Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функциональной организации бета-субъединицы РНК-полимеразы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональной организации бета-субъединицы РНК-полимеразы Escherichia coli"

министерство медицинской прошмешости ссср

вскхяоешя научш- жследовательския иазтигут

генетики и селекции промышленных микроорганизьюв

Ва правах рукописи УДК 577.214.32 Кашхев Михаил Валентинович

А

Изучение структурно-функциональной организации ^-субьединицы РНК-полиыеравы Escherichia coli.

(03.00.03 - молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики АН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор в. Г. Никифоров.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. С.Шакулов кандидат биологических наук С. Л Мэхедов

Ведущее предприятие: Институт биоорганической химии им. М.Ы. Шэмякина АН СССР

Защита состоится ¿¡/ff&ty Я199 б^года в /</часов на заседании специализированного совета Д 035. 01. 01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов ( Мэсква, 113545, 1-ый Дорожный проезд, д.1 ).

С диссертацией можно.ознакомиться в библиотеке ВНИИгенетика.

Автореферат разослан " OtSliQQQ г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из наиболее важных задач молекулярной биологии является изучение механизмов выражения генетической информации. Шрвый этап этого процесса - синтез РНК на матрице ДНК - осуществляется ДКК-зависимыми РНК-полимеразами (рибонуклеозид 5'-трифосфат: РНК-нуклеотидилтрансферазами, КФ. 2. 7. 7. б.). Как правило, эти ферменты являются сложными олиго-мерными белками. Для понимания механизмов их работы необходимы исследования функций отдельных субъединиц, выделение в них функциональных доменов.

Наилучшей моделью для исследования структуры и функций этого фермента является РНК-полимераза кишечной палочки (Escherichia coli), состоящая из четырех основных и

одной регуляторной (б) субъединицы. Дая наиболее просто устроенной бактериальной системы легче всего реализовать подходы, позволяющие получать направленные мутации в генах субъединиц РНК-полимеразы» и исследовать проявление этих мутаций in vitro.

Дель и задачи исследования. Целыэ работы являлось исследование структурно-функциональной организации jl-субъединицы РНК-полимеразы Е.coli методами инсёрционно-делеционного и точечного мутагенеза. В работе ставились следующие аадачи. Разработать систему регулируемого синтезауЗ -субъединицы под контролем лактозного промотора в составе плазмиды для отбора в ней доминантно-летальных мутаций. Получить набор инсерционных и делеционных мутаций в соответствующем гене (гроВ). Генетически и биохимически охарактеризовать полученные мутации и определить функцию, нарушаемую мутацией. Шлучить точечные мутации в районе предполагаемого активного центра РНК-полимеразы. Ш данный мутагенеза построить структурно-функциональную карту ß-субъедгошцы.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые проведе- . но детальное картирование ß-субъединицы РНК-полимерааы E.coli с помощью инсерционно-делеционного мутагенеза. Сконструирована система для получения летальных мутаций в жизненно-важном гене ß-субъединицы. Впервые получены мутации, нарушающие ферментативную активность РНК-полимеразы. Получена информация о районах.не существенных для функционирования исследуемой субъединицы.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на ежегодной научной конференции ИНГ АН СССР в 1990 году, на сиыпо-

- г -

аиуме по генетике бактерий и фагов в Ко лд-Спринг-Харборе, США в 1989 году, на семинарах в Институте молекулярной генетики АН СССР и во Всесоюзном научно-исследовательском институте, генетики и селекции прошшленных микроорганизмов, а также опубликованы в четырех статьях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включая таблиц и рисунков. Библиография включает в себя названий, в том числе русских и иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий. В работе использованы штаммы Escherichia coli К-12, полученные из коллекций ИМГ АН СССР и ВНИИ Генетика. Щгаммы AJ6207 и W3110 любезно предоставлены Робертом Гдассои (Англия).

Плазмиды. В работе использованы векторные плазмиды рШ19 (tossine et,al., 1981), pPR2 (Машко и др., 1985), pACYC184 (Chang, Cohén, 1978).

Источником гена гроВ были плазмиды pLMNl, рЬШЗ, рЬШ9 (Огрызько, Никифоров, 1988). Ген лактозного репрессора Laclq переклонировали из плазмиды рУС9 (Huynh et. al. ,1985). Источником гена устойчивости к канамицину (канамициновой кассеты) была плазмида pUC4K (Vieira, Messing, 1982).

Выделение плазмидной ДНК проводили по методу (Birnboim, Doly,1979).

Суммарную ДНК бактерий рода Accinetobacter выделяли по методу (Маггшг et.al., 1961).

Перевод инсерционных мутаций в гене гроВ в хромосому Е.coli проводили по методу (Огрызько, Никифоров, 1988).

Препараты ферментов были получены из НПО "Вектор", . ВНИИ прикладной энзимологии, г.Вильнюс и от фирмы "Serva" (ФРГ). Обработку ДНК ферментами проводили, как описано в методическом руководстве (Ыаниатис и др. , 1984).

Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 1Z агарозном или в 6-8Х полиакриламидном геле в трис-боратном буфере (Остерман, 1982). Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы прово-

дили как описано в руководстве (Ыаниатис и др., 1984).

Сайт-специфический мутагенез гена гроВ проводили по методу (Kunkel, 1977) с клонированием фрагментов гена в фагах Ш.З.

Определение нукдеотидных последовательностей в районах локализации мутаций проводили на автоматическом секвенаторе фирмы "Beckmann" с использованием флоурвсцентных меток по модифицированному методу (Sanier, 1977).

