Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутации в гене rpoB, влияющие на взаимодействие РНК-полимеразы Escherichia coli с субстратами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Мутации в гене rpoB, влияющие на взаимодействие РНК-полимеразы Escherichia coli с субстратами"

V

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 557.214

ПОЛЯКОВ Андрей Павлович

МУТАЦИИ В ГЕНЕ гроВ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Escherichia coli С СУБСТРАТАМИ

(03.00.03 — молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москва) и Колумбийском университете (Нью-Йорк).

Научный руководитель:

доктор биологических наук у ¿^¿»^ В. Г. Никифоров Официальные оппоненты:

доктор биологических'наук, Машко

кандидат биологических наук А. Я. Коц

Ведущая организация:

Институт Биоорганической Химии им. М. М. Шемякина

/С

Защита состоится 16 ноября 1993 года в . / . часов на заседании Специализированного совета при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ генетики

Автореферат разослан « ^ -»1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета:

кандидат биологических: паук В. И. Щербакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. ДНК зависимая РНК-полимераза нолязтсь одним из основных ферментов, принимающих участие в экспрессии генов. Холофермент РНК-полимеразы Escherichia coli сформирован из каталитически активного кора и ассоциированного с ним фактора инициации.ст. В кор входят В'-субъединица (1407 аминокислотных остатков), ß-субъединица (1312 а.о.), а также две а-субъединйцы (329 а.о.). Наиболее функционально охарактризооана ß-субъединица. Она состоит из трех доменов, соединенных между собой эволюцонно-вариабельными незначащими участками. Меньше всего исследована функциональная роль N-концевого домена, включающего в себя два коротких эволюционно-консервативных сегмента А и В (рис. 1). Показано, что рпг, аминокислот из сегмента В необходимы для связывания ингибитора РНК-полимеразы, рифампицина. В центральном домене локализованы два основных района устойчивости к рифампицину: I (а.к. 507-533) и I! (а.к. 563-572). Район II приходится на сегмент D, один из четырех эволюционно-консервативных сегментоо этого домена. Одиночная мутация устойчивости к рифампицину нчйдена в положении 687. Ряд мутаций, полученных в рифампициновой области приводит к изменению некоторых каталитических и терминационных свойств РНК-полимеразы. Две мутации, дестабилизирующие связывание РНК-полимеразы с промоторсм, обнаружены в центральном домене. Одна из них, Е813К, приходящаяся на сегмент Е, приводила также к сорьез^ым каталитическим нарушениям. В С-концевой домен РНК-полимеразы Е.соП ■ входят два высоко-консервативных сегмента. С помощью генетических исследований и экспериментов по химической модификации было продемонстрировано, что амийокислотные остатки Lys1065 (сегмент Н) и His1237 (сегмент I) находится в непосредственной близости от инициирующего субстрата в открытом промоторном комплексе. В сегменте Ч обнаружены многочисленные жизнеспособные мутации, влияющие на терминацию.

Цель и задачи исследования. Для того, чтобы полнее охарактеризовать 'функциональную роль эволюционно-консервативных сегментов ß-субъедин.щы РНК-полимеразы в работа были поставлены следующие задачи: 1) сконструировать мутации, приводящие к аланиновам заменам в сегменте D -С559А, РТЕ и CPTt; в сегмента Н - PSRM, а так же в сегменте I - REME; 2) исследовать фенотипы полученных мутантов в генетических ситемах in vim, 3)

изучить биохимические свойства и нарушения транскрипционного цикла у мутангных РНК-полимераз.

Научная новизна и прагггическал ценность. Б данной работе был разработан метод сверхпродукции ß'-субъединицы, несущей олигогистидиновый якорь и включения ее в РНК-полимеразу при сборке in vitro. Было показана роль эволюционно-консервативных сегментов Н и I в формировании участков связывания субстратов РНК-полимеразы. Продемонстрированко, что мутации в сегмонто D приводят к значительным нарушениям терминационных свойств РНК-полимеразы и устойчивости к ингибиторам транскрипции. Установлено, что расщепление РНК в транскрипционном комплексе но есть присущее РНК-полимеразе спойство, как было принято считать, а индуцируется ассоциированным с полимеразой фактором, продуктом гена дгеА.

С груюура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, а также списка литературы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включая 1 таблицу и ¿^рисункоз. Библиография включает в себя названий, в том числе 1 русское и иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В данной работе были использованы штаммы и плазмиды из коллекции ИМГ РАН (Москва), лаборатории А.Гольдфарба (Колумбийский университет, Нью-Йорк) и ряда других источников.

Конструирование мутаций в гене гроВ, клонированном в плазмиде pUCl9, .i осуществляй с помощью сайт-специфического мутагенеза (в случае мутаций REME, СРГЕ, РТЕ и С559А) с клонированием соответствующих фрагментов гена в фаге М13тр10, а также с помощью методики, основанной на ЦПР (для мутации PSRM).

Определение последовательностей ДНК для подтвеждения наличия мутаций проводили на приборе для автоматического определения нуклеотидных последовательностей фирмы Beckmann (США) с использованием флуоресцентной метки по методу Сэнгера (Sanger, 1977).

Фенотипический анализ мутаций, полученных в плазмиг'нэй копии гена гроВ, проводили по методике описанной Кашлевым и др. (Kashlev et al, 1990).

Для последующих биохимических исследований РНК-пслимсразу, несущую мутактную р-субъединицу собирали in vitro иг изолированных субъединиц (Zalenskaya et а!, 1989). Собранную РНК-полимеразу очищали с помощью голь-фильтрации и ионообменной хроматографии. РНК-полимеразу, содержащую Р'-субъединицу с олигогистидиновым якорем, оч/щали с помощью аффинной хроматографии нг< NTA-сорбенте.

