Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ транскрипционного цикла с помощью направленного мутагенеза и иммобилизованной РНК-полимеразы ESCHERICHIA COLI

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ транскрипционного цикла с помощью направленного мутагенеза и иммобилизованной РНК-полимеразы ESCHERICHIA COLI"

>1 ь ий

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 577.214

МАРТИН Емил Степанович

АНАЛИЗ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ЦИКЛА С ПОМОЩЬЮ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ESCHERICHIA COLI

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—1993

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москва) и в Колумбийском университете (Нью-Йорк).

Научные руководители:

доктор биологических наук В. Г. Никифоров, кандидат биологических наук М.В. Кашлев

Официальные оппоненты:

доктдр биологических наук' Р.С. Шакулов кандидат биологических наук Л.И. Патрушев

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, кафедра генетики.

Защита состоится 1993 года в часов на засе-

дании Специализированного совета Л 025. 01. 01. при Научноиссле-довательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов ( Москва, 113545, 1-ый Дорожный проезд, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан "—"-^^-1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета: кандидат биологических наук Щербакова В. И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Изучение механизмов экспрессии генетической информации является одним из основных направлений молекулярной биологии. Первый этап этого процесса - транскрипция - осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами (Chamberlin, 1974). Оп-. ределенне роли различных субъединиц в составе РНК-полимеразы, выявление ее структурно-функциональной организации, а также изучение механизмов транскрипции являются взаимосвязанными задачами, имеющими большое значение в понимании экспрессии генов. Одним из подходов к решению этих задач является получение мутаций в генах субъединиц РНК-полимеразы и подробное изучение возникших нарушений транскрипционного цикла. Наиболее информативными представляются мутации, нарушающие лишь одну из функций фермента или затрагивающие лишь одну стадию транскрипционного цикла, то есть вызывающие мутационное расчленение транскрипционного цикла.

Настоящая работа посвящена исследованию структуры и функции fl- и о'- субъединиц РНК-полимеразы Escherichia coli с помощью направленных мутаций. Мутагенез осуществляли в эволюционно консервативных областях этих субъединиц, так как считается, что такие области имеют наибольшую функциональную и структурную значимость. Кроме того, в данной работе осуществляли разделение стадий транскрипционного цикла с помощью иммобилизованной РНК-полимеразы.

В работе ставились следующие задачи. Получить и охарактеризовать мутации в эволюционно консервативной области С гроБ-гена и в эволюционно консервативной области D гроС-гона РНК-полимеразы Escherichia coli. Определить нарушения транскрипционного цикла мутантных полимераз. изучить свойства элонгационного комплекса в транскрипционных системах in vitro.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получена и биохимически охарактеризована направленная мутация rpoB-гена, дестабилизирующая промоторный комплекс РНК-полимера-

1

эы. Получена мутация rpoO-гена, полностью блокирующая образование фосфодиэфирной связи. Изучены (JwKTopu, определяющие стабильность коротких РНК в составе ^лонгационного комплекса, и исследована зависимость зффективности Ш1[к\1юофо1.юлиг}Н фоофодизфирной связи последнего и предпоследнего нуклеотидов ГНК от природы 3'-'концевого нуклеотида.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, р^^ультатст и обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включая таблиц и рисунков. Библиография включает в себя названий, в том числе русских и иностранных.

МАШ'ИШ И МКТОДи

В работе попользованы штаммы и плазмнды из коллекции лаборатории А. Гольдфарба (Колумоийекии Университет, Нью-Йорк) и плазмнды из коллекции ИМГ l'Ail (Москва).

Мутации ВО'- субьединице РНК-нолимеразы получали с помощью сайт-специфического мутагенеза с клонированием Фрагмента Гена гроС в фазмиде pîZ19R. Мутагенез проводился на однонитевой фаз-МИДе, полученной В ОДНОНИТеВОЙ форме после Заражения фагом-помощником (Rokeaoli ut al., 10tW) Делеционные мутации в ipofMx-iie, зонированном в pUOjy векторе, получали с помощью рестриктазы EcoRV или рестриктазы Clal и Ва131 нуклеази.

Анализ подвижности двойного комплекса РШ'-полимеразн и иромо-торного Фрагмента ДНК при электрофорезе в натиыюм геле проводи ли по (Straney ami Orothers, №!5). Кинетику образования двойного комплекса изучали с помощью связывания комплекса на нитроцел-люлозном фильтре по (Hlnkle г-uid Cluiml>ei iln, l'JVI'h

Изучение транскрипционной активности фронтон на ДНК ilara Т4 проводили по (Хесин и др., 196;.!), а на Фрагментах, содержащих промотор, по (ChaubjiJlii et al., 1981J.

РНК-полимеразу, содержащую мутантмую i"i субгедшпшу, получали

метолом сборки из изолированных субъединиц (Zalenskaya et al., 1990). РНК-полимеразу, содержащую мутантную в'-субъединицу, выделяли с помощью аффинной иммобилизации на NTA-сорбенте (Kashlev et al., 1993).

