Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействий бактериальной РНК-полимеразы с ингибиторами пептидной и непептидной природы

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействий бактериальной РНК-полимеразы с ингибиторами пептидной и непептидной природы"

003469917

На правах рукописи

Павлова Ольга Андреевна

Изучение взаимодействий бактериальной РНК-полимеразы с ингибиторами пептидной и непептидной природы

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

1 4 мдц 2003

003469917

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Северинов Константин Викторович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Гельфанд Михаил Сергеевич кандидат биологических наук Кульбачинский Андрей Владимирович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт белка

РАН

Защита диссертации состоится 4 июня 2009 года в ' ' часов на заседании

//

Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова д.32.

Автореферат разослан _]_ мая 2009 года

Ученый секретарь диссерт;

канд. фарм. наук

Л. С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) - это центральный фермент транскрипции ДНК. Для бактериальной РНКП детально изучено довольно мало низкомолекулярных ингибиторов. Изучение действия таких ингибиторов позволит углубить наши представления о механизме действия РНКП и разработать антибактериальные препараты, которые могут быть использованы на практике. На сегодняшний день только один ингибитор РНКП, рифампицин, и некоторые его производные нашли применение в медицине, как ключевые компоненты при лечении туберкулеза. Данная работа посвящена изучению трех ингибиторов бактериальной РНКП: микроцина .125, сорангицина и gp79. Нами было показано, что сорангицин, полиэфирный антибиотик, продуцируемый микобактерией Sorangium се11и1о$шп, связывается с РНКП там же, где и рифампицин. Основной проблемой при терапевтическом использовании рифампицина является быстрое появление мутаций устойчивости к этому антибиотику. Мы продемонстрировали, что благодаря своей конформационной лабильности сорангицин во многих случаях остается нечувствителен к мутациям в р-субъединице РНКП, приводящим к устойчивости к рифампицилу. Таким образом, принцип конфирмационной адаптации, показанный на сорангицине, может быть использован как важный критерий отбора лигандов при поиске антибактериальных агентов.

Несмотря на то, что в последнее время найдено довольно много новых ингибиторов РНКП как синтетических, так и продуцируемых различным организмами, микроцин Л25 представляют особый интерес. Микроцин Л25 - это пептид, приобретающий в результате посттрансляционных модификаций необычную структуру: первые 8 аминокислотных остатков микроцина .125 замкнуты лакгамной связью в кольцо, в которое продет С-концевой хвост пептида. То, что в отличие от других известных ингибиторов РНКП, микроцин .125 кодируется ДНК и синтезируется рибосомами, позволяет применить молекулярно-генетические методы для получения самых различных его производных. Изучение этих производных (мутантных микроцинов): определение их активностей и установление их структур - позволяет получить новые данные о процессе созревания микроцина, о его действии на РНКП, а также о структуре самого фермента-мишени. В данной работе были получены точечные мутации в гене, кодирующем микроцин Л25. Полученные мутации приводят ко всем возможным заменам в каждом положении зрелого

микроцина J25. Биохимический и микробиологический анализ мутантных микроцинов позволили определить влияние замен аминокислотных остатков на созревание микроцина J25, его способность ингибировать рост чувствительных клеток и способность ингибировать транскрипцию. Оказалось, что, несмотря на малые размеры и сложную структуру микроцина J25, лишь треть замен препятствует созреванию зрелого микроцина J25 и его действию на РНКП. В ходе работы были получены производные микроцина J25 с повышенной активностью и расширенным спектром действия. На основании полученных данных возможно дальнейшее выведение производных микроцина J25 с желаемыми свойствами.

Бактериофаги - это модельные организмы, изучение которых заложило основы современной молекулярной генетики и молекулярной биологии. В ходе развития в клетке бактерии-хозяина фаги должны ингибировать экспрессию генов бактерии-хозяина и обеспечить правильный временной контроль экспрессии генов. Контроль экспрессии генов хозяина и бактериофага осуществляется с помощью разнообразных факторов, закодированных в геноме бактериофага и действующих на аппарат транскрипции бактерии-хозяина. Таким образом, изучение кодируемых бактериофагами ингибиторов хозяйской РНКП тесно связано с изучением механизмов временной регуляции транскрипции фаговых генов. Данные о таких ингибиторах не только расширяют знания о конкретном бактериофаге, но и открывают новые механизмы регуляции транскрипции у бактерий. На сегодняшний день становится ясно, что генетическое разнообразие бактериофагов, инфицирующих Е. coli ограничено. Геномы большинства известных ДНК-содержащих фагов Е. coli напоминают геномы Т4, X или Т7. Недавно охарактеризованный бактериофаг РЫ32 существенно отличается от этих фагов. На этом основании мы предполагаем, что РЫ32 использует новые и, возможно, уникальные механизмы регуляции экспрессии генов. В третьей части работы было показано двойственное действие белка gp79: с одной стороны, это ингибитор хозяйской РНКП, а, с другой, он активирует транскрипцию РНКП с ст-фактором gp36 бактериофага. Эти результаты вместе с полученными данными о временной экспрессии генов Phi32 и о функции закодированного в геноме РЫ32 <т-фактора позволили предложить общую схему регуляции транскрипции в ходе инфекции этим новым бактериофагом.

Цель работы и задачи исследования. Целью данной работы было изучение взаимодействий с бактериальной РНК-полимеразой трех ингибиторов этого фермента: микроцина Ш, сорангицина и белка бактериофага РЫ32. В работе были поставлены следующие задачи:

1. провести структурно-функциональный анализ микроцина Л25 с предсказанием позиций микроцина, важных для созревания антибиотика, для ингибирования РНКП и для входа в бактериальную клетку;

2. изучить механизм действия сорангицина на бактериальную РНКП;

3. изучить механизм действия 8р79 на РНКП и роль белка gp79, а также gp36 во временной регуляции экспрессии генов бактериофага РЫ32.

Научная новнзна и практическая ценность. В работе была создана полная коллекция плазмид, кодирующих мутантные микроцины ¡25 с единичными заменами аминокислот, определены позиции микроцина .125, важные для созревания антибиотика, его транспорта в клетку и ингибирования РНКП. Впервые был обнаружен ряд производных микроцина 125 с повышенной и расширенной антибактериальной активностью, ставших основой для патента. Во второй части работы был показан механизм действия и место связывания сорангицина с РНКП, было продемонстрировано, что сорангицин обладает конформационной подвижностью, позволяющей ему адаптироваться к изменениям в месте его связывания с РНКП. В третьей части работы было установлено действие нового ингибитора транскрипции «р79 бактериофага РЫ32. Результаты работы показывают, что микроцин Л5 и его производные могут быть использованы для разработки новых антибактериальных веществ с повышенной активностью и расширенным спектром действия. Проблемой разработки новых антибактериальных агентов, могущих дополнить или даже заменить антибиотики, к которым слишком легко возникает устойчивость, сейчас занимаются многие группы исследователей. На примере сорангицина показано, что конформационная подвижность ингибиторов позволяет преодолевать устойчивость за счет мутаций в центре связывания мишени. Таким образом, принцип конформационной адаптации можно использовать для отбора более эффективных ингибиторов РНКП бактерий.

Публикации н апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 1 патент. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Waksman Institute Annual Poster Session and Competition (New Brunswick, USA, 2004); Biannual meeting on post-initiation activities of RNA polymerase (Mountain Lake, USA, 2004); 7" международная конференция памяти В. А. Энгельгардта по молекулярной биологии (Суздаль, Россия, 2004); International Union of Microbiological societies 2005 annual meeting (San Francisco, USA, 2005); 20th Anniversary RNA Polymerase Workshop (London, England, 2008); Cold Spring Harbor Meetinmg on Molecular Genetics of Bacteria & Phages (Cold Spring Harbor, USA, 2008).

Структура n объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает //^источника. Работа содержит рисунка и таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА 1. Структурно-функциональный анализ микроцина J2S

Получение коллекции производных микронина J25. Исчерпывающим сайт-специфическим мутагенезом части гена mcjA, которая кодирует зрелый микроцин J25, в кодоны, кодирующие положения 1-7 (кольцо) и 9-21 (хвост) зрелого микроцина J25 (Рис. 1), были введены мутации, приводящие ко всем 19 возможным аминокислотным заменам. Единственным аминокислотным остатком, который не подвергался исчерпывающему мутагенезу, был Glu8, так как он участвует в образовании лактамной связи, ключевой для структуры "протянутое лассо". Вместо этого была сконструирована единственная плазмида с мутацией, приводящей к консервативной замене Glu8 на Asp. Таким образом, была создана коллекция из 381 мутантной плазмиды. Каждая мутация, а также отсутствие других мутаций, были подтверждены секвенированием соответствующего участка плазмиды.

