Механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia coli

Прошкин, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia coli
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia coli"

л. //

На правах рукописи

ПРОШКИН Сергей Александрович

МЕХАНИЗМЫ КООРДИНАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ С ТРАНСЛЯЦИЕЙ И РЕПАРАЦИЕЙ ДНК У ESCHERICHIA COLI

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 С Г < ? о Три

МОСКВА-2014 ' ':

005547873

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Федерального государственного унитарного предприятия "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИГенетика").

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Миронов Александр Сергеевич

ФГУП "ГосНИИГенетика'

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук

Колб Вячеслав Адамович

доктор биологических наук, профессор

Патрушев Лев Иванович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Защита состоится 27 мая 2014 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов". Автореферат разослан /7 сиуе^Л, 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук, доцент

Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Транскрипция, осуществляемая РНК-полимеразой, - ключевой этап экспрессии генов и клеточной регуляции. Элонгационный комплекс, включающий РНК-полимеразу, матрицу ДНК и синтезируемую РНК, - центральный интермедиат в транскрипционном цикле, который служит конечной мишенью для различных регуляторных белковых факторов и сигналов, закодированных в ДНК и/или РНК (Прошкин С.А. и Миронов А.С., 2010). Взаимодействие элонгационного комплекса РНК-полимер&зы с компонентами других клеточных процессов (трансляции, репликации или репарации ДНК) позволяет координировать транскрипцию с последующими этапами генной экспрессии, лежит в основе поддержания стабильности генома и сопряжения транскрипции с репарацией ДНК (Nudler Е., 2012). Изучение механизмов, определяющих взаимосвязь этих важнейших молекулярных машин, - актуальная фундаментальная проблема, на решение которой было направлено диссертационное исследование.

Aguilera, 2013; Ganesan et al., 2012). В ходе транскрипции РНК-полимераза останавливается на поврежденных участках ДНК. Для исправления повреждения ДНК к соответствующему участку необходим доступ белков системы репарации, поэтому остановленная РНК-полимераза должна быть удалена с матрицы (терминация транскрипции) или отодвинута в сторону от повреждения. Известная на сегодняшний день модель сопряженной с транскрипцией репарации ДНК у бактерий основана на участии фактора Mfd, терминирующего транскрипцию. Мы обнаружили, что хеликаза UvrD может быть ключевым компонентом альтернативного пути сопряжения транскрипции с репарацией ДНК (Epshtein et al., 2014).

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлось выяснение механизмов взаимосвязи транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia сой. В ходе работы решались следующие задачи: определение скорости транскрипции и трансляции в зависимости от генотипа и условий роста клеток; установление влияния транслирующей рибосомы in vivo на структурные изменения элонгационного комплекса РНК-полимеразы и эффективность преодоления им белковых препятствий на ДНК-матрице; определение эффектов белков Mfd и UvrD на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in v/vo; изучение с использованием генетических подходов влияния различных элонгационных факторов на сопряжение транскрипции с репарацией ДНК.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые показано, что лидирующая рибосома препятствует спонтанному возвратному смещению РНК-полимеразы в ходе транскрипции in vivo и облегчает прохождение РНК-полимеразой участков ДНК, связанных с белками. Функциональное взаимодействие между двумя молекулярными машинами у бактерий позволяет подстраивать транскрипцию к трансляционным потребностям на разных генах в разных условиях роста клетки.

Кроме того, впервые обнаружено, что в основе координации транскрипции с репарацией ДНК лежит UvrD-зависимое возвратное смещение элонгационного комплекса РНК-полимеразы, которое необходимо для экспонирования поврежденной ДНК белкам систем репарации. Наличие гомологов UvrD у эукариот, может свидетельствовать о существовании схожего механизма и у высших организмов.

Примененные в работе подходы могут быть использованы для изучения эффекта других факторов на элонгацию транскрипции. Результаты исследования имеют фундаментальное значение для понимания механизмов реализации и сохранения генетической информации. Практическая значимость заключается в создании основы для разработки новых антибиотиков и стратегии конструирования бактериальных штаммов для суперпродукции важных биологически активных компонентов.

Положения, выносимые на защиту

Предложены новые молекулярные механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у бактерий.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 38-м конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) "Механизмы в биологии" (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013 г.) и XXV Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", посвященной 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, 11-15 февраля 2013 г.).

Диссертационная работа была апробирована на совместном заседании секций «Генетика микроорганизмов» и «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП "ГосНИИГенетика" 28 ноября 2013г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Стру1сгура и объем диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и содержит 30 рисунков и 3 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы, включающего 211 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Координация транскрипции и трансляции

1.1. Скорость транскрипции и трансляции in vivo в различных условиях роста

клеток

Для выяснения, не может ли рибосома непосредственно влиять на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo и определять ход транскрипции, мы изменяли скорость трансляции, направленно воздействуя на рибосому, и проверили, как это отразится на скорости транскрипции.

Для измерения скорости элонгации транскрипции in vivo мы использовали плазмиду pUV12 с репортерным геном LacZ под контролем lPTG-индуцибельной версии промотора Al фага Т7 (Vogel and Jensen, 1994) (рис. 1). Среднюю скорость элонгации определяли по разнице во времени появления сигнала гибридизации со специфических зондов, комплементарных проксимальной и дистальной частям гена LacZ. Хотя абсолютные значения сигналов

гибридизации могут меняться в зависимости от разных факторов (Rho-зависимая терминация, стабильность РНК или скорость инициации транскрипции), время между линейным приращением сигнала от двух зондов зависит только от скорости движения РНК-полимеразы (Epshtein et al., 2003; Vogel and Jensen, 1994) (рис. 2). Мы также определили скорость элонгации трансляции по времени, необходимом для синтеза первых активных мономеров ß-галактозидазы (Bohman et al., 1984) (рис. 3).

Рнсунок 1. Схема фрагмента плазмиды р1Л/12. Прямоугольниками условно обозначены гены. Отмечены положения промотора Т7А104оз с 'ос оператором (Р/О), терминатора транскрипции ггпВ (Т), а также использованных в гибридизации зондов (1 и 2), комплементарных 1асЕ транскриптам.

Для замедления рибосом мы использовали хлорамфеникол (Ст), специфический ингибитор элонгации трансляции. Хлорамфеникол в концентрации, которую мы применяли (1 мкг/мл), оказывает лишь мягкий ингибирующий эффект на бактериальный рост. В отсутствии антибиотика скорость элонгации транскрипции гена 1ас2 в использованных условиях роста клеток в экспоненциальной фазе составила ~42 нуклеотида в секунду (нт/с), что точно соответствует скорости элонгации трансляции ~14 аминокислотных остатков в секунду (а.о./с) (рис. 2 и 3). Однако снижение скорости трансляции с помощью хлорамфеникола до 9 а.о./с повлекло соответствующее уменьшение скорости элонгации транскрипции до 27 нт/с (рис. 2 и 3). Для подтверждения гипотезы, что рибосома непосредственно контролирует скорость транскрипции, мы воспользовались штаммом Е.соИ с хромосомными мутациями в гене (ЯииваЫ е1 а!., 1984), кодирующем рибосомный белок 512. Этот штамм (СН184) характеризуется сниженной скоростью элонгации трансляции, однако стрептомицин (Бш) стимулирует почти двукратное увеличение скорости трансляции. Действительно, в отсутствии антибиотика скорость трансляции составила 6 а.о./с, а при добавлении 100 мкг/мл стрептомицина возросла до 10 а.о./с, что согласуется с описанными ранее данными (ЯииБа1а е1 а1., 1984). Скорость элонгации транскрипции в этом штамме составила 19 нт/с, однако в присутствии стрептомицина выросла до 30 нт/с (рис. 2 и 3), что соответствует изменению в скорости трансляции. Противоположный эффект трансляционных антибиотиков (Ст и Эт) на элонгацию транскрипции (замедление и ускорение рибосом) показывает, что рибосома

Р/0

221 646 Зонд 1

определяет скорость движения РНК-полимераз по матрице ДНК. Влияние носит взаимный характер, поскольку, очевидно, что рибосома не может вести трансляцию быстрее, чем РНК-полимераза синтезирует РНК.