Определение последовательностей ДШ в районах локализации мутаций проводили на автоматическом секвенаторе фирмы "Beckmann" с использованием флуоресцентных меток по модифицированному методу (.Sanger, 1977).

Футпршггный анализ открытого промоторного комплекса с помощью перманганата калил проводили по модифицированному методу (Gral la, 1985).

Выделение илазмиднпй ДШ и трансформацию бактерий проводили, как описано в методическом руководстье ( Маниатис и др. 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Генетический и биохимический анализ делеционной мутации rpcEARV

Анализ последовательностей гомологичных субъединиц РНК-поли-мераз различных организмов выявляет в составе ß-субъединицы РНК-полимеразы Escherichia coll девять зволюционно консервативных областей. Наше внимание привлекла так называемая область С, лежащая в районе 440-467 аминокислотных остатков. Функция этого участка не ясна. Были получены делеционные мутации, в сумме перекрывающие всю консервативную область С. Для того чтобы можно было различить активности мутантной РНК-полимеразы и фермента дикого типа, делеции получали в клонированном под lac-промотором rpoB-гене, содержащем rlf-r-мутацию. Для анализа способности му-тантных полимераз поддерживать рост клеток был использован штамм JL1444 (rpoBolamsupD43), содержащий амбер-мутацию в хромосомном rpoB-гене и ее термочувствительный супрессор на F'-факторе. Данный штамм способен расти при температуре выше 37°С только при введении в него плазмид, содержащих функционапыю активный геи

з

гроВ. Единственной мутацией, которая нарушила функциональную активность гроВ-гена в таком тесте, была делеция аминокислотных остатков 435-444 В-субъединицы (rpoBARV).

1.1. Транскрипционная активность rpoBARV-фермента in vitro

Для получения препарата РНК-полимерази, содержащей о-субъеди-ницу с делецией десяти аминокислотных остатков, ми воспользовались разработанним в лаборатории А. Гольдфарба (Колумбийский Университет) методом сборки In vitro РНК-полимерази из отдельных изолированных субт^единиц, сверхпродуцируемих в клетках Е. coll после индукции генов РНК-полимерази, клонированных под регулиру омыыи промоторами. Этот метод позволяет получать препараты му-тантных РШ-полимераз, которые не способны поддерживать рост клеток или оказываются токсичными дли клетки.

Анализ транскрипционной активности ARV фермента in vltrc» на ДНК фага Т4 и на фрагменте фага Т7, содержащем прмотор А1, показал, что фермент сохранил около 107. удельной активности дикого типа. Активность rpoBARV-фермрнта не подавлялась при добавлении в реакционную смесь рифампицина .

Для выявления природы нарушения rpoBARV-фермента были последовательно изучены стадии транскрипционного цикла мутантного фермента: связывание полимеразы с промотором, образование открытого промоторного комплекса (OI1K), определение активности фермента на стадиях инициации и элонгации транскрипции.

1.2. Связывание мутантного rpoBARV-(¡».-рмента с промотором и

образование 011К

Образование стабильного промоторного комплекса РНК полимеразом включает две последовательные стадии: 1) образование нестабильного закрытого промоторного комплекса и 2) его изомеризация в стабильный ОПК. При этом образование ОШ происходит лишь при температуре выше 1Ь-18°С. При более низкой температуре 'изомери-

4

зация не происходит, что дает возможность изучать закрытый про-юторный комплекс.

При сравнении способности мутантного фермента и РНК-полимера-зы дикого типа образовывать закрытый комплекс с фрагментом, со-]ержащим Т7А1-промотор, при 4°С по результатам измерения элект-зофоретичесой подвижности комплекса в геле выяснилось, что в эдинакоЕЫХ условиях ДРУ-полимераза формирует такое же количество закрытого промоторного комплекса, что и фермент дикого типа. Та-шм образом, мутантный фермент способен так же эффективно связываться с промотором и образовывать закрытый комплекс, как и по-1имераза дикого типа.

Электрофоретический анализ показал также, что мутантный фермент не образует устойчивого открытого промоторного комплекса в трисутствии таких конкурентов связывания ДНК, как гепарин или ю1у(с1АТ).

Электрофоретический анализ позволяет лишь качественно оценить способность полимеразы связывать ДНК и образовывать ОПК. Поэтому 5ыла изучена кинетика образования открытого комплекса по синтезу абортивного продукта и по количеству задержанного на нитроцеллю-иозном фильтре меченого фрагмента ДНК, содержащего промотор Г7А1. В обоих случаях измеряемая величина прямо пропорциональна количеству образованного ОПК. Как видно из Рис. 1А и Б, в случае РНК-полимеразы дикого типа насыщение Т7А1-промотора достигается при 1.5-2-кратном избытке фермента, в то время как мутантный фермент не обеспечивает насыщения и при 20-ти кратном избытке. Яз этих же графиков, построенных в обратных координатах (Рис. 1А и 2Б, вставки), видно, что даже при очень большом избытке му-гантной РНК-полимеразы над ДНК ферментом занята лишь треть доступных промоторов. Вычисленная по этим графикам константа равновесия образования промоторного комплекса (0.8х108 М-1 и 2.2x10® соответственно для первого и второго метода) отличается на три порядка от опубликованной для фермента дикого типа на Г7А1-промоторе.