связь

Рисунок 1 Структура микроцина J25 (l'DIi фаПл IQ71 Кольцо показано синнм (первый и восьмой остатки и лактамиая связь ыежду Егнмт h зеленым (со ьтиросо [то седьмой остатки) цветами. Хвост сюкй'йи жедтым (с девятого по восемнадцатый II ДШЩЦй гьггерный остатки), красным {Леня i пддцатып остаток, замок plie 19) И poSûfibiM двадцати достаток. замок Тут2С1

Мутации в reite mcjA, влияющие ira продукцию мнкрацпна J25 Первым этапом анализа коллекции клеток, несущих плаэмиды с кластером генов mcjA ВСD с мутациями в гене mcjA. был масс-спектрометрический анализ кулиуральных сред. Этот анализ позволил определить, продуцируется ли то или иное Производное микроцина. Продукция в данном случае включает в себя синтез предшественника микроцина. созревание предшественника, экспорт зрелою мутаитного микроцина и eco стабильность

Наши данные покалывают, что 60% от веех возможных производных микроцина J25 (242 из 3Í> I) продуцируются : в этих образцах мы наблюдали на епектре пики, совпадавшие с теоретически рассчитанной массой зрелых производных (Рис 2). Физико-химические свойства аминокислот не позволяют сделать выводы о причинах, по которым аминокислота в конкрет ной позиции может или, напротив, не может быть заменена.

л л A —7

— л - ■ — с 1) с D С D С —- —

с A E E E D

ï> А * С t ? F E л —4 A

E с с D G I< C, F E С

с F Е F E H { H H F A E

H с F — С Q 1 К К К 0 E F

1 к I К G H A H ! 1[ 1 к L L M L M 1. M H 1 F H H К Г— A

L л M t С К L M N N N К [ L л D

M □ N !. F L M N F F e L К M с D t

р F Т M 0 M N F Q Q Q M M N D И К

0 H R N r N 0 Q R R R S I> E M N

я к S R L Q R R S S S p R Q M 0 0

s R т S N s S S T T r 0 S В N R R

т S V T S T T T V V V s T T 0 S __ S

V T W T V V w W w w w V V R w [71 V

V <3 V V V w w V ¥ Y V VI V T v 1 V

С G AGHVPEYfVO t G T Г I S F V с

i г з л s t 7 a > !l il u H H » u n u и 2« ii

PHCyHOX 2. Мутации в ГСИС ".О i ЙЛНЧЮ1Ц11С НИ продукцию ЧИЧрОШПГа КИНТСЧ ПрСДШССТВСННИКа микропика.

j."-ipL-P:niпредшественника, "к"."торт зредлго иутштюто микроцина и cftf стабильность). На рисунке приведены данные по 381 производному мнкрпцкна J25. Bhhîj приведена аминокислотная 11 i : сю " ; li i': i. ■. ■. к: т :, v i кгкч :i J25. Высота столбцов соответствует доли (в процентах) производных ымкроцинз по данной позиции, кегторые продуцируются от общего количества возможны* замен. Il к к | : внутри столбца соответствуют аминокислотным остаткам. замена на которые не препятствует продукции Серый столбик над позицией S показывает, что замены згой позиции не уплывали при анализе (объяснении в тексте).

То, что настолько существенное количество производных микроцина J25 созревает и экспортируется в кульзуральную среду, является очень неожиданным результатом, учитывая маленькие размеры пептида и сложность сто структуры На основании полученных результатов можно предположить, что ферменты посттрансляционного процессинга микроцина J25. MçjB и McjC не высоко специфичны С точки зрения структурного анализа мнкроцина J25, очевидна важность остатков, участвующих в образовании лактамной связи, а также остатков, запирающих хвост микроцина J25 в кольце, для созревания. Причем Туг20. не позволяющий хвосту выйти из кольца, должен быть важнее Phel9. не дающего хвосту продвинуться дальше в кольцо Полученные нами данные полностью подтверждают сделанные предположения Анализ влияния мутаций в гене mcj на созревание микроцина 125 показал большую важность аминокислотных остатков в позициях, близких к сайту протеол ити ческо го процессинга предшественника

х

микрицнна J25. близких к месту образования лакгамной связи и к замку, запирающему хвоит микроцнмв S25 в кольце Остатки Gly 1, G!y2. GluS и, я меньшей степени. Туг20 строго необходимы для созревания мнкрощша J25, а почти половина замен I'tiel9 не влияет на созревание. Аминокислоты в позициях 11-14 ев важны для проекции Ранее сходный вывод в отношении лих позиций был получен при изучении химически модифицированного (Mukhopadhyay ei в!.. 2004) к частично расщепленного микроципа J25 (Semenova el а)., 2005) соответственно Из рисунка 3 »идио. что различные ло важности для созревания остатки расположены на структуре микроцииа J25 не дискретно, а четкими группами Gly!, Gly2, Gluü и Туг20 вместе образуют компактную зону на молекуле микрицнна (на рисунке 3 эта зона показана черным) Возможно, ферменты посттрансляционной модификации одновременно взаимодействуют с чтя ми четырьмя важный» остатками Остатки IJ-J4 оказавшиеся неважными для созревания, находятся на

конце петдн, образованной хвостом.

сннгезаУсоэрСйвгшя/зкс порта/стаоил kitocri! никрещана I5 красиы.ч покэ i.tMi.i позиции, важные для ищ ийнроааиия РНКГТ.

Рисунок 3. Структура MHtfpomlifa J25 (стерео ПрСДСЛВЛСННв|, Черным ПОКаллиЫ ПОЗИЦИИ, наиболее важные длн

Мутации в гене mcj.A, влияющие на ннгпбнрованме РНКП. Все продуцируемые производные микроцина J25 были поверены на способность ингибировать РНКП Е. coli in vitro. Супернатанты культуральных сред клеток, несущих плазмцды с кластером генов mcjABCD с мутациями в гене mcjA, добавлялись в реакцию абортивной инициации транскрипции. Результат такого теста может отражать не только активность производного, но и то, какое количество этого производного продуцируется, поэтому мы считаем in vitro тест качественным, но не количественным.

Из 242 продуцируемых мутантов 155 (64%) ингибировали РНКП (Рис. 4). Туг9 определенно играет существенную роль в ингибировании РНКП (и, соответственно, в связывании микроцина с РНКП), так как ни один из 15 созревающих мутантов по этой позиции не ингибирует транскрипцию in vitro. Возможно, Туг9 специфически взаимодействует с РНКП. Позиции 4, 7, 10, 17 и 19 также важны для ингибирования РНКП, так как от 50% до 94% созревающих замен по этим позициям приводили к потере активности ш vitro активности. Среди этих позиций Phel9, один из замков, запирающих хвост в кольце, может быть заменен на химически сходные Туг и Тгр без потери активности. Мы считаем, что эти шесть аминокислотных остатков (9, 4, 7, 10, 17 и 19) участвуют в прямом взаимодействии микроцина J25 с РНКП. В немодифицированном микроцине J25 эти остатки гидрофобны, три из них ароматические, это позволяет предположить, что взаимодействия микроцина J25 с РНКП, в основном, гидрофобные. Интересно, что по результатам структурного анализа остатки микроцина J25, наиболее важные для ингибирования РНКП (9, 10, 4, 7, 17 и 19) образуют непрерывную область, опоясывающую микроцин (Рис. 3).

Аминокислоты в позициях 11-15 не важны для ингибирования РНКП, что согласуется с полученными ранее данными о делеции, замене и модификации этих остатков без потери активности (Mukhopadhyay et al., 2004; Semenova et al., 2005).

□

¡—1

А А -

С А С

Е С О

Р Н Г с Е Г

Л I н И

с к к к —

Е 1.

? м м м А

0 N N N р

1 И Р р С1 Л

ь (5 0 11 Е Г А

м К К К ь ] н |> —' О

1 N £ 5 5 м К и Е Р

м 0 т т т N О м м К

К т V V V о К г 0 N

* * (V » т т К Л

* V V V V * V V т У г V

Л С Н V Г Е У Г V в 1 О Т » 1 5 3 * 9 < IX 9 10 II II и 14 15 К 17 II

Г V С

1* м 11

Рисунок 4. Мутации ь гене япняюшие на ннгийировдпне РНКП I рксунке приведены данные по 242 производным мнкроцика, которые созревают Внизу приведена аминокислотная последовательность м.',кропи на 125. Высота столбцов соответствует донн (Б процентах). ::;кя ии|;лы\ мм кропи из по данной позиции, которые нигибнруют РНКП от общего количества оозревакхднх производных по этой позиции, [г. И.и внутри столбца соответствуют аминокислотным остаткам, замена на которые не мешают ннгнбированню РНКП Сери с столоны над позициями I. 2, И показы вою г, что замены этик позиций не >ч'(,-пип,1|н при анализе ..ми.яснения ц рэкете).

Мутации в гене тс/А, влияющие на иигиКированне роста бактерий. Вес

продуцируемые производные микрошша. иягибирующие РНКП. были проверены на способность ингибировать рост чувствительных бактерий 45% от общего числа Производных (70 из 155) ингибировали рост бактерии (Рис. 5), что позволяет сделать вывод о том, что зги производные способны проникать в бактериальную клетку

Шесть аминокислотных остатков микроцкна .125 (4, 7, 9, 10, 19. 20) строго необходимы для проникновения в бактериальную клетку - ни одно нз созревающих производных по этим позициям, ингибировавшнх РНК"[ I, не обладало антибактериальным действием Как н в случае с созреванием, нам не уддлось понять, почему конкретная замена влияет иди не влияет на антибиотическую активность

п

—

*

с

F

с А

н F

L G

M И

« С L

г И M

II Q N

т S Q

V т S

W V w

Е V F V И 9 10 II

GICTÎISFVC Il И 14 15 It It 18 If 2* 21

Рисунок 5. Мутаций в тепе тс;А. влияющие на Р1Г:Г';[>НН!': роста бактерий. На рисунке приведены данные по 155 производим мнкроцина Ш. которые спивают и действуют на РНКП Внизу приведена аминокислотная последовательность мнкроцина J25. Высота столбцов соответствует доли je npouein-ax) производных мнкроцина по данной позиции, которые подавляют рост бактерий от количества производных по УГоЙ ПОЗИЦИИ, которые созревают H I'll: нбнр} кп РНЬСП. Жирным шрифтом выделены замены, приводившие к повышенной антибактериальной активности. Серые столбцы кал позициями 1. 2. в, ' показывают, 'гго замены ITI'V позиций не учитывали при анализе (объяснения в тексте).