срт

200

-Ст

00 200 300 Ь С

срт 100

10С 200 300 1, С

Время (с) 0 20 40 80 80 100 120 140 160 180 200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

-Ст <»••••» ф Ф -Ст

+Ст * • ' (-Ст

Зонд 1

* * » Зонд 2

) 200 300 10

Время (с) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

+5т * •••• +Бт

-Бт ф -Эт

Б Зонд 1

200 300 I, с

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 *••

Зонд 2

Рисунок 2. Скорость элонгации транскрипции зависит от скорости трансляции. Эффект хлорамфеникола (Ст) (А) на элонгацию транскрипции в штамме М§1655 и стрептомицина (8т) в штамме СН184 (Б). Представлены типичные результаты гибридизации РНК с проксимальным (1) и дистальным (2) зондом. Время отсчитывалось от момента добавления 1РТС к клеткам. Скорость элонгации транскрипции определяли, используя графики зависимости приращения сигнала гибридизации от времени после индукции транскрипции 1ас1.

Рисунок 3. Эффект Ст и Бт на скорость элонгации трансляции. Кинетика образования | о-нитрофенола представлена как функция квадратного корня из нормированных значений поглощения образцов (А) (420 нм) от времени. Время, необходимое для синтеза первых мономеров р-галактозидазы, найдено после экстраполяции функции к нулевым значениям ! поглощения.

Мы обнаружили соответствие скоростей транскрипции и трансляции в различных условиях культивирования клеток, включая разные источники углерода и фазы роста (табл. 1). ; В стационарной фазе транскрипция и трансляция согласованно замедляются в клетках "дикого типа" (МС1655) или штамма с "медленной рибосомой" (СН184). Кроме того, Эт ускоряет и транскрипцию, и трансляцию в стационарной фазе роста в клетках СН184 до уровня, наблюдаемого в М01655 в стационарной фазе. Таким образом, транскрипция находится под строгим трансляционным контролем в меняющихся условиях роста бактерий.

Таблица 1. Средняя скорость элонгации транскрипции соответствует скорости | элонгации трансляции в различных условиях роста клеток. Указанные штаммы растили в среде ЬВ до СЮ6оо 0.4, если не указано иное. В стационарной фазе индукцию проводили при СЮс,оо 2.5. В качестве альтернативных источников углерода также использовали глицерин (0.5%) или а-метил-глюкозид (в отношении 15:1 к глюкозе). (*) В каждом случае данные получены на основе трех-четырех повторностей опыта. В то время как абсолютные значения сигналов гибридизации могли меняться от опыта к опыту, расчетная скорость транскрипции и трансляции воспроизводилась с относительным стандартным отклонением не более 15%.

Штамм Условия роста клеток Скорость транскрипции* (нт/с) Скорость трансляции* (а.о./с)

МБ 1655 42 14

М01655 +Ст 27 9

М01655 стационарная фаза 21 7

МО 1655 глицерин 31 10

М01655 аМО 23 8

СН184 31 10

СН184 19 6

СН184 стационарная фаза +8т 22 7

СН184 стационарная фаза 12 4

1.2. Структурные изменения элонгационного комплекса РНК-полимеразы под влиянием рибосомы

В ходе транскрипции часто происходят спонтанные возвратные смещения РНК-полимеразы вдоль ДНК и РНК in vitro и in vivo (Komissarova and Kashlev, 1997; Nudler et al,

I 1997; Toulme et al., 1999). При этом З'-конец РНК выходит из активного центра, что приводит к паузам в транскрипции или остановкам транскрипции с образованием инактивированных элонгационных комплексов. Подобного рода паузы и остановки могут задавать среднюю скорость элонгации транскрипции (Epshtein and Nudler, 2003; Epshtein et al., 2003). Ранее было показано, что элонгационный комплекс РНК-полимеразы способен подавлять откат впереди идущего элонгационного комплекса (Epshtein and Nudler, 2003; Epshtein et al., 2003). j Поскольку при откате РНК-полимеразы синтезируемая РНК проходит через фермент в обратном направлении, транслирующая рибосома может ингибировать такое смещение, сдвигая элонгационный комплекс вперед. В результате, контролируя паузы и остановки транскрипции, рибосома может определять скорость транскрипции.

Для проверки этой гипотезы мы разработали модельную систему, которая позволяет детектировать влияние рибосомы на смещение РНК-полимеразы in vivo. За основу была взята плазмида р2ЕС, на которой РНК-полимераза начинает транскрипцию с конститутивного промотора hisR и останавливается на расстоянии 64 нуклеотида от старта транскрипции перед Lac репрессором, связанным с последовательностью lac оператора (Epshtein et al., 2003; Guerin et al., 1996) (рис. 4). Ранее было показано, что при столкновении РНК-полимеразы с белком, связанным с ДНК, элонгационный комплекс смещается против хода транскрипции in vitro и in vivo, и такое возвратное смещение ограничивает способность РНК-полимеразы проходить через препятствие на матрице ДНК (Epshtein et al., 2003). Остановка РНК-полимеразы на данной плазмиде происходит в пределах тринуклеотидного повтора (АТС)10, что позволяет с : высокой точностью локализовать положение элонгационного комплекса на матрице ДНК. { Для устранения эффектов, связанных с влиянием на остановленную РНК-полимеразу

¡ следующих за ней других молекул РНК-полимераз (Epshtein and Nudler, 2003; Epshtein et al., 2003), мы приготовили генно-инженерную конструкцию, позволившую получить in vivo изолированный элонгационный комплекс (рис. 4). Мы модифицировали плазмиду рЕС2, клонировав Rho-независимый терминатор транскрипции trp между промотором и оператором. Нуклеотидная последовательность терминатора была введена с таким расчетом, чтобы между политимидиновой последовательностью терминатора и операторным участком мог поместиться только один элонгационный комплекс РНК-полимеразы. В полученной плазмиде рЕС1 уникальный сайт ВатН\ расположен между промотором и терминатором, что отличает ее от описанной ранее плазмиды pATC-Ter (Epshtein et al., 2003).