Стабильность ОПК можно изучать добавлением к предварительно

5

о

Е а. о

ршсп, м хю "7

к

9 о

Е а. и

рнки.м хЮ"

в

1 2 3

геп&рин,мг/ил

Рис. 1 Образование откр промоторних комплексов

промоторе Т7А1 ЛИУ-РИК-поли* зой, ферментом итого тана и у чивостъ этих ОГ1К с гепарину.

За образоианием отер промсячрного комплекса следил количеству синтезированного 3! минут абортивного продукта (А) и количеству удержанного на филь составе двойного комплекса мече фрагмента ДНК (Б). По оси аба концентрация РНК-нолимеразы, ги ординат - выраженное в количество синтезированной РМК(А задержанной ДНК (Б). Вставки - 1 графики в обратных координатах.

Об устойчивости ОГК к гена судили по количеству оипеэироа го за 15 минут абортивного проду1 присутствии возрастающего кодич< ингибитора (В). За ЮО прош активности принята актив! фермента в отсутствии гепарина.

□ - РНК-палимераза дикого тапа мугангная Д-И\/РНК-полимераза.

бразованному двойному комплексу ингибитора связывания ДНК (ге-арина) и набора нуклеотидов, необходимых для синтеза первого .бортивного продукта. Количество синтезированного абортивного родукта за 15 минут реакции отражает количество активного СИ. дк видно из Рис. 1В, открытый комплекс мутантного фермента настойчив и полность разрушается под воздействием ингибитора смывания полимеразы (гепарина) при концентрации 0.5 мкг/мл, в то ремя как фермент дикого типа образует устойчивый комплекс и не азрушается дате при концентрации гепарина 3 мкг/мл.

Из приведенных данных следует, что у мутантного фермента ¡:а-'ушена способность образования стабильного открытого комплекса, ем, вероятно, и объясняется пониженная транскрипционная актиз-ость гроШУ-РНК-полимера?».

1.2. Активность мутантной гроВЛРУ-РНК-полимеразы в "скольед-

щем" синтезе

Чтобы проверить гипотезу о том, что активность мутантной СТ-полиыерази снижена за счет неспособности фермента сбразовы-1ать стабильный ОШ, ни изучили активность мутантного фермента в 'скользящем" синтеае на гомоолигомерных последозаталькостях од-юнитевых ДНК, поскольку при этой реакции отсутствует стадия (ткрыьания промотора.

Для изучения активности мутантного феррита с зге:1; рсакцла в ;ачестве матрицы был использован денатурированный "Ц'Ш'неит фага .7, содержащий промотор А1. Последовательность годкрущеЯ нити (анного фрагмента содержит по одному тетра- и пекта-Т блоку, ко-,'орые могли бы являться матрицей для синтеза ро1уА РНК, а тетра-I понта-А блоки некодирущей'нити - для синтеза ро1уи. Мы обна->ухшш. что ни мутаьтный фермент, ни полнмераза дикого типа не ши актиыш в синтезе ¡ю1уА, но эЗДэктивио осуществляли синтез )01уи.

Оказались, что мутантнни Фермент не просто способен синтези-юьать ро1у1), но да*; обладает большей удельной акткьиоетып, чем

7

фермент дикого типа.

Известно, что рейтеративный синтез наблюдается не только на однонитевой ДНК, но и на определенных промоторах, обладающих го-моолигомерными блоками в области инициации транскрипции, напри-мер sar+lT. В этом случае для осуществления синтеза должен образоваться стабильный открытый промоторный комплекс. Выяснилось, что мутантная РНК-полимераза, в отличие от фермента дикого типа, не способна осуществлять синтез polyU на sar-tlT промоторе. Это еще раз подтверждает то, что мутация нарушила образование стабильного (Ж.

1.3. Стабильность элонгационного комплекса мутантной ARV-

РНК-полимеразы

Для изучения свойств элонгационного комплекса мутантного фермента был выделен препарат этого комплекса, остановленный в строго определенном положении матрицы. Для этого в качесте матрицы использовали фрагмент ДНК, содержащий Т7А1-промотор. В первых '¿2-х нуклеотидах транскрибируемой области этого фрагмента содержатся лишь два Т во 2-ом и 21-ом положении. Если в смеси нуклеотидов заменить UTP на терминирующий З'-dUTP и использовать комплементарный к И и t-2 положениям транскрибируемой части матрицы динуклеотид ApU в качестве затравки синтеза РНК, то можно получить "замороженный" в -t21 -положении комплекс. Добавлением большого количества UTF к остановленному комплексу можно добиться полной замены З'-dUTP на UTP и возобновить элонгацию цепи РНК, так как фермент-зависимая реакция пирофосфосфатного обмена высвобождает концевой З'-dUMP нуююотид в раствор. Результаты такого опыта отражены на Рис. 2. В случае фермента дикого типа стехиометрическое к промоторному фрагменту ДНК количество элон-гационных комплексов было достигнуто через 30" инкубации. Однако для мутантного фермента такое количество комплексов достигнуто не было и через 2 часа. После добавления UTP к остановленным комплексам элонгация возобновилась. Оба фермента количественно 8