Активность 37 производных была сравнима с активностью михрешина J25 или ниже ее, а двенадцать производных с заменами 13-го или 15-го аминокислотных остатков были более активны (на рисунке 5 они показаны жирным шрифтом). Различная степень активности производных в нашем тесте может отражать как степень антибактериальной активности, так и количество производимого мутантного микроцина Представлялось важным определить истинный уровень активности 'более активных мутантов". Для этого один из таких мутантов с заменой Тгр15 на Gly (T!5G). стабильно обладавший повышенной активностью я нашем тесте, был очищен, и его антибактериальная активность была сравнена с активностью аналогично выделенного микроцина J25 T15G оказался более активным как против нескольких чувствительных штаммов Е coli, так и против штамма Shigella {Таблица 1). Однако поскольку активность T15G против РНКП in

vitro была сравнима с активностью микроцина J25, увеличение антибактериальной активности, видимо, обусловлено увеличением эффективности проникновения в клетку.

Таблица 1. Ингибироваине роста бактерий производным микроиина J25 T15G

Вещество Диаметр зоны ингибирования (мм)"

К. coli DH5a Shigella flexncri В О 12440

Микроцин 125 3 ± 1 8 ± 1.5

T15G 9 ± 1 13 ±1.7

"Данные по результатам трех независимых экспериментов с указанием стандартных отклонений. ГЛАВА 2. Изучение механизма действия сорангицпна на бактериальную РНКП

Влияние сорангицнна на транскрипцию РНКП Escherichia coli и Thermus aquaticus. Первым этапом в установлении механизма действия сорангицина было сравнение действия антибиотика с действием рифампицина. Как сорангицин, так и рифампицин эффективно ингибировали синтез с промотора Т7 А1 РНКП Е. coli (Рис. 6). В отсутствии антибиотиков РНКП синтезирует полноразмерный транскрипт (ПП, 127 нт.) и продукт терминации на терминаторе tR2 (ПТ, 105 нт), а также два продукта абортивного синтеза (CpApU и pppApU). При концентрациях, превышающих 1 мкМ (дорожки 5-8 и 13-16 на рисунке 6), оба антибиотика полностью ингибировали синтез ПП и ПТ, одновременно с этим количество абортивных продуктов возрастало. При самой высокой концентрации сорангицина (1 мМ) количество абортивных продуктов уменьшалось (дорожка 16), предположительно, из-за неспецифического ингибирования транскрипции.

В отличие от действия на РНКП Е. coli, действие антибиотиков на РНКП Г. aquaticus отличалось между собой. Оба антибиотика по-прежнему ингибировали синтез ПП и ПТ, одновременно с этим количество абортивных продуктов возрастало. Однако рифампицин действовал на РНКП Т. aquaticus значительно слабее, его эффект проявлялся только при концентрациях 0.1-1 мМ (дорожки 23, 24). При этом сорангицин действовал на фермент Т. aquaticus так же эффективно, как на РНКП Е. coli (дорожки 28-31). Эти

факты подтверждают предположение о том, что механизм ингнбирования РНКП анткбио I г. хам и одинаковый, а взаимодействие антибиотиков е ферментами отлично

Ичкп Exoti "Г dquaffcus

Ингибитор Рмфлмпицнн Сорангицин Рифампицим Сорангицин

Имгибнтор (MKMJ, ollS-slt . 113 - я § | „¡Sis.sH Hs => s§

m АЪортинныс

ПРОДУКТ^ -

1 г з 4 £ 6 т а э to г г тг тз и 15is 17 10 го гг гдг* zs ге -¿тш гз за зг зг

Рисунок 0. Влияние рифамииаила а соравпщкпа На транскрипцию ¡'I iKI! . coli (дорожки 1-10) и ' aquatiais (дорожки ¡7-32). Холофермегтт РНКП синтезирует с чатриаы. содержащей ттро\иугор T7 AI и терминатор I:<' Прецста&лен радиоавтограф результатов разделения продукта транскрипции в 20% ГГААГ.

Анализ перекрестной устойчивости производных РНКП к рнфампицину н сорангицину. Дли дальнейшего уточнения сходств и различий мест связывания сорангицииа и рифамгщцкка мы проанализировали коллекцию производных РНКП, устойчивых к рифамлнцину за ечет мутаций а rpoß гене, на устойчивость к сорангицину Чувствительные к обоим антибиотикам клетки были протран сформированы плазы идам и, экспрессирующими описанные выше производные Такие клетки высевались параллельно на чашки с линейными градиентами рифаммнцина и сорангицииа (от ü до 50 мкг/мл). Результаты этого полу количестве иного теста представлены в таблице 2. Клетки, экспресс ирукзщие J)-субъедин нцу дикого тина прекращали рост при концентрации рифампицнла около 7.5 мкг/мл; эти же клетки прекращали рост при концентрации сорангицииа около 15 мкг/мл. Поскольку m vitro для иигибирования РИКГ1 Ii. coli требовались одинаковые концентрации антибиотиков, мы заключили, что сорангицииа проникает в клетки хуже, чем рифампицин. Поскольку влияние мутаций изучалось на

14

ферменте Е. coli, а дальнейший структурный анализ проводился на ферменте Т. aqualicus, я буду указывать сначала номер, соответствующий позиции в РНКП Е. coli, а следом в РНКП Т. aquaticus. По результатам анализа мутации в гене гроВ можно разделить на две группы.

К первой группе мы отнесли замены, приводившие к устойчивости к обоим антибиотикам в одинаковой степени. Например, замена His526/406 на Pro приводила к высокому уровню устойчивости как к рифампицнну так и к сорангицину, а замена этого же His на Gin приводила к среднему уровню устойчивости к обоим антибиотикам. В первую группу попало большинство мутаций (17 из 25 проверенных).

Вторая группа включает в себя мутации, приводившие к высокому уровню устойчивости к рифампицнну, но не к сорангицину. Например, замена Ser 531 /4 И на Туг.

Поскольку мы использовали коллекцию мутантов, изначально отобранных на устойчивость к рифампицнну, нельзя исключить возможность существования дополнительных мутаций, приводящих к устойчивости только к сорангицину. Тем не менее, полученные данные указывают на то, что места связывания антибиотиков, по-видимому, пересекаются, но не совпадают.

Таблица 2. Влияние аминокислотных замен в ß-субьединице РНКП на устойчивость к рифампицнну и сорангицину

Мутации (Е. í-oWT. aquaticus)* рифямпнцин сорангицин группа

Единичные замены Дикий тип V(146/137)W

S(5I2/392)P D(516/396)N S(522/402)F H(526/406)Y H(526/406)P H(526/406)Q R(529/409)1I R(529/409)L R(529/409)C S(531/411)F S(531/411)Y A(532/412)V

15

++ + II

++ ++ I

++ ++ I

++ ++ 1

++ ++ I

++ ++ I

+ + I

++ + II

+ + I

++ + II

++ - II

++ + II

А(532/412)1-: + + I

Ц533/413)Г -и- - II

С(534/414)1) + - ||

1(572/452)К ++■ - II

Множественные замены или делешш

Я(687/Т566)Ц

У(137/128)/1(138/129Ж

1Ч(139/130)ОЖ(143/134)\¥

N(I39/130)K/R(143/134)W

У(144/135)1Л(145/136)Я + + I

Д540-544/420-424

Д538-54(Ю418-420

Д538-542/415-422 + + I

л мутации, приводившие к разным уровням устойчивости к рифампицину и сорангицииу, выделены жирным шрифтом; результаты представлены в виде: «-» - нет устойчивости, «+» - средний уровень устойчивости, «++» - высокий уровень устойчивости 6 группы I, II описание в тексте

1 некоторые мутанты не были устойчивы к рифампицину в нашем тесте из-за выбранного нами времени инкубации - 24 часа, при 48 часовой инкубации была видна слабая устойчивость к рифампицину.

Структура комплекса РНКП с сораш ицнном. Для окончательного определения места связывания сорангицина с РНКП были получены кристаллы кор-фермента РНКП Т. aqitaiicus с сорангицином. Кристаллы РНКП-сорангицин были изоморфны кристаллам РНКП и имели область повышенной электронной плотности в кармане связывания рифампицина. Ранее установленная структура сорангицина (Jansen et al., 1989) без труда была наложена на область повышенной электронной плотности (Рис. 7). Структура комплекса РНКП-сорангицин показала, что сорангицин действительно связывается в том же кармане и взаимодействует со всеми остатками, с которыми взаимодействует рифампицин. Эти данные согласуются с описанными выше биохимическими данными по первой группе мутантов - замена остатков, взаимодействующих с антибиотиками, приводила к сходному для двух антибиотиков уровню устойчивости.