Анализ транскрипционной активности мутантных РНК-полимераз проводили на следующих матрицах: ДНК фага Т4; промоторныа фрагменты Т7А1, rrnB Р\, ladJV5, а также po!y[dAdT].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ЭВОЛЮЦИОНЧО-КОНСЕР8А1ИВНЫХ УЧАСТКОВ р-СУБЪЕДИНИЦЫ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ E.coli

Для мутагенеза были вобраны участ;а-, оодэ.сжэщие кластеры высококонсервативных, а в большинстве случаев инвариантных аминокислотных остатков. Мы попытались отказаться от внесения делеций в р-субъединицу, т.к. известно, что в делоционных мутантах нередко происходят прсстрзн лзенио-структурныэ изменения, приводящие к нарушению сборки ^Н'/ч-полимеразы. С работе был использован метод множественного аланинсвсгс мутагенеза, суть которого заключается в замене сразу нескольких аминокислот на аланины. При этом потенциально-функциональные аминокислотные остатки как-бы "срезаются", но сохраняется сам пептидный остов белка. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей показал, что в результате произведенных замен, вторичная структура белка практически не изменялась.

В данной работе с помощью сайт-специфического мутагенеза были сконструированы следующие мутации в гене р-субъединицы РНК-полимеразы Е.со//.: REM? (сегмент I) и PSRM (сегмент Н) в высоко-консервативном С-концевом домене; СРТЕ, РТЕ и С559А (сегмент D) в области устойчивости к рифампицину (рис. 1). Получая замену С559А , мы надеялись выяснить роль единственного инвариантого цистеина 559 в р- субъединице РНК-покимеразы.

2. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ.

Все мутации, за исключениэм PSRM, были получены на основе плазмиды pMKSe. Чувствительная к рифампицину (Rifs) аллег.о гена гроВ на этой плазмиде находится под контролем /ас-промотора, индуциируемого ИПТГ. В случае PSRM использовали родственную плазмиду рМКА92 с устойчивой к рифампицину (RilR) аллелью гена гроВ.

При индукции ИПТГ клетки E.coli, несущие на плазмиде мутацию REME, теряли способность к росту. На основании этого мы отнесли мутацию REME к доминантным леталям. Все остальные мутации позволяли клеткам E.coli расти в присутствии ИПТГ. Аллель гена гроВ с мутацией PSRM была классифицирована как рецессивная леталь в связи с тем, что при индукции плазмида рМКА92 с введенной мутацией была неспособна сообщать чуьствигсяьным к рифампицину клеткам Е.соЧ, Ritn фенотип. При этом нужно принимать во внимание, что во время индукции, около 90% клеточной полиморазы включает в себя (î-субъединицу плазмидного происхождения. Мутации СРТЕ и С559А также были признаны рецессивными деталями на основании аналогичных критериев. Мутация РТЕ проявила себя как жизноспособнлп в данной системе.

Рецессивные лэтали и мутация РТЕ были таже проверены в системе, где хромосомная копия р-субъединицы несет амбер-мугацию. Рост таких клоток поддерживается за счет плазмиды, кодирующей супрассор амбер-мутации. В присутствии плазмиды, несущей жизнеспособную копию р-субъединицы, возможна потеря плазмиды с супрессором.

Это тестируется по возникновению белых колоний на чашках с X-gal и ИПТГ, возникающих в результате того, что потеря супрессора приводит к прекращению экспрессии гена р-галактозидазы с амбар-мутацией, находящегося на хромосоме. В данном тесте мутации PSRM, СРТЕ и С559А не позволяли клеткам сбрасывать супрессор, а клетки, несущие плазмиды с мутацией РТЕ и с геном дикой р-субъединицы образовывали белые колонии с равной частотой. Таким образом, в обих тестах все мутации, за исключениэм РТЕ, проявляли летальное действие.

Н1237Л REME

1 Ii

ISO CP T E

vhfthycfvcmetfe

Sullol. Urtl HUI. Чм< fc»« ft»«»

ДдИ Am j

Boom

I"!""!' s* •I*V»

t'G.OW.U* .f.. . . *.*S*

L*H*0F*KI* 8**C*

L^A'D»"!' • t" . . ..•c«

I,'».l»*ll** •д.. •HAV«

LO'SOF'WL* TAD* ■EAC«

LG*SC**liL* •ST* • . • E AC*

Ll*r>4*FI' •VH* •0 •TPS'

Ll'eSWJfl • •VH* •o •SFC*

»••M'lYf' IIDV •• И••QV *

1095 PSRU 1105

DIVLKMGVPSÍUNI0 0ILET

• »•••••.......y......

...................

•u if'..............

..............v**-r*c

• y]«3.....

•t,IV**H*:*.*-TV**LI"A •*1*»*HAL**'*T****U*A

•ЦУ'НАГ"'!»''»"«

•llI*'HAI*'*,TVAHl.I*e

*4i**>uf**,*t**iify*S

•vi1*stsif"kt*shli*v

/ A AAA

/ ! Ill 1280 я EUE 1260 oo';aofgcqbfgeuev»alea

•....................•(¡••HQ.

.............••••a

H*B*KQ**.*V*e.*.****G

BE' *L*"***l!OV*ia

K'*E**L*.....ft DC* 10

.............ч0с-1-

H*RE**L*V**"*RDTVIO rSPD"L*",**,R0C3t* n.nD..L...•••HDC3IS

ÍSÍE**L*L****FIDC*:S AKR0**V......AD**X»

яклн**1*у**.*яо**:а

АКПО**1К.****ВОС*1*

Рисунок 1. Мутации в конссроативных областях р-суъединкц'г! РНК-полимеразы B.coll. ß-суъединица (суммарный размер -1342 аминокислотных остатков) изображена п виде темного отрезка. Светлые окошки представляют эволюционно-консервативные сегменты. Над изображением ß-суъединицы показаны летальные мутации, полученныо в консервативных областях, а также, область Rif^ мутаций и незначащая область. В нижней части более детально представлены области мутагенизиоованные в данной работе. В первой строке приведпна аминокислотная последовательность соответствующих /мстков ß-суъединицы РНК-лолимеразы & coli. '• Под ней выравнены последовательности из гомологичных субъединиц следующих организмов: Pseudomonas putida, Bacillus subtiliis, Mycobacteium leprae; хлоропластов из видов: Spinach, Nicotiana, Marchatia; Thermococcus, Sulfolobus acidocaldarius, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium haiobiwn, РНК-полимераза II человека, РНК-полимераза Ч дрозофилы, РНК-полимераза II дрожжей, РНК-полимераза III дрожжей, РНК-полимераза III дрозофилы, РНК-полимераза I дрозофилы, РНК мо.1имераза I дрожжей и вируса коровьей оспы. Звездочки символизируют аминокислоты, идентичные ß-суъединицв Е.соИ.

3. БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ

Разработанный в лаборатории А. Гольдфарба метод позволяет собирать in vitro РНК-полимэразу, содержащую летальные для клэткм субъединицы. Метод основан на том, что клонированные гены субъединиц находлтся под контролем индуцируемых промоторов, что позволяет клетке накопить значительное количество субъединиц, несмотря на их летальность. В данной работе впервые была продемонстрирована возможность сверхпродукции р1-субърдиницы с олигогистидиновым якорем на С-конце, а также возможность использовать эту модифицированную субъединицу для сборки РНК-полимеразы in vitro. РНК-полимераза, несущая такой якорь способна аффинно связываться с N¡?+ ионами, сорбированными на специально модифицированной агарозе (NTA-сорбенте). Эго открыло путь для новых тестов и методов исследования мутаций в генах субъединиц РНК-полимеразы. В данной работе были собраны следующие мутантные РНК-полимеразы, содержащие мутантные р-субьединицы, а также либо модифицированную, либо интактную Р'-субъединицу: REME, PSRM, СРТЕ, С55ЭА, PTE, Н1237А, K1065R и Е813К, а также РНК-полимераза никого типа в качестве контроля. Все препараты РНК-полимераз после сборки содержали стехиометрические количества с-фактора.

_ Муган1ы REME, PRSM и СРТЕ оказались абсолютно неактивными в стандартном тесте активности РНК-полимеразы на суммарной ДНК фага Т4 in vitro. РНК-полимераза с мутацией С559А проявила около 30% активности по сравнению с диким типом.

Дпп того, чтобы выяснить природу дефектов, вызываемых мутациями, внесенными в р-субъединицу РНК-полимеразы, мы исследовали мутантные полимеразы на индивидуальных промоторных фрагментах. Это поззоляет вычленить затронутый мутацией этап в транскрипционном цикле РНК-полимеразы, а также выявить промоторную специфичносить мутантнои РНК-полимеразы. На рисунке 2 показана способность мутантов, неактивных в тесте на ДНК фагаТ4, олонгировать на транскрипционном фрагменте содержащем промотор А1 фага Т7. Стандартные условия этого теста: 5-кратный молярный избыток промоторного фрагмента над РНК-полимеразой, 0,5 мМ СрА - затравки синтеза и 0,1 мМ NTP. Мутанты СРТЕ и С55ЭА синтезировали полноразмерный транскрипт в количествах, сравнимых с полимеразой дикого типа. Единственным отличием было увеличенное количество первого абортивного продукте CpApü. В этих же условиях мутанты по С-концевой части р-субъедиг^цы оказались

абсолютно неспособными синтезировать полноразмерный транскрипт. REME РНК-полиМераза образовывала лишь незначительное количество CpApU, PSRM РНК-полимераза так же синтезировала только перзый абортиэный продукт, но в больших количествах. Было обнаружено, что при увеличении концентрации нуклеотидов или 1ЛР значительно повышалась зктивнооть REME и PSRM РНК-полимераз в абортивном синтезе РНК. Однако, даже присутствие 1 мМ NTP не стимулировало образование полноразмерного транскрипта у данных мутантов. Из этого эксперимента следовало, что мутации REME и PSRM затрагивают какие-то важные для РНК-полимеразы участки, необходимыэ для осуществления транскрипции. Исследование поведения мутантных РНК-полимераз in vitro в имеющихся тестах помогло выяснить какой этап транскрипционного цикла затрагивали данные мутации.

3.1. Образование стабильного открытого промоторного комплекса мутантными REME и PSRM РНК-полимеразами

Первым этапом в транкрипционном цлкпв является связывание РНК-полимеразы с промотором и образование открытого промоторного комплекса. Способность мутантных РНК-полимераз формировать открытый комплексе Т7А1 промотором была исследована в экспепименте с гепарином. Добавление гепарина к свободной РНК-полимеразе предотвращае.- ее еллзывпчие с промотором и, как следствие, приводит к неспособности полиморазы синтезировать РНК. Однако, если гепарин добавляется к уже сформированному открытому промоторному комплексу, то подавление активности РНК-полимеразы практически не наблюдается. Открытые промоторные комплексы, образованные REME и PSRM РНК-полимеразами, оказались устойчивыми к концентрациям гепарина 3-5 мкг/мл.

Это соответствовало устойчивости открытого комплекса РНК-полимеразы : дикого типа. Данный эксперимент доказал, что мутантные РНК-полимеразы способны формировать устойчивый открытый промоторный комплекс и деоокт, вероятно, проявляется на последующих стадиях синтеза РНК.

UTP, мМ NTP, мМ 0,1 0,1

0,1 1 0,1 1 0,1 1 0,1 1 0,1 1 0,1 1

Полноразмерный транскрипт

CpApU

ш. ш iWbt,. _ ■ "У • & - щ N . -ф

/ \ С559А СРТЕ

Дикий тип REME

PSRM

Рисунок 2. Транскрипционная активность мутантных РНК-полимераз и PflK-полимеразы дикого типа на матрице Т7А1. На авторадиограмме видны РНК-продукты, синтезируемые РНК-полимеразами С55ЭА, СРТЕ, дикого типа, REME и PSRM на матрице Т7А1 при инициации с 0,5 мМ СрА. Для REME, PSRM РНК-пслимеопз и феоменга дикого типа показан эффект хонцентрац/-'. нуклеотадог и IJTP на синтез РНК.

3.2. Измененное сродство к инициирующим субстратам у мутантных РНК-попимераз

Сформировав открытый промоторный комплекс, РНК-полимераза начинает синтйз РНК со связывания субстратов реакции -рибонуклеозидтрифосфатев. Первым инициирующим нуклеотидом для большинства генов E.cdiявляется АТР, реже GTP. В экспериментах in vitro показано, что динуклеотиры типа цитидил(3'-5')аденозина (СрА) тоже могут служить инициаторами синтеза РНК, причем константы их связывания значительно ниже, чем для АТР.

