы эта концентрация в О раз выше, чем для немутантной.

3. экспрессия_оперона_ргоВ0 __coli

§_М§1ках_бвктер^_г_сшбионтов_сои_Щ1120

С целью использования гена ргоВоат в сельскохозяйственном оизводстве, мы перенесли его в бактерии - симбионты сои Rhlzoblum ■edil. Ризобиальные бактерии обладают пониженной знеспособностью, особенно в стрессовых условиях. Кроме того, олин является необходимым компонентом в цепи мбиотической азотфиксации у сои.

Для переноса оперона ргоВоатргоА, среди полученных нами из И сои штаммов R. íredll, мы отобрали штамм, наиболее вствительный к соли. Таким оказался штамм BD 32. Этот штвмм был делен из клубеньков сои Gllclne soja Sieb et Zuce, произростающей Амурской области. Он хорошо зарекомендовал себя на плантациях сои Крыму. Растения сои,инокулированные данным штаммом, дают от 50 до \% прибавки, урожая в условиях Крыма. Однако, в условиях Амурской |ласти он оказался неконкурентноспособеным по отношению к ■ зидентным ризобиальным штаммам и, следовательно, малоэффективным.

попытались определить влияние оперона ргоВОЗП)ргоА на знеспособность и осмоустойчивость данного штамма.

Для введения в клетки R. fredll BD32 оперон proBos(|)proA клонировали из гибридной плазмиды pNIfl, имеющей репликон плазмиды О 101, в вектор с широким кругом хозяев pVA 12-2. Схема

клонирования приведена на рисунке 6.

Получили фрагмент ДНК Eco RI - Bgl II плазмиды pNLM и фрагмент ДНК Eco RI - Ваш HI векторной плазмиды pVA 12-2. Гибрида, jh плазмида pNS, полученная в результате лигирования данных фрагментов, имеет размер 9,8 т.п.н. и содежит детерминанту устойчивости к канамицину, сайты узнавания рестриктаз Eco RI, Eco 1051 и гибридный сайт Bgl II/ Ваш HI, который плохо узнается каждой из рестриктаз.

В начале экспериментов по. клонированию мы определили, что клетки R. fretlll BD 32 обладают значительной устойчивостью к канамицину ( до 100 мкг/ мл ) и довольно низкой устойчивостью к ампициллину ( до 50 Mit г/ мл ). В связи с этим, работа с плазмидой pNS, имеющей только один маркерный ген устойчивости к канамицину, после переноса ее в клетки R. fredll, была бы сопряжена с значительными трудностями. Для того, чтобы избежать их, мы клонировали в составе pNS ген устойчивости к ампициллину ( Ыа ) из плазмиды pCV 16. Ген bla шрезали с помощью рестриктазы Eco RI и лигировали с ДНК плазмида pNS, расщепленной с помощью той же рестриктазы. Полученная гибридная плазмида pNSA имеет размер 11,6 т.п.н., содержит детерминанты устойчивости к канамицину и ампициллину и оперон ргоВоаюргоА ( см. рис.6 ).

Аналогичным образом была получена плазмида pLVA, содержащая натиышй оперон ргоВА. Данный оперон реклонировали из плазмиды i'^pro" 1,Jm3MlW pLVA использовали в качестве контроля.

Мобилизационный перенос дишзмид pLVA и pNSA осуществляли с помощью трехродительского скрещивания. В качестве плазмиды -помощника использовали илазмиду pliK 2013. Анализ плазмид pNSA и pLVA после их переноса в клетки R. fredll показал, что они

Есой!

Рис. 6 . Клонирование оперона ргоВоатрго1 на векторе с широким кругом хозяев рУА 12-2.

Таблица 3. Скорость роста ( генерация/час ) клеток ЕМаоЫит Гге&И штаммов В!) 32, ВВ Зг/рНЭА. и ВС 32/рЬУА в богатой и минимальной среде Я с различной концентрацией НаС1.

