Изучение генов, кодирующих белки семейства RhtB у Escherichia coli

Кутукова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение генов, кодирующих белки семейства RhtB у Escherichia coli
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генов, кодирующих белки семейства RhtB у Escherichia coli"

На правах рукописи

КУТУКОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА RhtB У ESCHERICHIA COLI

Специальность: 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории №2 Научно-исследовательского института «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»),

Научный руководитель:

кандидат биологических наук В.А.Лившиц

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. P.C. Шакулов

доктор биологических наук, проф. Ю.Д. Цыганков

Ведущая организация:

Кафедра Генетики Биологического Факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится 25 октября 2005 года в 14 часов на заседании диссертационного совета ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: Москва, 117545,1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат диссертации разослан_сентября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Штаммы Escherichia coli широко используются для получения продуцентов различных биологически активных веществ, в частности, аминокислот. Аминокислоты применяют в различных отраслях, в основном в пищевой, кормовой и фармацевтической промышленности. Мировой объем продукции аминокислот составил в 1998 году 3 миллиарда долларов США, и эти показатели растут на 5-10% каждый год.

Для создания штаммов-продуцентов с заданными свойствами и высокой эффективностью продукции требуется детальное знание метаболических путей и процессов регуляции, контролирующих клеточный метаболизм.

В последнее время появляется все больше данных о том, что немаловажную роль в увеличении эффективности продукции биологически активных веществ штаммами-продуцентами Е. coli играют белки, осуществляющие транспорт из клетки конечного продукта. У эффективных продуцентов концентрация целевого метаболита может достигать значительной величины, например, при ферментации треонина штаммом-продуцентом Е coli концентрация последнего в культуральной жидкости составляет 100-120 г/л. В этих условиях может происходить подавление активности ферментов и роста клетки продуктами собственного метаболизма. Поэтому для увеличения выхода продукта необходимо уменьшать его внутриклеточную концентрацию. Одним из способов такого уменьшения является активация экскреции метаболитов.

В процессе ферментации может изменяться множество параметров среды: доступность различных питательных веществ, концентрации кислорода и углекислого газа, рН и осмотический статус среды и т.д. В этих условиях активируются так называемые глобальные или мультигенные регуляторные системы. К ним относятся, в частности, системы, защищающие клетку от стрессов, в том числе, системы осмотического стресса, перехода в стационарную фазу роста, в состояние анаэробиоза и др. Поскольку для получения максимального выхода продукта необходимо культивировать штамм-продуцент в наиболее подходящих условиях, чрезвычайно интересным представляется изучение влияния глобальных регуляторов на различные компоненты ферментных и транспортных систем клетки.

Поиск и изучение генов, продукты которых ответственны за транспорт метаболитов из клетки, а также определе^^е^^Й^^ЧЙ^^!^*» их экспрессии

■' i^xB!

6 - 4 4 37

различных глобальных регуляторных систем является важной задачей, которая имеет большое научное и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение генов Е. coli, кодирующих белки, входящие в состав семейства RhtB. Эта гены являются паралогами ранее описанного гена rhtB, продукт которого осуществляет экскрецию гомосерина и треонина из клеток Е. coli.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- Изучить влияние сверхэкспрессии генов — паралогов rhtB на устойчивость клеток к аминокислотам и их аналогам.

- Изучить влияние сверхэкспрессии этих генов на накопление аминокислот штаммами Е. coli - продуцентами аминокислот.

- Провести компьютерный поиск возможных сайтов связывания белков -регуляторов в регуляторных областях генов rhtB, rhtC, yeaSviyahN.

- Сконструировать вектор на основе малокопийной плазмиды pMW119 для исследования уровня экспрессии генов на основе определения активности ß-галактозидазы.

- Определить индукцию экспрессии исследуемых генов аминокислотами.

- Изучить влияние аллельного состояния генов, кодирующих белки регуляторы, на уровень экспрессии исследуемых генов.

- Изучить влияние некоторых физиологических стрессов на уровень экспрессии исследуемых генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе были исследованы гены, кодирующие белки - члены семейства RhtB: yfiK, yeaS, yggA и yahN. Впервые показано, что амплификация каждого из них повышает устойчивость клеток Е. coli к нескольким аминокислотам и/или их аналогам и увеличивает продукцию ряда аминокислот модельными штаммами-продуцентами. При этом сверхэкспрессия гена yeaS приводит к значительному увеличению накопления в среде культивирования лейцина, и в меньшей степени -метионина и гистидина. Эти данные представляют практический интерес при получении промышленных штаммов-продуцентов аминокислот на основе Е coli. В работе также исследовалась регуляция генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Установлено, что экспрессия гена yeaS индуцируется такими аминокислотами, как лейцин, а-аминобутират и, в меньшей степени, треонин, метионин, лизин,

гистидин, аланин и гомосерин. Показано, что для осуществления этой индукции необходимо присутствие в клетке белка Lrp, который является репрессоромyeaS.

Экспрессия генов rhtB, rhtC и yahN также регулируется белком Lrp. Кроме того, обнаружено, что уровень экспрессии гена yahN значительно падает при добавлении в среду лейцина, и это падение также зависит от присутствия в клетке белка Lrp.

Также показано, что продукт гена уеаТ, расположенного рядом с геном yeaS на хромосоме Е coli и кодирующего LysR-подобный регулятор, не оказывает влияния на экспрессию генауеяЗ'.

Кроме того, изучено влияние некоторых физиологических стрессов на уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Показано, что в случае ряда стрессов уровень экспрессии всех четырех генов увеличивается в несколько раз.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на конференции ВОГИС «Генетика в XXI веке» (Москва, 6-12 июня 2004 г.) и на смотре-конкурсе работа сотрудников ЗАО «АГРИ» (Москва, 14-18 июня 2005 г.). Диссертация была апробирована на заседании секции по молекулярной генетике ученого совета ГосНИИГенетики 27 апреля 2005 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано две печатные работы, из них одна в отечественном журнале, и два тезисных сообщения в материалах научной конференции.

Структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах печатного текста, включая 32 рисунка и 15 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, заключения, выводов и списка цитированной литературы (184 наименования).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При выполнении работы использовали штамм Escherichia coli TGI и его производные, несущие делеции ряда генов, а также штаммы - продуценты аминокислот - В-7270 (продуцент гистидина), В-7386 (продуцент лейцина) и В-8125 (продуцент метионина) и их производные, и штамм MG1655. В качестве полноценной питательной среды использовали L-среду, в качестве минимальной -М9 (Miller, 1972).

Выделение плазмидной ДНК, трансформацию и клонирование осуществляли, как это описано в руководстве (Sambrook et. al., 1989). Трансдукцию осуществляли, как описано в руководстве (Miller, 1972).

Определение минимальной ингибиругощей концентрации (МИК) аминокислот и их аналогов, проводили следующим образом: ночную культуру выращивали в течение 5 часов при 37°С при 260 об/мин. в среде М9, высевали на чашки со средой М9, ампициллином и добавлением ингибитора, и инкубировали в течение 48 часов при 37°С.

Интеграцию гена yeaS под конститутивным промотором гена nlpD проводили при помощи плазмиды pMIV, как описано в (Livshits et al., 2001).

Инактивацию генов проводили при помощи PCR как описано в (Datsenko and Wanner, 2000).

Ферментации проводили в пробирках диаметром 20 мм, содержащих 3 мл среды, на качалке (260 об/мин) в течение времени и при температуре, оптимальной для каждого продуцента.

Об уровне экспрессии генов судили на основании активности ß-галактозидазы. Для этого был сконструирован вектор на основе малоокопийной плазмиды pMW119, в которую был клонирован беспромоторный ген lacT из плазмиды рМС1871, а также терминатор гена ггпВ для предотвращения транскрипции собственного гена lacZ плазмиды pMWl 19. В полученный вектор pMWLT по сайтам Smal при помощи PCR были клонированы фрагменты ДНК, содержащие 300 нуклеотидов регуляторной области и 50 нуклеотидов кодирующей области генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN, в результате чего были получены плазмиды pMWLTrB, pMWLTrC, pMWLTyS и pMWLTyN. Этими плазмидами трансформировали штамм TG1, а также штаммы TG1, несущие делеции генов, кодирующих белки-регуляторы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние сверхэкспрессии генов yfiK, yahN, yeaS и yggA на устойчивость бактерий к аминокислотам и их аналогам. Проведенный ранее в нашей лаборатории компьютерный анализ показал, что гены Escherichia coli rhtB, rhtC, yfiK, yahN, yeaS и yggA кодируют мембранные белки, входящие в состав семейства RhtB (Aleshin et. al., 1999).

Кроме того, в нашей лаборатории ранее были клонированы гены rhtB и rhtC и было показано, что белки, которые эти гены кодируют, участвуют в экспорте из клетки гомосерина, треонина и других аминокислот (Zakataeva et. al., 1999).

Известно, что сверхэкспрессия генов, кодирующих транспортные белки, участвующие в экскреции антибиотиков и других ингибиторов роста, повышает устойчивость бактерий к этим соединениям. В то же время, инактивация этих генов может снижать устойчивость к ингабиторам (Li and Nikaido, 2004). Известно также, что природные аминокислоты могут подавлять рост бактерий на минимальных средах (Zakataeva et. al., 1999, Kruse et al., 2002, Livshits et al., 2003). Мы амплифицировали с помощью PCR остальные гены Е. coli, кодирующие белки семейства RhtB - yfiK, yahN, yeaS и yggA, и клонировали их в многокопийный вектор pUC21, получив плазмиды pYFDC, pYEAS, pYAHN и pYGGA. Кроме того, мы инактивировали ген yeaS и трансформировали полученный штамм плазмидой pUC21. Затем изучали влияние сверхэкспрессии этих генов и инактивации гена yeaS на устойчивость клеток штамма Е coli TGI к различным аминокислотам и их токсичным аналогам. Результаты этих экспериментов представлены в табл.1.

Табл. 1. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) аминокислот, их аналогов и глицил-лейцина для штамма Е. coli TGI, несущего плазмиды с генами, кодирующими белки семейства RhtB, а также для штаммов TG1 и TG1AyeaS, несущих плазмиду pUC21.

Соединение (мг/мл) МИК для штамма

TG1 (pUC21 TGI (pYEAS) TGI byeaS (pUC21) TG1 (pYFlK) TG1 (pYAHN) TG1 (pYGGA)

Азалейцин"' 0,1 0,9 0,075 н.о. н.о. н.о.