Основываясь на наблюдении, что при увеличении концентрации субстратов повышалась активность REME и PSRM РНК-полимераз в абортивном синтезе CpApU, более тщательно была исследована зависимость скорости реакции абортивного синтеза от концентрации субстратов. Рисунок 3 демонстрирует зависимость образования CpApU от концентрации обоих субстратов (СрА и UTP) для РНК-полимеразы дикого типа и для REME и PSRM мутантов. С помощью графиков, построенных в обратных координатах, на основе данных, полученных в этом эксперименте, были рассчитаны кажущиеся константы Михаэлиса (Км) для СрА и UTP. Напомним, что Км отражает такую концентрацию субстрата, при которой достигается скорость реакции равной половине максимальной. В таблице 1 приводятся данные по измеренным К^ для полученных а этой работе и уже описанных раннее мутантов.

Таблица 1. Рассчитанные константы Михаэлиса (Км) для субстратов реакции образования CpApU.

РНК-полимераза ¡ I Км Л™ СрА | Км для UTP ¡ I I

Дикий тип | 32 MKM | 5,6 MKM I

REME | >3500 MKM | 540 MKM I

PSRM | 1000 MKM | 625 MKM I

СРТЕ ! 155 MKM | 4,2 mkM I

PTE | 7 MKM ! 5,4 mkM I

C559A | 16 MKM | 3,6 mkM I

K1065R | нет данных | ЮмкМ |

E813K | I нет данных | 17мкМ I I I

Рисунок 3. Зависимость скорости образования CpApl) на промоторе Т7А1 от концентрации субстратов (СрА и UTP). На графиках представлены кривые накоплении радиоактивного абортивного продукта CoApU за 15 минут при 37°С для РНК-полимеразы дикого типа и мутантов REME и PSRM. Измерение зависимости . скорости реакции от концентрации UTP проводили в присутствии 500 мкМ СрА для всех трех ферментов. Зависимость скорости накопления CpApU от концентрации СрА измеряли для РНК-полимеразы дикого типа при концентрации UTP -100 мкМ, для мутантов - 2500 мкМ.

Приведенные данные показывают, что у REME РНК-полимеразы примерно на два порядка, по сравнению с диким типом, понижено сродство к обоим субстратам реакции. У мутанта PSRN-í десЪокт по связыванию UTP выражен также сильно как у REME, аКмк СрА выше, чем у РНК- топиме? азы дикого типа примерно в 30 раз. Данные мутации являются первыми описанными мутантами РНК-полимеразы Е.соИс такими сильными нарушениями в свя:ывании субстратов транскрипции. Из рисунка 3 видно, что при условии насыщения обоими субстратами скорость реакции синтеза CpApU у мут'-чтов не ниже, чем у РНК-полимэразы дикого типа. Это означает, что данные мутации ко затраызают каталитические участки РНК-полимеразы, позволяя ей нормально осуществлять синтез фосфодиэфирной связи, а скорее всего, серьезно нарушают места связывания обоих субстратов при инициации синтеза РНК. Таким образом, в данной работе удалось локализовать группы аминокислот е. С-концевом домене р-субъединицы, принимающие участие а формировании сайта связывания субстратов РНК-пслимеразы.

Примерно 6-кратное ухудшение в связывании перэого субстрата (СрА) .соблюдается у мутанта СРТЕ. В тоже время мутантные С559Л и РТЕ РНК-полимеразм имели даже большее сродство к СрА, ч-эм полимераза дикого типа. Имеющиеся наблюдения указывают на то, что у всех трех мутантоз по сегменту D нет нарушений в Сгмзывании второго субстрата. Данные мугации, вероятно, не прямо влияют на способность FHK полимеразы связывать су1':стоаты, а могут посредством конформационньк изменений й субъединице изменять это сродство.

3.3. Образования и связывание коротких РНК-продуктов на матрице polvfdAdTI и промоторе lacUV5

Вклад в дефект REME и PSRM РНК-полимераз по ci¡ -ггезу полноразмерного транскрипта на Т7А1 промоторе кроме значительного нарушения сродстза к нуклеотидам, возможно, в::осит пониженная способность связывать Cp/pU. Поскольку CpApU является абортивнь.м и очень быстро диссоциирует, проворить предположение о его повышенной нестабильности у мутанта на магеiu-.э с промотором Т7А1 не представлялась возможной.

Для проверки способности мутантов связывать тринуюъэотиды была использована матрица poly[dAdT], Установлено, что при условиях, когда синтез РНК на polyídAdT] начинется с ApU, первый тринуклеотид (ApUpA) обладает

относительной стабильностью и характеризуется временем полураспада равным 15 минутам при комнатной температуре (Zillig, 1981). В случае UpApU, когда ситез начинается с UpA, для РНК-полимеразы дикого типа не удается зарегистрировать наличие стабильного комплекса этого тринуклеотида с полимеразой.

Все мутантныа РНК-полимеразы, кроме REME были способны синтезировать ApUpA и UpApU на poly[dAdT]. Однако, не все из проверенных ферментов оказались способными к образованию стабильного тройного комплекса с ApUpA. В этом эксперименте экзогенный радиоактивно-меченный ApUpA добавляли к открытому комплексу РНК-полимеразы и poly[dAdT]. После 15-ти минутной инкубации при комнатной температуре препараты пропускали через колонку с сефадексом G-50, чтобы избавиться от несвязавшегося ApUpA. Этот эксперимент показал, что REME, СРТЕ. Н1237А и K1065R были носпособны сопэыпагь ApUpA, в то время как РНК-полимераза дикого типа, PSRM, С559А, Е81ЭК и ARV связывали тринуклеотид.