Штаммы Концентрация ИаС1

Богатая среда Р1 Минимальная среда Р1

без ИаС1 0,4 М 0,6 л 0,8 М без НаС1 0,4 М 0,6 М 0,8 Ы

В1) 32 0,062 0,02 не растет не растет 0,02 0,001 не растет не растет

вс зг/рИБА 1,0 0,8 0,4 0,15 0,09 •0,125 0,06 0,01

ВИ 32/рЬУА 1,0 0,8 0,4 0,145 0,076 0,025 не растет не растет

¡охраняют нативную структуру в этой бактерии.

Определили скорость роста бактерий R. fredil BD 32 и R. redil BD 32 / pNSA и R. fredll BD 32 / pLVA в богатой и инимальной среде Р1 без NaCl и с различной концентрацией NaCl. Эти ;анние представлены в таблице 3. Из таблицы видно, что в богатой реде Р1 скорость роста обоих рекомбинантных штаммов и их стойчивость к NaCl -зачительно выше, чем у штамма дикого типа, днако, в минимальной среде Р1 клетки R. fredll BD 32/ pNSA бладают большей скоростью роста и большей осмоустойчивостыо, чем летки R. íredll BD 32 / pLVA. В настоящее время данные штаммы роходят сравнительную проверку на способность к инокуляции и изнеспособность в полевых условиях в НИИ сои в г. Благовещенске.

ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью двухэтапного отбора мы отобрали клетки Е. coll, утантные по первому гену биосинтеза пролина ргоВ. Механизм вухэтапного отбора во многом еще не ясен. Мутанты, отобранные на зрвом этапе, могут иметь мутацию как в гене, по которому ведется гбор, так и в других генах, активность которых связана с стивностью изучаемого гена. На основании данных'го экспрессии элученных нами гибридных генов можно сделать вывод, что-^устойчивость и устойчивость клеток к ьи. с>ким концентрациям Azc нашем случае связана с заменой А на Т в положении 194 ^клеотидной последовательности гена ргоВ. Хотя нельзя исключить (зможность того, что при полном секвенировании последовательности на proBosm, где - либо в другом месте может быть обнаружена чечная мутация, которая связана с первым этапом отбора. Эта

мутация' не обеспечивает осмоустойчивости, но придает клетка устойчивость к невысоким концентрациям Azc.

Замена Лей на Гли в положении 65 аминокислотно! после;")вателыюсти мутантной 7 - глутамилкйназы, возможно, приводи: к изменению конформации ее регуляторного центра. Лей больше п< размеру чем Гли, и замена большой аминокислоты на меньшую может, вероятно, привести к "охлопыванию" регуляторного центра фермента. Это изменение конформации фермента может затруднять подход пролина регуляторному центру и приводить к нечувствительности мутантной 7 -глутамилкиназы к пролину.

То , что полученная нами мутация может затрагивать регуляторный центр данного фермента, подтверждается сопоставление»» наших дашшх с данными других авторов, представленным на рисунке 6. Все указанные на рисунке 6 мутации получены с помощью аналогов пролина и приводят к понижению чувствительности мутантной 7 -глутамилкиназы к пролину и повышению его синтеза. Мутация ргоВ 74

придает клетке осмоустойчиьость. На рисунке видно, что все эти

*

мутации локализованы на 5 - конце.гена ргоВ, т.е. на N - конце кодируемой им полипептидной цепи. Из этих дашшх можно заключить, что именно N - конец полигшнтидной цопи 7 - глутамилкиназы формирует регуляторный цонтр фермента.

Клонированный огюрои ргоВозщргоА может служить хорошей основой для получения промышленного штамма - продуцента пролина. В случае его переноса в бактерии, хорошо экскретирующие аминокислоты,, можно надеяться на получение значительной концентрации пролина в среде выращивания.

Эксперименты по определению роли повышенного синтеза пролинь в устойчивости бактерий к высоким и низким температурак

оказывают, что повышенная концентраци пролина в клетках мутантных актерий не обеспечивает им каких - либо преимуществ* Вероятно, у

IJfj (65) Asti(lor) ÄEo(M)

i M«t Leu(S5) Asp(lor) C5u (W) ' Arg 1

i iii . " ,

atq caq саг си ci;ttaa

\ 1 1

ctq аат

р«В„,п ргоВ74 ПНР" i---- „i ___i_______ _ i i

0 »00 200 300 56Г

миноиисмтч ndQK^eiMtMiWOiTb

Рис.6. Локализация мутаций proBogm, proB 74 и DHPR в гене ргоВ.