[!ремн удлинения: О 1 5 10 0 1 5 10

4S

2. Аналш (naflvijujiíjcth и прчу-ииши«ли :íjsmhi .1h1vhih'*<> а мутантнскх) A-RV-4teiimenra

íihimvo тина.

iM- 'А.ЧПилГ в »21 ПОЛОЖЕН»! ЛИНГанИШШЫИ ((MlltltC 6Ш| (f "[>>H .«MtilílfHHfM H TpatKT'pWUM-«i im«m (04 (ii Pl lh" i*>ji»M4ia.«j. 10 нг ДПК«атцши. сиифжаикй цхилчор T7A1, 100 цМ рибо nimia» Si) (Al ApU дннуимгтца mu запиши <iumaa) UTPua ii|».uinii|)yniiiini З'-dUTP. 'le-'«)' инкубации на :Г7 X". цпн <1»1**ита munm тина ОцхЛа l) и час ш мугантмий нол1*к>]пзы la 5) а |1'л1.11»»шук> orfíamuin шСьтж UTP Ш!И июибнинлгнин элош ании. Il|x«iu отбирали i I (<г|>2 и 61 5 Цк/nj ÍI и 7\ 10 «тут (пцтбц 4 и Н) и напоили ил Sí % ПААГ, НМ м<>ч«-1яшу.

|)«|>рцми уьалши диины T¡xiiui4*cn<

удлиняли РНК до полноразмерного продукта, что гоьорит о том, чт их элонгационные комплексы одинаково стабильны (Рис. 2, пробы и 9). При этом удлинение РНК осуществлялось мутантной РНК-пол1 меразой и ферментом дикого типа за одинаковое время (Рис. I пробы 2-4 и 6- 9), что свидетельствует об одинаковой скорост элонгации обеих РНК-полимераз. Эти данные совместно с результс тами по активности мутантного фермента в рейтеративном синтег говорят о том, что активный центр rpoBARV-фермента не затрону мутацией. Таким образом, rpoBARV-мутация не изменила стабиль ность элонгационного комплекса мутантного фермента и не повлиял

на целостность его активного центра.

* * *

Из изучения свойств мутантного фермента следует, что делеци 10-ти аминокислотных остатков в эволюционно консервативной об ласти С з-субъединицы РНК-полимеразы нарушила способность фер мента образовывать стабильный промоторный комплекс, но не отра зилась на активности фермента в элонгации и не изменила стабиль ности элонгационного комплекса. Эти данные свидетельствуют том, что функция взаимодействия РНК-полимеразы с ДНК в открыто помотирном комплексе и каталитическая функция независимы. Нали чие подобной мутации является генетическим доказательством того что характер контактов с ДНК и природа стабильности инициаторно го и элонгационного комплекса различны. rpoBARV-мутация позволи ла расчленить два типа взаимодействия РНК-полимеразы с матрично ДНК в ходе транскрипционного цикла.

Глава 2. Генетический и биохимический анализ направленной му

тации в гроС-гене

3'- субъединица, кодируемая гроС-геном, является самой боль шой субъединицей РНК-полимеразы. Структурно функциональная орга низацин этой субгединицы мало изучена. Немногочисленные данни-10

з мутациям в гроО-гене указывают на важную роль В'- субъединицы з взаимодействии с промотором, в терминации транскрипции, во заимодействии с регуляторными факторами и в организации актив-зго центра фермента. Анализ аминокислотных последовательностей 1К-полимераз разных организмов выявляет у всех "3'-подобных" |'бъединиц семь эволюционно консервативных районов. Наиболее ротяженний участок гомологии расположен в четвертой консерва-шюй области Р и представлен имеющейся у всех "О'-подобных" ^бьединиц аминокислотной последовательностью МОПИ). Для изу-?ния функциональной роли этой области была получена множествен-ая сайт специфическая замена остатков аспаргиновой кислоты №П)!Ж-последовательности на аланины. .Полученная мутация была ¿звана ООО. РНК-полимераза, несущая эту мутацию, оказалась нес-эсобной обеспечивать рост клеток штамма К]20 (гроС^), содержало температуро-чувствительную мутацию хромосомного гена гроС ри При суперпродукции мутантной полимеразы в штамме НВ101 эста клеток не наблюдалось. На основании этих тестов данная му-ация была классифицирована как доминантная деталь.

'¿Л. Аффинное выделение мутантной ООО-РНК-полимеразы с применением олигогистидинового якоря в а'- субъединице

Изучение биохимических свойств РНК-полимераз, содержащих му ации в О'-субъедшшце, так же как и в случае полимераз с му-ангной и-субъединицей, сопряжено с проблемой определения ис-инной активности мутантной полимеразы на фоне активности воз-ожных примесей фермента дикого тина в изучаемых препаратах. Для '-субъединици пока не известен подходящий маркер, подобный успешности к рифампнцину, используемый для 0-суОъедшщы. Поэто-у перед мгши стояла задача введения такого маркера ц'-субъеди-ицы, который позволял бы отличать активность маркированной НК-полимеразы от актинности фермента дикого типа и не сказывал-я бы на функции ГНК- полим^ки-.ы.