Анализ клеточных белков проводили диск-электрофорезом в 6-15Х ПАА гелях в присутствии ДСН по (Laenmli, 1970).

Тестирование сборки мутантных ft-субъедиииц в состав РНК-полимераэы m vivo проводили выделением фермента с помощью микроколонок с моноклональными антителами против р-субъединицы РНК-полимеразы (Nikiforov et. al., 1983), сорбированными на Protein A-Sepharose ("Pharmacia").

Ферментативную активность ' РЖ- солимераз определяли в грубых клеточных экстрактах по (Ларионов и др., 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Клонирование гена jS-субъединицы под контроль лактоано-го промотора.

В качестве вектора для клонирования гена J>- субъединицы была выбрана плазмида pUC19, содержащая ColEl-ориджин репликации и лактозный промотор дикого типа. Источником гена ßr-субъ-единицы явились полученные ранее в нашей лаборатории (Огрызь-ко, 1988) плазмида рШ1 (с геном гроВ дикого типа ) и pLM 3 (с rif-r мутацией), содержащие гроВС-оперон в составе BglII-фраг-ьзента. Для предотвращения конститутивной экспрессии, гена субъединицы были удалены все собственные конститутивные промоторы этого оперона. Дяя этого под контроль лактозного промотора в составе рШ19 (по участкам расщепления HindiII/BamHI в~ полилинкере) клонировали HindIII/ВгШ-фрагыенты, содержащие гены оперона, rplL (рибосомный белок L7/12) и гроВ без названных промоторов из плазмид рЬШ и pLM3 (Огрызько, Никифоров, 1988). Таким образом, появилась возможность регулировать экспрессию генаß-еубъединицы в специальном штамме, содержащем повышенное количество лактозного репрессора (JM109, lac IQ аллель гена, расположенный на хромосоме). Плазмида получили наз-

ДО lift1 I ДОЮ ЛЛ' fl CO о

чмм» tap щр

*

Sail

Рис.1. Сверхпродукция и агрегация Ji-суОъединицы в пггамме НВ101 с плазшдами рМКА11(9), рШ92 ( Л - суммарный ли-зат, 0 - быстроседиментирующий осадок, С - супернатант) и схема плазмиды рМКА92, использованной для мутагенеза гена гроВ (плазмида рЫКА92 отличается от рМКА11(9) наличием микроделеции в районе SD-последовательности перед геном rpoß).

ванке pMKAl, а Однако, они оказались непригодными для получения мутаций в гене гроВ, т. к. замедляли или останавливали рост клеток различных штаммов Е. coli, если температура инкубации превышала 37°С. Как показало картирование, летальный аффект связан с экспрессией гена rplL под контролем дактозного прош-тора. Поэтому этот ген был делетирован в составе HindiII/ Sali -фрагмента 8 результате был удален не только ген rplL, но и слабый конститутивный промотор непосредственно перед гроВ-геном вместе с аттенюатором транскрипции и участком процессинга РНКазы III, которые по многочисленным данным снижают экспрессию дистально-расволоженного гена субъединицы (Dennis, 1984 ). Полученная плазмида рЫКАИ содержала ген JV-субъединицы дикого типа и обеспечивала синтез большого избытка JV-субъединицы. образующего в клетках тела включения. Дня отбора летальных мутаций в плазмиду pMKAll введи маркер устойчивости к рифампицину путем вамеадэния ее центрального SalGI-фрагмента rpoB-гена дикого типа на соответствующий фрагмент, содержащий rif-г-мутацию из плазмиды pLM 9 ( полный аналог pLM 1, но с rlf -г-мутацией (Огрызько, Никифоров, 1988 )). В результате такого замещения была получена плазмида рЬКА 9 (рис.1), которую трансформировали в рифампицин-чувствительные штаммы J Ml 09 и НВ101.

2. Шлучение производных плазмиды рШДЭ с хорошим прояв-

лением маркера устойчивости к рифампицину.

Шазмида рЫКАЭ не обеспечивала рост на рифампицине рифам-пицин-чувствительных штаммов несмотря на накопление больших избытков jV-субъединицы с ri f-г-мутацией. Это было связано с особенностями регуляции лактозного промотора, транскрипционная активность которого зависит от состава среды культивирования бактерий и не обеспечивает достаточного для роста на рифампицине избытка JV-субъединицы на определенных стадиях роста культура Поэтому была проведена селекция производных плазмиды рМКАЭ, обеспечивающих устойчивость к рифампицину в соответствующих штаммах за счет увеличения продукции р-субъедииицы.

Для этого производили микроделеции и микроинсерции в районе инициирующего кодона гена гроВ (по литературным данным, такие модификации могут существенно изменять уровень экспрессии гена ). (Машко и др., 1985). В результате были получены плазмиды рМКА91,92,93 и др.(данные не приведены), содержащие делеции и инсерции различной протяженности, не затрагивающие кодирующей области гена гроВ. Эти плазмиды давали различные уровни фенотипического проявления маркера устойчивости к рифампицину (эффективность высева на рифампицин в штамме НИ01 составляла от долей процента до 100Х) и обеспечивали синтез различных количеств jb-субъединицы. Для дальнейшей работы выбрали плазмиду рЫКА92 (рис. 1).обеспечивающую синтез максимального количества белка (заметно большего, чем в случаях рМКА1,11,9,91,93) и 100t эффективность высева на рифампицин в штаммах НВ101 и JM109 (+ИГОТ). Она была использова на для де-леционно-инсерционного мутагенеза гена гроВ.

3. Разработка системы репрессии синтеза fi-субъединицы на плазмиде PMKA92.