Аргинин 10 15 н.о. 10 10 20

ААБ^ 1 30 0,75 1,5 1,5 1,5

A3LT 0,01 0,02 н.о 0,02 0,02 0,2

Валин 0.005 0.005 0.003 0.005 н.о. н.о.

Гистидин 5 40 н.о. 10 5 10

Гистидин-гядраксамат 1,5 3 н.о. н.о. н.о. н.о.

Глицин-Лейцин*4 0,05 6 0,01 н.о. н.о. н.о.

Глутамат 5 5 н.о. 10 20 5

Гомосерин 0,6 3 н.о. 1,5 1,5 0,6

Дегидропролин"5 , 0,01 0,02 н.о. 0,015 0,015 0,015

Изолейцин 25 30 20 н.о. н.о. н.о.

Канаванин 30 30 н.о. 30 30 30

Лейцин >20 >20 15 >20 >20 >20

Лизин 12,5 20 н.о. 12,5 15 20

Метионинсульфон'6 1.5 6 1,25 н.о. н.о. н.о.

Норлейцин"' 0,01 0,05 н.о. Н.о. н.о. н.о.

Пролин 1 2 н.о. 5 2 1

ГАА'8 200 200 н.о. 200 300 300

Греонин 30 30 н.о. 40 50 30

Цистеин 8 н.о. н.о. 15 н.о. н.о.

азалейцин - 4-a3a-DL- лейцин *гААБ - а-аминобутират - L-a-амино-п-масляная кислота *3АЭЦ - a-D-аминоэтилцистеин *4глицил-лейцин - дипептид *5dHPro - 3,4-дегидро-ОЬ-пролин

*6метионинсульфон - ОЬ-2-амино-4-(метилсульфоиил)бутановая кислота 7 нор лейцин - DL-a-амино-п-капроидная кислота *8ТАА - триазолаланин - DL-1,2,4-триазол-З-алаиин н.о. -не определяли

Из данных, представленных в табл.1, видно, что при амплификации каждого из генов, кодирующих белки семейства Rh® из Е. coli, клетки приобретают устойчивость к нескольким аминокислотам и/или их аналогам. Однако для

каждого из генов можно выделить аминокислоты, уровень устойчивости к которым максимален при амплификации этого гена.

Так, при амплификации гена yfiK максимальный уровень устойчивости возникал к пролину (в пять раз). Следует отметить, что в период выполнения настоящей работы появилась публикация, где белок, который кодирует ген yfiK, был описан как транспортер цистеина и О-ацетил-серина (Franke et al., 2003). Однако, мы не наблюдали значительного увеличения устойчивости к цистеину при амплификации этого гена (устойчивость повышалась менее чем в два раза). Мы предполагаем поэтому, что основной функцией белка YfiK в клетке является, скорее, участие в экспорте пролина, и, возможно, гистидина и цистеина. Участие белка YfiK в транспорте пролина подтверждают также наши данные о том, что сверхэкспрессия гена yfiK в клетках модельного штамма-продуцента повышает накопление им пролина в культуральной жидкости при ферментации.

При сверхэкспрессии гена yggA мы наблюдали заметное повышение устойчивости к аминоэтилцистеину (аналогу лизина) - более чем на порядок. Также в этих условиях повышалась устойчивость клеток к аргинину и лизину (табл.1). Кроме того, мы установили, что амплификация гена yggA увеличивает накопление лизина и аргинина клетками модельных штаммов-продуцентов этих аминокислот в процессе ферментации. Полученные нами результаты до некоторой степени согласуются с работой (Nandineni and Gowrishankar, 2004), где было показано, что YggA участвует в транспорте аргинина из клеток Е. coli. Однако, в отличие от Nandieni с соавт., мы предполагаем, что белок YggA участвует в транспорте из клеток не только аргинина, но и лизина. Это согласуется с данными о том, что YggA является очень близким гомологом белка LysE, который осуществляет экспорт аргинина и лизина из клеток С. glutamicum (Vrljic et. al., 1996).

При сверхэкспрессии гена yahN мы наблюдали увеличение устойчивости клеток Е. coli к глутамату (в 4 раза), гомосерину и пролину и повышение продукции пролина и глутамата соответствующими штаммами-продуцентами.

При сверхэкспрессии гена yeaS максимальный уровень устойчивости наблюдался к глицил-лейцину (более чем на два порядка) и к природному аналогу лейцина а-амино-и-масляной кислоте (а-аминобутирату) (в 30 раз, табл.1). Известно, что чувствительность клеток Е. coli к лейцин-содержащим дипептидам (в частности, к глицил-лейцину) связана с повышением внутриклеточной концентрации лейцина, который образуется при их расщеплении в клетках (Tavori

et al., 1981). Таким образом, повышение устойчивости клеток Е coli к глицил-лейцину может быть связано именно с увеличением выброса лейцина. В пользу этого предположения говорит и тот факт, что инактивация гена yeaS заметно снижает устойчивость клеток к этому дипептиду (табл.1).

Кроме того, сверхэкспрессия гена yeaS повышает устойчивость и к другим аналогам лейцина, в частности, к 4-азалейцину, а также к гистидину и его аналогу гистидин-гидроксамату, и к аналогам метионина - метионинсульфону и норлейцину (табл. 1).

Необходимо также отметить, что сверхэкспрессия yeaS приводит к появлению незначительного уровня устойчивости и к другим разветвленным аминокислотам - валину и изолейцину, который можно тестировать через 24 часа инкубирования культуры на чашках (данные не представлены).

При экспрессии гена yeaS под соответствующими регуляторными элементами в клетках В. subtilis мы также наблюдали увеличение уровня устойчивости бактерий к аналогам лейцина, метионина и гистидина (данные не представлены). Этот факт можно объяснить тем, что при гетерологичной экспрессии белок YeaS встраивается в мембрану бациллы и обеспечивает экскрецию этих соединений.

Как уже отмечалось, исследуемые нами гены кодируют мембранные белки, принадлежащие к семейству, для многих членов которого было показано участие в экспорте из клетки аминокислот и их аналогов., Поэтому обнаруженное нами повышение устойчивости к нескольким, иногда структурно разнородным, аминокислотам и их аналогам при сверхэкспрессии генов yfiK, yähN, yeaS и yggA может означать, что каждый из белков, которые они кодируют, участвует в экспорте ряда аминокислот и/или их аналогов из клетки. В дальнейшем мы более подробно исследовали ранее не описанный ген yeaS.

2. Влияние сверхэкспрессии и инактивации гена yeaS на накопление аминокислот штаммами-продуцентами. Для проверки нашего предположения об участии белка YeaS в транспорте из клетки аминокислот, мы проверили влияние сверхэкспрессии этого гена на накопление аминокислот клетками штаммов-продуцентов Е. coli. Для этого мы интегрировали ген yeaS в хромосому штамма MG1655 под конститутивным промотором P„ipd, а затем полученную конструкцию с помощью трансдукции переносили в модельные штаммы-продуценты аминокислот.

Для проверки влияния сверхэкспрессии и инактивации гена уеа8 на накопление аминокислот мы выбрали штаммы-продуценты тех аминокислот, устойчивость к которым обеспечивала сверхэкспрессия гена уеаБ, то есть продуценты лейцина, метионина, и гистидина.

Полученные результаты представлены на рис.1.

Рис.1. Влияние сверхэкспрессии и инактивации гена уеаБ на уровень накопления аминокислот клетками штаммов-продуцентов.

Как показано на рис.1, при сверхэкспрессии гена уеаЯ накопление аминокислот клетками штаммов-продуцентов увеличивается. Наиболее заметное влияние сверхэкспрессия гена уеаБ оказывает на продукцию лейцина (уровень накопления повышается в 3,5 раза); накопление метионина повышается в 2 раза. Сверхэкспрессия гена уеаБ влияет на накопление гистидина наименее значительно, но и в этом случае увеличение накопления составляет 48%. Инактивация гена уеаБ приводит к уменьшению продукции этих аминокислот (рис.1).

Полученные результаты коррелируют с данными, представленными в табл.1, об устойчивости, которую сообщает клеткам Е. соИ амплификация гена уеаБ на многокопийной плазмиде. Надо также отметить, что уровень влияния сверхэкспрессии уеаБ на накопление аминокислот соответствует уровню устойчивости, который мы наблюдаем: так, наиболее значительное влияние сверхэкспрессия гена уеаБ оказывает на накопление лейцина и на устойчивость к к глицил-лейцину и аналогам лейцина. С другой стороны, сверхэкспрессия гена

yeaS не оказывает практически никакого влияния на продукцию валина (данные не представлены), устойчивость к которому мало изменяется при амплификации этого гена.

Необходимо также отметить, что инактивация гена yeaS приводит к значительному уменьшению накопления лейцина клетками модельного штамма-продуцента в миниферментации (рис.2). Нам не удалось получить данные по влиянию инактивации гена^еа5на накопление лейцина при полной трехсуточной ферментации, поскольку клетки с инактивированным геном yeaSne размножались в таких условиях. Это служит косвенным свидетельством в пользу того, что продукт гена YeaS участвует в экспорте лейцина, поскольку наблюдаемое явление можно объяснить резким увеличением внутриклеточной концентрации лейцина в процессе ферментации штамма-продуцента в условиях отсутствия белка-экспортера этой аминокислоты.

Безусловно, полученные нами данные не однозначны. Одним из объяснений наблюдаемого увеличения накопления аминокислот в среде культивирования может быть усиление процессов биосинтеза при сверхэкспрессии гена yeaS, также как появление фенотипа устойчивости к ряду аминокислот и их аналогов можно объяснить не усилением выброса этих аминокислот из клеток E.coli, а, например, уменьшением транспорта этих аминокислот внутрь клеток при сверхэкспрессии гена yeaS. Однако только гипотеза, предполагающая участие продукта гена yeaS в экспорте ряда аминокислот и их аналогов из клеток E.coli, позволяет объяснить все наблюдаемые нами эффекты.

3. Влияние разобщителя на продукцию лейцина. Многие белки, транспортирующие различные вещества через мембрану, используют для осуществления этого процесса электрохимическую энергию протонного потенциала, который присутствует на цитоплазматической мембране. При добавлении протонного разобщителя, например, карбонилцианид-тя-хлорфенилгидразона (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazon, СССР), функция этих белков подавляется (Landgraf et. al., 1996).

Мы проверили влияние добавления СССР на накопление лейцина модельным штаммом-продуцентом Е. coli, который содержит интегрированный в хромосому ген yeaS под конститутивным промотором Pn/pD (рис. 2).

Время, ч

Рис.2. Кинетика накопление лейцина клетками Е coli. Влияние разобщителя.