В |кд!лел№.*« время широкой популярностью стал польгонатьси №'. -

11

тод аффинного выделения различных белков из клеточных зкстракто за предварительно введенный в белок олигогистидиновый якорь. .Пр этом обычно белок удлиняют за счет достройки одного из концо несколькими последовательными гистидинами. Подобный биохимичес кий маркер образует комплексные сязи с N1++ ионом специальног NTA-сорбента. Это позволяет аффинно выделять подобные белки пря мо из клеточного лизата, а также отличать их от изоморфных бел ков, не содержащих этот якорь. Обычно удлинение -NH2 или -С00 концов белков этим маркером не сказывается на их функции. Имени эта система и была использована для маркирования гроС-гена, который затем вводили различные направленные мутации.

В нашей лаборатории М.В. Кашлевым была сконструирована плаз мида рМКА201 (Kashlev et al., 1993), содержащая гроС-ген по, контролем 1ас-промотра. Непосредственно перед стоп-кодоном. бы встроен олигонуклеотид, приводящий к удлинению -С00Н конца О' субъединицы на шесть последовательных остатков гистидина. Плаз мида с таким удлиненным гроС-геном полностью снимала ts-феноти! штамма R120. Это говорит о том, что РНК-полимераза с дополни тельными гистидинами в &'- субъединице не токсична для клетки и более того, способна In vivo заменять полимеразу дикого типа.

Тем не менее, перед получением мутации в удлиненном гроС- rette необходимо было проверить in vitro свойства полимеразы, содержащей олигогистидиновый якорь. Известно, например, чт< РНК-полимеразы, несущие rif-r-мутации, способны in vivo компле-ментировать летальные мутации, однако в тестах in vitro многи< из них отличаются по своим свойствам от полимеразы дикого типа Изучение транскрипционной активности на ДНК фага Т4, синтез; абортивного и полноразмерного продуктов на промоторе Т7А1, ¡ также стабильности ОПК показало, что РНК-полимераза, содержащш олигогистидиновый якорь, не отличается в этих тестах in vitro 0: РНК-полимеразы дикого типа. Фрагмент гроС-гена, содержащий DDD-мутацию, был перенесен в ген 0'- субъединицы плазмиды рМКА201, После индукции плазмидного гроС-гена в штамме R12Q РНК-полимераза, содержащаяся в клеточном лизате, была иммобилизована нг 12

NTA-сорбент и аффинно выделена. Полученный препарат фермента был использован для исследований мутантной полимеразы in vitro. Выяснилось, что DDD-PHK-полимераза не активна на ДНК фага Т4 и не образует полноразмерных и абортивных транскриптов на фрагменте ДНК, содержащем Т7А1-промотор. Для выявления природы дефекта DDD-полимеразы ее трансрипционный цикл был изучен по стадиям.

2.2. Образование ОПК мутантной DDD-PHK-полимеразой

Электрофоретический анализ в нативном геле показал, что DDD-полимераза сохранила способность образовывать комплекс с промоторным фрагментом ДНК. При этом двойной комплекс был так же устойчив к ингибиторам связывания полимеразы с ДНК, как и' фермент дикого типа. Опыты по модификации перманганатом калия одно-нитевых участков ДНК в открытых промоторных комплексах показали одинаковую способность ферментов "расплавлять" участок ДНК в об-' ласти старта транскрипции, а также сходство структуры комплексов мутантного и контрольного ферментов (Рис. 3 пробы 2 и 2'). Эти данные свидетельствуют о том, что мутация не нарушила способности DDD-PHK-полимеразы связывать ДНК и открывать промотор.

2.3. Связывание инициирующих тринуклеотидов мутантной DDD-

PHK-полимеразой

Поскольку DDD-мутация не влияет на открывание промоторов, причину отсутствия транскрипционной активности DDD-PHK-полимеразы следовало искать на стадиях собственно синтеза РНК, включающих связывание субстратов и катализ образования фосфодиэфирной связи.

Принято считать, что в РНК-полимеразе имеется два центра связывания рибонуклеотидов: центр Р, обеспечивающий связывание РНК-продукта и включающий в себя центр связывания инициирующего нуклеозидтрифосфата, и центр N, связывающий элонгирущий НТФ. Обычно для изучения сродства субстратов и праимеров к этим цент-

13

РНК» KUilOt ddCTP

■i -10 -12

- + -- + +

+ -+ +

■f «

I

**

t S

r • 5

D()jm<)|ia'jMq)M Т]ШШХ|ЖОТ

+12

+3

•18 -20

-24 •32

# « ■

i1!' г ♦ ♦ ♦

I ;. á ' *

L: à

12 3 4 V T У 4'

Jb. Tu ООО

Рис. Я M(nuv|»u.aiui« iiqnuHi анаюм ia/шш (.(ипц/ук>ш«-й ниш <>ii,|uii*<> ii|kim<>i<i|»i<i«o мми.и-ма ■гишмераш и ф**(мгн<а пикши ища иа (^ш**""' ДНК, шш-рлашкм I7AI iii«<\*>iit>

