Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РНК-полимераза бактерий: иммунология и молекулярная генетика

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Никифоров, Вадим Георгиевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. РНК-ПОЛИМЕРАЗА £. cod : СТРУКТУРА И НАЧАЛЬНЫЕ

СТАДИИ ЦИКЛА ТРАНСКРИПЦИИ.

1.1.Структура РНК-полимеразы

1.1.1. Очистка.

1.1.2. Субъединичный состав.

1.1.3. Самосборка. . .13"

1.1.4. Четвертичная структура.

1.1.4.1. Ограниченный протеолиз.

1.1.4.2. Сшивки бифункциональными реагентами

1.1.4.3. Электронная микроскопия

1.1.4.4. Малоугловое нейтронное и рентгеновское рассеяние в растворе.

1.2. Начальные стадии цикла транскрипции

1.2.1. Общая характеристика. реакций, катализируемых РНК-полимеразой

1.2.2. Цикл транскрипции

1.2.3. Связывание с ДНК.

1.2.3.1. Свойства комплексов РНК-полимеразы с ДНК.

1.2.3.2. Поиск промотора

- 1.2.3.3. Нуклеотидная последовательность промоторов.

1.2.3.4. Контакты .РНК-полимеразы с промоторами

1.2.4. Инициация

1.2.4.1. Выбор стартовой точки

1.2.4.2. Изменение свойств комплекса РНК-полимеразы с ДНК после начала синтеза РНК.

1.2.4.3. Абортивная инициация.

1.2.4.4-. Рифампицин - ингибитор продуктивной инициации.

ГЛАВА 2. СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГОМОЛОГИЯ

РНК-ПОЛИМЕРАЗ РАЗНЫХ БАКТЕРИЙ.

2.1. Сравнение РНК-полимераз мезофильной B.c&fc

И термофильной

2.2. Сравнение структурно-функциональных свойств бактериальных РНК-полимераз (литературные данные)

2.2.1. Субъединичный состав.

2.2.2. Гомология субъединиц.

2.2.3. Узнавание промоторов в чужеродной ДНК

ГЛАВА 3. ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ СТРУКТУРЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ

РНК-ПОЛИМЕРАЗ.

3.1. Пептидные карты о(.-субъединицы.

3.2. Участки субъединиц, выступающие на поверхность минимальной РНК-полимеразы.

3.3. Участки субъединиц, скрытые внутри молекулы РНК-полимеразы.

3.4. Консервативность структуры центра связывания ДНК.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ СУБЬЕДИНИЦ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ СУБЬЕДИНИЦ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ С ПОМОЩЬЮ ХОЛОДОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ МУТАЦИЙ

5.1. Получение холодочувствительных мутантов

5.2. Идентификация субъединиц, затронутых мутациями.

5.3. Влияние холодочувствительных мутаций на функциональные свойства РНК-полимеразы.

5.3.1. Элонгация.

5.3.2. Открывание промоторов на ДНК фага Т2.

5.3.3. Стабильность закрытых комплексов РНК-полимеразы с ДНК фага Т2.

5.3.4. Влияние сверхспирализации.

5.3.5. Связывание с разными ДНК.

5.4. Итоги изучения холодочувствительных мутантных РНК-полимераз

5.5. Термочувствительные мутации в генах РНК-полимеразы.

5.6. Амбер-мутации в генах РНК-полимеразы.

ГЛАВА 6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН ПРИ МУТАЦИЯХ

УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ

ГЛАВА 7. МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

7.1. РНК-полимераза.

7.1.1. Получение экстрактов для определения активности РНК-полимеразы

7.1.2. Получение экстрактов для иммунологического сравнения РНК-полимераз

7.1.3. Определение концентрации белка.

7.1.4. Очистка РНК-полимераз.

7.1.5. Разделение субъединиц и реконструкция.

7.1.6. Иодирование.

7.1.7. Пептидные карты.

7.1.8. Определение активности РНК-полимеразы.

7.1.9. Определение связывания РНК-полимеразы с ДНК

7.2. ДНК.

7.2.1. Получение фаговых ДНК.•.

7.2.2. Получение плазмидных ДНК.

7.2.3. Определение' контактов с РНК-полимеразой

7.2.4. Определение нуклеотидной последовательности

7.3. Иммунология.

7.3.1. Иммунизация кроликов.

7.3.2. Получение моновалентных антител.

7.3.3. Приготовление иммуносорбентов.

7.3.4. Связывание меченых препаратов РНК-полимеразы с иммуносорбентами.

7.3.5. Получение гибридом.

7.3.6. Радиоиммунологический анализ.

7.3.7. Реакция с антигенами, иммобилизованными на нитроцеллюлозе.

7.4. Мутагенные обработки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "РНК-полимераза бактерий: иммунология и молекулярная генетика"

Актуальность проблемы. Проблема регуляции активности генов является в молекулярной биологии одной из главных. Знание механизмов этой регуляции совершенно необходимо для понимания природы многих принципиальных общебиологических явлений, в частности процесса клеточной дифференцировки, а также для решения практических задач генной инженерии. Важнейшую роль в регуляции экспрессии генов играет первый этап реализации генетической информации - транскрипция. Ферментативный аппарат транскрипции относительно прост и у бактерий состоит по существу из одного фермента - ДНК-зависимой РНК-полимеразы. На многих матрицах этот фермент способен осуществлять все стадии синтеза РНК в отсутствие каких бы то ни было дополнительных факторов: при этом ш уИго образуется точно такая же РНК, как /п \zlvo . Даже в том случае, когда в транскрипции участвуют те или иные регуляторные факторы, они лишь помогают или мешают РНК-полимеразе на тех стадиях синтеза РНК, которые она в принципе способна осуществлять и в их отсутствие. Именно поэтому выяснение механизма действия РНК-по-лимеразы дает ключ к пониманию механизмов регуляции транскрипции.