Анализируя результаты, представленные на рис.2, можно увидеть, что клетки Е. coli, у которых ген yeaS сверхэкспрессирован, уже после двух часов культивирования начинают накапливать лейцин, и в дальнейшем накопление лейцина такими клетками заметно превышает накопление этой аминокислоты клетками контрольного штамма. При инактивации гена yeaS накопление лейцина значительно снижаегся, хотя и не прекращается совсем, что может свидетельствовать о наличии какого-то дополнительного механизма выброса этой аминокислоты из клеток.

После добавления 20 цМ СССР накопление лейцина практически полностью прекращается, то есть транспорт лейцина из клеток Е. coli зависит от наличия протонного градиента на мембране.

Таким образом, белок YeaS, а возможно, и другие мембранные белки, участвующие в выбросе лейцина, для осуществления транспорта нуждаются в электрохимическом мембранном потенциале.

4. Индукция экспрессии гена yeaS экзогенными аминокислотами.

Известно, что экспрессия генов, кодирующих белки, участвующие в экспорте, может индуцироваться при добавлении субстрата в среду культивирования (Bellmann et al., 2001; Nandineni and Gowrishankar, 2004). Мы проверили, как влияет на экспрессию гена yeaS добавление аминокислот и их аналогов.

С этой целью штамм TG1, несущий плазмиду pMWLTyS с трансляционным слиянием регуляторной области гена yeaS и беспромоторного гена lacZ', выращивали в среде М9, в которую добавляли соответствующую аминокислоту

до концентрации 5шМ Основываясь на активности Р-галактозидазы, судили об экспрессии тетуеаБ (рис. 3).

Рис. 3. Индукция гена yeaS различными аминокислотами.

ААБ - а-аминобутират, (L-a-амино-п-масляная кислота)

ТАА - триазолаланин, (DL-1,2,4-триазол-З-аланин)

АЭЦ - a-D-аминоэтилдистеин

Из представленных на рис.3, данных видно, что экспрессия гена yeaS повышается, и в ряде случаев весьма значительно, при добавлении в минимальную среду культивирования ряда аминокислот. Все проверенные аминокислоты по их влиянию на уровень экспрессии гена yeaS можно условно разделить на три группы. К первой группе относятся те аминокислоты, добавление которых приводит к значительному увеличению экспрессии гена yeaS. Это лейцин и его природный аналог a-аминобутират. Ко второй группе можно отнести те аминокислоты, добавление которых увеличивает уровень экспрессии yeaS, но менее значительно, в 3-5 раз. Это треонин, метионин, лизин, гистидин, аланин и гомосерин. И, наконец, к третьей группе можно отнести аминокислоты, добавление которых практически не сказывается на уровне экспрессии гена yeaS.

Увеличение уровня экспрессии гена yeaS при добавлении в среду аминокислот в большинстве случаев коррелирует как с повышением уровня устойчивости к этой аминокислоте, которую сообщает клеткам Е. coli амплификация гена yeaS, так и с увеличением накопления этой аминокислоты при сверхэкспрессии гена yeaS в модельных штаммах-продуцентах (для лейцина, метионина и гистидина).

Таким образом, результаты всех трех экспериментов свидетельствуют о том, что белок YeaS участвует в транспорте из клеток Е. coli ряда аминокислот, преимущественно лейцина и его аналогов. В связи с этим мы предлагаем переименовать ген yeaS в leuE ("leucine export).

5. Определение старта транскрипции гена yeaS и анализ его регуляторной области. В дальнейшем мы определяли старт транскрипции гена yeaS. Для этого провели опыт по «продлению праймера» (primer extension) и установили, что транскрипция гена yeaS начинается с остатка ЦТФ (С) за 41 нуклеотид до старта трансляции (рис.4).

уеай УваТ / yeaS yeaR

Рис.4. А. Карта хромосомы Е coli в районе гена yeaS.

Б. Последовательность межгенного yeaT-yeaS участка.

Кодирующие области генов yeaT и yeaS выделены курсивом, предполагаемые участки -10 и -35, RBS и старт-кодон гена yeaS помечены жирным шрифтом, гипотетические сайты связывания белка Lrp выделены серым цветом, сайт, совпадающий с консенсусом, обнаруженным Кюи с соавт (Cui et al, 1995) , подчеркнут Стрелкой выделен остаток нуклеотида, с которого начинается транскрипция.

В. Определение сайта начала транскрипции гена yeaS в опыте с primer extension. 1 - pUC21, 2 - pYEAS.

При анализе последовательности регуляторной области гена yeaS на каноническом расстоянии от старта транскрипции мы обнаружили участки, близкие к-35 ик-10 консенсусам для о70-зависимого промотора - Е coli. Кроме того, при помощи базы данных DPInteract (http://arep.med.harvard.edu/dpmetract) мы нашли в этой области гипотетические сайты связывания белка Lrp, один из которых, очень близкий к консенсусу, описанному Кюи с соавторами (Cui et al., 1995) (совпадение составляет 11 нуклеотидов из 15), перекрывает предполагаемый -10 участок промотора. Наличие этих сайтов связывания могло означать, что белок Lrp участвует в регуляции экспрессии гена yeaS.

6. Влияние инактивации гена lrp на экспрессию гена yeaS. Lrp - это

глобальный регулятор метаболизма у Е. coli, регулирующий экспрессию около 10% всех генов этого микроорганизма. Его действие может модулироваться лейцином, в частности, в присутствии лейцина Lrp репрессирует гены, кодирующие белки транспорта лейцина внутрь клетки (Calvo and Matthews, 1994).

Для проверки предположения об участии Lrp в регуляции гена yeaS мы инактивировали ген lrp, кодирующий этот белок, и определяли влияние такой инактивации на уровень экспрессии гена yeaS. Об уровне экспрессии гена yeaS судили на основании активности ß-галактозидазы.

1,4

} 1,2

X С

о -1 1,0

0,8

Б ^ 0,6

ш S 0,4

0,2

0,0

[Э 1- -¡I' —рг

Л i I и

His

BTG1 0,110 0,710 0,367 0,294 0,695 0,415

lDTG1lrp:.cat 0,755 1,150 1,100 1,020 0,880 0,778

Ala

Leu

Lys

Рис.5. Влияние инактивации гена lrp в штамме TGI на уровень экспрессии гена yeaS и на индукцию этого гена различными аминокислотами.

*ААБ - а-аминобутират - L-a-амгою-п-масляная кислота

На рис.5 видно, что при инактивации гена lrp уровень экспрессии гена yeaS в минимальной среде увеличивается почта в 7 раз. Кроме того, из представленных данных видно, что в отсутствии белка Lrp практически не происходит дополнительной индукции гена yeaS лейцином и лизином, а индукция а-аминобутиратом крайне незначительна.

Таким образом, мы показали, что белок Lrp прямо или косвенно репрессирует транскрипцию гена yeaS.

7. Влияние инактивации гена уеаТ на экспрессию гена yeaS. Мы

исследовали еще один аспект регуляции гена yeaS, а именно, попытались найти для него LysR-подобный регулятор. Известно, что гены, кодирующие белки-экспортеры, могут регулироваться специфическими регуляторами LysR-типа (Vrljic et al., 1996, Nandineni and Gowrishankar, 2004). Для гена yeaS хорошим кандидатом на роль такого регулятора был продукт гена уеаТ, расположенного рядом с ним на хромосоме (рис.4А).

Мы инактивировали ген уеаТ и проверили влияние такой инактивации на уровень экспрессии гена yeaS в разных условиях. Результаты представлены на рис.6.

Рис.6. Влияние инактивации уеаТ гена на уровень экспрессии гена yeaS в разных условиях.

*ААБ - а-аминобутират - L-a-амино-п-масляная кислота

Как видно из рис.6, инактивация гена уеаТ никак не сказывается на уровне экспрессии гена yeaS как в минимальной, так и в богатой среде. Более того, при инактивации гена уеаТ мы наблюдаем индукцию экспрессии гена yeaS лейцином и a-аминобутиратом практически в полном объеме относительно штамма с полноценным уеаТ геном, то есть и для индукции гена yeaS аминокислотами не нужно присутствия белка YeaT.

Таким образом, уровень экспрессии гена yeaS практически не зависит от аллельного состояния гена уеаТ и, скорее всего, продукт гена уеаТ не является регулятором гена yeaS.

8. Влияние инактивации гена Irp на экспрессию генов rhtB, rhtC и yahN.

В следующей части нашей работы мы исследовали регуляцию еще трех генов, кодирующих белки семейства RhtB: rhtB, rhtCviyahN.

Мы провели компьютерный анализ регуляторных областей этих генов для поиска гипотетических сайтов связывания различных регуляторных белков при помощи программы Genome. В качестве матриц (pattern) для поиска гипотетических сайтов связывания использовались последовательности, представленные в базе данных DPInteract и последовательности, предоставленные Д.А. Родионовым и А.А. Мироновым.

Основываясь на результатах компьютерного анализа, мы предположили, что экспрессия интересующих нас генов может регулироваться несколькими

регуляторами - Lrp, OmpR, Fis, MarR, Crp и AcrR. Однако гипотетические сайты связывания, которые нам удалось обнаружить в регуляторных областях генов г ht В, rhtC и yahN, в каждом случае не вполне соответствуют консенсусным для каждого из регуляторов. Таким образом, на основании только данных компьютерного анализа невозможно было сделать вывод о том, раулируется или нет экспрессия исследуемых генов белками-регуляторами, для которых были найдены сайты связывания.

Поэтому мы экспериментально исследовали регуляцию генов, кодирующих белки семейства RhtB, для чего были сконструированы трансляционные слияния генов rhtB, rhtC и yahN с беспромоторным геном lac?, подобно тому, как это было сделано для гена yeaS, и на основании активности Р-галактозидазы судили об уровне экспрессии этих генов.

Влияние инактивации гена lrp на уровень экспрессии генов rhtB, rhtC и yahN показано на рис.7.

Рис.7. Влияние инактивации гена lrp на уровень экспрессии генов rhtB, rhtC и yahN при культивировании в минимальной среде М9.

А - штаммы TG1 и TGlilij), несущие плазмиду pMWLTrB (rhtB'-lacZО

Б - штаммы TG1 и TQXMrp, несущие плазмиду pMWLTiC (rhtC'-lacZ")

В - штаммы TG1 и TG1Дlrp, несущие плазмиду pMWLTyN (yahN'-lacZ*) я - активность р-галактозидазы в штамме TG1 • - ОП540 штамма TG1

□ - активность р-галактозидазы в штамме TG1 Ыгр ° - ОП540 штамма TG1Дlrp

На рис.7 видно, во-первых, что уровень экспрессии всех трех генов зависит от фазы роста культуры, причем эта зависимость не универсальна.