«1>]JUITW'HI ({ига '17, оонфАаший цям<>|()|> AI bi|>i6u 3 и 3' ) ti ii|«niii>|aiiiii мтнш-кс liippfuj 2 и '.'.') |)г)|с|г)а1ии.1ли iíi'jc.',.iuiai:.i игч ьа »иа н|*< .17 t* ,jt.1 is it-пл|>1*1|"in шпмчью и »kiioiiuai ьали b (Аодиии удлинения |цл!|1ме|а. ! 5ы« мкм|ип-мгн|а{я-'н Г» м wiuy nj««чмt¡iл o ({ifui

Wèin Эшг ле li|ial№|i ипюльлжал! а в |«'Дкшш уцшн.-ни» на н-чГ^ыГимапни! ДНК |)i(>i6a 1 И 1*). а также Hila <ш(»чкч|смма muoAiirlii шши'шши ui выпиши' 'ji|«if>u 4 и 4' ) < iihumi

ddCTP.

Vbaiaitu И fit. И мо.до1«и.аиии mMíUinv*! cjifua) И t. iAmuu шшшш*** a iv in ыыулн «m

ф|и1ЪК.'Н|Г (lUk|i|«J >ll|OBi.).

рам используют реакцию абортивного синтеза. Оказалось, что му-тантная РНК-полимераза не способна осуществлять абортивный синтез на фрагменте ДНК, содержащем А1-промотор фага Т7, даже при увеличении концентрации затравки СрА до 1,5 мМ (Км для дикого типа 50-70 мкМ) и иТР до ШмМ (Км для дикого типа 10-30 мкМ). Эти данные можно объяснять как иотерей сродства СрА и (или) 11ТР к центрам Р и N. так и потерей способности РНК-полимеразы катализировать образование фосфодиэфирной связи. Для выбора между этими возможностями необходимо прямое определение связывания нуклеотидов с РНК-нолимеразой, не зависящее от способности РНК-полимеразы образовывать фосфодиэфирную связь. К сожалению, существующие в настоящее время методы прямого определения связывания ЫТР и динуклеотидов с центрами Р и N весьма ненадежны из-за низкого сродства центров Р и N к соответствующим. Поэтому мы ограничились изучением связывания с мутантной РНК-полимераэой инициирующих тринуклеотидов, стабильное связывание которых поли-меразой дикого типа было уже продемонстрировано ШШг еЬ а1, 1985).

В работе гине е1 а1., 1985 для выделения тройного комплекса и удаления несвязавюейся РНК осуществляли гель-фильтрацию реакционной смеси, содержащей ДНК-матрицу, полимеразу и затравочную РНК. Гораздо удобнее оказалось выделять и изучать свойства таких комплексов при иммобилизации на зернах ЭТА-сорбента РНК-полимеразы с олигогистидиновым якорем. В этом случае после простого центрифугирования вместе с фракцией супернатанта можно эффективно удалить из реакционной смеси несвязавшуюся РНК и мономерные ШР.

Предварительно нами было показано, что удельная активность полимеразы дикого типа не изменилась после ее иммобилизации на сорбенте, и она может так же эффективно осуществлять все стадии транскрипции, как и фермент в свободном состоянии.

При использовании в качестве матрицы фрагмента ДНК, содержащего 1ао1!У5-промотор, было обнаружено, что мутантная БОП-РНК-по-лимераза связывает экзогенный инициирующий тринуклеотид ОрАрА

1&

(комплементарный -1,+1 и +2 положениям промотора) столь же эффективно, как и РНК-полимераза дикого типа, но, в отличие от последней, не способна удлинять его при добавлении соответствующего NTP. Отсюда можно было бы сделать вывод о том, что центр Р * у мутанта не поврежден, а поврежден центр N, или каталитический центр. Однако опыты с poly(dAT) показали, что природа дефекта у DDD-РНК-полимеразы является более сложной. На этой матрице РНК-полимераза дикого типа образует стабильные комплексы с ApUpA, но не образует таких комплексов с UpApU, хотя оба нуклео-тида эффективно удлиняются РНК-полимеразой при добавлении соответствующих NTP. Предполагается, что эти два праймера по разному связываются с РНК-полимеразой: ApUpA располагается в центре Р с образованием стабильного посттранслокационного комплекса, а UpApU в центре N в виде нестабильного претранслокационного комплекса, не регистрируемого имеющимися методши (Silvester and Kashel, 1984). Наши опыты показали, что DDD-PHK-полимераза, в отличие от РНК-полимеразы дикого типа, стабильных комплексов с ApUpA не образует, но образует комплекс с UpApU. Ни тот ни другой тринуклеотид DDD-PHK-полимераза удлинить не способна. Приходится предположить, что у DDD-РНК-полимеразы изменен как центр Р (причем это изменение не проявляется на lacUVS-промоторе), так и способность транслокации нуклеотида. Для проверки этого предположения необходимы дальнейшие эксперименты, ь частности с промоторами, различающимися по последовательности инициирующих три-нуклеотидов.