Несвпзываниэ ApUpA мутантами REME и СРТЕ было такжо почасано на препаратах РНК-полимеразы с олигогистидиновым якорем. В данном опыте от несвязавшогосп меченого тринуклеотида избавлялись многократной промывкой сорбонга с иммобилизованной на нем РНК-полимеразой. Сгязание ApUpA РНК-полимеразой замедляет скорость абортивного синтеза. Эт:;м, од^оятнс», и объясняется наблюдение, что СРТЕ РНК-полиь;граза быпа Гопое активна в абортивном синтезе ApUpA по сравнению с диким типом. 3 то время каг по . синтезу UpApU их актизноти были сравнимы. Результаты по связыванию тринуклеотида СРТЕ РНК-пслимеразой и нарушенное сродстзо к первому инициирующему субстрату указывают, что область, затронутая данной мутацией, может находиться о близости от активного центра РНК-полимеразы.

Неспособность связызать ApUpA REME РНК-полимеразой, с одной стороны подтрорждает гипотезу о неспособности этого мутанта образовывать стабильный комплекс с тринуклеотидом, с другой это может быть связано с общим дефектом REME РНК-полиморазы использовать poly[dAd Т] в качестве матрицы.

Для того, чтобы прямо показать неспособ! юсть РЕМЕ РНК-полимеразы удерживать тринуклеотиды мы использовали матрицу с промотором lacUVS. ЬЛ. Кашлевым (личное сообщение) было показано, что на промоторе !acUV5 тринуклеотид GpApA, подобно ApUpA на po!y[dAdT], явлется относительно стабильным. REME РНК-полимераза в условиях насыщения субстратами (1 мМ

GpA и 2,5 мМ ATP) синтезировала GpApA в количествах, соответствующих активности РНК-полимеразы дикого типа. При использовании "ммобилизспаньой РНК-полимеразы было возможно фракционировать новосиыелиизванный GpApA на тргауклеотид, диссоциированный в раствор (абортиный продукт) и на тот, который оставался связанным в тройном комплексе с PHK-no.ni меразой. Было установлено, что весь новосинтезированный REME РНК-полимеразой GpApA являлсп абортивным, тогда как у РНК-полимеразы дикого типа около 1/3 синтезируемого тринуклеотида в данных условиях оставалось связанным в комт..г.зксе с ферментом. Это демонстрирует, -ito для REME РНК-полимеразы свойственней дефект не только в связывании первых двух субстратов при инициации, но, в отличие от PSRM, и в свпзывании тринуклеотидов.

3.4. Синтез длинных транскр! чтоз REME РНК-полиу ?рззой на рибосом ном прсмоторв гтв Я1

В отличие от большинства промоторов Е.соН, где РНК продукты короче, чэм 8-9, обычно - абортивные, на рпйосомном промоторе Е.соП:г"В R1 при определенных условиях короткие РНК-продукты, начиная с четырехмера, стабилизируются и не диссоциируют з растсор. Начальная последовательность промотора ггпВ Р\ следующая: CpApCpCpApCpUpGpApCpApC. гдо выделенный А служит инициирующим нук/эотидом in visa. С. Борухсвым (Borukhovet.al. 19Э2) было лродемонстрировано, что при использовании в качество затравки СрА у. ь зависимости от присутствия в реакционной смоси определенных нуклатидов для РНК-полимеразы дикого типа возможны два пути инициации синтеза РНК на п ^омотора ггпЗ Я1. Если в смеси, наряду с СрА и нуклеотидами, присутствуй! UTP, то начинается обычный синтез РНК с образованием CpApCpU в качестве основного ¿бортивного продукта. В другом случае, когда ' ;ТР ¡

отсутствует, образовавшийся тринуклеотид СрАрС "соскальзывает" назад на три положения матрицы и все следующие синтезирующиеся РНК-гродукты, начинал с СрАрСрС, являются стабильными.

Оказалось, что это удивительное свойство р/Лосомного промотора формировать стабильные короткие FHK помогает FiEME РНК-,"ол.и/еразе, ' несмотря на все ее дефекты, синтезировать более длинные, '.üm тринуклеотиды РНК-продукты. П"!/. повышенных концентрациях СрА и асех нулей, идов REME РНК-полимераза была способна синтезировать на данном промоторе РНК-

продукты длиной 9 и 10 нуклеотидов (рис 4.). Комплексы РНК-полимеразы в положениях +9 и +10 были стабильны (об этом мы судили по прохождению комплексов через Сефадекс G-50) и неспособны к дальнейшей элонгации при добавлении 1000 мкМ нуклеотидов.

Причину остановки REME РНК-полимеразы в этих позициях удалось установить, изучив поведение полимеразы дикого типа на этом участке рибосомного промотора. При инициации с СрА, в присутствии всех нуклеотидов, у РНК-полимеразы дикого типа не возникает пауз в соответствующих положениях. Если же РНК-полиморазе позволить сформировать 6-мер (СрАрСрСрАрС) путем альтернативного варианта инициации синтеза в присутствии СрА, СТР и ATP, а затем к чистому комплексу добавить заведомо низкую концентрацию всех нуклеотидов (0,5 мкМ), то, как можно видеть на рисунке 4, практически вся попимераза останавливается в положении +9, практически не задеживаясь на позициях +7 и *8. При повышении концентрации нуклеотидов происходит пароход комплекса в дальнейшую элонгацию. Данный эксперимент показывает, в первую очоррдь, что REME РНК-полимераза для синтеза РНК-продуктов +9 и + 10 использовала альтернативный способ инициации (с "соскальзыванием"). Во-вторых, стала понятной причина остановки мутантной РНК-полимеразы. Если допустить, что у ПЕМЕ РНК-полимеразы сохраняется дефект по связыванию нуклеотидов и на болэе поздних стадиях транскрипции, то позиции +9 и +10, нвппющилсм пял полимеразы дикого типа концентрационными паузами, для мутантной РНК-полимеразы могут быть непроходимы по тем же концентра цгонным соображениям.

Чтобы показать наличие нарушений по связыванию субстратов в данной систпмо, мы измерили концентрации нуклеотидов, необходимые для перехода из 6-мора в 7-мер (CpApCpCpApCpU) и из 7-мера в 8-мер (CpApCpCpApCpUpG), для обоих ферментов. Поставленные эксперименты показали, что для ЛЕМЕ РНК-полимеразы требовались примерно на два порядка более высокие концентрации UTP и GTP, чтобы осуществить соответствующий шаг синтеза. Следует отметить, что для мутантной полимеразы в равной степени характерны были нарушения в связывании пуринов и пиримидинов.