Во-вторых, данные, представленные на рис.7, свидетельствуют о том, что все три исследуемых гена регулируются белком Lrp. Судя по активности Р-галактозидазы, экспрессия гена rhtB в штамме TGlA/rp падает на порядок, то есть Lrp играет роль активатора транскрипции rhtB. Такую же роль этот белок играет и в отношении двух других генов, уаШ и rhtC, и, хотя в этих двух случаях эффект инактивации lrp не столь выражен, уровень р-галактозидазы соответствующих штаммов уменьшается в несколько раз.

На уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yahN и yeaS не оказывает практически никакого влияния инактивация генов ompR, crp, acrR, marR,fis, relA и spo Т (данные не представлены).

9. Влияние физиологических стрессов на экспрессию генов rhtB, rhtC, yahNnyeaS. По одной из гипотез Ernsting с соавт. (Ernsting et. al., 1992), роль Lrp как глобального регулятора состоит в адаптации клеток Е. coli к различным стрессовым условиям, которые могут возникать во время их жизни в кишечном тракте животного-хозяина. Основываясь на этой точке зрения, мы можем рассматривать тот факт, что Lrp регулирует экспрессию исследуемых генов, как довод в пользу того, что эти гены кодируют белки, участвующие в ответе клетки на различные физиологические стрессы.

Для экспериментальной проверки этого предположения мы исследовали влияние нескольких стрессовых состояний на уровень экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB.

Данные о влиянии осмотического стресса на уровень экспрессии всех четырех генов представлены на рис.8.

О 2 4 6 8 10 12 14 18 1В 20 22 24 26 Время, Ч

10 12 14 16 16 20 22 24 26 Время, ч

Время, ч

0 г 4 В в 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Время, ч

Рис.8. Влияние осмотического стресса на уровень экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB, при культивировании на богатой среде LB.

А - штамм TGI, несущий плазмиду pMWLTrB (rhtB '-lacZ1) Б - штамм TG 1, несущий плазмиду pMWLTrC (rhtC '-lacZ1) В - штамм TG 1, несущий плазмиду pMWLTy S (yeaS '-lacZ') Г - штамм TGI, несущий плазмиду pMWLTyN (yahN'-lacZ ш - активность Р-галактозидазы на среде LB • - ОП540 на среде LB

□ - активность р-галактозидазы на среде LB с добавлением 0.6М NaCl 0 - ОП540 на среде LB с добавлением 0.6М NaCl

Из представленных данных видно, что при осмотическом стрессе, вызванном

добавлением 0,6М NaCl в стандартную среду LB, экспрессия всех четырех генов

возрастает в несколько раз. Похожие результаты мы получили и при добавлении в

богатую среду культивирования 4% этанола, хотя в этом случае увеличение

активности Р-галактозидазы было не столь значительно - всего в 2-2,5 раза.

При понижении рН и культивировании в анаэробных условиях уровень

экспрессии всех четырех исследуемых генов также повышался.

Полученные результаты позволяют нам говорить о том, что, по крайней мере,

четыре исследованных гена, которые кодируют белки семейства RhtB,

индуцируются во время стрессов, что свидетельствует о том, что белки, которые

они кодируют, участвуют в ответе клетки на различные стрессы.

Похожая регуляция во время стрессов известна и для некоторых другах генов, в частности, для оперона асгАВ, кодирующего один из основных транспортеров экскреции, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость у Е. соН (Ма е! а1., 1995).

Голодание по азоту, фосфору и углероду приводило к незначительному снижению уровня экспрессии гена гЫВ в позднем стационаре. Такой же эффект оказывало понижение температуры культивирования с 37°С до 25 °С (без снижения аэрации). Увеличение температуры культивирования с 37°С до 44°С не оказывало никакого эффекта на уровень экспрессии гена гЫВ (данные не представлены). Интересно, что и для оперона асгАВ, о котором мы уже упоминали, повышение температуры культивирования также не влияло на уровень экспрессии (Ма ег. а1., 1995).

В таблице 2 суммированы полученные нами данные о регуляции экспрессии генов гЫВ, гЫС, уеаБ и уаШ.

Табл.2. Факторы, регулирующие экспрессию генов гЫВ, гЫС, уеа5 и уаШ.

Факторы: гШВ гЫС уеаБ уаИИ

Фаза роста + + + +

Ьгр й (»10 раз) 1} (»3 раза) 0 (»7 раз) й (»4 раза)

Физиологические стрессы

(0,6М №0,4% этанол, П п гг

низкий рН, низкая аэрация)

Добавление аминокислот (Г (Ьеи) П (Ьеи, ААБ, 1Ъг, Ме^ Ьуя, Ив, А1а, Нот) •Ц (Ьеи и ТАА)

Уровень экспрессии гена гЫВ зависит от фазы роста культуры: и в

минимальной и в богатой среде соответствующая активность р-галактозидазы

увеличивается в фазе активного роста и достигает максимума к раннему

стационару (рис 7 и 8). Экспрессия гена гЫВ, кроме того, регулируется белком

Ьгр, который прямо или косвенно активирует его экспрессию, причем в

отсутствии Ьгр экспрессия гена гЫВ падает почти на порядок. Экспрессия гена

гЫВ не зависит от присутствия аминокислот в среде культивирования. Ни

гомосерин и треонин, которые являются субстратами белка ЮлВ, ни лейцин,

который часто модулирует регуляторное действие белка 1лр, не оказывают

никакого влияния на уровень экспрессии гена гЫВ. Экспрессия этого гена повышается в несколько раз при добавлении в среду культивирования 0.6М №С1 и 4% этанола, а также при низком значении рН и в анаэробных условиях.

Регуляция экспрессии гена гЫС в целом имеет аналогичный характер. Уровень экспрессии гЫС также зависит от фазы роста культуры и не меняется при переходе с минимальной на богатую среду (рис.7 и 8). Кроме того, он тоже активируется белком Iлр, хотя и в гораздо меньшей степени, чем ген гЫВ (рис.7). Экспрессия гена гЫС практически не индуцируется аминокислотами -субстратами белка ШиС (гомосерином и треонином). Однако добавление лейцина приводит к повышению уровня экспрессии гена гЫС, то есть, вероятно, к усилению регуляторного действия Ьгр. В штамме А!гр такого эффекта мы не наблюдали. В стрессовых условиях уровень экспрессии гена гЫС также повышается.

Регуляция гена уаШ несколько отличается от регуляции генов гЫВ и гЫС -в минимальной среде он индуцируется только в фазе позднего стационара, хотя при переходе на богатую среду индукция происходит уже в фазе активного роста (рис.7 и 8). Ьгр играет роль активатора его экспрессии, в штамме Д 1гр она падает в четыре раза (рис.7). Экспрессия гена уаЪЫ практически не индуцируется аминокислотами, а при добавлении лейцина и триазолаланина происходит значительное снижение (в 5-6 раз) соответствующей активности (З-галактозидазы. В штамме Ыгр такого снижения не происходит (то есть, в этом случае добавление лейцина и триазолаланина, видимо, препятствует регуляторному, активирующему действию Ьгр). Во время стрессов регуляция уаШ практически аналогична регуляции генов гЫВ и гЫС.

Характер регуляции гена уеаЯ значительно отличается от описанного для трех предыдущих генов. Ьгр в данном случае выступает не в качестве активатора, а в качестве репрессора, подавляя экспрессию гена уеа8 . Кроме того, для гена уеаБ, единственного из четырех исследованных генов, показана индукция аминокислотами-субстратами, которая коррелирует как с устойчивостью, так и с увеличением накопления соответствующей аминокислоты штаммами-продуцентами при сверхэкспрессии гена уеаЯ, Причем, интересно, что индукция не только лейцином, но и другими аминокислотами зависит от присутствия в клетке белка Ьгр.

В стрессовых условиях уровень экспрессии гена уеа$ в целом изменяется так же, как описано для трех предыдущих генов.

выводы.

1. Амплификация каждого из генов Е. coli, кодирующих белки семейства RhtB, сообщает клеткам Е. coli устойчивость к нескольким аминокислотам и/или их аналогам и повышает продукцию аминокислот соответствующими модельными штаммами-продуцентами. Сверхэкспрессия гена yeaS приводит к увеличению накопления клетками штаммов-продуцентов лейцина, метионина и гистидина.

2. Экспрессия гена yeaS индуцируется добавлением в среду лейцина, а-аминобутирата и, в несколько меньшей степени, - треонина, метионина, лизина, гистидина, аланина и гомосерина. Вместе с данными о влиянии сверхэкспрессии этого гена на устойчивость бактерий Е. coli и В. subtilis к аминокислотам и их аналогам, а также на продукцию аминокислот, этот результат свидетельствует том, что белок YeaS участвует в выбросе из клетки ряда аминокислот, в основном -лейцина и его аналогов.

3. Индукция гена yeaS аминокислотами зависит от белка Lrp, который подавляет экспрессию этого гена. Продукт гена уеаТ, кодирующего LysR-подобный регулятор, не влияет на экспрессию remyeaS.

4. Экспрессия генов rhtB, rhtC и yahN активируется белком Lrp.

5. Уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN возрастает при осмотическом стрессе, при добавлении в среду 4% этанола, при снижении pH среды и в анаэробных условиях.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кутукова Е.А., Закатаева Н.П., Лившиц В.А. 2005 "Экспрессия генов, кодирующих белки семейства RhtB, зависит от глобального регулятора Lrp». Молекулярная Биология, №39, стр. 374-381.

2. Kutukova Е.А., Livshits V.A., Altaian I.P., Ptitsyn L.R., Zyiatdinov M.H., Tokmakova I.L., Zakataeva N.P. 2005. "The yeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression". FEBS Letters, №579, p. 4629-4634.

3. Кутукова E.A., Закатаева Н.П., Лившиц B.A., Алешин В.В., Трошин П.В. Родионов Д.А. 2004. «Исследование генов, кодирующих белки семейства RhtB, которые участвуют в экскреции метаболитов у Escherichia coli» Тезисы доклада III конференции ВОГИС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, стр.385.

4. Лившиц В.А., Закатаева Н.П., Алешин В.В., Гронский С.В., Кутукова Е.А. 2004 «Транспорт метаболитов из клеток бактерий: гены и белки, их свойства и применение в биотехнологии» Тезисы доклада III конференции ВОГИС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, стр. 341.