Так или иначе, можно утверждать, что у DDD-РНК-полимеразы практически полностью нарушена способность к полимеризации РНК. При этом полностью сохранена способность правильно взаимодействовать с промотором и, по крайней мере частично, сохранена способность взаимодействия с тринуклеотидами.

* * *

Изучение свойств РНК-полимеразы, содержащей мутацию ь эволюционно -консервативной области Ü гена гроС, показало, что Фермент не способен осуществлять транскрипцию, но при этом сохранил 1в

вое свойства связывания РНК-полимеразы с ДНК. Мутантный фермент обнаружил нарушение в одном из центров удержания РНК-продукта или связывания трифосфата и, как следствие, проявил отличный от полимеразы дикого типа характер связывания затравочной РНК. Это свидетельствует об участии области 0 0'- субъединицы в формировании одного из этих центров.

Глава 3. "Шагание" РНК-полимеразы по матрице: изучение элонгации транскрипции с помощью иммобилизованного фермента.

В течение ряда лет для исследования транскрипционного цикла используется метод "шагания" по ДНК-матрице. Этот метод заключается в выделении гомогенных транскрипционных комплексов, содержащих РНК-продукт строго определенной длины, путем остановки на выбранной позиции синтеза РНК при использовании неполного набора субстратов. Получение такого комплекса описано-в первой главе. Затем смесь субстратов удаляют с помощью гель-фильтрации, а после добавления соответствующего нуклеозидтрифосфата последовательно удлиняют РНК-продукт на очередное звено. Последовательно повторяя эти манипуляции, можно достигнуть РНК-продукта нужной длины. Такой метод шагания но матрице страдает многими недостатками, так как каждая гель-фильтрация приводит к разбавлению пробы и потерям фермента, что сильно ограничивает число реально осуществимых шагов. Кроме того, процедура весьма трудоемка и не очень хорошо воспроизводима.

Использование РНК-полимеразы, иммобилизованной на твердом носителе за счет олигогистидинового якоря, позволило радикально усовершенствовать метод шагания по матрице. Благодаря иммобилизации РНК-полимеразы на сорбенте появляется возможность с помощью простого центрифугирования сорбента эффективно удалять нуклеотиди из реакционной смеси, при этом практически не происходит потерь фермента. В этой системе удается следить не только за прямой реакцией роста цепи РНК, но и за обратной реакцией укорочения РНК в результате пирофосфоролиза.

3.1 Стабильность коротких РНК в составе тройного комплекса.

Мы изучили зависимость стабильности РНК в составе тройного комплекса на ро1у((1АТ)-матрице от длины РНК продукта и от природы 3'-концевого нуклеотида. Выделенные тройные комплексы инкубировали различное время перед удлинением до следующей позиции. По доле удлиненной РНК в препарате судили о ее стабильности в составе тройного комплекса, так как РНК, диссоциировавшая из активного центра не удлиняется РНК-полимеразой.

Выяснилось, что стабильность комплекса зависит от природы 3'-концевого нуклеотида: время полужизни ApUpA РНК приблизительно VI мин., в то время как комплекс с UpApll РНК не бил получен из-за его нестабильности. Стабильность четнрехзвенных РНК тагане радикально различается: комплекс с ApUpApU РНК обладает временем полужизни, равным 10 ти минутам, а UpApUpA РНК - 50-60 минутам.

Комплексы, содержащие РНК длинной более Ь-ти нуклеотидов, как оказалось, полностью стабильны в условиях эксперимента. Вероятно, это объясняется появлением дополнительных контактов РНК с полимеразой, стабилизирующих РНК-продукт в составе комплекса.

Полученные данные свидетельствуют о том, что :3'-концевой пурин стабилизирует тройной комплекс, ь то время как пиримидин ь этом положении дестабилизирует его. Как известно, инициирующим нуклеотидом транскринтов прокариот, за редким исключением, является пурин. В сьязи с этим можно предположить, что короткие РНК с 3'-пурином предпочтительно находятся в более стабильном пост-транслокационном состоянии РНК-полимеразы, аналогично инициирующему нуклеотиду, а РНК, имеющие 3'-концевой пиримидин, большее время находятся в сайте элонгирующего нуклеотида (N-сайт), т.е. в нестабильном, предположительно, претранслокациошюм состоянии-полимеразы. В последнем случае нестабильность РНК в составе комплекса может объясняться как дестабилизацией РНК в процессе транслокации, так и более слабыми взаимодействиями РНК-продукта с 3'-концевым пиримидином с тройным комплексом в погттроанелока-

Арир*АрирА Арир*АрирАрЧ

ЮН1Н'Пф. ГВ1|К*]ЮС(|>. концентр, тцху^х^).

I» I* «Е

ч ч * * * !?*!!!?

г- ё й 3

Арир*ЛрирА-> >

- >

Арир"А ррр*Ар11рА

ррр'Ари

!

ррр*А

4 Чувсгвиташлость к экэттаточу нирофосфату стерильных тройных комплексов на (<1АТ) матрице.