[

Рисунок 1. Структур?, сорангицина, связанного с РНКИ & сравнении с рнфампицином. (Л) Сорангицин, .'.ямКНЫЙ в кармане РНКП Т. вфШНСН.ч (стерео представление! Голубьтм цветом выделены атомы углерода р-субъсднннцы РНК П. зеленым - атомы углерода сорангицина. красным - кислород, синим ■ азот, желтым сера. (К) Вид на карман Р1Ш [. в котором связываются сорангипнн и рифампнпин. РНК1! выделена синим цветом, кроме той ее части, которая нахол(зтся в непосредственной близости от сорангицина (4Л) - она окрашена к же.тткгй : IНа структуру РНКП наложены структура сорангицина (атомы утлерода покатаны зеленым) и структура рифампицина (атомы углерода показаны желтым),

Механизм ннгийировання РНКИ сорангншшом. И биохимические, и структурные данные однозначно указывают на то. что механизм действия сорангицина идентичен механизму действия рифампицина. те сорангицин, связываясь в кармане р-рубъединнцы РНКП. стерически блокирует синтез РНК. длиннее, чем 2-3 нуклеотида

Конформацнонная мобильность сорангнонна. Г1о структурным данным мутации, попавшие в результате биохимического анализа во вторую группу, должны бы были стсричееки предотвращать связывание антибиотиков с ферментом Это справедливо для рифампицина. но не для сорангицина Несмотря на то, что замены V146/1371. 5531/41 ЕР. Я531 /41IV, 0534/414Р. 1572/452Г вводят крупные боковые цепи в карман связывания рифампицина и сорангицина. они приводят к ожидаемой устойчивости к рпфамницину, но не к сорангицину Эти данные указывают на то. что рифампицин чрезвычайно чувствителен к изменениям формы кармана, а сорангицин обладает определенной структурной лабильностью, позволяющей е.му алаптнроватся к изменениям

Для получения дополнительных данных о конформационных мобильностях антибиотиков, возможности их конформаиионньв изменений были сравнены биоинформатическим методом симуляция молекулярной динамики. Различные возможные конформации для каждого антибиотика были наложены друг на друга и сопоставлены с исходной конформациеЙ (Рис 8) Все конформации рифампицина были

близки к исходной, а среди конфирмации сорангицина Омни конфирмации, сильно отличающиеся и исходной. Таким образом, бноинформетические данные подтверждают предположение о возможности коиформациоиной адаптации сораигицина к изменениям в месте его связывания с И Nil I

Рисунок К. Ко информационная подвижность рифачннцина (А) и сорангицина (Б). Исходные коиформацни показаны оранжевым (ршфанпнцнн) и светло зеленый (сораыгицин). Возможные конформаани покюаны более тонкими линиями а более темным настом.

ГЛАВА 3. Изучение роли белков ур7У и црЗб во временный рнулнцин бактериофага Phi32.

13 ходе аннотации нового бактериофага РЫ32 выяснилось, что продукт гена 36 фага гомологичен LCI (extracytoplasmic I'aclur) подсемейству семейства с7"-факторон Для определения того действительно ли урЗб действует как а-фактор, PI IK! [ из клеток Я соН сравнили с PIIKII из таких же клеток, зараженных Р1и32 Элекгрофоретический и масс-спектрометрический анализы показали, что два белка бактериофага Pi) i32. gp36 (26кДа) и gpT^ (I ОкДа), обнаруживаются в препаратах РНКП. выделенных из зараженных клеток Таком образом, зги белки, возможно, связываются с хозяйской РНКП и регулируют транскрипцию генов фага.

Белки цр7У и «|iJ6 св(сзываются с РНКП in vitro. Методом наивного гель-эле ктро форс за вами показано, что рекомбинантный белок gp3o действительно

связывается с кор-ферментом РНКП, а рекомбинантный белок gp79 связывается как с Кор-фермсигом. так и с холоферлтентом

Gp7? ннгнбирует абортивную транскрипцию <т 'хо.юфер мента РНКП Для определения активности gp79 было проверено его действие на транскрипцию in vitro Влияние ер7*) изучали в реакции абортивной инициации транскрипции на матрице, содержащей промотор Т7 AI На этом промоторе ff-холофермент синтезирует абортивный продукт CpApU с затравки С'рД и "Р|УТФ Синтез CpApU в присутствии ср79 ингнбнронался (Рис 9) Полученные в наuiей лаборатории данные указывают на то. что gp79 ингибирует РНКП по механизму, отличающемуся от ранее описанных механизмов ингибировання бактериальной транскрипции. Детали этого механизма устанавливаются в настоящее время

Нлми было сделано предположение, что биологическая роль £р79 заключается в ингибировании хозяйской транскрипции на поздней стадии развития бактериофага, те gp79 мог бы участвовать в переключении транскрипции с хозяйских генов и ранних генов бактерно(|к1га на средние и поздние гены бактериофага

Рисунок 9. Gp79 ннгийнруст синтез абортивного крошукта с "-ходофермептоы РНКП, Показаны продукты [1 борта СПОЙ транскрипции к отсутствии -: И присутствии I I I ]р£ДСГ8ЬЛ'.'Ц

радиоавтограф ПААГ

Исследование временной чкспрссснн генон баь-тернофига I'hi32. Для

дальнейшего выяснения биологической роли gp79 и gp36 мы исследовали временную экспрессию генов бактериофага методом дот-гибридизации. Клетки Е. coli заражали Phi32 и останавливали инфекцию на 5, 10, 25 и 35 минутах Присутствие пиков концентраций PI [К различных генов в различных временных точках подтверждает наличие у РЫ52 трех временных классов генов Результаты полного анализа временной экспрессии генов бактериофага Pfn'32 представлены на рисунке (0 На этом рисунке на геноме бактериофага цветом обозначена принадлежность генов к временным классам. При отборе генов для нанесения на мембрану руководствовались тем. чтобы отобранные гены были равномерно

распределены по геному л предпочтительно находились в начале оперона На рисунке 10 ли гены окрашены темно красным, темно зеленым к темно синим цветом. Гены, не представленные на мембране, относили к тому или иному временному классу на основании расположения к одном опероне с генами, нанесенными на мембрану. Они покачаны более светлым опенком соответствующего цвета

р » и й «I и .„ _и ^ а Д'1^ та

П

ЦП Л Л м II и 1}

f М ИГ «/ 1Н I» ,'М И7 Ш

«2?

ш » я « п им н н я п |н лиюлалм ни юими»

/а ни «л гд 1

да «I да !Н _ да

р нрииш«^ у Ли

Рисунок 10. Геном бактериофага РЫ32. Стрелками показаны предсказанные открытые рамки считывания, их направление соответствует направлению транскрипции гена 8 геноме. Цветом обозначена принадлежность гена к временному классу: красным - поздние гены, зеленым - средние и синим - ранние. Более темным оттенком окрашены гены, которым соответствовали пробы, нанесенные на .мембрану. Более светлым оттенком показаны гены, не представленные на мембране, но отнесенные к тому или иному временному классу на основании расположения в одном опероне с генами, которым соответствовали пробы, нанесенные на мембрану. Стрелками обозначены промоторы, синим - промоторы, узнаваемые РНКП-о ". красным -узнаваемые РНКП-£р36.

Холофермент дрЗб-РНКП узнает промотор бактериофага 1*11132 в присутствии £р79. Следующим этапом работы было установление про моторной специфичности а-фактора gp36 Холофермент §р36-РНКП не синтезировал транскрипт с матрицы с промотором Т7 А1 - сильным промотором, узнаваемым а7"-холоферментом РНКП (данные не показаны) Нами была изучена способность gp36-xoлoфepмeитa

транскрибировать фрагменты ЛИК. соответствующие межгенным участкам генома Phi32. Оказалось, что в области перед геном 68 находится промотор, узнаваемый грЗб-РНКП В присутствии транскрипция этого промотора активировалась о '"-холофермент РНЫТ тгот промотор не узнавал Методом реакции удлинения прайм ера с использованием РНК, выделенной из зараженных клеток было показано, что определенный нами промотор PHKO-jip.íft активен /л vivo и является поздним промотором

Дополнительные промоторы бактериофага i'h¡32, узнаваемы« ррЗб-РНКП. На

основании данных о промоторе перед геном 6tS 6 но ни форм атичес Ким и методами был предсказан ряд промоторов, узнаваемых урЭй-PHKN Четыре промотора были подтверждены экспериментально /и г/то методом удлинения прайм ера На основании последовательностей перед подтверждённым и стартами транскрипции ¡¡рЗб-РНКП (для генов 6, 53. 40, 58 и 68) был выведен консенсус промоторной последовательности, которую узнает холофермент gpjft-PHKII (Рис 11).

11-

oJ „

ДАТ ТАтА

míüt^íüCíO-»-«« -я

«

GGAGGC ТТТТ Т GT GTTGTTG A TAATG TAG AAG GAG Tg

63

GTAG TAGATATGATAAC ТСТСAAATG TATATAGAGT£ 40

G TAC TGTTATC GGTATAAOCG TAATG TATAC ТАТАСД1 13

GAC CTATAC AAGCC AGTGTGTAAT GTATATT CTTTGX 58

TAGC AGAGTTTTAATAGTATC CATAATG TATAC TCCTX

Рнсунсж II. Консенсус промоторной последовательности. которую узннгг ррЗб-РНКП. Сверху показан консенсус, высота каждой Зуквы соответствует степени ее консервативности. Снизу приведены Т1уклеотилньге последователь ноет перед стартами i рйнскрнпиия генов 6. 13. 40. 58 'S на нич жирным шрифтом отменены консервативные позиции и старт трзнскрипаш (последний подчерки аа н и см).