Одной копии гена lacIQ, расположенной на зписоме в штамме JM109, оказалось недостаточно для эффективной репрессии транскрипции с лактозного промотора в плазмиде pl£KA92, вероятно, из -за амплификации лактозного оператора в составе многокопийного вектора Для амплификации гена лактозного репрессора использовали совместимую с рМКА92 плазмиду pACYC184 (Chang, Cohen,

- б -

1978), в которую клонировали ген 1ас1<3 в составе ЕсоЯЬфрагмента из плазмиды рМС9 (рЫКА92~несовместимая) (НиупЬ еЬ. а1., 1885). После трансформации штаммов НВ101(рМКА92) и .Щ09 (рМКА 92) полученной плазмидой (рЬасКЗ) и анализа продукции Д-субъ-едкницы на гель-электрофорезе белков в условиях репрессии 1ас-промотора было показано, что в клетках не синтезируется избыточная ^субъединица. Далее определяли рифампицинустойчи-вую РНК- налимеразную активность в грубых клеточных экстрактах из штамма НВ101 в условиях репрессии и индукции транскрипции с лактозного промотора на плазмиде рМКА92. Измерения показали практически полное отсутствие рифампицин-устойчивой РНК-поли-мерааы в условиях репрессии. Эхо позволило применить плазмиду рМКА92 для получения в гене гроВ доминантно-летальных мутаций.

4. Получение мутаций в плазмидном гене гроВ.

А. Инсерционный мутагенез гена гроВ на плазмиде РМКА92.

Мутации в гене гроВ получали путем встраивания фрагмента ДНК, содержащего ген устойчивости к канамицину из плазмиды pl)C4K, в ген гроВ по участкам расщепления рестрикционных эндо-нуклеаз TaqI и Alul (рис.3). После отбора и картирования мест инсерций Км-кассеты ген Км-г вырезали in vitro с помощью рест-риктазы BaraHI с последующим дотированием. В результате в этом месте оставалась вставка 21-24 и. п. (в вависишсти от используемого сайта TaqI или Alul), не нарушающая рамку трансляции j^-суб-ьединицы. Это вело к появлению в белке вставки 7-8 аминокислотных остатков. Такая мутантная Ji-суОъединица оказывалась на несколько аминокислот длиннее нормальной, что в ряде случаев меняло ее подвижность при электрофорезе. Восстановление рамки трансляции после вырезания канамициновой кассеты тестировали электрофоретически по появлению вместо амбер-фрагмента jVсубъединицы (обраувдэгося из-за сбоя рамки трансляции в месте внедрения Км-гена) полноразмерной субъединицы.

Б. Делеционный (Ва131) мутагенез гена гроВ. Шсле вырезания канамициновой кассеты в этом месте появлялся уникальный сайт эндонуклеазы ВалШ в последовательности гроВ-гена Это позволило получить в этом районе делеции различной длины с помощью экзонуклеазы Ва131.

В- Протяженные инсерции в (УсуОъединице. В двух точках £>-суО'ьединицц между 989-990 и 1010-1011 аминокислотными остат-

каш бьии получены протяженные инсерции, не сбивающие ражу трансляции ( по участкам расщепления Taql и PvuII соответственно). Эти мутации приводили к заметному увеличению молекулярного веса субъединицы.

б. Лэкализация инсерционных мутаций внутри гена гроВ.

Из результатов картирования инсерций (рис.3) видно,, что они распределены неравномерно по длине гена гроВ. Нутации преимущественно локализованы в трех районах гена: в б'-конце мел-ду 30 и 61 кодонами (4 инсерции), между 235 и 431 кодонаыи (9 инсерций), между 929 и 1010 кодонами (5 инсерций). На все остальные районы, составлявшие 76% гена, приходится 5 инсерций. Таким образом, мутациями обеднены центральная часть гена и протяженный 3'-концевой район. Отчасти это связано с низкой встречаемостью здесь участков узнавания AluI, по которым получена большая часть инсерций (инсерции по сайтам Taql распределены более равномерно). Данные картирования суммированы на рисунке 3.

б. Анализ фенотипического проявления полученных мутаций (рисунок 2,1).

Отбор и фенотипический анализ ыутаций в жизненно-важном гене гроВ проводили в присутствии копии гена дикого типа в бактериальной хромосоме. Тагам образом, в клетке присутствовала смесь РНК-полимераз с мутантной и нормальной jl-субъединицей (устойчивой и чувствительной к рифампицину соответственно).

Основным критерием того, что мутация в гроВ-гене не нарушает функционирование jV-субъединицы in vivo, была способность или неспособность плазмиды,содержащей мутацию, поддерживать рост рифампицив-чувствительного штамма на рифампицине. На основе этого критерия все полученные мутации можно распределить на две группы: не нарушающие функцию ]Усубъединицы и летальные мутации, нарушающие эту функцию. Среди летальных мутаций были ингибирущие рост клеток (доминантные летали) и не влияющие на жизнеспособность (рецессивные летали). Доминантный фенотип некоторых летальных мутаций выражался в гибели клеток, содержащих мутантный плаамидньй ген гроВ, несмотря на присутс-

рроВ

J Sj1

• HGC747

Ш-/НШШШ шш а ___ б1 т. . б2-

/Ринс Р*.