"табильные тройные комплекш на ДНК, содержащие радиоактивно меченную АрирАрирА :/>ч 1-6) И АрирАрирАри (пробы 7-11) РИК, инкубирояали 5 минут при комнатной темпе-

с возрастающими количесплми экзогенного пирофосфата. Анализ продуктов реакции юлили с помощью электроф^ги в 23 % ПААГ, содержащем 8\1 мочевину. Сказаны концентрации довавпенного неорганического пирофосфата и продукты пирофосфо-га.

ционном состоянии.

3.2. Чувствительность РНК в составе тройного комплекса к

пирофосфоролизу

Как известно, реакция пирофосфоролиза РНК является обратной ферментативной реакцией процесса полимеризации. Из общих соображений следует, что для осуществления реакции З'-концевой нуклео-тид должен находиться в М-сайте, а РНК-полимераза - в претранс-локационном состоянии. Поэтому с помощью реакции пирофосфоролиза можно проверить выдвинутую выше гипотезу о причине нестабильности коротких РНК с 3'-концевым пиримидином.

При анализе тройных комплексов, иммобилизованных на ЫТД- сорбенте, выяснилось, что РНК с 3'-концевым уридином сильно подвержена деградации даже в отсутствии экзогенного пирофосфата. При этом укорочение РНК происходит до ближайшего аденина (Рис. 4). В то же время пирофосфоролиз РНК, содержащей З'-концевой аденин, происходит только при концентрациях экзогенно добавленного пирофосфата выше 0.5 мМ (Рис. 4). Следовательно, чувствительность РНК к пирофосфоролизу отличается более чем на три порядка в зависимости от природы концевого нуклеотида. Это подтверждает нашу гипотезу о том, что РНК с 3'-концевым пиримидиновым нуклеотидом находится большее время в претранслокационном состоянии. Этим и объясняется нестабильность коротких РНК, содержащих З'-концевой пиримидин, в составе тройного комплекса и их повышенная чувствительность к обработке пирофосфатом.

В работе также изучали влияние ингибитора транскрипции -стрептолидигина - на реакцию пирофосфоролиза. Выяснилось, что он является конкурентным ингибитором этой реакции.

ВЫВОДЫ

1. Получена делеционная мутация , удаляющая 10 аминокислотных остатков из эволюционно консервативного района С о-субъединицы 20

Р11К-полимеразы. Анализ транскрипционной активности мутантного фермента In vitro показал, что полимераза в результате мутации утратила способность образовывать стабильный открытый промотор-ный комплекс. При этом стабильность элонгационного комплекса не изменилась. Это свидетельствует о различной природе взаимодействия фермента с ДНК на инициаторной и элонгационной стадиях транскрипционного цикла.

2. Получена мутация в эволкщионно консервативном районе D D'-субъединици РНК-полимеразы, полностью блокирующая образование фосфодиэфирной связи. Транскрипционный цикл мутантного фермента изучен в тестах in vitro. Выяснилось, что данная мутация не повлияла на связывание фермента с ДНК и на образование открытого комплекса, но изменила характер связывания экзогенных РНК, используемых для затравки синтеза, что привело к неспособности фермента образовывать фосфодизфирную связь.

Свойства полученных в работе РНК-полимераз свидетельствуют о том, что функции образования открытого промоторного комплекса и каталитическая функции осуществляются независимо.

3. Изучены свойства РНК-полимеразы, содержащей на -СООН конце В'-субъединип^ "олигогистидиновий якорь" из шести последовательных остатков гистидина. Показано, что внесение этого якоря не отразилось на транскрипционной активности фермента In vitro. С помощью иммобилизованной полимеразы на гетерополимерной poly(dAT) были получены тройные комплексы, содержащие короткие РНК разной длины. Изучено, каким образом влияет длина РНК-продукта и природа З'-концевого нуклеотида на стабильность РНК в составе комплекса, а также на ее чувствительность к пирофосфоро-лизу. Выдвинута гипотеза о том, что РНК с 3'-концевым пиримиди-новим нуклеотидом находится большее время в претранслокационном состоянии, чем РНК с З'-концевым пурином. Изучено влияние-ингибитора сгрептолидипша на пирофосфоролиза. Показано, что стреп-толидигнн является конкурентным ингибитором этой реакции.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных автором по теме диссертации:

1. Martin Е., Sagltov V.. Burova., Nlklforov V.,Goldfarb A..

(1991). " A lethal beta suburilt mutation destabilising the "open" promoter complex of E. coll RNA pollmerase". Molec. Genet. Bact. Phage. Meeting. Gold Spring Harbor.

2.Martin E., Sagltov., Burova E., Nlklflrov V., Goldfarb A.

(1992). "Genetic dissection of the transcription cycle:a mutant RNA polymerase that cannot hold onto promoter". J.Blol.Chem., V.267 (28), 20175-20180.

3. Kashlev., Martin E., A. Polyakov, K. Severlnov, Nlklforov V. and Goldfarb A. (1993). "Histldine-tagged RNA polymerase: dissection of the transcription cycle using Immobilized enzyme". Gene. Принята в печать.