На основе pECl нами была сконструирована плазмида pRBSlEC, содержащая последовательность Шайна-Дапьгарно (SD), энхансер трансляции гена 10 бактериофага Т7 (Olins and Rangwala, 1989) и ATG кодон на расстоянии 120 нуклеотидов от /ас-оператора (рис. 4). Между инициирующим кодоном и !ас оператором формируется открытая рамка считывания. Нуклеотидные последовательности полученных плазмид pECl и pRBSlEC между hisR промотором и lac оператором были проверены секвенированием.

+ trpтерминатор (pECl, pR3s1 ЕС)

CpRBS1 ЕС)

Рисунок 4. Модельная система для изучения изолированного элонгационного комплекса РНК-полимеразы и анализа влияния на него рибосомы in vivo. Плазмида pECl получена на основе рЕС2 добавлением терминатора trp. Плазмида pRBSlEC - производная от pECl, в которой закодирован сайт связывания рибосомы (RBS) и содержится открытая рамка считывания. Элонгационный комплекс РНК-полимеразы остановлен на участке с тринуклеотидными повторами (АТС)10 перед Lac репрессором. Терминатор транскрипции trp (Т) в плазмидах pECl и p^lEC размещен таким образом, что последующая РНК-полимераза останавливается точно на терминаторе и отделяется от матрицы.

Для определения положения элонгационного комплекса на матрице ДНК in vivo использовали хлорацетальдегид (CAA), специфичный к одноцепочечным участкам ДНК. CAA образует имидазольные кольца между положениями N3 и N4 цитозина или N1 и N6 аденина. В двухцепочной ДНК эти группы вовлечены в образование водородных связей и не реагируют с CAA (Dayn et al., 1992). В элонгационном комплексе РНК-полимеразы нематричная цепь ДНК в пределах транскрипционного пузырька находится в одноцепочечной форме, что делает реакционно-способные группы гетероциклических оснований доступными для реакции с CAA. Сайты модификаций в экстрагированной из клеток ДНК определяли методом достройки праймера. В данном подходе специфический радиоактивно меченный по 5'-концу праймер гибридизуется с выделенной ДНК и удлиняется in vitro ДНК-полимеразой, которая прекращает синтез цепи ДНК в сайтах модификаций (рис. 5). Продукты удлинения праймера с

одинаковым 5'-концом, но различающиеся по З'-концу в соответствии с позициями

модификаций, анализировали в денатурирующем полиакриламидном геле.

Рисунок 5. Локализация in situ элонгационного комплекса РНК-полимеразы на матрице ДНК с помощью хлорацетальдегида (CAA). (А) Схематично показан остановленный перед репрессором элонгационный комплекс, который находится в динамическом равновесии между активированным состоянием (3'-конец РНК в активном центре фермента) и неактивным состоянием (при смещении РНК-полимеразы назад). CAA модифицирует азотистые основания в одноцепочечном участке ДНК транскрипционного пузырька. (Б) Модифицированные основания ДНК устанавливаются с помощью удлинения праймера ДНК-полимеразой.

В результате анализа полученных футпринтов, как и ожидалось, на плазмиде рЕС2 было обнаружено два остановленных перед репрессором элонгационных комплекса РНК-полимеразы, а на плазмидах рЕС1 и pRBSlEC - по одному (рис. 6). Однако положение РНК-полимеразы, находящейся непосредственно перед репрессором, на этих матрицах существенно отличается. Изолированная РНК-полимераза на матрице рЕС1 в большей степени смещается назад, чем соответствующая РНК-полимераза на матрице pRBSlEC (или рЕС2): на рЕС1 повышается чувствительность к CAA оснований у верхней границы футпринта и снижается у нижней (рис. 6). Таким образом, аналогично эффекту предшествующего элонгационного комплекса на впереди идущий комплекс (дорожка 1 на рис. 6) (Epshtein et al., 2003), рибосома препятствует откату РНК-полимеразы.

1.3. Влияние рибосомы на прохождение РНК-полимеразой участков ДНК,

связанных с белками

Поскольку ингибирование возвратных смещений облегчает прохождение РНК-полимеразой участков матрицы ДНК, связанных с белками (Epshtein et al., 2003), рибосома также может способствовать преодолению РНК-полимеразой этих участков. Мы напрямую проверили это предположение, сравнив количество мРНК cat, синтезируемой за репрессором на матрицах plEC и pRBSlEC (рис. 7). Накопление мРНК cat оценили с помощью обратной транскрипции с праймера, комплементарного участку ДНК за оператором. Для нормирования проб оценивали также количество мРНК Ыа, используя специфичный праймер. На матрице plEC, не кодирующей рибосом-связывающего участка, только -10% элонгационных

комплексов РНК-полимераз преодолевают связанный с матрицей ДНК Lac репрессор. Однако доля элонгационных комплексов, транскрибирующих ДНК ниже репрессора, возрастает до 40% на матрице pRBS 1 ЕС, кодирующей рибосом-связывающий участок. В то же время ингибирование элонгации трансляции антибиотиками производит обратный эффект. Таким образом, функциональное взаимодействие in vivo между рибосомой и РНК-полимеразой облегчает прохождение РНК-полимеразой участков матрицы ДНК, связанных с белками.

р2ЕС

5-— ъ

р1ЕС

(АТС)п

Р t

55Í>csd=

СЖУ-

рга51ЕС ATG (АТС)п

р т. RBS Y Тег „_,

4 <i Я G А T С

#2i i

#1 as

1 2 3

™ Ter

Lac

Рисунок 6. Рибосома подавляет, возвратное смещение РНК-полимеразы. (А) Схема конструкций р2ЕС, plEC и p^lEC. (Б) Модификации САА in situ нематричной цепи ДНК в плазмидах р2ЕС (дорожка 1), plEC (дорожка 2) и pRBSlEC (дорожка 3) проанализированы методом достройки праймера. В присутствии второй РНК-полимеразы (дорожка 1) или транслирующей рибосомы (дорожка 3) остановленная перед препятствием РНК-полимераза сдвигается вперед по ходу транскрипции.

А Б р1ЕС р«ю | Ес р-иа,^

IPTG: Sp, Т::

р1ЕС <15%iBuniíuuuijli _Р Iг ™

RO2

pKBS1EC

P f- i Таг

ribnsorr^

4U'A readt-irouch TP» ♦ Ч.ШЩ IB*** ЩШ TP

pRBS1 ЕС АТ- <16%raDdthrMqh JU^ffl 'i ibri--

+Sp Tc ) 1 2 3 4 5 6

П(Ч4) 10 100 | 40 100 | 14 10В

Рисунок 7. Вклад рибосомы in vivo в преодоление РНК-полимеразой белков, связанных с ДНК. (А) Схема, описывающая кооперативный механизм. Рибосома реактивирует остановленный элонгационный комплекс РНК-полимеразы. Каталитически компетентный íj элонгационный комплекс РНК-полимеразы проходит через препятствие в виде Lac-репрессора, как только произойдет диссоциация последнего и матрицы ДНК. Ингибирование элонгации трансляции антибиотиками (Sp, Тс) нарушает кооперативный механизм, снижая эффективность прохождения препятствия РНК-полимеразой. (Б) На радиоавтографе представлены продукты обратной транскрипции с 32Р-меченых праймеров, гибридизующихся с РНК-транскриптами генов cat или Ыа (для нормировки). Стрелками отмечена i полноразмерная ДНК, полученная при обратной транскрипции мРНК cat (RO, runoff), и цепь ДНК, синтез которой прерван терминационной шпилькой на этой же матрице РНК (TP). За эффективность преодоления РНК-полимеразой препятствия на матрице ДНК (R, %) принята доля продуктов обратной транскрипции (RO+TP) от числа продуктов (100%) в условиях дерепрессии (+IPTG).