1 2 3 4 5 6789

Лолноразмерьый транскрипт

• CpApCpCpApCpUpGpApC (10)

• CpApCpCpApCpUpGpA (9)

■ CpApCpCpAoCpUpG (8)

■ CpApCpCpApCpU (7)

■ СрАрСрСрАрС (6)

CpApG (3)

Рисунок 4. Транскрипционная активность REME РНК-полимеразы на рибосомном промоторе ггпВ Р1. На авторадисг рамме геля показано сравнение актиь^.'стей РНК-полимеразы дикого типа и мутантной REME РНК-лолимеразы в многораундовом тесте на полноразмерный транскрипт с рибосомного промотора ггпВ . ; Р1. Дорожка 1 показывает РНК-продукты, синтезируемые PHK-полимеразсй дикого типа при обычной инициации с СрА в присутствии 100 мкМ всех нуклеотидсв за 3 минуты при 37°С. За 30 минут при тех же условиях REME РЧК псли.мераза синтезировал?, большее количества абортпансго СрАрС и остзнавливг^ась в положениях +9 и +10 (дор. 2). Ста комплексы были неспособны к дальнейшей элонгации при инкубации с 1000 мкМ нуклеотидсв р. течение 5 (дор. 3) и 15 минут (,тор. 4). Позиции +9 и +10 являлись для РНК-полимеолзы дикого типа "концентрационными" паузами. Около 90% РНК-полимеразы останавливалось в положении +Э, в случае, когда 6-мер (дор. 5), образе.рзнкый в результате альтернативной инициаци1 в отсутствии UTP, инкубировали в прису'с:сии 0,5 мкМ NTP в течение " минуты (дор. 6). Далее комг леке +9 был элонгирован при добавлении более высоких концентраций нуклеотлдез -10 мкМ (дор. 7), 100 мкМ (дор. 8) и 1000 мкМ (дор. ü); время инкубации 5 минут.

3.5. Обнаружение Фактора расщепления транскрипта в препаратах РНК-подимеразы

М. Чемберленом и сотр. было обнаружено, что РНК в составе транскрипционного комплекса может подвергаться спонтанному расщеплению (Surratt et al., 1991). В результате этой реакции выщепляется З'-концевая часть транскрипта длиной от 2 до 10 нуклеотидов и образуется новый З'-ОН конец, с которого может быть возобнавлена транскрипция. Расщепление транскрипта рассматривалось как одно из свойств, присущих самой РНК-полимеразе. Так, например, показано, что на рибосомном промоторе ггпВР\ транскрипт в комплексе +7 подвергается описанному спонтанному расщеплению. При этом происходит диссоциация З'-концевого динуклеотида, а 5-мер СрАрСрСрА остается в составе тройного комплекса и может быть дальше элонгировэн. Мы исследовали возможные нарушения в осуществлении данного расщепле.гия мугантными РНК-полимеразэми. Обнаружилось, что расщепление было минимальным нв только у мутантных REME и PSRM РНК-полимераз, но и у контрольного препарата РНК-полимеразы дикого типа, собранной in vitro. Данная реакция расщепления транскрипта наблюдалась ранее при использовании РНК-полимеразы, выделенной из клеток E.coliс помощью стандартного метода. Было обнаружено, что добавление выделенного из клеток фермента к тройному комплексу +7, сформироранному собранной РНК полимеразой, пндуцирооало расщепление транскрипта. Это означало, что препарат РНК-полимеразы, выделенной из клеток, содержал некий свободный фактор, способный действовать на комплекс, образованный другой (собранной in vitro из очищенных субъединиц) полимеразой. Данное наблюдение привело к выделению Г Боруховым белкового фактора расщепления транскрипта. Этот белок, Мг 19 kD, пзлялся продуктом гена дгеА. Таким образом, выяснилось, что препарат РНК-полимеразы, выделенной из клеток, был загрязнен фактором GreA, тогда как собранный фермент, прошедший очистку на колонке с MonoQ, содержал лишь малыо доли примеси этого фактора. Таким образсм, было продемонстрировано, что расщепление транскрипта индуцируется белковым фактором GreA, а но является функцией самой РНК-полимеразы. Открытие первого белкового фактора, действующего на прокариотическую РНК-лолимеразу о стадии элонгации, повлекло за собой целую волн-/ экспериментальных работ во многих лабораториях мира по изучению механизма

расщепления, структуры и свсйстз элонгационных комгшесов и поиска новых факторов траскриции.

Имея в руках чистый фактор GreA, мы исслс-до^пп его действие на комплексы, сформированные мутантными REME и PS°.M РНК-пог'/меразами. Выяснилось, что расщепление транскрипта з комплексах, образованных мутантными РНК-полимеразами, происходит с той же эффективностью, что и у фермента дикого типа. Это говорит о том, что нарушение участков связывания субстратов РНК-полимеразы не сказывается ни на взаимодоверии фермента ; фактором GreA, ни на самом расщеплении.