Принято к исполнению 20/09/2005 Исполнено 21/09/2005

Заказ № 1055 Тираж 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

* 1 8 3 01

РНБ Русский фонд "л < Л

18437

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кутукова, Екатерина Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Транспорт веществ через бактериальную мембрану.

1.1. Общая характеристика транспортных белков. Типы и классификация.

1.2. Белки множественной лекарственной устойчивости и их регуляция.

1.3. Транспортеры аминокислот у разных организмов.

1.3.1. Экспортеры аминокислот у Corynebacterium glutamicum.

1.3.2. Импортеры аминокислот у Corynebacterium glutamicum.

1.3.3. Экспортеры аминокислот у Escherichia coli.

1.3.4. Импортеры аминокислот у Escherichia coli.

1.3.5. Системы устойчивости к низким рН у E.coli.

2. Общие принципы регуляции генной экспрессии у прокариот. Глобальные и локальные регуляторы.

2.1. Глобальный регулятор Lrp.

2.1.1. Строение белка Lrp.

2.1.2. Регуляция экспрессии lrp.

2.1.3. Фенотип мутантов.

2.1.4. Сайты связывания Lrp. Влияние экзогенных аминокислот.

2.1.5. Гены, экспрессию которых регулирует Lrp.

2.1.6. Взаимодействие с другими факторами.

2.1.7. Семейство AsnC-Lrp.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генов, кодирующих белки семейства RhtB у Escherichia coli"

Штаммы Escherichia coli широко используются для получения продуцентов различных биологически активных веществ, в частности, аминокислот. Аминокислоты применяют в различных отраслях, в основном в пищевой, кормовой и фармацевтической промышленности. Мировой объем продукции аминокислот составил в 1998 году 3 миллиарда долларов США, и эти показатели растут на 5-10% каждый год.

В последнее время появляется все больше данных о том, что немаловажную роль в увеличении эффективности продукции биологически активных веществ штаммами-продуцентами Е. coli играют белки, осуществляющие транспорт из клетки конечного продукта. У эффективных продуцентов концентрация целевого метаболита может достигать значительной величины, например, при ферментации треонина штаммом-продуцентом Е. coli концентрация последнего в культуральной жидкости составляет 100120 г/л. В этих условиях может происходить подавление активности ферментов и роста клетки продуктами собственного метаболизма. Поэтому для увеличения выхода продукта необходимо уменьшать его внутриклеточную концентрацию. Одним из способов такого уменьшения является активация экскреции метаболитов.

Поиск и изучение генов, продукты которых ответственны за транспорт метаболитов из клетки, а также определение влияния на уровень их экспрессии различных глобальных регуляторных систем является важной задачей, которая имеет большое научное и практическое значение.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение генов Е. coli, кодирующих белки, входящие в состав семейства RhtB. Эти гены являются паралогами ранее описанного гена rhtB, продукт которого осуществляет экскрецию гомосерина и треонина из клеток Е. coli.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- Изучить влияние сверхэкспрессии генов - паралогов rhtB на устойчивость клеток к аминокислотам и их аналогам.

Провести компьютерный поиск возможных сайтов связывания белков — регуляторов в регуляторных областях генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN.

Сконструировать вектор на основе малокопийной плазмиды pMW119 для исследования уровня экспрессии генов на основе определения активности Р-галактозидазы.

Определить индукцию экспрессии исследуемых генов аминокислотами.

Изучить влияние аллельного состояния генов, кодирующих белки регуляторы, на уровень экспрессии исследуемых генов.

Изучить влияние некоторых физиологических стрессов на уровень экспрессии исследуемых генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе были исследованы гены, кодирующие белки - члены семейства RhtB: yfiK, yeaS, yggA и yahN. Впервые показано, что амплификация каждого из них повышает устойчивость клеток Е. coli к нескольким аминокислотам и/или их аналогам и увеличивает продукцию ряда аминокислот модельными штаммами-продуцентами. При этом сверхэкспрессия гена yeaS приводит к значительному увеличению накопления в среде культивирования лейцина, и в меньшей степени - метионина и гистидина. Эти данные представляют практический интерес при получении промышленных штаммов-продуцентов аминокислот на основе Е. coli. В работе также исследовалась регуляция генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Установлено, что экспрессия гена yeaS индуцируется такими аминокислотами, как лейцин, а-аминобутират и, в меньшей степени, треонин, метионин, лизин, гистидин, аланин и гомосерин. Показано, что для осуществления этой индукции необходимо присутствие в клетке белка Lrp, который является репрессором yeaS.

Также показано, что продукт гена уеаТ, расположенного рядом с геном yeaS на хромосоме Е. coli и кодирующего LysR-подобный регулятор, не оказывает влияния на экспрессию гена yeaS.

Кроме того, изучено влияние некоторых физиологических стрессов па уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Показано, что в случае ряда стрессов уровень экспрессии всех четырех генов увеличивается в несколько раз.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кутукова, Екатерина Александровна

V. ВЫВОДЫ

4. Экспрессия генов rhtB, rhtC и yahN активируется белком Lrp.

5. Уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN возрастает при осмотическом стрессе, при добавлении в среду 4% этанола, при снижении рН среды и в анаэробных условиях.

Автор благодарит Закатаеву Наталью Павловну за огромную помощь и поддержку, которую она всегда оказывала при выполнении данной работы.

Автор также благодарит Дмитрия Родионова и Константина Рыбака за неоценимую помощь в освоении компьютерных программ.

122

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена исследованию генов Е. coli, кодирующих белки семейства RhtB.

Было показано, что сверхэкспрессия генов yfiK, yeaS, yahN и yggA приводит повышению устойчивости к аминокислотам, причем сверхэкспрессия каждого из этих генов сообщает клеткам устойчивость сразу к нескольким аминокислотам и/или их аналогам. Кроме того, при сверхэкспрессии этих генов наблюдается увеличение накопления штаммами-продуцентами тех аминокислот, к которым возникает устойчивость.

Сверхэкспрессия гена yfiK сообщает клеткам устойчивость к пролину, гистидину, глутамату, гомосерину, дегидропролину, треонину и цистеину, а также увеличивает накопление треонина, пролина, глутамата и гистидина соответствующими штаммами-продуцентами.

При сверхэкспрессии гена yggA максимальный уровень устойчивости возникает к аминоэтилцистеину (аналогу лизина), а также к аргинину и лизину. Сверхэкспрессия гена yggA, кроме того, приводит к увеличению накопления аргинина и лизина соответствующими штаммами-продуцентами.

При сверхэкспрессии гена yahN возникает устойчивость клеток Е. coli к глутамату, гомосерину и пролину. Кроме того, сверхэкспрессия этого гена приводит к увеличению продукции пролина и глутамата.

При сверхэкспрессии гена yeaS максимальный уровень устойчивости наблюдался к глицил-лейцину и а-аминобутирату. Кроме того, амплификация гена yeaS приводит к возникновению устойчивости и к другим аналогам лейцина, к гистидину и его аналогу, гистидингидраксамату, и аналогу метионина - метионинсульфону. Инактивация гена yeaS значительно снижает устойчивость клеток к глицил-лейцину.

При помощи компьютерного анализа было показано, что ген yeaS кодирует белок, состоящий из 212 аминокислот и имеющий расчетную молекулярную массу 28,3 kDa. В его составе было показано наличие шести трансмембранных сегментов, и установлена его внутриклеточная локализация во внутренней мембране.

Сверхэкспрессия гена yeaS при помощи интеграции в хромосому Е. coli под конститутивным промотором Р„ipD приводит к увеличению накопления лейцина, метионина, и гистидина модельными штаммами-продуцентами. Инактивация гена yeaS снижает накопление лейцина, а добавление в среду разобщителя СССР практически останавливает выброс лейцина.

Полученные данные позволили предположить, что ген yeaS кодирует трансмембранный белок, участвующий в выбросе из клетки ряда аминокислот, преимущественно лейцина и а-аминобутирата, используя для этого процесса энергию протонного электрохимического потенциала. Мы предлагаем переименовать ген yeaS в leuE (leucine export).

Изучение регуляции экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB, показало, что гены rhtB, rhtC, yeaS и yahN регулируются глобальным регулятором Lrp, причем экспрессия гена yeaS подавляется этим белком, а экспрессия остальных генов — активируется.

Кроме того, было показано, что уровень экспрессии гена yeaS индуцируется при добавлении в среду ряда аминокислот. Максимальный эффект наблюдался при добавлении лейцина и а-аминобутирата, кроме того, экспрессию гена yeaS индуцируют такие аминокислоты, как треонин, метионин, лизин, гистидин, аланин и гомосерин. Было показано, что индукция аминокислотами экспрессии гена yeaS нуждается в присутствии в клетке белка Lrp.

Для гена yahN также был показан эффект добавления лейцина в среду культивирования, но в этом случае добавление лейцина значительно уменьшало уровень экспрессии гена yahN. Этот эффект также обусловливался присутствием в клетке гена lrp.

Уровень экспрессии гена rhtB не зависел от добавления лейцина, а-аминобутирата и субстратов, в транспорте которых участвует белок RhtB - гомосерина и треонина.

Уровень экспрессии гена rhtC увеличивался при добавлении лейцина в минимальную среду культивирования.

В работе было показано, что уровень экспрессии всех четырех изученных генов, кодирующих белки семейства RhtB, увеличивается во время таких физиологических стрессов, как осмотический стресс, при добавлении в среду 4% этанола, при низких значениях рН, а также в анаэробных условиях

Уровень экспрессии всех четырех проверенных генов не зависел от аллельного состояния генов ompR, crp, fis, marR, acrR, relA и spoT, а также от аллельного состояния гена rpoS. Инактивация гена rpoS оказывала незначительное действие лишь на уровень экспрессии теш yahN- он понижался вдвое.

В работе также было показано, что продукт гена уеаТ не является LysR-подобным регулятором экспрессии гена yeaS.

Полученные данные имеют важное практическое значение. Так, при введении гена yeaS, клонированного под конститутивным промотором, в штаммы, продуцирующие лейцин, метионин и гистидин, продукция названных аминокислот значительно возрастает.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кутукова, Екатерина Александровна, Москва

1. Авторское свидетельство СССР №1354458. Штамм бактерий Escherichia coli -продуцент лизина.

2. Аствацатурянц Г.В., Лисепков А.Ф., Смирнов Ю.В., Шакулов Р.С. 1988. Получение мутантов с нарушенным ретроингибированием биосинтеза гистидина. -Генетика 24:1928-1934.