V

им. suou-oecm

к ндаш гнав

г-с ипвиет гост- гадаем <шь

Рис.2. I. Тестирование вхождения мутантных ЛУсубъединиц в состав РНК-полимеразы in vivo в штамме MKDC747 (представлена схема гель-электрофореза выделенных препаратов РНК-полимеразы из клеток, выращенных в ■условиях репрессии (А) и индукции (Б) лактозного промотора). Приведено тестирование для Л-субъединицы дикого типа ( на плазмиде рМКА92)(Б1) И мутантной Р -субъединицы Т39 (Б2). Обозначения: Инс. - инсерция в хромосомном гене гроВ штамма MKDC747; , <*. , ja субъединицы РНК-полимеразы; X - мутация в плазмидном гене гроВ фх -р-субъединица с мутацией).

II. Генетический тест на функциональную активность^-субъ-единиц с мутациями в штамме AJ6207, разделяющий мутации на три класса Среди мутаций,не нарушающих функцию, имеются также мутации, замедляющие рост клеток штамма AJ6207 в условиях индукции лактозного промотора.

твие в них большого количества нормальной РНК-полимеразы ( с ^субъединицей хромосомного происхождения). Некоторые мутации, не нарушающие функциюсубъединицы, также заметно ингибировали рост клеток при индукции синтеза мутантной субъединицы. Доминантность мутаций мотет иметь различные механизмы (Ногу1986), связанные как с конкуренцией между мутантной ненормальной субъединицами при сборке РНК-полимеразы, так и с конкуренцией между нормальным и мутантным ферментом за сигналы и факторы транскрипции в ходе транскрипционого цикла.

Наиболее четким критерием сохранения функции мутантным белком было получение штамма, содержащего только мутантную субъединицу без примеси субъединицы дикого типа, кодируемой хромосомой. Для этого был использован штамм ^6207 (предоставлен Робертом Глассом), содержащий амбер-мутацию в гене гроВ в

хромосоме и амбер-супрессор в эписоме . Цри трансформации пггамыа функциональной копией гена гроВ в составе плазмиды эпи-сома с супрессором может быть удалена Удаление аписомы приводит к инактивации хромосомного гена гроВ и одновременной'пота-ре клетками активности fi-галактоаидазы из-за присутствия амбер-мутации в гене LaoZ этого штамма (рис. 2,II). Поэтому о сохранении функции гена гроВ в составе плазмиды южно судить по приобретению клетками, трансформированными плазмидой с гроВ мутацией Lac"фенотипа на индикаторной среде, содержащей X-gal. Результаты этого теста суммированы в таблице 1.

7. Анализ сборки мутаитных РНК-полимераз in vivo. (рисунок 2.1)

Для тестирования сборки мутантных рнк-полимераз был подучен специальный штамм, в котором молекулярный вес субъединицы хромосомного происхождения был изменен за счет введения инсер-ции, не сбивающей рамку трансляции, в область, не существенную для функционирования зтого белка. Для этого в хромосому штамма С600 с помощь» гомологичной рекомбинации был переведен ген гроВ с инсерцией длиной 390 н. п., кодирущий JV-субъединицу, на 127 аминокислот длиннее нормальной (мутация Т989). Штамм имел нормальную скорость роста и содержал функционально-активную РНК-полимеразу (обозначен MHDC747). Разница подвижностёй при гель-электрофорезе jV-субъединицы дикого типа и мутантных субъединиц в препаратах ферментов, выделенных из этого штамма, позволила оценить уровень вхождения мутантных субъединиц в состав РНК-полимераз ы. На рисунке приведен пример анализа вхождения в РНК-полимеразуJV-субъединицы плазмидного происхождения для белка дикого типа (плазмида рМКА92) и одного из полученных инсерционных мутантов (рис.2,1). В подавляющем большинстве. • случаев мутации приводят к ухудшению вхождения субъединиц в. РНК-полимеразу по сравнению с контрольной jj-субъединицей дикого типа на плазмиде рЫКА92. Заметное ингибирование сборки демонстрируют даже мутантные субъединицы, функция которых (в соответствии с тестом в штамме AJ6207) не нарушена В случае некоторых летальных Ва131~делеций уровень сборки настолько низок, что невозможно достоверно определить присутствие мутантной субъединицы в составе РНК-полимеразы in vivo. Результаты анализа сборки мутантных субъединиц приведены в таблице 1.

- 10 -

Таблица 1. Генетический анализ мутаций в гене гроВ.

Мутация Пяазшзда НВ101 АЛ6207 Ш)С747 Жиане- СЯорка

рЬасК} рьаоЮ рЬасК} способн. РНКпол Ампициллин: + + + + + в беасуп- в

Рифаыпицин: - + + - рессорном ЫКОС

шттамме 747 А)6207( вир-)

ИНЗЕРЦИИ

А31 3166

Т39 302

А49 3227

А61 3091

А235 3175

А256 3152

А276 3147

А308 3154

А316 3084

ТЗЗЗ 315

А380 Г2

Т414** 307

А431 231-29

Т609 В15

А717 КЗ

Т929 353

А952 3242 Т989* Р1010-1,2,3*

Т1187 312

А1196 210В Ва131-ДЕЛЕЦИИ

+ + + +

+ + + + + + +

-/+ -+ + +

+ +

-/+ -/+

+ + + +

-/+ +

+ + + + + + +

-/+ -+ +

+ +/-+ +

-/+ -/+ +

+ + + +

0А256 БАЗОЗ 0Т609 Т850-1 Т850-2 0А952-1 0А952-2

1--27 5 С12 А2 015 4-3242 28-3242

+ +

-/+ +

+

-/+ +

+ -/+ +

+

+ + ♦ + + + + +

0Р1010-1,2,3 0Т1187 35-312

+

+ + + + +

-А -

+ + +

■ + + +

и. о.

и.о.

н.о.

н.о. +

н. о. +

в. о. +

♦ + +

и.о.

и.о. +

+ +

в. о.

?

? +

и.о.