2. Координация транскрипции и репарации ДНК

Единственный известный у бактерий фактор, связывающий транскрипцию с репарацией, - Mfd (Park et al., 2002; Selby and Sanear, 1993). In vitro Mfd смещает остановленную PHK-

полимеразу вперед по ходу транскрипции и в конечном итоге удаляет ее с матрицы (Park et al.,

____

2002). Согласно принятой модели Mfd привлекает к поврежденному участку ДНК димер UvrA, запуская эксцизионную репарацию нуклеотидов.

2.1. Воздействие Mfd на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo

Инактивация гена mfd Е. coli

Для изучения физиологической роли фактора Mfd мы инактивировали кодирующий его ген в Е. coli. Для инактивации использовали метод, основанный на Red-зависимой рекомбинации (Datsenko and Wanner, 2000). Нуклеотидная последовательность mfd в хромосоме заменялась селективным маркерным геном cal, фланкированным сайтами A.attL и XattR (рис. 8). Интегрируемый фрагмент ДНК амплифицировали с плазмиды pMWl 18-XattL-CmR-A.attR (Каташкина и соавторы, 2005) с помощью олигонуклеотидов, 5'-концы которых содержат 36-нуклеотидные последовательности, гомологичные N- и С- концевым областям структурного гена mfd. Сайты XattL и XattR позволяют вырезать маркерный ген после отбора интегрантов с помощью вспомогательной плазмиды pMW-int/xis, используя Int/Xis-зависимую систему рекомбинации фага X. Для подтверждения интеграции кассеты XattL-CmR-XattR в ген mfd и ее последующее выщепление провели ПЦР на матрице хромосомной ДНК с фланкирующими mfd праймерами (рис. 8).

Red-зависимая интеграция кассеты

om£d2

УФ ycfT j-

ез Е Е MW 2 <3 <J

О 111 fell

Int/Xis-зависимое выщепление кассеты

omjai

-< КА- j|ЧН< усд j-

2- > 1.6— -1- г

0.75 — 0.50.25-

-«3.7 -<1.7

-«0.3

Рисунок 8. Инактивация гена пф. (А) Схема интеграции кассеты айЬ-са/-а1Ж в хромосомный локус lnfd и ее выщепление с образованием делеции ДттУ. (Б) Проверка интеграции и выщепления кассеты с помощью ПЦР с праймерами т!У1 и т!У2 на матрице хромосомной ДНК из указанных штаммов. Слева указаны длины (в т.п.о.) маркера ДНК (М\¥), справа -расчетные длины амплифицированных фрагментов ДНК.

Взаимодействие Mfd с остановленным элонгчционным комплексом РНК-полимеразы

Для исследования влияния, которое оказывают транскрипционный фактор Mfd на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo, мы сравнили положение остановленного элонгационного комплекса РНК-полимеразы на матрице рЕС1 в двух изогенных штаммах Е. coli: дикого типа (MG1655) и мутанте с инактивированным геном mfd. Тестирование провели, используя метод футпринтинга in situ (Toulme et al., 1999). Для того чтобы следить за изменениями, которые происходят с элонгационным комплексом с течением времени, мы использовали рифампицин, позволяющий ингибировать новые раунды транскрипции с промотора, и через определенные временные интервалы после добавления антибиотика проводили модификацию оснований одноцепочечных участков матрицы ДНК с помощью хлорацетапьдегида (CAA) (рис. 9).

Рисунок 9. Схема модельной системы с остановленным перед белком-репрессором элонгационным комплексом РНК-полимеразы на матрице рЕС1. После прекращения новых раундов транскрипции рифампицином (+Rif) определяли положение элонгационного комплекса in situ с помощью хлорацетальдегида (+САА). Отмечено положение промотора (Рг), терминатора (Тег) и репрессора (Lac).

+CAA-«

+CAA«

В штамме дикого типа (MG1655) реакционная способность оснований между терминатором и lac оператором быстро уменьшается после добавления рифампицина, что говорит о резком сокращении числа остановленных перед препятствием на матрице элонгационных комплексов. Исчезновение остановленных элонгационных комплексов с течением времени в условиях, когда нет поступления новых комплексов с промотора, может происходить при активном удалении их с матрицы и/или прохождении ими через препятствие. По сравнению со штаммом дикого типа в штамме с инактивированным геном mfd наблюдается сильное увеличение в реактивности оснований перед оператором, т.е. в области, где находится остановленный элонгационный комплекс (рис. 10). Кроме того, после ингибирования новых раундов транскрипции рифампицином уменьшение реакционной способности оснований в этом районе происходит гораздо медленнее, чем в штамме дикого типа. Таким образом, в мутантном штамме, в котором отсутствует фактор Mfd, перед препятствием на матрице

накапливается большее число РНК-полимераз и они проводят там гораздо большее время по сравнению со штаммом дикого типа (рис. 10).

MGI655 +САА

< g

< £ V Î

Д mfd +САА

< 2 S g

+Rif

+ 0 Г 2' 4'

« • . ......• ■ ■

ж: «к

- *iffi

i ^ ш ЩШ ■W g

«Çfc» «M«*

ж г als

M mjb Ф-

Рисунок 10. Мишенью для фактора Mfd in vivo служит остановленный элонгационный комплекс РНК-полимеразы. Модификации нематричной цепи ДНК в штаммах MG1655 (wt) и MG1655 Amfd проведены хлорацетальдегидом (+САА) и проанализированы методом достройки праймера. Модификации проводились через указанные промежутки времени (в минутах) после добавления рифампицина (+Rif). Отмечено положение изолированного элонгационного комплекса (ЕС), lac оператора, trp терминатора и hisR промотора.

Наши результаты, полученные in vivo, указывают на то, что для функционирования Mfd не обязательно наличия поврежденной ДНК, при этом действие фактора направлено на остановленный элонгационный комплекс РНК-полимеразы, что согласуется с данными in vitro (Park et al., 2002; Selby and Sanear, 1993). Остановка РНК-полимеразы может стать предпосылкой к возвратным смещениям элонгационного комплекса, и транслирующие рибосомы играют ключевую роль в подавлении таких смещений (Proshkin et al, 2010). Однако в условиях, когда трансляция неэффективна или отсутствует (например, в некодирующих областях), в клетке существуют альтернативные механизмы подавления избыточных возвратных смещений РНК-полимераз, один из которых основан на действии Mfd (Dutta et al., 2011).

Однако генетические и биохимические данные указывают на ограниченную роль Mfd в сопряжении транскрипции с репарацией ДНК: 1) клетки E.coli с инактивированным геном mfd

проявляют лишь небольшую чувствительность к ультрафиолетовому излучению (Schalow et al., 2012; Selby and Sanear, 1993; Witkin, 1966); 2) некоторые типы повреждений ДНК устраняются TCR без участия Mfd (Schalow et al., 2012); 3) TCR лишь частично зависит от Mfd на активно транскрибируемых генах (Kunala and Brash, 1995); 4) NusA задействован в TCR независимо от Mfd (Cohen et al., 2010); 5) Mfd очень медленно терминирует транскрипцию (Howan et al., 2012; Park et al., 2002). Таким образом, вероятно, существуют дополнительные факторы, связывающие транскрипцию с репарацией ДНК.