3.6. Процессивннй пирофосфоролиз на рибосомном промоторе гтВ Р1

исследовали активность мутантых REME и PSRM РНК-полимераз в реакции пирофосфоролиза РНК. Эта реакция является по сасей сути обратной синтезу РНК и выполняется каталитическим центром РНК-полимеразы. Место свя?1лапния пирофосфата составляет часть сайта, в котором происходит связывание нуклоотидов. Результаты экспериментов показали значительное нарушениез активности обоих мутантов в реакции пирофосфорслиза. Реакция пирофосфоролиза наблюдалась на комплексе +6, сформированным иммобилизованными РНК-.полимераслч'и на рибосом-юм npovo'ope гтВР1. Мы оцен-л-'ли концентрацию пирофэсфата, необходимую РНК-пслимеразе для осуществления перехода половины комплексов +6 в более короткие комплексы +5 и +4. РНК-полимеразе дикс:о типа для этого требовалось 5 мкМ пирофосфата, в то время как для PSRM РНК-полимеразы - 75 мкМ, а в случае REME РНК-полимеразы даже при 100 мкМ пирофосфата около 80% комплекса +6 оставались нетронутым. Такой результат говорит о том, что изменения, внесенные данными мутациями, затрагивают к участок связывания пирофосфата в субстрат-связывающэм сайте РНК-г;олимерг;зы. ;

3.7. Терминационные свойства мутантов, полученных в консервативном сегмднте D

РНК-полимеразы. несущие мутации СРТЕ, РТЕ и С559А, были проверены на способность терминировать на сконструированной М Кашлепь.м матрице Т7А1-tR2- Данная матрица с длиной транскрибируемого участка 176 н'у;с.':еотидоз несет терминатор tq2 Фага лямбда. Точка терминации отстоит на 103 куклеотидов от

стартовой точки промотора Т7А1. Эффективность терминации оценивалась по отношению количества комплексов, диссоциированных ча терминаторе, к количеству комплексов РНК-полимеразы, дошедших до конца матрицы. Как видно из рисунка 5, около 70% РНК-полимеразы дикого типа, стартовавшей из приготовленного комплекса +21, терминирует. В это же время, Мутанты СРТЕ и РТЕ проявляли сильные антитерминационные свойства - около 80% комплексов мутангных РНК-полимераз не узнают терминатор и образуют попноразмерный транскрипт на данной матрице. С559А РНК-полимераза в э.-ом эксперименте имеет терминационные свойства, неотличимые от фермента дикого типа. Таким образом, показано, что антитерминационные свойства возникают в результате замен Р,Т и Е на аланины и вклад замены С559А в данный фенотип не обнаруживается.

3.8. Действие фактора Ale на РТЕ РНК-полимеоазу

Фактор Ale бактериофага Т4 вызывает сайт-специфическую терминацию РНК-полимеразы Е.соИ. На матрице Т7А1Мд2 обнаружены 4 основ.шх сайта (+47, т83, +114 и +117), на которых фактор Ale действует на РНК-полимера^у дикого типа, дпижущуюся быстро (в присутствии 500 мкМ нуклеотидов). В т-гх же условиях фактор Ale но действует на РТЕ РНК-полимеразу в трех из известных участков, а на самом последнем сайте (+117) мутант терминирует в присутствии фактора примерно с той же эффективностью, что и фермент дикого типа. Изучение скорости движения РТЕ мутанта показали, что на большинстве участков данной матрицы мутант движется значительно быстрее РНК-полимеразы дикого типа, а на определенных участках их скорости сравнимы. Мы измерили также концентрационную зависимость ухода с первого сайта действия фактора Ale (+47) для обоих ферментов. Оказалось, что для мутантной РНК-полимеразы требуется в пять раз ниже концентрация GTP для удлинения комплекса +47. Предполагается, что при взаимодействии РНК-полимеразы с фактором Ale происходит конкуренция двух процессов - фактор-зависимой терминации и элонгации. Более высокая скорость элонгации РТЕ РНК-полимеразы в определенных положениях матрицы, вероятно, и является причиной нечувствительности к действию фактора.

Мы также проверили возможное изменение сродства РТЕ РНК-полимеразы к терминационной шпильке.

Дикий тип

СРТЕ

С559А

РТЕ

Г

Полноразмерный транскрипт

Продукт терминации

"1 Г

21- мер

1 Г

Рисунок 5. Терминационны.5 свойства мутантных СРТЬ, С559А и РТЕ РНХ-

гюлимераз. Элонгацию комплекса +21, полученного на матрице Т7А1-!,-,2, проводили при комнатной температуре с течение 10 мин в присутствии ТОО мкМ нуклеотидов. В результате этогс .агть комплексов РНК-полимеразы р?опадалась на терминаторе с высвобождением РНК {продукта терминации), а комплексы, проатдаме точку теминации, формировали полноразмерный транскрипт.

К. Арндт и М. Чемберлен (Arndt and Chamberlin, 1989) продемонстрировали, что РНК-полимераза при остановке на матрице Т7А1 в положении +37 позволяет новосинтезированной РНК сформировать шпильку.

При этом в отсутствии ионов Мд2+ комплексы +37 дестабилизируются и за 30 минут около половины комплексов распадается. Данный процесс напоминает ситуацию, происходящую на настоящем терминаторе, где дестабилизирующим фактором является полиуридиновая последовательность. Мы не обнаружили никаких нарушений во взаимодействии со шпилькой у мутантной РТЕ РНК-полимеразы, исходя из кинетики распада комплекса +37. За распадом мы следили подоле комлексов, способных к дальнейшей элонгации при добавлении нуклеотидов через определенные промежутки времени к комплексу +37 РНК-полимеразы. иммобилизованной на сорбенте и отмытой от ионоа Мд2+. Таким образом, наиболее вероятным объяснением антитерминационных свойств РТЕ мутанта {»ак на А1с-эависимых ,так и на фактор-независимых терминаторах) можно считать повышенное сродство РТЕ РНК-полимеразы к элонгирующим субстратам. Это дает данному мутанту больше шансов, по сравнению с РНК-полимеразой дикого типа, продолжить синтез РНК, чем терминировать. В литературе описано достаточно большое количество мутаций с изменненными терминационными свойствами, однако, в данной работе впервые представлены данныз, позволяющие утверждать, что природа антитерминационного эффекта заключается не в нарушении стабильности терминационной шпильки, а в измененной скорости элонгации. Здесь же следует отметить, что большинство экспериментов по торминации были бы невозможны без применения иммобилизованной РНК-полимеразы. Использование иммобилизованного фермента позволяет "шагать" вдоль матрицы, добавляя к комплексу РНК-полимеразы ограниченный состав нуклеотидов и избавляясь от них промывкой транскрипционным буфером. Количество "шагов" не ограничено и принципиально можно "дойти" и "остановиться" на любом (с небольшими исключениями) месте ДНК-матрицы.