н. о. +

+/-

рМКА92(дикий тип)

+ +

+ +

+

+

Тестирование фенотипа проводилось на чашках при 30 С (20-24 часа инкубации) в присутствии ИПГГ. Концентрация ампициллина 200-500 мкг/мл, тетрациклина - 10 мкг/мл,рифампицина -50 мкг/мл, ИПГГ - 10 шМ. рЬасЩ - плаамида с геном репрессора лактозного промотора (содержит также ген устойчивости к тетрациклину). В отсутствии ИПГГ плазмидный ген гроВ не экспресси-руется, рост клеток всех штаммов на ампициллине не подавлен. {+) - колонии нормального размера (рост не подавлен), (-/+)(-) - рост сильно подавлен иди отсутствует. (?) - уровень сборки очень низок или отсутствует.

(*) - звездочкой обозначены протяженные инсерции в позициях 989 (1 мутация) и 1010-ого (3 мутации) кодонов, не нарушающие рамку трансляции £»~субъединицы.

** - две звездочки обозначают мутацию не нарушающую функцию $>-субъедшшцы, но замедляющую рост тестерного штамма А]6207.

+■

+

- И -

8. Функциональная карта Jb-субъединицы РНК-подимеразы Е.С011 (рисунок 3).

Район 929-1010-ого аминокислотного остатка (мутацийГ'" не нарушающие функцию Т929, А952, Т989, Р1010, PlOlO-1,2,3, DA952-1.2, DPI010-1,2,3)

Район картирования перечисленных мутаций является частью области 930-1050 аминокислотных остатков, обладающей самой низкой во всей jV-субъединице эволюционной консервативностью. Уровень гомологии здесь очень низок даже при сравнении субъединиц E.C011 и P. put Ida (последняя имеет здесь инсерцию 12-ти остатков в позиции 985). Район с 949-ого по 1048-ый аминокислотные остатки полностью делегирован у хлоропластных и эукари-отических субъединиц. Данные мутагенеза показывают, что этот район может быть почти полностью удален из >-субъединицы без ущерба для функции. Так, делеция DP1010 -3, затрагивающая, примерно 30 аминокислотных остатков между 995 и 1029-ой позициями, не нарушает функционирование белка, а делеция примерно такого же размера А952-2, расположенная левее (с центром в районе 952 позиции) и не перекрывающаяся с первой, также сохраняет функцию. На незначимость района указывает также полученная ранее (Glass, Nene, 1985 ) спонтанная делеция 55 кодо-нов гена jV-субъединицы,не нарушающая функции белка (удаляет из -субъединицы 965-1021-ый остатки). Таким образом, район 950-1026-ого аминокислотных остатков практически полностью перекрывается делециями, не нарушающими функцию субъединицы, а инсерция Т929, не нарушающая функцию, позволяет предположить, что район, не сувдзственный для функционирования, продолжается до 929 остатка (хотя позиция 929 попадает в район гомологии между прокариотческими и хлоропластными субъединицами). Следует отметить, что jV субъединица не чувствительна также к очень протяженным (до 200 аминокислотных остатков) инсерциям в этот район (мутации Т989 - инсерция 196 остатков и PlOlO-1,2,3 -инсерции 10-100 остатков), сохраняющим рамку трансляции ^субъ-единицы. Эта область обогащена полярными аминокислотными остатками и в ней картируется место протеолитического разрыва пептидной связи при обработке РНК-по ли ме разы трипсином. Это позволяет предположить, что район бедка между 929 и 1010 аминокислотными остатками образует на поверхности фермента петлю, не существенную для функции.

I

I u

ГШГП BucMjoto

D Cbkro|jMts ~ Mala

(СНШЩС ш

Ш ШМ80

МаРЮЙМДЗ 0(852 №№1,2,3

j&Í-

L IL

Рис. 3. Локализация и фенотипическое проявление мутаций, полученных в гене гроВ.

А и Т - инсерции, DA и DT -делеции в районе участков растепления рестриктаз AluI и Taql, соответственно (границы деле-ций определены приблизительно). В рамки заключены точечные мутации и аминокислотные мотивы, имеющиеся в«£-субъединице (nDDh-аспарагиновая пара (возможный центр связывания матрицы (Argos, 1988)), Н.С.Е-имидазол-тиольный мотив (вероятный участок, осуществляющий нуклеофильную атаку в активном центре фермента (Lisitsyn et.al., 1988), бХХХХЕК-нуклеотид-связыващий мотив (Vooley, Clark, 1989), I—L - последовательность, гомологичная мотиву "лейциновая молния", найденному в эукариоти-ческих белках-регуляторах транскрипции (Shtrul et.al.. 1989). К и К. Н-центр связывания инициирующего субстрата по данным аффинного мечения активного центра фермента (Grachev et.al., 1989). С*С**С*С - предполагаемый цинк-связывающий мотив ("цинковые пальцы"), найденный в эукариотических и архебактериаль-ных субъединицах и отсутствующий в fi~субъединице Е.соП.

Intron 1 и 2 - показывает; расположение интронов в гене большой субъединицы рш-полимеразы II дрозофилы, гомологичном гроВ-гену.

Показаны делеции (промежутки между прямоугольниками, обозначающими последовательности хлоропластных и эукариотичес-ких субъединиц), инсерции (заштрихованные прямоугольники над последовательностью эукариотических субъединиц) и области высокой гомологии (A-J. черные прямоугольники), выявляемые.при сравнении гомологичных субъединиц из различных организмов. Штриховкой обозначены дополнительные области высокой гомологии между бактериальными и хлоропластными субъединицами. (*) -точка разрыва гомологичного гроВ гена архебактерий.