2.2. Роль фактора UvrD в координации транскрипции и репарации ДНК

В лаборатории проф. Нудлера (Nudler, New York University) в результате протеомного анализа химически сшитых in vivo с РНК-полимеразой белковых комплексов было обнаружено, что белок эксцизионной репарации нуклеотидов UvrD напрямую взаимодействует с РНК-полимеразой E.coli. Эти данные также нашли подтверждение в опытах in vitro (Epshtein et al., 2014). UvrD - ДНК-хеликаза суперсемейства 1 и 3'-5' транслоказа, обладающая оцДНК-зависимой АТР-азной активностью (Kumura and Sekiguchi, 1984; Lee and Yang, 2006; Matson and George, 1987). В настоящей работе мы исследовали влияние фактора UvrD на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo и его роль в сопряжении транскрипции с репарацией ДНК.

Суперпродукция UvrD в клетках E.coli

Генно-инженерная конструкция для индуцированной суперэкспрессии uvrD была создана на базе вектора pZA31, содержащего регулируемый промотор Рцяо-i (Lutz and Bujard, 1997). Этот промотор сконструирован на базе промотора Pl фага X, в котором сайты связывания репрессора cl заменены на нуклеотидные последовательности оператора 2 (telO2) оперона tel устойчивости к тетрациклину транспозона Тп/0. В результате промотор регулируется Tel репрессором, что позволяет в данной системе использовать в качестве индуктора ангидротетрациклин. Плазмида pZA31 содержит ориджин репликации р 15а, что делает ее совместимой с плазмидами на основе ColEl репликона (рис. 11).

Для обеспечения синтеза репрессора TetR его ген помещен под контроль конститутивного промотора Рмгз в составе экспрессионной кассеты (Z1), несущей также ген устойчивости к спектиномицину и /ас/. Кассета интегрирована в бактериальную хромосому по сайту интеграции фага X и может быть перенесена транедукцией в тестируемые штаммы E.coli.

MW, kDa

Xhv1(2) /',.:■ TT 1 / P Í tPtO

aTc, ng/ml: - 50 150

ECOKÍ (24I5j " J WtíldlII (2403)/

cfal (ajjs)'

-170 -130

-95

— 72

-55

UvrD

Рисунок 11. Суперпродукция UvrD в клетках E.coli. (А) Схема экспрессионной плазмиды pUvrD. (Б) Электрофоретическое разделение белков из клеток, несущих плазмиду pUvrD, для анализа индукции биосинтеза UvrD ангидротетрациклином.

Инактивация генов uvrD, greA и greB E.coli

Для инактивации генов uvrD, greA и greB E.coli применили описанный выше подход на основе Red-зависимой рекомбинации (Datsenko and Wanner, 2000). В данном случае интегрируемая кассета включала ген устойчивости к канамицину, фланкированный сайтами FRT. Для элиминации маркерного гена использовали плазмиду рСР20, кодирующую FLP рекомбиназу. Объединение мутаций в одном штамме MG1655Z1 проводили с помощью трансдукции фагом PI.

Влияние UvrD на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo

Для изучения влияния UvrD на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo мы использовали плазмиду р1ЕС. Штамм Е. coli MG 1655 ZI AuvrD, содержащий pi ЕС, трансформировали плазмидой pUvrD или исходным вектором pZA31. Для индукции синтеза UvrD в клетках использовали ангидротетрациклин. Положение элонгационного комплекса на матрице ДНК in vivo установили с помощью CAA. Область матрицы ДНК plEC, где модификация оснований происходит только в отсутствии IPTG (т.е. когда Lac репрессор связан с матрицей plEC и физически препятствует движению РНК-полимеразы), соответствует положению одиночного элонгационного комплекса, остановленного перед репрессором. Анализ полученных футпринтов (рис. 12) показал, что под влиянием UvrD in vivo происходит большее смещение РНК-полимеразы против хода транскрипции, чем в отсутствии фактора: у верхнего участка футпринта усиливается чувствительность гетероциклических оснований к CAA, а у нижнего участка - снижается. Т.е. in vivo UvrD смещает остановленный элонгационный комплекс РНК-полимеразы против хода транскрипции. Такой эффект UvrD на элонгационный комплекс может иметь большое

значение для репарации повреждений в ДНК, когда РНК-полимераза останавливается на

поврежденном сайте ДНК и ее необходимо сместить для доступа к повреждению

репарационных белков.

Мд1655 ЪЛ тгОг.Кт' + р1ЕС

+ pZA31 + pUvrD

IPTG: - + - - + -

CAA: - + + + + -

9 3 1 С SHp|K

щш' '

Рисунок 12. Возвратное смещение (backtracking) элонгационного комплекса (ЕС) РНК-полимеразы под действием UvrD in vivo. Представлен радиоавтограф

футпринта in situ остановленного ЕС. Модификация

одноцепочечного участка ДНК транскрипционного пузырька ЕС проведена хлорацетальдегидом (+САА). В присутствии UvrD (pUvrD) остановленный ЕС смещается дальше, чем ЕС, не испытывающий действие UvrD (pZA31).

Мы протестировали чувствительность штамма с инактивированным геном uvrD к различным мутагенам: митомицину С, 4-нитрохинолин-1 -оксиду (4NQO), цисплатину и ультрафиолетовому излучению (УФ). Эти мутагены приводят к сшивкам и объемным модификациям ДНК, устраняемым белками эксцизионной репарации нуклеотидов. Клетки uvrD(-) оказались гораздо более чувствительны к повреждению ДНК указанными реагентами и УФ, чем клетки исходного штамма с неповрежденным геном uvrD (рис. 13). Кроме того, чувствительность uvrD(-) клеток к различным мутагенам гораздо выше, чем клеток с инактивированным геном mfd.

Если возвратное смещение РНК-полимеразы действительно необходимо для эффективной репарации транскрибируемой ДНК, то подавление факторов, в норме препятствующих возвратному смещению РНК-полимеразы, должно способствовать устранению повреждений в ДНК. Действительно, инактивация генов greA/greB супрессирует

ЕС

■

нами

чувствительность делеционного мутанта uvrD генотоксичным реагентам и УФ (рис. 13).

А В С D А В С D

А - MG1655Z1 В - Ад re А АдгеВ С - A uvrD

D - АдгеА AgreB AuvrD

LB митомицин С

(1 мкг/мл)

ко всем протестированным

цисплатин (80 мкг/мл)

Г6 4NQO (1 мкМ)

митомицин С 4NQO УФ(5Дж/м2)

Рисунок 13. Инактивация greA/greB или замедление трансляции супрессирует чувствительность мутанта uvrD к генотоксичным реагентам и УФ. (А) Рост клеток из серии последовательных разведений (1:10) бактериальных культур на LB-arape с указанными мутагенами после инкубации в течение 24 ч при 30°С. (Б) Анализ чувствительности штаммов E.coli к митомицину С, 4-нитрохинолин-1 -оксиду (4NQO) и УФ-излучению.