3. Закатаева Н.П. 1997. Исследование плейотропной мутации устойчивости к гомосерину и треонину у Escherichia coli К-12. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, ГНИИГенетики и селекции промышленных микроорганизмов.

4. Зиятдинов М.М., Ворошилова Э.В., Гусятинер М.М. 2001. L-метионин продуцирующие бактерии рода Escherichia и метод продукции L-метионина. — ЗАО АГРИ, Патент РФ № 2209248.

5. Клячко Е.В., Зиброва М.Г., Шакулов Р.С., Дебабов В.Г., Козлов Ю.И. 1998. Штамм of Escherichia coli — продуцент гистидина. ГНИИГенетика. Патент РФ № 2119536.

6. Рыбак КВ. 2005. Поиск новых генов Escherichia coli, участвующих в экспорте аминокислот. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва. ЗАО «АГРИ». На правах рукописи.

7. Рыбак КВ., Сливииская Е.А., Хургес Е.М. 2004. Поиск новых генов Е. coli, ответственных за транспорт аминокислот. — Биотехнология 2:31-47.

8. Патент №2212447 по заявке № 2000110350, от 26.04.2000.

9. Тараканов Б.В., Яковлева А.А., Николичева Т.А., Комкова Н.М., Манухина А.К, Алешин В.В. 2004. Экспрессионный вектор pLF22 для молочнокислых бактерий. -Микробиология 73:211-217.

10. Харитонов А.А., Тарасов А.П. 1986. Клонирование и экспрессия генов Corynebacterium Jlavum АТСС 14067, комплементирующих мутации ArgA и ArgE в клетках Escherichia coli. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология 9:29-33.

11. Alekshun M.N., Levy S.B. 1997. Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance: the mar regulon. Minireview. Ant. Agents Chemoth. 41:2067-2075.

12. Aleshin V.V., Zakataeva N.P., Livshits V.A. 1999. A new family of amino-acid-efflux proteins. — Trends Biochem. Sci. 24:133-135.

13. Ambartsoumian G., D'Ari R., Lin R.T., Newman E.B. 1994. Altered amino acid metabolism in lrp mutants of Escherichia coli K12 and their derivatives. Microbiol. 140:17371744.

14. Anderson J.J., Oxender D.L. 1977. Escherichia coli transport mutants lacking binding protein and other components of the branched-chain amino acid transport systems. J. Bacteriol. 130:384-92.

15. Antonucci Т.К., Oxender D.L. 1986. The molecular biology of amino-acid transport in bacteria. Adv. Microbiol. Phys. 28:145-180.

16. Bachmann B.J. 1983. Linkage map of Escherichia coli K-12, edition 7. Microbiol. Rev. 47:180-230.

17. Barbosa T.M., Levy S.B. 2000. Differential expression of ever 60 chromosomal genes in Escherichia coli by constitutive expression of MarA. J. Bacteriol. 182:3467-3474.

18. Belitski B.R., Gustafson M.C., Sonenshein A.L., von Wachenfeld C. 1997. An Lrp-like gene of Bacillus subtilis involved in branched-chain amino acid transport. J. Bacteriol. 179:5548-5557.

19. Bellmann A., Vrljic M, Patek M., Sahm H., Kramer R„ Eggeling L. 2001. Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum. -Microbiol. 147:1765-1774.

20. Bern R. 1985. Porin from bacterial and mitochondrial outer membranes. Crit. Rev. Biochem. 19:145-190.

21. Blatther F.R., Plunkett G., Bloch C.A., Perna N.T., Burland V., Riley M, et.al. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science, 277:1453-1474.

22. Blomfield I.C., Calie P.J., Eberhardt K.J., McClain M.S., Eisenstein B.I. 1993. Lrp stimulates phase variation of Type 1 fimbriation in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 175:2736.

23. Borst D. W., Blumenthal R.M., Matthews R.G. 1996. Use of an in vivo titration method to study a global regulator: effect of varying Lrp levels on expression of gltBDF in Escherichia coli.- J. Bacteriol. 178:6904-6912.

24. BouvierJ., Gordia S., Kampmann G., Lange R., Hangge-Aronis R., Gutierrez C. 1998. Interplay between global regulators of Escherichia coli: effect of RpoS, Lrp and H-NS on transcription of the gene osmC. Mol. Microbiol. 28:971-980.

25. Brinkman A.B., Etterma T.J.G., de Vos W.M., van der Oost J. 2003. The Lrp family of transcriptional regulators. Mol. Microbiol. 48:287-294.

26. Broer S., Kramer R. 1990. Lysine uptake and exchange in Corynebacterium glutamicum. J. Bacterid. 172:7241-7248.

27. Burkovski A., Krdmer R. 2002. Bacterial amino acid transport proteins: occurrence, functions, and significance for biotechnological applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:265-274.

28. Burkovski A., Weil В., Kramer R. 1996. Characterization of a secondary uptake system for L-glutamate in Corynebacterium glutamicum. FEMS Microbiol. Lett. 136:169-173.

29. Calvo J.M., Mathhews R.G. 1994. The leucine-responsive regulatory protein, a global regulator of metabolism in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 58:466-490.

30. Campbell A. 1961. Sensitive mutants of bacteriophage lambda. Virology 14:22-32.

31. Campbell J.D., Biggin P.C., Baaden M., Sansom M.S. 2003ю Extending the structure of an ABC transporter to atomic resolution: modeling and simulation studies of MsbA. -Biochemistry, 42:3666-73.

32. Carole S., PichoffS., Bouche J.-P. 1999. Escherichia coli gene ydeA encodes a major facilitator pump which exports L-arabinose and isopropyl-P-D-thiogalactopyranoside. J. Bacteriol. 181:5123-5125.

33. Celis R.T. 1984. Phosphorylation in vivo and in vitro of the arginine-ornithine periplasmic transport protein of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 145:403-11.

34. Celis T.F., Rosenfeld H.J., Maas W.K. 1973. Mutant of Escherichia coli K-12 defective in the transport of basic amino acids. J. Bacteriol. 116:619-26.

35. Chen C.F., Lan J., Korovine M., Shao Z.Q., Tao L., Zhang J., Newman E.B. 1997. Metabolic regulation of lrp gene expression in Escherichia coli K-12. Microbiol. 143:20792084.

36. Chen C., Newman E.B. 1998. Comparison of the sensitivities of two Escherichia coli genes to in vivo variation of Lrp concentration. J. Bacteriol. 180:655-659.

37. Chollet R., Chevalier J., Bryskier A., Pages J.M. 2004. The AcrAB-TolC pump is involved in macrolide resistance but not in telithromycin efflux in Enterobacter aerogenes and Escherichia coli. Antimicrob. Ag. Chemother. 48:3621-4.

38. Chopra I., Roberts M. 2001. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol. Mol. Rev. 65:232-260.

39. Cohen S.P., Hachler H., Levy S.B. 1993. Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance {mar) locus in Escherichia coli. J. Bacterid. 175:1484-1492.

40. Cohen S.P., Yan W„ Levy S.B. 1993. A multidrug resistance regulatory chromosomal locus is widespread among enteric bacteria. J. Infect. Dis. 168:484-488.

41. Cole S.T., Brosh R., Parkhill J., Gamier Т., Churcher C.M., Harris D., et al. 1998. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. — Nature, 393:537-544.

42. Crost C., Garrivier A., Harel J., Matin C. 2003. Leucine-responsive regulatory protein-mediated repression of clp (encoding CS31A) expression by L-leucine and L-alanine in Escherichia coli. J. Bacterid. 185:1886-1894.

43. Cui Y., Wang Q„ Stormo G.D., Calvo J.M. 1995. A consensus sequence for binding of Lrp to DNA. J. Bacterid. 177:4872-4880.

44. Cundliffe E. 1989. How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Annu. Rev. Microbiol. 43:207-233.

45. Dabler Т., Maier Т., Winterhalter С., Bock F. 2000. Identification of a major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cystein pathway. Mol. Microbiol. 36:1101-1112.

46. D'Ari R., Lin R.T., Newman E.B. 1993. The leucine-responsive regulatory protein: more then a regulator? Trends Biochem. Sci. 18:260-263.

47. Datsenko K., Barry A., Wanner L. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products PNAS 97:6640-6645.

48. Eggeling L., Sahm H. 2003. New ubiquitous translocators: amino acid export by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli. Arch. Microbiol. 180:155-160.

49. Ernsting B.R., Atkinson M.R., Ninfa A. J., Matthews R.G. 1992 Characterization of the regulon controlled by the leucine-responsive regulatory protein in Escherichia coli J. Bacteriol. 174:1109-1118.

50. Ernsting B.R., Deninger J. W, Blumenthal R.M., Matthews R.G. 1993. Regulation of the gltBDF operon of Escherichia coli: how is a leucine-insensitive operon regulated by the leucine-responsive regulatory protein? J. Bacteriol. 175:7160-7169.

51. Fath M.J., Kolter R. 1993. ABC-transporter: the bacterial exporters. Microbiol. Rev. 57:995-1017.

52. Franke I, Resch A., Dabler Т., Maier Т., Bock A. 2003. YfiK from Escherichia coli promotes export of O-acetylserine and Cysteine. J. Bacterid. 185:1161-1166.

53. Friedberg D., Midkiff M., Calvo J.M. 2001. Global versus local regulatory roles for Lrp-related proteins: Haemophilus influenzae as a case study. J. Bacteriol. 183:4004-4011.

54. Gazeau M., Delort F., Dessen P., Blanquet S., Plateau P. 1992. Escherichia coli leucine-responsive regulatory protein Lrp controls lysyl-tRNA synthetase expression. FEBS Lett. 300:254-258.

55. Gentry D.R., Hernandes V.J., Nguyen L.H., Jensen D.B., Cashel M. 1993. Synthesis of the stationary phase sigma factor cts is positively regulated by ppGpp. J. Bacteriol. 175:79827989.

56. Gibson T.J. 1984. Ph. D. Thesis. Cambridge University. Cambridge. London,

57. Gong S., Richard H„ Foster J.W. 2003. YudE (AdiC) is the Arginine:Agmatine antiporter essential for Arginine-dependent acid resistance in Escherichia coli. J. Bacteriol. 185:4402-4409.

58. Griffith J.K., Baker M.E., Rouch D.A., Page M.G., Skurray R.A., Paulsen I.T., Chater K.F., Baldwin S.A., Henderson P.J. 1992. Membrane transport proteins: implications of sequence comparisons. Curr. Opin. Cell Biol. 4:684-95.

59. Grkovic S., Brown M.H., Skurray R.A. 2002. Regulation of bacterial drug export systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:671-701.