I. - инсерции (▼) и делеции (а) не блокирующие ферментативную активность РНК-полимеразы in vitro,

II. - инсерции, делеции и точечные мутации W, нарушающие ферментативную активность фермента in vitro (включены мутации (Landick et.al., 1990)).

район 235-414-ого аминокислотного остатка (мутации, , не затрагивающие функционирования: А235, А256, А276, А316, ТЗЗЗ, A38Q, DA256; сохраняющие функцию, но ингибирующие рост: Т414; ' летали: А308, DA308).

Этот участок входит в состав протяженной области Ji-cy6ir единицы от 155 до 440-ого аминокислотного остатка, обладающей низкой эволюционной консервативностью. В хлоропластных и эукариотических субъединицах в этом районе имеются обширные делеции относительно бактериальных субъединиц (у субъединиц из хлоропластов затрагивают 231-390-ьй остатки). Если сравнивать эволюционно более близкие субъединицы из Е.coli и P.putida, то видно, что наиболее эволюционно-вариабельным является участок от 206 до 360-ого аминокислотного остатка. Мутационный анализ этого района выявил.его функциональную неоднородность. Большая часть инсерций (А235 -ТЗЗЗ) попадает в область расположенного вблизи N-конца района, отсутствующего в хлоропластных и эукариотических субъединицах (рис.3 ). Здесь же расположена деле-ция DA256, удаляющая примерно 30 аминокислотных остатков без нарушения функции белка, to мере приближения к консервативному району С (440-467 остатки) эффект влияния мутаций на функцию проявляется все больше. Так, мутация Т414, хотя и ведет себя в большинстве тестов как неповреждающая функцию субъединицы, но при этом заметно ингибирует рост клеток, приближаясь по этому признаку к доминантно-летальным мутациям. В центре этого района располагается доминантно-летальная мутация А308 (и делеция DA308), что указывает на присутствие здесь функционально-важного участка. Пэвидимому. данный район ( в отличие от области 929-1010 остатков) нельзя целиком удалить из JV- субъединицы без существенного нарушения ее функции.

- 14 -

Мутации в N-концевом районеfi-cyOseдиницы (мутации, не нарушающие функции Т39, А61; летальные мутации: А31, А49).

N-концевой район ji-субъединицы отличается низкой эволюционной консервативностью. Относительно р-субъединицы, в хлороп-ластных и эукариотических белках здесь имеется несколько коротких (4-12 остатков) делеций. В субъединице P.putida в позиции 35-ого остатка имеется инсерция 4-х аминокислотных остатков. Гомологичная субъединица из S. cerevisiaa имеет N-кон-цевое удлиннение на 18 аминокислотных остатков. Инсерции, полученные нами, расположены в узком интервале между 31 и 61 остатками и демонстрируют сложную картину влияния на функцию белка. Так, инсерции Т39 и А61 не нарушают функции, тогда как очень близко расположенные к ним А31 и А49 нарушают функционирование фермента in vivo (рецессивные летали). Таким образом, влияние мутаций в N-концевом районе белка на его функцию вави-сит от природы мутации. Инсерции здесь имеют позиционный эффект (вероятно, важна и природа вставляемых аминокислот). Данный район jb-субъединицы обогащен полярными аминокислотными остатками, что свидетельствует о его поверхностной локализации в составе РНК-полимеразы. Об этом же говорят опыты по йодированию тирозиновых остатков Ji-субъединицы в составе РНК-полимеразы (Лебедев, 1983), в которых было показано, что оба N-koh-цевых тирозина JJ-субъединицы ( в позиции 3 и 5) доступны для йодирования как в свободной субъединице, так и в составе фермента

Мутации в центральном районе fi-субъединицы (мутации, не нарушающие функцию: нет; летальные мутации: А431, Т609, А717, DT609, DT850-1, DT850-2).

Этот район соответствует области fi-субъединицы (440-935 аминокислотные остатки) с заметным уровнем гомологии между бактериальными и хлоропластными субъединицами, которая прерывается вьюококонсервативными участками С (440-467), D (543-588), Е (652-690), F (796-826), G (860-890), гомологичными у всех известных на сегодня родственных JV-субъединице белков.. Этот район содержит мало мутаций,. вероятно, из-за низкой встречаемости здесь в последовательности гена гроВ участков расшэпления рестриктаз AluI и Taql, в которые производили инсерции. Все мутации, попавшие в этот район, оказались деталь-

иыми, что указывает на его важность для функционирования? РНК-полимеразы. Так, мутация А431 попадает на границу высококонсервативного района С (440-467), функции которого не^ясны. Этот район содержит мотив (в позициях 442-445) hDDh (два остатка аспарагиновой кислоты, окруженные гидрофобными остатками), имеющийся во многих РНК и ДНК-полимеразах, где он формирует участок связывания матрицы (Argos, 1988). Летальные мутации Т609, делеция DT609 попадают в район низкой эволюционной консервативности. В эукариотических субъединицах здесь расположена протяженная инсерция (относительно бактериальных и хлоропластных Ji-субъединиц), а у архебагсгерий здесь происходит разрыв кодирующей последовательности с образованием двух генов, гомологичных 5'- и 3'-гонцам гена гроВ. Летальность обеих мутаций говорит о важности этого участка для функции субъединицы. Летальная мутация А717 находится в районе,отсутствующем у всех эукариотических и архебактериалькых субъединиц, однако эволюционно-конеервативном у хлоропластных и эубактериальных субъединиц, что говорит о его важности для работы полимераз прокариотического типа Этот район является продолжением консервативного района Е (652-690), в котором картируется мутация устойчивости к рифампицину. Возможно, данный район участвует в формировании центра связывания рифампицина Летальные делеции DTS50-1 и 2 затрагивают консервативный район 6 (860-890), гомологичный у всех субъединиц. При этом меньшая делеция DT8501 доминантно-детальна (т.е. ингибирует рост клеток), а большая DT850-2 (27 кодонов) рецессивна •Зволюционно-консервативный район G содержит нукдеотид-связывающий мотив G-типа (Vooley et. al., 1989), сохраняющийся у всех гомологичных субъединши Его функция в jV-субъедшице не известна

Мутации в С-концевом районе ft-субъеднницы ( мутации, не нарушающие функцию: нет; летальные мутации: Т1187, А1196, DT1187).