ктерий, в отличие. от растений, пролин не участвует в механизме тойчивости к изменениям температуры внешней среды..

Увеличение скорости роста рекомбинантных бактерий R. Гredil, держащих ген proBoaffl, как в богатой, так и в минимальной среде Р1 NaCl, вероятно, связано с деградацией избытка пролина в глутамат, торый, как известно, является осмопротектором ризобий и хорошим точником азота для них. Можно предположить, что.повышенный синтез олина в рекомбинантных бактериях R. tredil может обеспечить ижение затрат энергии растения - симбионта на синтез данной йнокислоты для бактероидов и, возможно, лучшей симбиотической гивности рекомбинантных бактерий.

Результаты, полученные с рекомбинантными бактериями R. !dll, дат возможность предположить, что ген ргоВ может быть

использован для увеличения жизнеспособности различных полезны?

бактерий в стрессовых условиях.

' f (

выводы

1. Полученная мутация ргоВ08Ш обеспечивает повышенный синтег пролина в клетках Е. coli и их осмоустойчивость. По свои>. характеристикам она может быть отнесена к типу так называемых osm -мутаций ( Le Ruduller et al., 1984 ).

2. Мутация ргоВОЭП), как можно предположить из экспериментальных данных .приводит к изменению регуляторного центр* ■f - глутамилкиназы, что, в свою очередь, снижает чувствительносп фермента к ингибированию пролином.

3. Перенос мутантного гена proB0jgn) Е. coli в клетки бактерий - симбионтов сои R. Tredii приводит к повышению их жизнеспособности и осмоустойчивости.

4. Полученный мутантный ген proBQsm Е. coli может быть рекомендован для повышения жизнеспособности как бактерий -симбионтов, так и свободно живущих полезных почвенных бактерий, а также бактерий биодеградации.

5. Ген proBQsm Е. coll рекомендуется для переноса в растения с целью возможного повышения их осмоустойчивости и жизнеспособности в стрессовых условиях.

Основные материалы дисертации опубликованы в работах:

1. Л.В.Неумывакин, Н.О.Кобец, Э.С.Пирузян. " Получение i изучение свойств мутанта Е. coll, способного к сверхсинтезу пролиш

и обладающего устойчивостью к осмотическому стрессу Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма", Пущино - на - Оке, 1989г., стр. 152.

2. Л.В.Неумывакин. " Осморегулируемые опероны бактерий ". Тезисы докладов IV Всесоюзной школы молодых ученых " Молекулярные механизмы биологических процессов ". Минск, 1989г., стр. 5-7.

3. Л.В.Неумывакин, Н.С.Кобец, Э.С.Пирузян. " Получение спонтанного мутанта Escherichia coll, способного к сверхсинтезу пролина и устойчивого к повышнной концентрации NaCl. " Генетика 1990г., т.26, N8, стр. 1370 - 1379.

4. Л.В.Неумывакин, Н.С.Кобец, Э.С.Пирузян. " Мутантный локус ргоВА Escherichia coll, обеспечивающий устойчивость к стрессовым условиям окружающей среды." Тезисы докладов Всесоюзной коферешии

" Новые направления биотехнологии ". Пущино - на Оке, 1ЭЭ0г. стр.97.

5. Л.В.Кеумывэкин, Н.С.Кобец, Э.С.Пирузян. " Получение и клонирование мутантного гена proBQSm Escherichia coll, обеспечивающего устойчивость к повышенной осмолкрности среды ". Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума " Клеточные механизмы адаптации ". Чернигов, 1991г., " Цитология ", N5, 1991г.

6. Л.В.Неумывакин, В.П.Соловьев, Т.С.Денисова, Л.С.Чернин и Э.С.Пирузян. " Экспрессия оперона proBogmproA Escherichia coll в клетках Rhizoblum fredll Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции " Микробиология сельскому хозяйству Пущино - на -Оке, 1992г. стр. 41.

Технический редактор С.К. Сведлова

Подписано в печать 18.03.92. Формат 60x84/16 Уч.-изд. л. 1,3. Тираж 100. Заказ 60 Отпечатано в ИАЭ