выводы

1. Создана коллекция плазмид (381 плазмида), кодирующих мутантные микроцины 125 с единичными заменами аминокислот.

2. Определены аминокислотные позиции микроцин!" .125, важные для его созревания, транспорта в клетку и ингибирования РНКП.

3. Получен ряд производных микроцина Л25 с повышенной антибактериальной активностью.

4. Показано, что сорангицин связывается с РНКП в том же кармане, что и рифампицин, и ингибирует транскрипцию по тому же механизму.

5. Показано, что сорангицин обладает конформационной подвижностью, позволяющей ему адаптироваться к изменениям РНКП в месте связывания.

6. Показано, что £р79 ингибирует о7°-холофермент РНКП и активирует холофермент РНКП, содержащий фаговый а-фактор црЗб.

7. Определен консенсус промоторов, узнаваемых gp36-xoлoфepмeнтoм РНКП, и показано, что эти промоторы относятся к среднему и позднему классам промоторов бактериофага РЫ32.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах:

1. Pavlova. О.. Mukhopadhyay, J., Sineva, Е., Ebright, R.H., Severinov, К. (2008) Systematic structure-activity analysis of microcin ¡25. J Biol Chem. 283(37):25589-95.

2. Savalia, D., Westblade, L.F., Goel, M., Florens, L., Kemp, P., Akulenko, N.. Pavlova, P.. Padovan, J.C., Chait, B.T., Washburn, M.P., Ackermann, H.W., Mushegian, A., Gabisonia, Т., Molineux, I., Severinov, K. (2008) Genomic and proteomic analysis of phiEco32, a novel Escherichia coli bacteriophage. J Mo! Biol. 377(3):774-89.

3. Павлова. О. А., Северинов, К. В. (2006) Постгрансляционно-модифицированные микроцины. Генетика. 42(12):1636-46.

4. Campbell, Е.А., Pavlova. О- Zenkin, N., Leon, F., Irschik, H., Jansen, R., Severinov, K., Darst, S.A. (2005) Structural, functional, and genetic analysis of sorangicin inhibition of bacterial RNA polymerase. EMBOJ. 24(4):674-82.

1. Severinov, K., Pavlova. Q„ Sineva, E., and Ebright, R Mutational derivatives of microcin J25. US Patent number 7,442,762. Тезисы конференций:

1. Pavlova, P.. Mukhopadhyay, J., Sineva, E., Ebright, R., Severinov, K. (2008) Systematic structure-activity analysis of microcin J25. Molecular Genetics of Bacteria & Phages, Cold Spring Harbour, USA.

2. Akulenko, N., Pavlova. P., Severinov, K. (2008) Gene expression regulation in a novel bacteriophage phi32. 20th Anniversary RNA Polymerase Workshop. London, England.

3. Severinov, K., Campbell, E. A., Pavlova. P.. Zenkin, N., Darst, S. (2005) Structural analysis of RNAP interaction with sorangicin and rifampicin. International Union of Microbiological societies 2005 annual meeting, San Francisco, USA.

4. Pavlova. P.. Sineva, E., Ebright, R., and Severinov, K. (2004) Systematic structure-functional analysis of bacterial RNA polymerase inhibitor Microcin J25. Waksman Institute Annual Poster Session and Competition, New Brunswick, USA.

5. Severinov, K., Campbell, E. A., Pavlova, P.. and Darst, S. A. (2004) Structural, functional, and genetic analysis of transcription inhibition by sorangicin. Biannual meeting on post-initiation activities of RNA polymerase, Mountain Lake, USA.

6. Severinov, K., Nechaev, S., Pavlova. P.. Yuzenkova, U., Zenkin, N. (2004) Molecular mechanism of transcription inhibition by a peptide antibiotic Microcin J25. 7м международная конференция памяти В. А. Энгельгардта по молекулярной биологии. Суздаль, Россия.

Патент:

Отпечатано в типографии ООО НВП «ИНЭК» Тираж 60 экз. г.Москва, Ленинградское шоссе, д. 18 тел. 8(495)786-22-31

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлова, Ольга Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель работы и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность.

Структура и объем работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Бактериальная РНКП.

1.2 Ингибиторы бактериальной РНКП.

1.2.1 Рифампицин.

1.2.2 Сорангицин.

1.2.3 Миксопиронин, кораллопиронин и рипостатин.

1.2.4 Стрептолидигин.

1.2.5 Тагетитоксин.

1.2.6 Новые ингибиторы бактериальной РНКП.

Семейство ингибиторов СВК703.

СЕ23077.

Липиармицин.

1.3 Микроцины.

Микроцин 525.

1.4 Белки-регуляторы транскрипции, кодируемые бактериофагами.

1.4.1 Белок АвгА бактериофага Т4.

1.4.2 Белок вр2 бактериофага Т7.

1.4.3 Р7 - транскрипционный фактор бактериофага ХрЮ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Бактериальные штаммы.

2.2 Плазмиды.

2.3 Питательные среды и антибиотики.

2.4 Компетентные клетки и трансформация бактерий.

2.5 Выделение ДНК.

2.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.7 Сайт-специфический мутагенез гена mcjA, отбор мутантов и подтверждение мутаций.

2.8 Тест производных микроцина J25 на антибактериальную активность.

2.9 Масс-спектрометрический аиализ производных микроцина J25.

2.10 Транскрипция in vitro.

2.11 Тест на ингибирование активности РНКП in vitro производными микроцина J

2.12 Выделение и очистка микроцина J25 и его производного T15G.

2.13 Сравнение устойчивости производных РНКП к рифампицину и сорангицину.

2.14 Выделение белков gp79 и gp36.

2.15 Приготовление лизата фага РЫ32.

2.16 Заражение клеток Е. coli 55 бактериофагом РЫ32.

2.17 Выделение тотальной РНК и реакция удлинения праймера.

2.18 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.20 Дот-гибридизация.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МИКРОЦИНА J25.

3.1.1 Получение коллекции производных микроцина J25.

3.1.2 Мутации в гене mcjA, влияющие на продукцию микроцина.

3.1.3 Мутации в гене mcjA, влияющие на ингибирование РНКП.

3.1.4 Мутации в гене mcjA, влияющие на ингибирование роста бактерий.

3.2 ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ СОРАНГИЦИНА НА БАКТЕРИАЛЬНУЮ РНКП.

3.2.1 Влияние сорангицина на транскрипцию РНКП Escherichia coli и Thermus aquaticus

3.2.2 Анализ перекрестной устойчивости производных РНКП к рифампицину и сорангицину.

3.2.3 Структура РНКП с сорангицином.

3.2.4 Механизм ингибирования РНКП сорангицином.

3.2.5 Конформационная мобильность сорангицина.

3.3 ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ БЕЛКОВ GP79 И GP36 ВО ВРЕМЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ БАКТЕРИОФАГА РЫ32.

3.3.1 Белки gp79 и gp36 связываются с РНКП in vitro.

3.3.2 Gp79 ингибирует абортивную транскрипцию РНКП с а70-фактором.

3.3.3 Исследование временной экспрессии генов бактериофага Phi32.

3.3.4 ОрЗб-холофермент РНКП узнает промотор бактериофага Phi32 в присутствии gp

3.3.5 Промоторы бактериофага Phi32, узнаваемые gp36-PHKn.

3.3.6 Схема регуляции временной экспрессии генов в ходе инфекции РЫ32.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимодействий бактериальной РНК-полимеразы с ингибиторами пептидной и непептидной природы"

Актуальность проблемы

ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) - это центральный фермент транскрипции ДНК. Для бактериальной РНКП детально изучено довольно мало низкомолекулярных ингибиторов. Изучение действия таких' ингибиторов позволит углубить наши представления о механизме действия РНКП, а в перспективе разработать антибактериальные препараты, которые найдутнайдут практическое применение. На сегодняшний день только один ингибитор РНКП, рифампицин, и некоторые его производные нашли применение в медицине, как ключевые компоненты при лечении туберкулеза. Данная работа посвящена изучению трех ингибиторов бактериальной РНКП: микроцина Л5, сорангицина и §р79. Основной проблемой при терапевтическом использовании рифампицина является быстрое появление мутаций устойчивости к этому антибиотику. Нами было показано, что сорангицин, полиэфирный антибиотик, продуцируемый микобактерией Вогап&ит сеИиЬзит, связывается с РНКП там же, где и рифампицин. Мы продемонстрировали, что благодаря своей конформационнои лабильности сорангицин во многих случаях остается нечувствителен к мутациям в субъединице РНКП, приводящим к устойчивости к рифампицину. Таким образом, возможность конформационной адаптации может быть использована как важный критерий при поиске антибактериальных агентов, действующих на РНКП бактерий.