В последние годы благодаря появлению методов клонирования и определения нуклеотидной последовательности ДНК достигнуты значительные успехи в выяснении структуры сигнальных участков нуклеиновых кислот, используемых для регуляции транскрипции. Однако знание структуры одних только регуляторных участков ДНК без знания структуры РНК-полимеразы и других белков, взаимодействующих с ними, совершенно недостаточно для понимания механизмов этой регуляции. Выяснение структуры РНК-полимеразы и функциональной значимости ее элементов стандартными методами белковой химии встречается со значительными трудностями, связанными как со сложностью процесса синтеза РНК, так и с исключительно большими размерами и сложным субъединичным строением РНК-полимеразы. Последнее обстоятельство исключает пока применение к РНК-полимеразе такого прямого метода, как рентгеноструктурный анализ. Все это диктует необходимость привлечения различных нетрадиционных подходов. Наряду с методом аффинных модификаций, наиболее перспективным представляется генетический подход. Действительно, мутации дают уникальную возможность изучения функциональных последствий замен единичных аминокислот в строго определенных положениях полипептидной цепи, причем эти последствия можно изучать не только в пробирке, но и в живой клетке. Идеологически родствен генетическому сравнительный подход, использующий существующие в природе отличия между гомологичными белками, возникшие за счет множества мутаций, накопившихся в, ходе эволюции. Наконец, важную информацию можно получить при использовании в качестве молекулярных ' зондов специфических антител, особенно в сочетании со сравнительным подходом.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлась разработка и применение сравнительного, иммунологического и генетического подходов к изучению функциональной роли субъединиц РНК-полимеразы. На первом этапе исследования ставилась задача выяснить, какие субъединицы РНК-полимеразы участвуют в разных стадиях транскрипции. На втором - выяснить функциональную значимость фрагментов субъединиц и отдельных аминокислотных звеньев. Особое внимание уделялось вопросу о том, какие функции РНК-полимеразы требуют эволюционной консервативности структуры соответствующих участков ее молекулы, а какие допускают вариабельность. Конкретные этапы реализации этой программы изложены в тексте.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые применен сравнительный подход к изучению функциональной роли субъединиц РНК-полимеразы. Продемонстрирована структурная и функциональная гомология РНК-полимераз филогенетически далеких видов бактерий. Показано, что в процессе открывания промоторов РНК-полимераза играет активную роль. Впервые показано, что процесс открывания промоторов зависит как ото' --субъединицы, так и от минимального фермента. Совместно с лабораторией Ю.А.Овчинникова(ИБОХ АН СССР) разработан новый метод сравнения пептидных карт близких белков и метод анализа распределения тирозиновых остатков между участками субъединиц, выходящими на поверхность белка и скрытыми в нем за счет межсубъединичных контактов. Продемонстрирована возможность изучения филогенетических связей бактерий путем сравнения антигенной структуры РНК-полимераз. Показана различная скорость эволюционной дивергенции 0 и^уЗ'-субъединиц РНК-полимеразы. Антитела впервые применены для ингибиторного анализа функций субъединиц РНК-полимеразы. Совместно с лабораторией О.В. Рохлина (ВКНЦ АМН СС.СР) впервые получены моноклональные антитела против РНК-полимеразы Е.со£* . Разработаны основы метода локализации индивидуальных антигенных детерминант ^-субъединицы РНК-полимеразы. С помощью обычных и моноклональных антител продемонстрировано участие уЗ- и [¡> -субъединиц в связывании с ДНК и в элонгации цепей РНК. Впервые продемонстрирована эволюционная консервативность участка РНК-полимеразы, контактирующего с промоторами. Впервые разработан метод обнаружения антигенных детерминант субъединиц РНК-полимеразы, участвующих в контактах с другими субъединицами. Впервые установлено, что функционирование ряда участков РНК-полимеразы совместимо со значительной структурной вариабельностью. Проведены систематические исследования функциональной роли субъединиц РНК-полимеразы генетическими методами.

Впервые введены в практику таких исследований холодочувстви-тельные мутации. С их помощью продемонстрировано участие р- и субъединиц во взаимодействии РНК-полимеразы с промоторами и в элонгации цепей РНК, получены данные в пользу того, что контакты РНК-полимеразы с разными промоторами могут различаться. Разработан метод направленного получения мутаций в клонированных генах РНК-полимеразы, позволяющий проводить идентификацию мутаций путем определения нуклеотидной последовательности ДНК. Совместно с лабораторией Е.Д.Свердлова (ИБОХ АН СССР) идентифицированы аминокислотные звенья ^-субъединицы, существенные для взаимодействия РНК-полимеразы с рифампицином. Найдены производные рифамици-на, способные подавлять РНК-полимеразу некоторых мутантов, устойчивых к рифампицину. Разработанные в . диссертации подходы открывают широкие возможности для дальнейшего исследования функциональной роли различных участков и отдельных аминокислотных звеньев РНК-полимеразы, -могут быть использованы для решения вопросов классификации бактерий, а также при поиске новых производных рифамицинов.

Результаты работы получены как лично автором, так и в соавторстве с Э. С. Каляевой, 0. Н. Данилевской и аспирантами В. В. Бельковым, А. И. Грагеровым, А. Н. Лебедевым, 0. А. Ларионовым и Е.П. Моисеевой, работавшими в ЙМГ АН СССР под руководством автора. Сотрудничество с другими институтами отмечено в тексте.