Интересно, что UvrD противодействует GreA/B даже при нормальных условиях роста клеток, поскольку инактивация uvrD супрессирует термочувствительность двойного мутанта greA greB (рис. 14).

Транслирующие рибосомы подавляют спонтанные возвратные смещения РНК-полимеразы (Proshkin et а!., 2010), а их ингибирование повышает устойчивость клеток к УФ-повреждениям (Doudney and Rinaldl, 1985; Hanawalt, 1966). Действительно, задержка рибосом сублетальной дозой хлорамфеникола делает клетки uvrD(-) более устойчивыми к митомицину С, 4-нитрохинолин-1-оксиду и УФ (рис. 13). Таким образом, для эксцизионной репарации нуклеотидов в течение генотоксичного стресса UvrD конкурирует с факторами, препятствующими откату РНК-полимеразы.

MG1655

AgreAAgreB AgreAAgreB AgreAAgreB

Рисунок 14. Инактивация uvrD супрессирует термочувствительный фенотип штамма \greAAgreB.

2.3. Участие транскрипционного фактора NusA в координации транскрипции с репарацией ДНК

Недавно на основе генетических данных было сделано предположение об участии транскрипционного фактора NusA в неохарактеризованном ранее пути эксцизионной репарации нуклеотидов, отличном от Mfd-зависимого пути (Cohen et al., 2010). Поскольку фактор NusA усиливает возвратные смещения РНК-полимеразы в элонгации транскрипции (Bar-Nahum et al., 2005), NusA может играть роль в UvrD-зависимом механизме координации транскрипции с репарацией ДНК. Анализ на чувствительность к мутагенам штамма, полностью лишенного гена nusA, невозможен в обычном генетическом окружении из-за незаменимости этого гена для жизни E.coli. Однако делегирование nusA возможно в специально сконструированном штамме E.coli MDS42, из которого направлено удалены фрагменты ДНК, полученные E.coli горизонтальным переносом (Cardinale et al., 2008; Posfai et al., 2006). Действительно, штамм MDS42 AnusA чувствителен к УФ, митомицину С и 4-нитрохинолин-1-оксиду (рис. 15). Мы обнаружили, что инактивация reHagreß в этом штамме приводит к супрессии чувствительности клеток mtsA(-) к протестированным мутагенам (рис. 15). Таким образом, наши данные указывают на участие NusA в репарации ДНК и роль возвратного смещения РНК-полимеразы в этом механизме.

Ю"1 10'2 Ю3 10 ' 105 Ю'в

□ 13

с 12

•f«

А ■ MDS42 В • AnusA С - AnusA дгеВ

митомицин С (0.5 мкг/мл)

Рисунок 15. №1$А участвует в репарации ДНК с использованием возвратного смещения РНК-полимеразы. Рост клеток из серии последовательных разведений (1:10) бактериальных культур на ЬВ-агаре после УФ облучения или на ЬВ-агаре с указанными мутагенами после 24 ч при 30°С.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Модель координации транскрипции с трансляцией

Хотя и РНК-полимераза, и рибосома действуют по принципу броуновского храповика (Bar-Nahum et al., 2005; Ramakrishnan, 2002; Spirin, 2009), эти молекулярные машины имеют различие в своем рабочем цикле: транслокация рибосомы по РНК практически необратима, в то время как РНК-полимераза осциллирует, смещаясь вперед-назад по матрице ДНК с одновременным движением РНК относительно фермента (Bar-Nahum et al., 2005; Komissarova and Kashlev, 1997; Nudler et al., 1997; Toulme et al., 1999). Равновесие между продуктивным (посттранслокационным) и непродуктивными (претранслокационным или сдвинутым назад) состояниями элонгационного комплекса определяет скорость элонгации транскрипции (Bar-Nahum et al., 2005). Транслирующая рибосома способна препятствовать спонтанному возвратному смещению РНК-полимеразы, повышая эффективность транскрипции (рис. 6 и 7). Функциональное взаимодействие рибосомы и РНК-полимеразы по своему эффекту на транскрипцию сходно с кооперативным эффектом между РНК-полимеразами (Epshtein and Nudler, 2003; Epshtein et al., 2003; Jin et al., 2010; Saeki and Svejstrup, 2009). Однако взаимодействие между РНК-полимеразами, вероятно, проявляется на генах с высоким уровнем экспрессии (например, рибосомные, стресс-индуцибельные гены). Большинство же белок-кодирующих генов имеют относительно слабые промоторы, что усиливает роль эффекта рибосом на транскрипцию. Таким образом, немонотонность элонгации транскрипции играет важную роль в ее синхронизации с трансляцией. Рибосома контролирует РНК-полимеразу, позволяя подогнать синтез РНК к трансляционным потребностям клетки (Proshkin et al., 2010). В отсутствие взаимодействия между макромолекулами можно ожидать продолжительные паузы в транскрипции. Действительно, на первых 50 нуклеотидах транскрибируемой области рядом с промотором часто находят остановленные элонгационные комплексы РНК-полимеразы (Hatoum and Roberts, 2008). Возможно, отчасти такие остановки РНК-полимераз связаны с тем, что рибосомы не могут связать РНК этих элонгационных комплексов и противодействовать паузам в транскрипции.

Интересно, что in vivo фактор терминации Rho локализуется вместе с РНК-полимеразой сразу после инициации транскрипции (Peters et al., 2009). Действительно, in vitro было показано, что Rho может быть связан с элонгационным комплексом РНК-полимеразы на всем протяжении фазы элонгации транскрипции и не нуждается в РНК-транскрипте для начального взаимодействия с РНК-полимеразой (Epshtein et al., 2010). Кроме того, связывание Rho с РНК-полимеразой достаточно сильное для того, чтобы исключить обмен молекул Rho и важно для терминации транскрипции (Epshtein et al., 2010). Каким же образом транскрипция доходит до

конца даже тех генов, чьи транскрипты слабо транслируются и потенциально содержат незащищенные рибосомами протяженные области-мишени Rho? Вероятно, паузы в транскрипции задерживают РНК-полимеразу, позволяя лидирующей рибосоме догнать РНК-полимеразу и контролировать движение до конца транслируемой области, предотвращая Rho-зависимую терминацию транскрипции.

Структурные основы прямого контакта РНК-полимеразы и рибосомы предложены в работе, в которой установлено физическое взаимодействие С-концевого домена транскрипционного фактора NusG и рибосомного белка S10 малой субчастицы рибосомы (Burmann et al., 2010). Поскольку сайт связывания NusG белка S10 экспонирован на поверхности 30S субчастицы рибосомы, а N-концевой домен NusG связывается с РНК-полимеразой (Belogurov et al., 2009), NusG может служить линкером между рибосомой и РНК-полимеразой (Burmann et al., 2010). NusG также взаимодействует с фактором терминации транскрипции Rho и необходим для его функции in vivo (Cardinale et al., 2008; Sullivan and Gottesman, 1992). Поскольку Rho конкурирует с S10 за связывание с С-концевым доменом NusG, активация Rho возможна только в отсутствие рибосом (Burmann et al., 2010).