Несмотря на то, что в последнее время найдено довольно много новых ингибиторов РНКП как синтетических, так и продуцируемых различным организмами, микроцин Д25 представляют особый интерес. Микроцин .125 — это пептид, приобретающий в результате посттрансляционных модификаций необычную структуру: первые 8 аминокислотных остатков микроцина 125 замкнуты лактамной связью в кольцо, в которое продет С-коицевой хвост пептида. То, что в отличие от других известных ингибиторов РНКП, микроцин Л5 кодируется ДНК и синтезируется рибосомами, позволяет применить молекулярно-генетпческие методы для получения самых различных его производных. 5

Изучение этих производных (мутаитных микроцинов): определение их активностей и установление их структур - позволяет получить новые данные о процессе созревания микроцина, о его действии на РНКП, а также о структуре самого фермента-мишени. В данной работе была получена коллекция точечных мутаций в гене, кодирующем микроцин J25. Полученные мутации приводят ко всем возможным заменам в каждом положении зрелого микроцина J25. Биохимический и микробиологический анализы мутантных микроцинов позволили определить влияние замен аминокислотных остатков на созревание микроцина J25, его способность ингибировать рост чувствительных клеток и способность ингибировать транскрипцию. Оказалось, что, несмотря, на малые размеры и сложную структуру микроцина J25, лишь 30% замен препятствует созреванию зрелого микроцина J25 и его действию на РНКП. В ходе работы были получены производные микроцина J25 с повышенной активностью и расширенным спектром действия. На основании полученных данных возможно получение новых производных микроцина J25 с желаемыми свойствами.

Бактериофаги - это модельные организмы, изучение которых заложило основы современной молекулярной генетики и молекулярной биологии. В ходе развития в клетке бактерии-хозяина фаги должны ингибировать экспрессию генов бактерии-хозяина и обеспечить правильный временной контроль экспрессии собственных генов. Контроль экспрессии генов инфицированного хозяина и самого бактериофага осуществляется с помощью разнообразных факторов, закодированных в геноме бактериофага и действующих на аппарат транскрипции бактерии-хозяина. Таким образом, изучение кодируемых бактериофагами ингибиторов хозяйской РНКП тесно связано с изучением механизмов временной регуляции транскрипции фаговых генов. Данные о таких ингибиторах не только расширяют знания о конкретном бактериофаге, но и открывают новые механизмы регуляции транскрипции у бактерий. На сегодняшний день становится ясно, что генетическое разнообразие бактериофагов, инфицирующих Е. coli, ограничено. Недавно охарактеризованный бактериофаг РЫ32 существенно отличается от всех известных на сегодняшний день фагов Е. coli. На этом основании мы предполагаем, что РЫ32 использует новые и, возможно, уникальные механизмы регуляции экспрессии генов. В третьей части работы было показано двойственное действие белка gp79 фага РЫ32: с одной стороны, это ингибитор хозяйской РНКП, а, с другой, он активирует транскрипцию

РНКГТ с а-фактором gp36 бактериофага. Эти результаты вместе с полученными данными о временной экспрессии генов РЫ32 и о функции кодируемого РЫ32 о-фактора в транскрипции поздних генов фага позволили предложить общую схему регуляции транскрипции в ходе инфекции РЫ32.

Цель работы и задачи исследования

Целью данной работы было изучение взаимодействий с бактериальной РНК полимеразой (РНКП) трех ингибиторов этого фермента: микроцина J25, сорангицина и белка gp79 бактериофага РЫ32.

Задачи исследования:

1. Структурно-функциональный анализ микроцина J25 с определением позиций микроцина важных для созревания, для ингибирования РНКП и для входа в бактериальную клетку.

2. Изучение механизма действия сорангицина на бактериальную РНКП.

3. Изучение временной регуляции экспрессии генов бактериофага РЫ32, роли фаговых белков gp79 и gp36 во временной регуляции экспрессии генов фага Phi32 и изучение механизма действия gp79 на РНКП.

Научная новизна и практическая ценность

В работе была создана коллекция плазмпд, кодирующих все возможные единичные единичныезамены аминокислот микроцинв J25, определены позиции микроцина J25, важные для созревания антибиотика, его транспорта в клетку и ингибирования РНКП. Впервые был обнаружен ряд производных микроцина J25 с повышенной и расширенной антибактериальной активностью, ставших основой для патента (патент США 7,442,762). Результаты показывают, что микроцин J25 и его производные могут быть использованы для разработки новых антибактериальных веществ с повышенной активностью и расширенным спектром действия. Одно из производных микроцина J25, полученное в ходе данной работы, в перспективе может быть использовано как антибактериальный консервант в пищевой промышленности (неопубликованные данные). Микроцин J25 активен против патогенных штамов Salmonella, Shigella и Е. coli, включая 0157:Н7, который наиболее часто вызывает 7 пищевые отравления. Однако, микроцин J25 дикого типа устойчив к протеолитичесим ферме и гам желудка и кишечника и, таким образом, остается антибиотически активным в пищеварительном тракте, что может быть губительно для нормальной микрофлоры кишечника. Было показано, что замена глицина в положении 12 на тирозин не влияет на активность микроцина, но делает его чувствительным к желудочным протеазам. Показан механизм действия и определено место связывания сорангицина с РНКП, продемонстрировано, что сорангицин обладает конформационной подвижностью, позволяющей ему адаптироватся к изменениям РНКП в месте связывания. Эти данные демонстрируют, что принцип конформационной адаптации может быть использован как важный критерий отбора лигандов при поиске антибактериальных агентов, действующих на РНКП. Установлено ингибирующее действие нового небольшого белка gp79 бактериофага РЫ32 на РНКП Е. coli. Данные показывают, что бактериофаги могут быть использованы как источник генов, кодирующих нобые ингибн горы бактериальной РНКП.

Структура и объем работы

Диссертация изложена настраницах машинописного текста и состоит из следующих

разделов: введение, обзор литературых данных, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает источника. Работа содержит 27 рисунков и 2 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Павлова, Ольга Андреевна

1. Создана коллекция плазмид (381 плазмида), производных pTUC202, кодирующих мутантные микроцины с единичными заменами аминокислот.2. Определены позиции микроцина J25, важные для созревания антибиотика, его транспорта в клетку и ингибирования РНКП.

3. Найден ряд производных микроцина J25 с повышенной антибактериальной активностью.4. Показано, что сорангицин связывается с РНКП в том же кармане, что и рифампицйн и ингибирует транскрипцию по тому же механизму.5. Показано, что сорангицин обладает конформационной подвижностью, позволяющей ему адаптироватся к изменениям РНКП в месте связывания.6. Показано, что белок gp79 фага РЫ32 ингибирует ст^^-холофермент РНКП, но активирует холофермент РНКП, содержащий фаговый а-фактор gp36.7. Определен консенсус промоторов, узнаваемых gp36-xoлoфepмeнтoм РНКП, и показано, что эти промоторы относятся к среднему и позднему классам промоторов бактериофага РЫ32.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Ольга Андреевна, Москва

1. Богданова, Е.С., Зографф, Ю.Н., Басс, И.А., Щемякин, М.Ф. (1970) Свободные субъединицы РНКП из нормальных клеток и клеток инфицированных Е. coli. Мол Биол. 4: 435-444.

2. Павлова, О., Северинов, К. (2006) Посттрансляционно-модифицированные микроцины. Генетика. 42: 1-11.

3. Лисицын, Н.А., Свердлов, Е.Д., Моисеева, Е. П., Никифоров, В.Г. (1985) Локализация мутации, приводящей к устойчивости РНК-полимеразы Е. coli к антибиотику стрептолидигину, в гене гроВ, кодирующем р-субъединицу фермента. БиооргХим. 11: 132-134.

4. Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Москва, "Мир".

5. Огрызько, Е.П., Никифоров, В. Г., Бородин, A.M., Данилкович, А.В., Монастырская, Г.С. (1988) Аминокислотные замены в р-субъединице РНК-полимеразы Е. coli компенсирующие вызванные мутациями повреждения rho фактора терминации. БиооргХим. 14:963-964.

6. Adelman, К., Orsini, G., Kolb, A., Graziani, L., Brody, E.N. (1997) The interaction between the AsiA protein of bacteriophage T4 and the sigma70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 272: 27435-27443.

7. Adelman, K., Yuzenkova, J., La, P.A., Zenkin, N., Lee, J., Lis, J.T. et al. (2004) Molecular mechanism of transcription inhibition by peptide antibiotic Microcin J25. Mol Cell. 14: 753-762.

8. Andre, E., Bastide, L., Michaux-Charachon, S., Gouby, A., Villain-Guillot, P., Latouche, J., Bouchet, A., Gualtieri, M., Leonetti, J. (2006) Novel synthetic molecules targeting the bacterial RNA polymerase assembly. JAntimicrob Chemother. 57: 245-251.

9. Artsimovitch, I., Chu, C., Lynch, A.S., Landick, R. (2003) A new class of bacterial RNA polymerase inhibitor affects nucleotide addition. Science. 302: 650-654.

10. Asensio, C., and Perez-Diaz, .T.C.> (1976) A new family of low molecular weight antibiotics from enterobacteria. Biochem Biophys Res Commun 69: 7-14.

11. Bar-Nahum, G., Epshtein, V., Ruckenstein, A.E., Rafikov, R., Mustaev, A., Nudler, E. (2005) A ratchet mechanism of transcription elongation and its control. Cell 120: 183193.

12. Bayro, M.J., Mukhopadhyay, .T., Swapna, G.V., Huang, J.Y., Ma, L.C., Sineva, E. et al. (2003) Structure of antibacterial peptide microcin J25: a 21-residue lariat protoknot. J Am ChemSoc. 125: 12382-12383.