Этот район содержит наиболее протяженные зволюционно-консервативные участки Н (1050-1120) и I (1213-1290), разделенные низко-консервативным участком, отсутствующим в хлоропластных и эукариотических субъединицах. Пэ данным аффинного мечения активного центра РНК-полимеразы (Grachev et. al. ,1989), участки Н и 1 участвуют в формировании активного центра РНК-полимеразы,

образуя центр связывания инициирующего субстрата. Весьма вероятно их участие в связывании элонгирухщего нуклеотида и РНК-продукта. Именно здесь следует искать аминокислотные остатки, катализирующие образование фосфодиэфирной связи и процесс транслокации. Мутации, полученные в этом районе, картированы на очень коротком участке между 1187 и 1196 кодонами с низким уровнем гомологии между родственными субъединицами. Несмотря на это, они нарушают функционирование Ji-субъединицы ín vivo.

9. Определение ферментативной активности РНК-полимераз, содержащих летальные мутации в ft-субъединице (таблица 2)

Для определения ферментативной активности мутантной РНК-полимеразы в выделенных из клеток препаратах, содержащих смесь мутантного и нормального ферментов, использовали два метода. Это тестирование устойчивой к рифампицину активности в грубых клеточных экстрактах (к рифампицину устойчива только мутантная РНК-полимераза) и определение ферментативной активности после селективной сорбции из клеточных экстрактов му-: тантных ферменов на фильтрах с полученными в нашей лаборатории моноклональными антителами против субъединицы, которые взаимодействуют с £-субъединицей, кодируемой плазмидой, но не реагируют с Ji-еубъединицей, кодируемой хромосомой. В хромосомном гене гроВ участок, соответствующий антигенной детерминанте этих антител, делегирован без нарушения функции белка (штамм предоставлен Р. Глассом (Англия)). В опыт также были включены мутанты (инсерционные и делеционные) по ji-субъединице, предоставленные Робертом Лэндиком (США). Здесь же приведены данные по анализу ферментативной активности некоторых Мутантов, собранных из изолированных субъединиц in vitro в лаборатории А. Гольдфарба (США). Этот метод (Zalenskaya et. al., 1990) также позволяет получить препараты мутантного фермента практически без примеси РНК-полимеразы дикого типа Результаты по определению каталитической активности РНК-полимераз, содержащих му-тантные jV-субъединицы суммированы в таблице 2 .

Таблица 2. Определение каталитической активности цутаятпых РНК-полкмераз in vitro.

Наименование мутации А31 А49 А308 Т414 Т609 DT850-1 T1187~ A11Q5

1, сорбция на антителах и.о. н. 0. + н. 0. + + -

2. грубый экстракт ♦ . + ■ + + h. 0. h. 0. ■ и.о.

а сборка in vitro + + (A. Goldfarb) +

Нутации ХЗб Дел. Х42 Х16 инс. дед. X73 дед. X19 . Дел. X54 дел.

А. к. позиция 1-53 t 34 328-349 175-370 884-890 1187-1192

1.сорбция на антителах + + + •t- + -

2. грубый экстракт - + - - + (из работы Landlck et. al. ,1990) -

"+" - ферментативно-активная РНК-полимераза •

- ферментативно-неактивный фермент, н.о. - не определялось

Из этих данных следует, что большинство мутаций не бдоки-, рует ферментативную активность РНН-полишраэы. При этом выявляются три протяженные области, которые могут быть удалены делениями без нарушения каталитической активности фермента in vitro (это районы 1-103, 178-439 и 849-1030 аминокислотных остатков). Только мутации, расположенные в, С-концевом районе бедка, приводят к потере каталитической активности,что говорит о его участии в формировании активного центра фермента. Даннкэ таблицы суммированы на рисунке 3 (графы I и II).

10. Сайт-специфический мутагенез гена ft-субъединицы РНК-полимеразы Е-coll.

Для сайт-специфического мутагенеза были выбраны аминокислотные позиции, выявляемые в опытах по аффинному шчению активного центра РШ-полимеразьс лизиновш остатки в позициях 1051, 1065 и гистидины 1237 и 1244. Эти аминокислотные остатки обладают высокой эволюционной консервативностью и располагают-

ся вблизи центра связывания инициирующего субстрата РНК-поли-меразы (Grachev, et. al., 1987). Для выяснения их роли в активном центре фермента в эти положения вводились мутации Lys Arg (консервативная замена для внесения минимальных изменений в структуру активного центра) и His ♦Ala (для выяснения роли боковой группы гистидина ). Результаты генетического анализа полученных мутаций по той же, что и для инсерций, схеме суммированы в таблице &

Таблица 3. Генетический анализ сайт-специфических мутаций в ^Усубъединще РНК-полимеразы E.coli.