Для изучения взаимодействия РНК-полимеразы и рибосомы Е. coli недавно была предложена система сопряженной транскрипции и трансляции in vitro из очищенных компонентов (Castro-Roa and Zenkin, 2012). В отличие от разработанных ранее систем бесклеточной трансляции, которые нацелены главным образом на продукцию белков in vitro (Martin et al., 2001; Shirokov et al., 2007; Spirin et al., 1988), новый подход позволяет пошагово контролировать движение РНК-полимеразы и рибосомы. В результате показано, что рибосома, транслирующая мРНК непосредственно за РНК-полимеразой, меняет продолжительность пауз в транскрипции in vitro (Castro-Roa and Zenkin, 2012). Принимая во внимание отсутствие стабильной вторичной структуры использованной РНК, этот эффект может являться следствием прямого взаимодействия между молекулярными машинами, что согласуется с предложенной ранее нашей гипотезой (Proshkin et а!., 2010).

Недавние исследования показали, что обнаруженный нами эффект подавления рибосомой спонтанных возвратных смещений РНК-полимеразы in vivo связывает трансляцию с геномной нестабильностью у бактерий (Dutta et al., 2011). Частые столкновения РНК-полимеразы и репликативной вилки в попутном направлении неизбежны, поскольку скорость репликации на порядок выше скорости транскрипции (Kornberg, 1988). Выяснилось, что такие столкновения реплисомы со сдвинутым назад элонгационным комплексом РНК-полимеразы приводят к двухцепочечным разрывам ДНК, при ошибочной репарации которых возникают мутации (Dutta et al., 2011). Транслирующие рибосомы играют важную роль в поддержании целостности белок-кодирующих генов, предотвращая откат РНК-полимеразы. Поскольку

рибосомы - основной сенсор клеточного метаболизма и стресса, сопряжение транскрипции и трансляции обеспечивает связь между условиями роста бактерий, мутагенезом и клеточной адаптацией к изменению окружающей среды.

Модель координации транскрипции с репарацией ДНК

Двойная спираль ДНК с одноцепочечным участком является предпочтительным сайтом связывания UvrD, проявляющего активность хеликазы/транслоказы (Maluf et al., 2003; Yang, 2010). Подобная структура с экспонированным одноцепочечным участком нематричной цепи ДНК присутствует в транскрипционном пузырьке и, следовательно, служит потенциальной мишенью для UvrD. Действительно, наши коллеги экспериментально установили, что в составе элонгационного комплекса РНК-полимеразы UvrD локализуется у верхней границы транскрипционного пузырька в районе домена "заслонка" ß-субъединицы РНК-полимеразы (Epshtein et al., 2014). Примечательно, что UvrD и NusA связываются в непосредственной близости друг от друга на поверхности РНК-полимеразы, что может объяснить участие NusA в эксцизионной репарации нуклеотидов (Cohen et al., 2010). Действительно, NusA кооперирует с UvrD in vitro (Epshtein et al., 2014) и роль NusA в репарации связана с возвратным смещением элонгационного комплекса (рис. 15). Кроме того, UvrD и NusA взаимодействуют с UvrB и UvrA, соответственно (Ahn, 2000; Butland et al., 2005; Cohen et al., 2010; Manelyte et al., 2009). Возможно, UvrD и NusA помимо синергетического эффекта по смещению РНК-полимеразы, в результате которого экспонируется поврежденный участок ДНК, также способствуют привлечению UvrAB к этому месту.

Рисунок 16. Модель координации транскрипции и репарации.

В условиях отсутствия клеточного стресса UvrD содержится в эквимолярном количестве по отношению к РНК-полимеразе (около ЗхЮ3 молекул на клетку) (Arthur and Eastlake, 1983). Однако при SOS-ответе внутриклеточный уровень UvrD увеличивается примерно втрое (Kunuira and Sekiguchi, 1984), что может способствовать димеризации фактора. Вероятно, именно димер UvrD является активной хеликазой/транслоказой (Maluf et al, 2003) и его образование необходимо для UvrD-зависимого отката РНК-полимеразы (Epshtein et al., 2014). Такие возвратные смещения РНК-полимераз в ходе элонгации транскрипции может нарушать целостность генома в клетках, восстанавливающихся от генотоксичного стресса и возобновляющих репликацию, т.к. частые столкновения в попутном направлении между реплисомой и тупиковыми элонгационными комплексами приводят к двуцепочечным разрывам ДНК (Dutta et al., 2011). Сдвигая тупиковые комплексы РНК-полимеразы вперед, Mfd подавляет появление двуцепочечных разрывов ДНК, вызванных подобными столкновениями, и, следовательно, снижает высокую частоту мутаций, связанных с репарацией этих разрывов. Данная модель согласуется с фенотипом mfd(-) ("mutation frequency decline") E.coli, высокой УФ-мутабильностью, небольшой чувствительностью к УФ и сниженной способностью к восстановлению транскрипции после УФ-облучения (Schalow et al., 2012; Witkin, 1966). Вероятно, основную роль Mfd может играть в восстановлении клетки после избыточных возвратных смещений РНК-полимераз, связанных с SOS-ответом.

Повреждение ДНК

UvrD стимулирует откат РНК-полимеразы

Привлечение UvrAB к экспонированному повреждению ДНК

UvrC ДНК-полимераза I лигаза

ДНК

▼

Репарация

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что лидирующая рибосома препятствует спонтанному возвратному смещению РНК-полимеразы в ходе транскрипции in vivo и способствует повышению эффективности преодоления белковых препятствий на матрице ДНК.

2. Предложена модель контроля транскрипции транслирующими рибосомами.

3. Получены экспериментальные данные in vivo, показывающие, что остановленный элонгационный комплекс РНК-полимеразы служит мишенью для фактора Mfd.

4. Установлено, что фактор UvrD смещает элонгационный комплекс РНК-полимеразы против хода транскрипции in vivo,

5. На основании экспериментальных данных построена модель координации транскрипции с репарацией ДНК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Proshkin S., Rahmouni A.R., Mironov A., Nudler Е. (2010) Cooperation between translating ribosomes and RNA polymerase in transcription elongation. Science. 328, 504-508.

2. Прошкин C.A., Миронов A.C. (2011) Регуляция элонгации транскрипции у бактерий. Молекулярная биология. 45, 395-415.

3. Epshtein V., Kamarthapu V., McGary К., Svetlov V., Ueberheide В., Proshkin S., Mironov A., and Nudler E. (2014) UvrD facilitates DNA repair by pulling RNA polymerase backwards. Nature. 505, 372-377.

4. Proshkin S. Mironov A. (2013) Effects of RapA, the bacterial SWI2/SNF2 family factor, on transcription in vivo. FEBSJ., 280 (si), p. 40 (Special Issue: 38th FEBS Congress, Saint Petersburg, Russia, July 6-11,2013).

5. Прошкин С.A. (2013) Неравномерное течение транскрипции. XXV Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», посвященная 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН. Материалы конференции. Москва, 11-15 февраля 2013 г., с. 27.

Заказ N° 06-Р/04/2014 Подписано в печать 02.04.14 Тираж 75 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таНигф>@ф.ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прошкин, Сергей Александрович, Москва

Федеральное государственное унитарное предприятие

"Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных

микроорганизмов"

04201456225

На правах рукописи

Прошкин Сергей Александрович

МЕХАНИЗМЫ КООРДИНАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ С ТРАНСЛЯЦИЕЙ И РЕПАРАЦИЕЙ ДНК У ESCHERICHIA COLI

03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Миронов A.C.