13. Bellomio, A., Vincent, P.A., de Arcuri, B.F., Farias, R.N., Morero, R.D. (2007) Microcin J25 has a dual and independent mechanism of action in Escherichia coli: RNA polymerase inhibition and increased superoxide production. JBacteriol. 177: 3323-3325.

14. Blond, A., Peduzzi, J., Goulard, C., Chiuchiolo, M.J., Barthelemy, M., Prigent, Y. et al. (1999) The cyclic structure of microcin J25, a 21-residue peptide antibiotic from Escherichia coli. Eur J Biochem. 259: 747-755.

15. Braun,V., Patzer,S.I., and Hantke,K. (2002) Ton-dependent colicins and microcins: modular design and evolution. Biochimie. 84: 365-380.

16. Brüssow, H., Hendrix, R.W. (2002) Phage genomics: small is beautiful. Cell. 108: 13-16.

17. Bryson, V., Szybalski, W. (1952) Microbial Selection. Science. 116: 45-51.

18. Buchstein, S.R., Hinkle, D.C. (1982) Genetic analysis of two bacterial RNA polymerase mutants that inhibit the growth of bacteriophage T7. Mol Gen Genet. 188: 211-218.

19. Campbell, E.A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair, S., Goldfarb, A., Darst, S.A. (2001) Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell. 104: 901-912.

20. Campbell, E.A., Pavlova, O., Zenkin, N., Leon, F., Irschik, H., Jansen, R., Severinov, K., Darst, S.A. (2005) Structural, functional, and genetic analysis of sorangicin inhibition of bacterial RNA polymerase. EMBOJ. 24: 674-682.

21. Cormack, B.P., Struhl, K. (1993) Regional codon randomization: defining a TATA-binding protein surface required for RNA polymerase III transcription. Science. 262: 244-248.

22. Cramer, P., Bushnell, D.A., Kornberg, R.D. (2001) Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science. 292: 1863-1876.

23. Darst, S.A. (2001) Bacterial RNA polymerase. Curr Opin Struct Biol. 11: 155-162.

24. Delgado, M.A., Vincent, P.A., Farias, R.N., and Salomon, R.A. (2005) Yojl of Escherichia coli functions as a microcin J25 efflux pump. J Bacterial. 187: 3465-3470.

25. DeWyngaert, M.A., Hinkle, D.C. (1979) Bacterial mutants affecting phage T7 DNA replication produce RNA polymerase resistant to inhibition by the T7 gene 2 protein. J Biol Chenu 254: 11247-11253.

26. DeWyngaert, M.A., Hinkle, D.C. (1980) Characterization of the defects in bacteriophage T7 DNA synthesis during growth in the Escherichia coli mutant tsnB. J Virol. 33: 780788.

27. Duquesne, S., Destoumieux-Garzon, D., Zirah, S., Goulard, C., Peduzzi, J., Rebuffat, S. (2007) Two enzymes catalyze the maturation of a lasso peptide in Escherichia coli. Chem Biol. 14: 793-803.

28. Ebright, R.H. (2000) RNA polymerase: structural similarities between bacteriaL RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II. J Mol Biol. 304: 687-698.

29. Ezekiel, D.H., Hutchins, J.E. (1968) Mutations affecting RNA polymerase associated with rifampicin resistance in Escherichia coli. Nature. 220: 276-277.

30. Fu, J., Gnatt, A.L., Bushneil, D.A., Jensen, G.J., Thompson, N.E., Burgess, R.R., David, P.R., Kornberg, R.D. (1999) Yeast RNA polymerase II at 5 A resolution. Cell. 98: 799810.

31. Jin, D.J., Gross, C.A. (1988) Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. J Mol Biol. 202: 45-58.

32. Gualtieri, M., Villain-Guillot, P., Latouche, J., Leonetti, J.P., Bastide, L. (2006) Mutation in the Bacillus subtilis RNA polymerase beta' subunit confers resistance to lipiarmycin. Antimicrob Agents Chemother. 50: 401-402.

33. Guilda, N., Gayleb, M., Sweeneyc, R., Hollingswortha, T., Modeera, T., Golda, L. (1988) Transcriptional activation of bacteriophage T4 middle promoters by the motA protein. J Mol Biol. 199: 241-258.

34. Hesselbach, B.A., Nakada, D. (1975) Inactive complex formation between E. coli RNA polymerase and inhibitor protein purified from T7 phage infected cells. Nature. 258: 354357.

35. Hesselbach, B.A., Nakada, D. (1977) "Host shutoff' function of bacteriophage T7: involvement of T7 gene 2 and gene 0.7 in the inactivation of Escherichia coli RNA polymerase. J Virol. 24: 736-745.

36. Hesselbach, B.A., Nakada, D. (1977 (2)) I protein: bacteriophage T7-coded inhibitor of Escherichia coli RNA polymerase. J Virol. 24: 746-760.

37. Hesselbach, B.A., Yamada, Y„ Nakada, D. (1974) Isolation of an inhibitor protein of E. coli RNA polymerase from T7 phage infected cell. Nature. 252: 71-74.

38. Heil, A., Zillig, W. (1970) Reconstitution of bacterial DNA-dependent RNA-polymerase from isolated subunits as a tool for the elucidation of the role of the subunits in transcription. FEBSLett. 11: 165-168.

39. Heisler, L.M., Suzuki, H., Landick, R., Gross, C.A. (1993) Four contiguous amino acids define the target for streptolydigin resistance in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 268: 25369-25375.

40. Hochlowski, J.E., Swanson, S.J., Ranfranz, L.M., Whittern, D.N., Buko, A.M., McAlpine, J.B. (1987) Tiacumicins, a novel complex of 18-membered macrolides. II. Isolation and structure determination. JAntibiot. (Tokyo). 40: 575-588.

41. Irschik, H., Gerth, K., Höfle, G., Kohl, W., Reichenbach, H. (1983) The myxopyronins, new inhibitors of bacterial RNA synthesis from Myxococcus fulvus (Myxobacterales). J Antibiot. (Tokyo). 36: 1651-1658.

42. Irschik, H., Jansen, R., Höfle, G., Gerth, K., Reichenbach, H. (1985) The corallopyronins, new inhibitors of bacterial RNA synthesis from Myxobacteria. J Antibiot. (Tokyo). 38: 145-152.

43. Irschik, H., Jansen, R., Gerth, K., Hofle, G., Reichenbach, H. (1987) The sorangicins, novel and powerful inhibitors of eubacterial RNA polymerase isolated from myxobacteria. J Antibiot. (Tokyo). 40: 7-13.

44. Irschik H, Augustiniak H, Gerth K, Höfle G, Reichenbach H. (1995) The ripostatins, novel inhibitors of eubacterial RNA polymerase isolated from myxobacteria. J Antibiot. (Tokyo). 48: 787-792.

45. Kulish, D., Lee, J., Lomakin, I., Nowicka, B., Das, A., Darst, S., Normet, K„ Bomkhov, S. (2000) The functional role of basic patch, a structural element, of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB. J Biol Chem. 275: 12789-12798.

46. Lambert, L.J., Wei, Y., Schirf, V., Demeler, B., Werner, M.H. (2004) T4 AsiA blocks DNA recognition by remodeling c70 region 4. EMBO J. 23: 2952-2962.

47. Laptenko, O., Lee, J., Lomakin, I., Borukhov, S. (2003) Transcript cleavage factors GreA and GreB act as transient catalytic components of RNA polymerase. EMBO J. 22: 6322-6234.

48. LeClerc, J.E., Richardson, C.C. (1979) Gene 2 protein of bacteriophage T7: purification and requirement for packaging of T7 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sei USA. 76: 48524856.

49. Liao, Y.D., Kuo, T.T. (1986) Loss of a-factor of RNA polymerase of Xanthomonas campestris pv. oryzae during phage XplO infection. J Biol Chem. 261: 13714-13719.

50. Liao, Y.D., Tu, J., Feng, T.Y., Kuo, T.T. (1986 (2)) Characterization of phage-XplO-coded RNA polymerase. EurJBiochem. 157: 571-577.

51. Lisitsyn, N.A., Sverdlov, E.D., Moiseyeva, E.P., Danilevskaya, O.N., Nikiforov, V.G. (1984) Mutation to rifampicin resistance at the beginning of the RNA polymerase beta subunit gene in Escherichia coli. Mol Gen Genet. 196: 173-174.

52. Lopez, F.E., Vincent, P.A., Zenoff, A.M., Salomon, R.A., Farias, R.N. (2007) Efficacy of microcin J25 in biomatrices and in a mouse model of Salmonella infection. J Antimicrob Chemother. 59: 676-680.

53. Miller, E.S., Kutter, E., Mosig, G., Arisaka, F., Kunisawa, T., Rüger, W. (2003) Bacteriophage T4 genome. Microbiol Mol Biol Rev. 67: 86-156.

54. Minakhin, L., Camarero, J.A., Holford, M., Parker, C., Muir, T.W., Severinov, K. (2001) Mapping the molecular interface between the c70subunit of E. coli RNA polymerase and T4 AsiA. J Mol Biol. 306: 631-642.

55. Minakhin, L., Semenova, E., Liu, J., Vasilov, A., Severinova, E., Gabisonia, T., Inman, R., Mushegian, A., Severinov, K. (2005) Genome sequence and gene expression of Bacillus anthracis bacteriophage Fah. J Mol Biol. 354: 1-15.