60. Gusyatiner, M.M., hunts, M.G., Ivanovskaya, L.V., Rostova, Y.G., Bachina, T.A., Khurges, E.M., Livshits, V.A., Kozlov, Y.I., and Debabov, KG. 2000. Method for producing L-leucine. Ajinomoto. United States Patent No. 6124121.

61. Haney S.A., Platko J.V., Oxender D.L., Calvo J.M: 1992. Lrp, a leucine-responsive protein, regulates branched-chain amino acid transport genes in Escherichia coli. — J. Bacteriol. 174:108-115.

62. Heatwole V.M., Somerville R.L. 1991. Cloning, nucleotide sequence, and characterization of mtr, the structural gene for a tryptophan-specific permease of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 173:108-115.

63. Hecht K., Tjhang S., Klopotowski Т., Ferro-Luzzi Ames G. 1996. D-histidine utilization in Salmonella typhimurium is controlled by the leucine-responsive regulatory protein (Lrp). J. Bacteriol. 178:327-331.

64. Hung S„ Baldi P., Hatfield G. W. 2002. Global gene expression profiling in Escherichia coli K-12: the effects of leucine-responsive regulatory protein. J. Biol. Chem. 277:4030940323.

65. Jack R. W., TaggJ.R., Ray B. 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Microbiol. Rev. 59:171-200.

66. Jafri S., Evoy S., Cho K., Crayghead H.G., Winans S.C. 1999. An Lrp-type transcriptional regulator from Agrobacterium tumefaciens candenses more than 100 nucleotides of DNA into globular nucleoprotein complexes. J. Mol. Biol. 288:811-824.

67. Kawamura-Sato K., Shibayama K., Horii Т., linuna Y., Arakmva Y., Otha M. 1999. Role of multiple efflux pumps in Escherichia coli in indole explusion. FEMS Microbiol. Lett. 179:345-352.

68. Kennerknecht N. Sahm H., Yen M.-R., PatekM., Saier M.H., Eggeling J.M., EgglingL. 2002. Export of L-isoleucine from Corynebacterium glutamicum: a two-gene-encoded member of a new translocator family. J. Bacteriol. 184:3947-3956.

69. Keuntje В., Masepohl В., Klipp W. 1995. Expression of the putA gene encoding proline dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus is independent of NtrC regulation but requires an Lrp-like activator protein. J. Bacteriol. 177:6432-6439.

70. Kinoshita S., Udaka S., Shimono M. 1957. Amino acid fermentation. I. Production of L-glutamic acid by various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 3:193-205.

71. Kolling R., Lother H. 1985. AsnC: an autogenously regulated activator of asparagine synthetase A transcription in Escherichia coli. J. Bacteriol. 164:310-315.

72. Koning W.N., Poolman В., Driessen A.J.M. 1989. Bioenergetics and solute transport in Lactococci- Crit. Rev. Microbiol. 16:419-476.

73. Koyanagi Т., Katayama T.M., Suzuki H., Kumagai H. 2004. Identification of the LIV-I/LS system as the third phenylalanine transporter in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 186:343-350.

74. Kruse D., Kramer R., Eggeling L., Rieping M., Pfefferle IV., Tchieu J.H., Chung Y.J., Saier M.H., Burkovski A. 2002. Influence of threonine exporters on threonine production in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:205-210.

75. Kyte J., Doolittle R.F. 1982. A simple method for displaying the hydrophatic character of a protein. J. Mol. Biol. 157:105-132.

76. Landgraf J.R., Boxer J.A., Calvo J.M. 1999. Escherichia coli Lrp (leucine-responsive regulatory protein) does not directly regulate expression of the leu operon promoter. J. Bacteriol. 181:6547-6551.

77. Landgraf J.R., Wu J., Calvo J.M. 1996. Effects of nutrition and growth rate on Lrp levels in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178:6930-6936.

78. LandickR., Oxender D.L. 1985. The complete nucleotide sequences of Escherichia coli LIV-BP and LS-DP genes. J. Biol. Chem. 260:8257-8261.

79. Landini P., Hajec LI., Nguyen L.H., Burgess R.R., Volkert M.R. 1996. The leucine-responsive regulatory protein (Lrp) acts as a specific repressor for as-dependent transcription of the Escherichia coli aidB gene. Mol. Microbiol. 20:947-955.

80. Levinthal M„ Lejeune P., Danchin A. 1994. The H-NS protein modulates the activation of the ilvIH operon of Escherichia coli K-12 by Lrp, the leucine regulatory protein. — Mol. Gen. Genet. 242:736-743.

81. LiX.Z., Nikaido H. 2004. Efflux-mediated drug resistance in bacteria. Drugs. 64:159204.

82. Lin R, D'Ari R., Newman E.B. 1990. The leucine regulon of Escherichia coli: a mutation in rblA altered expression of L-leucine-dependent metabolic operons. J. Bacteriol. 172:4529-4535.

83. Lin R, D'Ari R., Newman E.B. 1992. X placMu insertions in genes of the leucine regulon: extension of the regulon to genes not regulated by leucine. J. Bacteriol. 174:19481955.

84. Lin R., Ernsting В., Hirshfield I.N., Matthews R.G., Neidhardt F.C., Clark R.L., Newman E.B. 1992. The lrp gene product regulates expression of lysll in Escherichia coli K-12. -J. Bacteriol. 174:2779-2784.

85. Lin S., Riggs A.D. 1975. The general affinity of Lac repressor for E. coli DNA: implications for gene regulation in prokaryotes and eucaryotes. Cell 4:107-111.

86. Liu J. Y., Miller P.F., Gosink M., Olson E.R. 1999. The identification of a new family of sugar efflux pumps in Escherichia coli. -Mol. Microbiol. 31:1845-1851.

87. Liu J.Y., Miller P.F., Willard J., Olson E.R. 1999. Functional and biochemical characterization of Escherichia coli sugar efflux transporters. J. Biol. Chem. 274:22977-22984.

88. Livshits, V.A., Doroshenko, V.G., Mashko, S.V., Akhverdyan, A.Z., and Kozlov, Y.I. 2001. Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing amino acid. Ajinomoto. European patent no.1149911.

89. Livshits V.A., Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Vitushkina M.V. 2003. Identification and characterization of the new rhtA gene involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli. Res. In Microbiol. 154:123-135.

90. Lomovskaya 0., Kawai F., Matin A. 1996. Differential regulation of the mcb and emr operons of Escherichia coli: role of mcb in multidrug resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 40:1050-1052.

91. Lomovskaya O., Lewis K., Matin A. 1995. EmrR is a negative regulator of the Escherichia coli multidrug resistance pump EmrAB. J. Bacteriol. 177:2328-2334.

92. Ma Д, Cook D.N., Alberti M„ Pon N.G., Nikaido Я, Hearst J.E. 1993. Molecular cloning and characterization of acrA and acrE genes of Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:6299-6313.

93. Ma D., Cook D.N., Alberti M., Pon N.G., Nikaido H., Hearst J.E. 1995. Genes acrA and acrB encode a stress-induced efflux system of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 16:45-55.

94. Madhusudhan K.T., Huang N. Sokatch J.R. 1995. Characterization of BkdR-DNA binding in the expression of the bkd operon of Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 177:636-641.

95. Mathew E, Zhi J, Freundlich M. 1996. Lrp is a direct repressor of the dad operon in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178:7234-40.

96. Merlin C., Gardiner G., Durand S„ Masters M. 2002. The Escherichia coli metD locus encodes an ABC transporter which includes Abe (MetN), YaeE (Metl), and YaeC (MetQ). J. Bacteriol. 184:5513-5517.

97. Miller J.H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

98. Miller P.F., Ganbino L.F., Sulavik M.C., Gracheck S.J. 1994. Genetic relationship between soxRS and mar loci in promoting multiple antibiotic resistance in Escherichia coli. -Ant. Agents Chemoth. 38:1773-1779.

99. Nandineni R„ Gowrishankar J. 2004. Evidence for an Arginine exporter encoded by yggA (argO) that is regulated by the LysR-Type transcriptional regulator ArgP in Escherichia coli. J. Bacteriol. 186:3539-3546.

100. Newman E.B., D'Ari R., Lin R.T. 1992. The Ieucine-Lrp regulon in E. coli: a global response in search of a raison d'Etre. Cell 68:617-619.

101. Newman E.B., Lin R. 1995. Leucine-responsive regulatory protein: a global regulator of gene expression in E. coli. Annu. Rev. Microbiol. 49:747-775.

102. Newman E.B., Lin R.T., D'Ari R. 1996. The leucine/Lrp regulon. In Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology, pp. 1513-1525. Edited by F.C. Neidhardt,

103. Curtiss R. Ill, Ingraham J.L., Lin E.C.C., Low K.B., Magasanik В., Reznikoff W.S., Riley M. ASM Press, Washington, DC.

104. Neyfakh A.A. 2002. Mystery of multidrug transporters: the answer can be simple. Mol. Microbiol. 44:1123-1130.

105. Nies D.H. 1999. Microbial heavy-metal resistance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:730-750.

106. Nikaido H. 1996. Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 178:5853-5859.

107. Nikaido H., Zgurskaia HI. 2001. AcrAB and related multidrug efflux pumps of Escherichia coli. — J. Mol. Microbiol. Biotech. 3:215-218.

108. Nogueira Т., Springer M. 2000. Post-transcriptional control by global regulators of gene expression in bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 3:154-158.

109. Okusu H., Ma D., Nikaido H. 1996. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 18:306-308.

110. Ono E., Tsujimoto N., Izui H., Matsui K. 1997. Escherichia strain for fermentative production of L-glutamic acid. Patent FR2747689.

111. Paul L., Blumenthal R.M., Matthews R.G. 2001. Activation from a distance: roles of Lrp and integration host factor in transcriptional activation of gltBDF. J. Bacteriol. 183:39103918.

112. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. 1996. Proton-dependent multidrug efflux systems. Microbiol. Rev. 60:575-608.

113. Peekhaus N., Tolner В., Poolman В., Kramer R. 1995. The glutamate uptake regulator protein (Grp) of Zymomonas mobilis and its relation to the global regulator Lrp of Escherichia coli.-. Bacteriol. 177:5140-5147.

114. Peter H., Burkovski A., Kramer R. 1998. Osmo-sensing by N- and C-terminal extension of the glycine betaine uptake system BetP of Corynebacterium glutamicum. J. Biol. Chem. 273:2567-257'4.

115. Pittard A.J., Wookey P.J. 1991. Cloning and sequencing of the pheP gene, which encodes the phenylalanine-specific transport system of Escherichia coli. J. Bacteriol. 173:3622-3629.