НВ101 AJ62Q7 MKDC747 Сборка Еизнеспос.

pLaoIQ pLacIQ pLacIQ в РНК-пол. в безсуп-

-ШЗТГ ---------+ИПГГ----------(ШШС747) ресс. штамме

Мутация AT' AT АТРиф. AT АТРиф. AT AJ6207sup-

KR1065 + -/+ - - - - + -

KR1051 + + 102 + + + + +

HA1237. + + - + - + + -

HAl244 + + + + + + + +

дикий + + + + + + + +

тип

Обозначения как в таблице 1 ("АТ"-среда с ампициллином и тетрациклином) .

Из приведенных данных видно, что мутации KR1051 и НА1244 не нарушают функционирование РНК-полимеразы и не влияют на жизнеспособность тестерных штаммов HB1D1 и AJ6207. Сборка Ji-субъединиц в состав фермента также не нарушена.

Мутации KR1065 и НА1237 нарушают работу РНК-полимеразы и являются летальными, не влияя на сборку фермента При этом мутация KR1065 доминантно-летальна, т. е. приводит к гибели клеток даже в присутствии нормальной РНК-полимеразы.

Проверка ферментативной активности РНК-полимераз с му-тантными субъединицами KR1065 и НА1237 после их сорбции на ш-ноклональных антителах против JV субъединицы показала, что они транскрипционно- неактивны. Этот результат подтвержден в лаборатории Гольдфарба (США) после сборки мутантных ферментов in vitro из изолированных субъединиц. При этом показано, что фермент с мутацией KR1065 нормально образует открытый инициатор-

ный комплекс на промоторе Al фага Т7, который не способен переходу в элонгационный комплекс. Открытый комплекс при этом»., полностью каталитически активен, т.е. способен образовывать фосфодиэфирные связи в" ходе реакции абортивного синтеза олиго-нуклеотидов на Al- промоторе. Таким образом, мутация KR1065 блокирует переход РВК-полимеразы от инициации к элонгации транскрипции. Нами предложена модель, объясняющая эффект мутации дестабилизацией тройного комплекса ДНК/фермент/олигонукле-отид, которая ускоряет диссоциацию последнего из активного центра РНК-полимеразы. По этой модели, роль лизинового остатка в позиции 1065 заключается в фиксации инициирующего нуклеотида в активном центре фермента

Мутант с заменой His-1237 на Ala, реконструированный из изолированных субъединиц in vitro, также был полностью транс-крипционио-неактивен на ДНК фага Т4. Это позволяет предположить, что гистидин 1237 участвует в каталитической функции РНК-полимеразы.

Полученный результат является первой прямой демонстрацией роли лизиновых и гистидиновых остатков С-концевого района jV-субъединицы в формировании активного центра РНК-полимеразы.

ВЫВОДЫ.

1. Сконструированна плазмида с регулируемой экспрессией гена ji-субъединицы под контролем лактозного промотора, позволяющая отбирать доминантно-летальные мутации в жизненно-важном , гене гроВ и тестировать их фенотипическое проявление. .

2. В результате инсерционно-делеционного мутагенеза обна-, руявно, что эволюционно-вариабельный район 929-1029-ого аминокислотного остатка не является существенным для функции^ субъединицы in vivo; предположительно этот район образует петлю со сближенными концами на поверхности РНК-полимеразы.

3. В JVсубъединице выявлен второй эволюционно-вариабельный район 235-414-ого аминокислотного остатка инсерции в который не нарушают функцииJb-субъединицы in vivo.

4. В субъединице выявлены три области (1-103, 178-439 и 849-1030 аминокислотные остатки), мутации в которых могут нарушить функцию in vivo, но не нарушают ферментативную активность РНК-полимеразы in vitro.

" 20 -

Б. Гистидиновый остаток в положении 1237 необходим для ферментативной активности РНК-полимеразы.

6. Замена инвариантного лизинового остатка в положении 1065 последовательности ^-субъединицы на аргинин нарушает переход РНК-полимерааы от инициаии к элонгации транскрипции. Предложена модель, объясняющая аффект мутации черев дестабилизацию тройного комплеса фермент/ДНК/олигонуклеотид.

7. Эволюционно-консервативные остатки Ьуз-1051 и Н1э1244 не существенны для функции р-субъединицы в составе фермента.

Список статей, опубликованных по теме диссертации.

1. КатлевМ.Е, Грагеров А. И., Никифоров а Г. "Влияние индукции белков теплового шока на фенотипическое проявление мутации рифамшщинустойчивости, затрагивающих ген Ji-субъединицы РНК-полимеразы, клонированный под контролем лактозного промот-ра." Генетика, т. 24, 1343-1352, 1088.

2. Кашлев 1LE , Басс И. А., Лебедев А. Е , Каляева Э. С.. Никифоров ЕГ. "Делеционно-инсерционное картирование области» несущественной для функционированияJV субъединицы РНК-полимеразы Escherlshia coli." Генетика, т.25, 396-405, 1989.

3. Kashlev M.V. , Gragerov A. I., Niklforov V. a "Heat shook response in Escherichia coli promotes assembly of Plasmid encoded RNA polymerase JJ-subunlt into RNA polymerase." tol. Gen. Genet., v. 216, 469-474, 1989.

4. Kashlev M. V., Lee J., Zalenskaya K., Niklforov V. й , Goldfarb A. "Transdominant RNA polymerase mutation blocking lnitiation-to-elongatlon transition." Science, v. 248, 1006-1009, 1990.

Автор выражает глубокую благодарность Басс И. А., Лебедеву А. Е , Грагерову А. И. .Заленской К., Ли Дж., Гольдфарбу А. эа оказанную помощь в проведении работы.