56. Mukhopadhyay, J., Sineva, E., Knight, J., Levy, R. M., Ebright, R. H. (2004) Antibacterial peptide microcin J25 inhibits transcription by binding within and obstructing the RNA polymerase secondary channel. Mol Cell. 14: 739-751.

57. Murakami, K.S., Darst, S.A. (2003) Bacterial RNA polymerases: the wholo story. Curr Opin Struct Biol. 13: 31-39.

58. Murakami, K.S., Masuda, S., Campbell, E.A., Muzzin, O., Darst, S.A. (2002) Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science. 296: 1285-1290.

59. Nechaev, S., Severinov, K. (1999) Inhibition of Escherichia coli RNA polymerase by bacteriophage T7 gene 2 protein. J Mol Biol. 289: 815-826.

60. Nechaev, S., Severinov, K. (2003) Bacteriophage-induced modifications of host RNA polymerase. Annu Rev Microbiol. 57: 301-322.

61. O'Neill, A., Oliva, B., Storey, C., Hoyle, A., Fishwick, C., Chopra, I. (2000) RNA polymerase inhibitors with activity against rifampin-resistant mutants of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 44: 3163-3166.

62. Ontell, M.P., Nakada, D. (1980) Rescue of abortive T7 gene 2 mutant phage infection by rifampin. J Virol. 34: 438-445.

63. Opalka, N. Chlenov, M., Chacon, P., Rice, W.J., Wriggers, W., Darst, S.A. (2003) Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell. 114: 335-345.

64. Orsini, G., Ouhammouch, M., Le Caer, J.P., Brody, E.N. (1993) The asiA gene of bacteriophage T4 codes for the anti-sigma 70 protein. JBacteriol. 175: 85-93.

65. Ouhammouch M, Orsini G, Brody EN. (1994) The asiA gene product of bacteriophage T4 is required for middle mode RNA synthesis. J Bacteriol. 176: 3956-3965.

66. Qimron, U., Kulczyk, A.W., Hamdan, S.M., Tabor, S., Richardson, C.C. (2008) Inadequate inhibition of host RNA polymerase restricts T7 bacteriophage growth on hosts overexpressing udk. Mol Microbiol. 67: 448-457. <

67. Qimron, U., Marintcheva, B., Tabor, S., Richardson, C.C. (2006) Genomewide screens lor Escherichia coli genes affecting growth of T7 bacteriophage. Proc Natl Acad Sci U S A. 103: 19039-19044.

68. Rintoul, M.R., de Arcuri, B.F., Salomon, R.A., Farias, R.N., and Morero, R.D. (2001) The antibacterial action of microcin J25: evidence for disruption of cytoplasmic membrane energization in Salmonella newport. FEMS Microbiol Lett. 204: 265-270.

69. Rommele, G., Wirz, G., Solf, R., Vosbeck, K., Gruner, J., Wehrli, W. (1990) Resistance of Escherichia coli to rifampicin and sorangicin A-a comparison. J Antibiot. (Tokyo). 43: 88-91.

70. Rosengren, K.J., Blond, A., Afonso, C., Tabet, J.C., Rebuffat, S., Craik, D.J. (2004) Structure of thermolysin cleaved microcin J25: extreme stability of a two-chain antimicrobial peptide devoid of covalent links. Biochemistiy. 43: 4696-4702.

71. Rosengren, K.J., Clark, R.J., Daly, N.L., Goransson, U., Jones, A., and Craik, D.J. (2003) Microcin J25 has a threaded sidechain-to-backbone ring structure and not a head-to-tail cyclized backbone. J Am Chem Soc. 125: 12464-12474.

72. Salomon, R.A., and Farias, R.N. (1992) Microcin 25, a novel antimicrobial peptide pioduced by Escherichia coli. JBacteriol. 174: 7428-7435.

73. Salomon, R.A., and Farias, R.N. (1993) The FhuA protein is involved in microcin 25 uptake. J Bacterial. 175: 7741-7742.

74. Sarubbi, E., Monti, F., Corti, E., Miele, A., Selva, E. (2004) Mode of action of the microbial metabolite GE23077, a novel potent and selective inhibitor of bacterial RNA polymerase. EurJBiochem. 271: 3146-3154.

75. Schleif, R. (1969) Isolation and characterization of streptolydigin resistant RNA polymerase. Nature. 223: 1068-1069.

76. Sensi, P. (1983) History of the development of rifampin. Rev Infect Dis. 5: S402-406.

77. Severinov, K., Muir, T.W. (1998) Expressed protein ligation, a novel method for studying protein-protein interactions in transcription. J Biol Chem. 273: 16205-16209.

78. Severinov, K., Soushko, M., Goldfarb, A., Nikiforov, V. (1993) Rifampicin region revisited. New rifampicin-resistant and streptolydigin-resistant mutants in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 268: 14820-14825.

79. Severinov, K., Soushko, M., Goldfarb, A., Nikiforov, V. (1994) Rif* mutations in the beginning of the Escherichia coli rpoB gene. Mol Gen Genet. 244: 120-126.

80. Severinova, E., Severinov, K., Fenyo, D., Marr, M., Brody, E.N., Roberts, J.W., Chait, B.T., Darst, S.A. (1996) Domain organization of the Escherichia coli RNA polymerase a70subunit. J Mo I Biol. 263: 637-647.

81. Severinova, E., Severinov, K., Darst, S.A. (1998) Inhibition of Escherichia coli RNA polymerase by bacteriophage T4 AsiA. JMol Biol. 279: 9-18.

82. Shanblatt, S.H., Nakada, D. (1982) Escherichia coli mutant which restricts T7 bacteriophage has an altered RNA polymerase. J Virol. 42: 1123-1126.

83. Siddhikol, C., Erbstoeszer, J.W., Weisblum, B. (1969) Mode of action of streptolydigin. J Bacteriol. 99: 151-155.

84. Solbiati, J.O., Ciaccio, M., Farias, R.N., and Salomon, R.A. (1996) Genetic analysis of plasmid determinants for microcin J25 production and immunity. J Bacteriol. 178: 36613663.

85. Solbiati, J.O., Ciaccio, M., Farias, R.N., Gonzalez-Pastor, J.E., Moreno, F., and Salomon, R.A. (1999) Sequence analysis of the four plasmid genes required to produce the circular peptide antibiotic microcin J25. J Bacteriol. 181: 2659-2662.

86. Sosunov, V., Sosunova, E., Mustaev, A., Bass, I., Nikiforov, V., Goldfarb, A. (2003). Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBOJ. 22: 2234-2244.

87. Sosunova E, Sosunov V, Kozlov M, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. (2003) Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gr c. Proc Natl Acad Sci USA. 100: 15469-15474.

88. Stevens, A. (1972) New small polypeptides associated with DNA-dependent RNA polymerase of Escherichia coli after infection with bacteriophage T4. Proc Natl Acad Sci USA. 69: 603-607.

89. Vassylyev, D.G., Svetlov, V., Vassylyeva, M.N., Perederina, A., Igarashi, N., Matsugaki, N., Wakatsuki, S., Artsimovitch, I. (2005) Structural basis for transcription inhibition by tagetitoxin. Nat Struct Mol Biol. 12: 1086-1093.

90. Vassylyev, D.G., Vassylyeva, M.N., Zhang, J., Palangat, M., Artsimovitch, I., Landick, R. (2007) Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase. Nature. 448: 163-168.

91. Vincent, P.A., Bellomio, A., de Arcuri, B.F., Farias, R.N., and Morero, R.D. (2005) MccJ25 C-terminal is involved in RNA-polymerase inhibition but not in respiration inhibition. Biochem Biophys Res Commun. 331: 549-551.

92. Vogel, U., Jensen, K.F. (1994) The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate. JBacteriol. 176: 2807-2813.

93. Wichelhaus, T., Schafer, V., Brade, V., Boddinghaus, B. (2001) Differential effect of rpoB mutations on antibacterial activities of rifampicin and KRM-1648 against Staphylococcus aureus. JAntimicrob Chemother. 47: 153-156.

94. Wilson, K.A., Kalkum, M., Ottesen, J., Yuzenkova, J., Chait, B.T., Landick, R. et al. (2003) Structure of microcin J25, a peptide inhibitor of bacterial RNA polymerase, is a lassoed tail. JAmChemSoc. 125: 12475-12483.

95. Yang, X., Price, C.W. (1995) Streptolydigin resistance can be conferred by alterations to either the beta or beta' subunits of Bacillus subtilis RNA polymerase. J Biol Chem. 270:23930-23933.

96. Yamada, Y., Silnutzer. J., Nakada, D. (1979) Accumulation of bacteriophage T7 head-related particles in an Escherichia coli mutant. J Virol. 31: 209-219.

97. Yuan, A.H., Nickels, B.E., Hochschild, A. (2009) The bacteriophage T4 AsiA protein contacts the {beta}-flap domain of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sei USA. Принято в печать.

98. Yuzenkova, J., Nechaev, S., Berlin, J., Rogulja, D., Kuznedelov, K., Innian, R., Mushegian, A., Severinov, K. (2003) Genome of Xanthomonas oryzae bacteriophage XplO: an odd T-odd phage. J Mol Biol. 330: 735-748.

99. Yuzenkova, Y., Zenkin, N., Severinov, K. (2008) Mapping of RNA polymerase residues that interact with bacteriophage XplO transcription antitermination factor p7. J Mol Biol. 375: 29-35.