116. Pittman M.S., Corker H., Wu G., Binet M.B., Moir A.J.G., Poole R.K. 2002. Cystein is exported from the Escherichia coli cytoplasm by CydDC, an ATP-binding cassette-type transporter required for cytochrome assembly. J. Biol. Chem. 277:49841-49849.

117. Platko J. V., Calvo J.M. 1993 Mutations affecting the ability of Escherichia coli Lrp to bind DNA, activate transcription, or respond to leucine. J. Bacteriol. 175:1110-1117.

118. Platko J.V., Willins D.A., Calvo J.M. 1990. The ilvIH operon of Escherichia coli is positively regulated. J. Bacteriol. 172:4563-4570.

119. Plesiat P., Nikaido H. 1992. Outer membranes of Gram-negative bacteria are permeable to steroid probes. Mol. Microbiol. 11:755-769.

120. Poole RK, Hatch L, Cleeter MW, Gibson F, Cox GB, Wu G. 1993. Cytochrome bd biosynthesis in Escherichia coli: the sequences of the cydC and cydD genes suggest that they encode the components of an ABC membrane transporter. Mol. Microbiol. 10:421-30.

121. Poolman В., Molenaar D., Smid E.J., Ubbink Т., Abee Т., Renauld P.P., Konings W.N. 1991. Malolactic fermentation: electrogenis uptake and malate/lactate antiport generate metabolic energy. J. Bacteriol. 173:6030-6037.

122. Ptashne M., Gann A. 1997. Transcriptional activation by recruitment. Nature 389:569-577.

123. Rahmanian M., Claus D.R., Oxender D.L. 1973. Multiplicity of leucine transport systems in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 116:1258-66.

124. Rahmati S., Yahg S., Davidson A.L., Zechiedrich E.L. 2002. Control of the AcrAB multidrug efflux pump by quorum sensing regulator SdiA. Mol. Microbiol. 43:677-695.

125. Reiaer J., Reizer A., Saier M.H. 1992. A new subfamily of bacterial ABC-type transport systems catalyzing export of drugs and carbohydrates. Prot. Sci. 1:1326-1332.

126. Rhodius V.A., Busby S.J. W. 1998. Positive activation of gene expression. Curr. Opin. Microbiol. 1:152-159.

127. Rosen B.P. 1971. Basic amino acid transport in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 246:3653-62.

128. Rosenberg M.F., Callaghan R., Ford R.C., Higgins C.F. 1997. Structure of multidrug resistance P-glycoprotein to 2.5 nm resolution determined by electron microscopy and image analysis. J. Biol. Chem. 272:10685-10694.

129. Rosner J.L., Slonczewski F. 1994. Dual regulation of inaA by the multiple antibiotic resistance (mar) and superoxide stress response (SoxRS) systems of Escherichia coli. — J. Bacteriol. 176:6262-6269.

130. Russel M., Model P. 1988. Sequence of thioredoxin reductase from Escherichia coli. -J. Biol. Chem. 263:9015-9019.

131. Saier M.H. 1994. Computer-aided analyses of transport protein sequences: cleaning evidence concerning function, structure, biogenesis and evolution. Microbiol. Rev. 58:71-93.138. SU Patent №5175107.

132. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. -Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

133. Schell, M.A. 1993. Molecular biology of the LysR family of transcriptional regulators.- Ann. Rev. Microbiol. 45:597-626.

134. Schembri M.A., Kjaergaard K., Klemm P. 2003. Global gene expression in Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 48:253-267.

135. Schubert M.P. 1937. Reaction of semimercaptals with amino compounds. J. Biol. Chem., 121:539-548.

136. Schwan W.R., Wetzel K.J., Gomez T.S., Stiles M.A., Beitlich B.D., Grunwald S. 2004. Low-proline environments impair growth, proline transport and in vivo survival of Staphylococcus aureus strain-specificputP mutants. Microbiology 150:1055-1061.

137. Seoane A.S., Levy S.B. 1995. Characterization of MarR, the repressor of the multiple antibiotic resistance {mar) operon in Escherichia coli. J. Bacteriol. 177:3414-3419.

138. Simic P., Sahm H., Eggeling L. 2001. L-threonine export: use of peptides to identify a new translocator from Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 183:5317-5324.

139. Soksawatmaekhin W., Kuraishi A., Sakata K., Kashiwagi K., Igarashi K. 2004. Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli.- Mol. Microbiol. 51:1401-1412.

140. Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A. 1992. Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance. Clin. Microbiol. Rev. 5:387-399.

141. Squires C.H., DeFelice M., Devereux J, Calvo J.M. 1983. Molecular structure of ilvIH and its evolutionary relationship to ilvG in Escherichia coli K-12. Nucleic Acid Res. 11:52995313.

142. Stasinopoulos S.J., Farr A., Bechhofer D.H. 1998. Bacillus subtilis tetA(L) gene expression: evidence for regulation by translation reinitiation. Mol. Microbiol. 30:923-932.

143. Stauffer L.T., Stauffer G.V 1999. Role of the leucine-responsive regulatory protein (Lrp) as a structural protein in regulating the Escherichia coli gcvTHP operon Microbiol. 145:569-576.

144. Summers A. 1992. Untwist and shout: a heavy metal-responsive transcriptional regulator. J. Bacteriol. 174:3097-3101.

145. Tani Т.Н., Khodursky A., Blumenthal R.M., Brown P.O., Matthews R.G. 2002. Adaptation to famine: a family of stationary-phase genes revealed by microarray analysis. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13471-13476.

146. Tavori H., Kimmel Y, Barak Z. 1981. Toxicity of leucine-containing peptides in Escherichia coli caused by circumvention of leucine transport regulation. J. Bacteriol. 146:676683.

147. Tong S., Porco A., Isturiz Т., Conway T. 1996. Cloning and molecular genetic characterization of the Escherichia coli gntR, gntK, and gntU genes of GntI, the main system for gluconate metabolism. J. Bacteriol. 178:3260-3269.

148. Trotschel C., Deutenberg D„ Bathe В., Burkovski A., Kramer R. 2005. Characterization of methionine export in Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol., 187: 3786-3794.

149. TuanL.R., D'Ari R., Newman E.B. 1990. The leucine regulon of Escherichia coli K-12: a mutation in rblA alters expression of L-leucine-dependent metabolic operons. J. Bacteriol. 172:4529-4535.

150. Vierra J., Messing J. 1991. New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene 100:189-194.

151. Vrljic M., Konemeyer W., Sahm W., Eggeling L. 1995. Disbalance of L-lysine efflux in Corynebacterium glutamicum and its use for the isolation of excretion defective mutants. J. Bacteriol. 177:4021-4027.

152. Vrljic M., Sahm H., Eggeling L. 1996. A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum. Mol. Microbiol. 22:815826.

153. Wang Q., Calvo J.M. 1993. Lrp, a major regulatory protein in Escherichia coli, bends DNA and can organize the assembly of a higher-order nucleoprotein structure. J. EMBO 12:2495-2501.

154. Wang Q., Calvo J.M. 1993. Lrp, a global regulatory protein of Escherichia coli, binds cooperatively to multiple sites and activates transcription of ilvIH. J. Mol. Biol. 229:306-318.

155. Wang L„ Miller A., Rusch S.L., Kendall D.A. 2004. Demonstration of a specific Escherichia coli SecY-Signal peptide interaction. Biochemistry 43:13185-13192.

156. Wang Q., Wu J., Friedberg D„ Platko J., Calvo J. 1994. Regulation of the Escherichia coli lrp gene J. Bacteriol. 176:1831-1839.

157. Ward J.B., Zahler S.A. 1973. Regulation of leucine biosynthesis in Bacillus subtilis. — J. Bacteriol. 176:1831-1839.

158. Wheldrake J.F. 1967. Intracellular concentration of cystein in Escherichia coli and its relation to repression of the sulphate-activating enzymes. J. Biochem. 105:697-699.

159. White, B.A. 1993. PCR protocols. Current methods and applications., ed. Humana Press , Totowa, New Jersey.

160. White D.G., Goldman J.D., Demple B, Levy S.B. 1997. Role of the acrAB locus in organic solvent tolerance mediated by expression of mar A, soxS, or robA in Escherichia coli. — J. Bacteriol. 179:6122-6126.

161. Willins, D.A., Calvo J.M. 1992. In vitro transcription from the Escherichia coli ilvH promoter. J. Bacteriol. 174:7648-7655.

162. Willins D.A., Ryan C.W., Platko J.V., Calvo J.M. 1991. Characterization of Lrp, an Escherichia coli regulatory protein that mediates a global response to leucine. J. Biol. Chem. 266:10768-10774.

163. Wood J.M. 1975. Leucine transport in Escherichia coli. The resolution of multiple transport systems and their coupling to metabolic energy. J. Biol. Chem. 250:4477-4485.

164. Wood J.M., Zadworny D. 1979. Characterization of an inducible porter required for L-proline catabolism by Escherichia coli K12. Can. J. Biochem. 57:1191-1199.

165. Wood J.M., Zadworny D. 1980. Amplification of the put genes and identification of the put gene products in Escherichia coli K12. Can. J. Biochem. 58:787-796.

166. Yang J., Hwang J.S., Camakaris H, Irawaty W., IshihamaA., PittardJ. 2004. Mode of action of the TyrR protein: repression and activation of the tyrP promoter of Escherichia coli. -Mol. Microbiol. 52:243-256.

167. Yen M.-R., Tseng Y.-H., Simic P., Sahm H., Eggeling L., Saier M.H.J. 2002. The ubiquitous ThrE family of putative transmembrane amino acid efflux transporters. Res. Microbiol. 153:19-25.

168. Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Tokmakova I.L., Troshin P.V., Livshits V.A. 1999. The novel transmembrane Escherichia coli proteins involved on the amino acid efflux. FEBS Lett. 452:228-232.

169. Zeppenfeld Т., Larisch C., Lengeler J. W., Jahreis K. 2000. Glucose transporter mutants of Escherichia coli K-12 with changes in substrate recognition of IICB(Glc) and induction behavior of the ptsG gene. J. Bacteriol. 182:4443-4452

170. Zhi J., Mathew E., Frudlich M. 1999. Lrp binds to two regions in the dadAX promoter region of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 32:29-40.

171. Zhou A., WozniakA., Meyer-Lipp K„ Nietschke M., Jung H., Fendler K. 2004. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E. coli. J. Mol. Biol. 343:931-42.

Информация о работе

Кутукова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Изучение генов, кодирующих белки семейства RhtB у Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы