Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия регуляторных факторов с РНК-полимеразой Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нечаев, Сергей Юрьевич

Актуальность темы.

1. Обзор литературы.

1.1. Введение.

1.2 Основные принципы регуляции транскрипции.

1.3. Роль нуклеотидной последовательности промотора.

1.4. Теоретическое предсказание промоторов.

1.5. Бесфакторная активация транскрипции.

1.6. Влияние конформации ДНК на силу промотора.

1.6.1 Взаимовлияние промоторов.

1.7. Регуляция транскрипции небелковыми эффекторами.

1.8. Регуляция транскрипции рибосомальных РНК.

1.9. Регуляция транскрипции с помощью ковалентной модификации РНК-полимеразы.

1.10. Регуляция транскрипции на уровне взаимодействия сигма факторов с кор-ферментом РНК-полимеразы.

1.11. Регуляция альтернативных сигма факторов.

Регуляция количества as.

1.12. Регуляция других альтернативных сигма факторов.

1.13. Механизм замещения основного сигма фактора.

1.13.1. Поиск антисигмы основного сигма фактора.

1.14. Регуляция транскрипции белковыми регуляторами.

1.15 Репрессоры транскрипции.

1.15.1. Пассивная репрессия.

1.15.2. Сайленсинг.

1.16. Активная репрессия.

1.17. Дополнительные операторы.

1.18. Активация транскрипции.

1.19. Концепции работы активаторов.

2. Материалы и методы.

2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и бактериофаги.

2.2. Бактериальные среды.

2.3. Синтетические пептиды.

2.4. Электрофорез.

2.5. Компетентные клетки и трансформация бактерий.

2.6. Приготовление ДНК.

2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.8. Клонирование.

2.9. Разделение мутаций gp2j3.

2.10. Направленный ПЦР-мутагенез.

2.11. Экспрессия субъединиц РНК-полимеразы.

2.12. Выделение тел включения гиперпродуцированных субъединиц РНК-полимеразы Е. coli.

2.13. Выделение альфа субъединицы РНК-полимеразы.

2.14. Выделение gp2 и его производных.

2.15. Выделение сигма субъединицы РНК-полимеразы.

2.16. Сборка РНК-полимеразы Е. coli из отдельных субъединиц in vitro.

2.17. Приготовление РНК-полимеразы из клеток.

2.18. Транскрипция in vitro.

2.19. Аффинная хроматография на Ni++-NTA агарозе.

3. Результаты и обсуждение.

3.1 Изучение молекулярного механизма ингибирования

РНК-полимеразы Е. coli продуктом гена 2.

3.1.1. Локализация мутаций устойчивости к gp на р'-субъединице РНК-полимеразы Е. coli.65.

3.1.2. Район 1158-1188 (3'-субъединицы- место связывания gp2 на РНК-полимеразе.

3.1.3. Gp2 подавляет формирование открытых промоторных комплексов.

3.1.4. Gp2 не влияет на взаимодействие РНК-полимеразы с -10 элементом промотора.

3.1.5. Взаимодействие консервативного района 4.2 фактора а с -35 элементом промотора является наиболее вероятной мишенью gp2.

3.1.6. Распространенность функции gp2 среди бактериофагов.

3.1.7. Ингибирование транскрипции белком gp2(3.

3.1.8. Роль gp2 в развитии бактериофага Т7.

3.2. Изучение мутаций в факторе а70, нарушающих взаимодействие а-фактора с кор-ферментом РНК-полимеразы Е. сой.

3.3. Изучение механизма активации транскрипции промотора virB Agrobacterium tumefaciens.

Список сокращений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимодействия регуляторных факторов с РНК-полимеразой Escherichia coli"

Актуальность темы. Транскрипция, синтез РНК на матрице ДНК, является основным этапом, координирующим реализацию генетической информации. Транскрипционный аппарат клетки включает в себя три основных компонента - информацию, содержащуюся в ДНК, РНК-полимеразы -ферменты, осуществляющие транскрипцию, а также факторы, осуществляющие тонкую настройку РНК-полимераз и тем самым регуляцию транскрипции.

Изучение транскрипции предполагает решение двух основных проблем: установление структуры и функции РНК-полимеразы, с одной стороны, и понимание регуляции транскрипции, с другой. Важным этапом в изучении структуры и функции РНК-полимеразы послужило опубликование кристаллической структуры кор-фермента РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus aquaticus, что открыло возможность для систематизирования ранее полученного материала, а также для планирования новых экспериментов. К сожалению, получение кристаллической структуры лишь одной из множества возможных конформаций РНК-полимеразы не дает ответы на многие вопросы и, в частности, на вопрос о механизмах работы РНК-полимеразы на разных стадиях транскрипционного цикла.

Одним из перспективных подходов к изучению механизма транскрипции является изучение модуляции РНК-полимеразы транскрипционными факторами. Вирусы бактерий, бактериофаги, являются одним из наиболее ценных источников транскрипционных регуляторов, так как сочетают в себе большое разнообразие доступного материала с уникальностью используемых путей взаимодействия с транскрипционным аппаратом клетки.

Помимо чисто научного, изучение транскрипции несет в себе и практический интерес, открывая пути к манипуляции микроорганизмами в интересах человека, например, к разработке видоспецифичных антибиотиков на основе бактериофаговых ингибиторов транскрипции.

Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение транскрипционных факторов, взаимодействующих с РНК-полимеразой Е. coli на стадии инициации. В задачи данного исследования входило:

1) Изучить механизм ингибирования РНК-полимеразы Escherichia coli белком gp2 бактериофага Т7.

2) Установить район(ы) фактора с , принимающие участие во взаимодействии с кор-ферментом РНК-полимеразы Escherichia coli.

3) Изучить детерминанты видоспецифичности регуляции транскрипции промотора VirB Agrobacterium tumefaciens.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе исследован молекулярный механизм ингибирования РНК-полимеразы Escherichia coli белком gp2 бактериофага Т7. В частности, охарактеризованы мутации, приводящие к устойчивости РНК-полимеразы Escherichia coli к gp2. Показано, что gp2 является первым известным ингибитором транскрипции, взаимодействующим с (З'-субъединицей, а также первым известным фактором

70 транскрипции, нарушающим взаимодеиствия а с промотором, место связывания которого находится на кор-ферменте РНК-полимеразы.

Получены свидетельства в пользу того, что исследование механизма взаимодействия gp2 и РНК-полимеразы может быть перспективным для разработки антибиотиков.

В работе использован метод пептидного сканирования для анализа мутаций в белке а70, нарушающих взаимодействие с кор-ферментом РНК-полимеразы Escherichia coli. Данный метод может применяться для изучения межсубъединичных взаимодействий в РНК-полимеразе.

Впервые показан молекулярный механизм развития патогенности растительного паразита Agrobacterium tumefaciens.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков. Библиография включает в себя 253 названиг, в том числе 4 русских и