3.9. Устойчивость СРТЕ. С559А и РТЕ РНК-полимераз к ингибиторам транскрипции - рифампицину и стрептолидигиь!у

Выло вполно вероятно ожидать получения устойчивых к рифампицину мутаций в области, где локализовано большинство RifR мутаьчГ", в JV-субъадинице. Однако, данные in vivo показали, что жизнеспособная мутац 'я

РТЕ не проявляет RifR фенотипа. Клетки E.coli, имеющие ß-субъединицу с данной мутацией в качестве единственного источника ß-субъединицы РНК-полимеразы, были неспособны расти в присутствии 15 мкг/мл рифампицина. Используя имеющиеся генетические системы, невозможно проверить летальные мутацит, на устойчивость к рифампицину in vivo. Поэтому мы не можем судить о Rif фенотипах мутаций С559А и СРТЕ in vivo. Однако, данные in vitro говорят, что-все три мутантные РНК-полимеразы устойчиры к 10 мкг/мл рифампицина. Это причисляет данные мутации к мутациям с умеренным R¡fR фенотипом in vitro. RifR мутации при замене Рго560 и Thr563 уже были описаны в литературе. Мутация в Cys559, приводящая к устойчивости к рифампицину показана впервые. Еще одним интересным наблюдением явлется факт, что мутац/л РТЕ обладала R¡fn фенотипом in vitro, но нэ придавала устойчивости к рифампицину клеткам in vivo.

Мы также проверили устойчивость мутантных РНК-полимераз к другому ингибитору транскрипции - стрептолидигину. В отличие от рифампицину, этот антибиотик продавляет синтез РНК на всех этапах цикла работы полимеразы. Обнаружилось, что СРТЕ РНК-полимераза, в отличие от мутантов С559А и РТЕ, была устойчива к действию стрептолидигина. Нами оценивалось количество синтезированного CpApU в присутствии возрастающей концентрации стрепто :>:дигина. В качестве контроля мы использопали РНК-полимеразу дикого типа и П46 РНК полимеразу (Severinov et.al, 1993), имеющую сильный фенотип устойчивости к стрептолидигину (3tiR). Фермент дикого типа подавлялся на 90% при концентрации стрептолидигина Ю мкг/мл. РНК-полимераза с StlR фенотипом сохраняла 85% активности в присутствии 100 мкг/мл антибиотика, при этой же концентрации СРТЕ РНК-полимераза проявляла около 40% активности. Таким образом, можно говорить о выраженной устойчивости к стрептолидигину у данного мутанта.

выводы

1. Разработан метод сверхпродукции Р'-субъединицы, несущей опигогистидиновый пкорь, и включения ее в PH''-полимеразу при сборке in vitro. Это открыло путь к исследованию мутаций, полученных в других субъединицах (в частности, в р-субъединице), в экспериментах, использующих иммобилизованную на сорбенте РНК-полимеразу.

2. В высоко-консервативных сегментах H и I С-концевого домена р-субъединицы РНК-полимеразы E.coli получены две летальных мутации REME и PSRM, приводящие к серьезным нарушениям в связывании инициирующих субстратов, но незатрагивающие активного центра РНК-полимеразы. Продемонстрировано, что данные мутанты проявляют значительные нарушения в осуществлении реакции пирофосфоролиза. Эти данные свидетельствуют о том, что области р-субъединицы, затронутые мутациями REME и PSRM, принимают участио в формировании участков связывания субстрагоп РНК-полимеразы.

3. Получена группа мутаций в кластере консервативных аминокислот в Rlf области - С559А, РТЕ и СРТЕ. В тестах in vitro установлено, что РНК-полимераза с мутацией РТЕ (также как и СРТЕ) имеет ярко выраженный антитерминационный фенотип и сильно измененную способность отвечать на действие фактора Ale фага Т4. Оба дефекта могут быть объяснены повышенным сродством РТЕ РНК-полимеразы к элонгирующим субстратам на определенных участках матрицы ДНК. Показано, что СРТЕ, РТЕ и С55ЭА РНК-полиморэзы проявляют in vitro умеренную устойчивость к рифампицину, а СРТЕ также и к сгрппголидигину. Для СРТЕ РНК-полимеразы продемонстрировано наличие нарушения в связывании первого субстрата при инициации транскрипции и в формировании стабильных тройных комплексов с тринуклеотидами. Свойства мутантов, полученных в Rif области, подтверждауют гипотезу о близости данного участка к каталитическому центру РНК-полимеразы.

4. Продемонстрировано, что спонтанное расщепление РНК в транскрипционных комплексах, описываемое ранее как функция самой РНК-полимеразы, на самом деле индуцируется примесным фактором, ассоциированным с РНК-полимеразой. В последствии в лаборатории этот фактор был идентифицирован как продукт гена дгеА.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных автором по теме диссертации:

1. A.Mustaev, M.Kashlev, J.Lee, A.Polyakov, A.Lebedev, K.Zalenskaya, M.Grachev, A.Goldfarb, and V.Nikiforov (1991)."Mapping of Priming Substrate Contacts in Active Center of Escherichia coli RNA Polymerase". J. Bio!. Chsm. Vc!. .266, pp. 23927-23931

2. S.Eorukhov, A.Polyakov, V.Nikiforov, and A.Goldfarb (1992). "GreA Protein: A Transcription Elongation Factor from Escherichia coli'. Proc. Nati.Acad. Sei. USA. Vol 89. pp. 88S9-S902

3. M.Kashlev, E.Martin, A.Polyskov, K.Severino", V.Nikiforov, and A.Goldfarb (1993). "Histidine-Tagged RNA Polymerase: Dissection of the Transcription Cycle using Immobilized Enzyme". Gene. Vol. 130, pp. 9-14

4. A. Polyakcv, V. Nikiforov, and A. Goldfaro (1993). "Mutations in C-ierminal part of p Subunit Disrupt Substrate Binding Pocket of Escherichia coli RNA polymerase". Control of Transcription Initiation in Prokaryotes. FASEB Meeting.

5. A. Polyakov, V. Nikiforov, and A.Goldfarb "Mappinng of Substrate Binding Site of Escherichia coli RNA Polymerase". Готовится к печати.