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение..............................................................................................................3

1. Регуляция элонгации транскрипции у бактерий (обзор литературы)................................6

1.1. Структура и функции элонгационного комплекса РНК-полимеразы...........................6

1.1.1. Функциональные участки РНК-полимеразы.....................................................6

1.1.2. Каталитические активности.......................................................................10

1.1.3. Цикл присоединения нуклеотидов...............................................................12

1.1.4. Транслокация..........................................................................................13

1.2. Регуляция элонгации транскрипции.................................................................15

1.2.1. Неравномерность элонгации: паузы, терминация и антитерминация транскрипции.........................................................................................15

1.2.2. Регуляторные белки.................................................................................25

2. Материалы и методы.........................................................................................36

2.1. Материалы..............................................................................................36

2.2. Методы...................................................................................................42

3. Результаты......................................................................................................55

3.1. Координация транскрипции и трансляции..........................................................55

3.1.1. Скорость транскрипции и трансляции in vivo в различных условиях роста клеток...55

3.1.2. Структурные изменения элонгационного комплекса РНК-полимеразы под влиянием рибосомы.................................................................................60

3.1.3. Влияние рибосомы на прохождение РНК-полимеразой участков ДНК, связанных с белками.................................................................................................66

3.2. Координация транскрипции и репарации ДНК....................................................67

3.2.1. Воздействие фактора Mfd на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo....61

3.2.2. Роль фактора UvrD в координации транскрипции и репарации ДНК....................72

3.2.3. Участие транскрипционного фактора Ñus А в координации транскрипции с репарацией ДНК......................................................................................79

. 4. Обсуждение результатов.....................................................................................80

4.1. Модель координации транскрипции с трансляцией...........................................80

4.2. Модель координации транскрипции с репарацией ДНК.....................................83

5. Выводы...........................................................................................................86

Список сокращений..............................................................................................87

Список литературы...............................................................................................88

ВВЕДЕНИЕ

Транскрипция, осуществляемая РНК-полимеразой, - ключевой этап экспрессии генов и клеточной регуляции. Элонгационный комплекс, включающий РНК-полимеразу, матрицу ДНК и синтезируемую РНК, - центральный интермедиат в транскрипционном цикле, который служит конечной мишенью для различных регуляторных белковых факторов и сигналов, закодированных в ДНК и/или РНК. В течение последних нескольких лет было получено много структурных и биохимических данных, которые проливают свет на молекулярные детали функционирования бактериальной РНК-полимеразы [1-4]. Взаимодействие элонгационного комплекса РНК-полимеразы с компонентами других клеточных процессов (трансляции, репликации или репарации ДНК) позволяет координировать транскрипцию с последующими этапами генной экспрессии, лежит в основе механизма поддержания стабильности генома и сопряжения транскрипции с репарацией ДНК [5]. Изучение механизмов, определяющих взаимосвязь этих важнейших молекулярных машин,- актуальная фундаментальная проблема, на решение которой было направлено диссертационное исследование.

Транскрипция и трансляция у бактерий сопряжены в пространстве и во времени. Инициация трансляции большинства бактериальных мРНК начинается вскоре после экспонирования рибосом-связывающего участка (11В в) РНК на выходе из РНК-связывающего канала РНК-полимеразы. Хотя о связи транскрипции и трансляции в бактериях известно уже несколько десятилетий, механизм, лежащий в основе координации этих процессов, был описан лишь для специфических случаев полярного эффекта и аттенюации транскрипции [6]. Остановка трансляции мРНК одного из генов (например, из-за нонсенс-мутации) нарушает экспрессию расположенных за ним генов, входящих в состав той же транскрипционной единицы (полярный эффект). Образующийся в этом случае разрыв между транслирующими рибосомами и РНК-полимеразой дает возможность фактору Шю связать РНК и терминировать транскрипцию [7]. Рибосомы также ответственны за преждевременную терминацию транскрипции в аттенюаторах ряда метаболических оперонов, влияя на образование Шю-независимых терминационных шпилек в РНК [8]. В каждом из этих феноменов эффект рибосомы на РНК-полимеразу опосредован или фактором Шю, или специфической вторичной структурой РНК. В то же время оставался неясен механизм синхронизации скоростей транскрипции и трансляции, которые зависят от скорости роста бактерий в различных условиях [9]. В данной работе мы обнаружили, что транслирующая рибосома напрямую ассистирует РНК-полимеразе в ходе элонгации транскрипции.

Клеточные РНК-полимеразы очень чувствительны к отклонениям в структуре матричной цепи ДНК, и в случае повреждения ДНК транскрипция на этом месте временно или постоянно блокируется [10-11]. Таким образом, РНК-полимераза может служить сенсором, осуществляющим контроль качества ДНК во время транскрипции. Скорость репарации нуклеотидов активно транскрибируемых генов обычно выше, чем нетранскрибируемых участков генома, причем матричная цепь ДНК исправляется быстрее нематричной [12]. Это явление получило название репарации, сопряженной с транскрипцией (transcription-coupled repair, TCR), и описано как путь глобальной эксцизионной репарации нуклеотидов у бактерий и у эукариот [13-14]. В ходе транскрипции РНК-полимераза останавливается на поврежденных участках ДНК. Для исправления повреждения ДНК к соответствующему участку необходим доступ белков системы репарации, поэтому остановленная РНК-полимераза должна быть удалена с матрицы (терминация транскрипции) или отодвинута в сторону от повреждения. Известная на сегодняшний день модель сопряженной с транскрипцией репарации ДНК у бактерий основана на использовании фактора Mfd, действующего на остановленные элонгационные комплексы РНК-полимераз и терминирующего транскрипцию. Мы обнаружили, что хеликаза UvrD может быть ключевым компонентом альтернативного пути сопряжения транскрипции с репарацией ДНК.

Целью настоящей работы являлось выяснение механизмов взаимосвязи транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia coli. В ходе работы решались следующие задачи: определение скорости транскрипции и трансляции в зависимости от генотипа и условий роста клеток; установление влияния транслирующей рибосомы in vivo на структурные изменения элонгационного комплекса РНК-полимеразы и эффективность преодоления им белковых препятствий на ДНК-матрице; определение эффектов белков Mfd и UvrD на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo; изучение с использованием генетических подходов влияния различных элонгационных факторов на сопряжение транскрипции с репарацией ДНК.

В результате данного исследования открыты новые механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у бактерий. В частности, впервые показано, что лидирующая рибосома препятствует спонтанному возвратному смещению РНК-полимеразы в ходе транскрипции in vivo и облегчает прохождение РНК-полимеразой участков ДНК, связанных с белками. Функциональное взаимодействие между двумя молекулярными машинами у бактерий позволяет подстраивать транскрипцию к трансляционным потребностям на разных генах в разных условиях роста клетки [15].

Кроме того, впервые обнаружено, что в основе координации транскрипции с репарацией ДНК, лежит иугО-зависимое возвратное смещение элонгационного комплекса РНК-полимеразы, которое необходимо для экспонирования поврежденной ДНК белкам систем репарации [16]. Наличие гомологов иугЭ у эукариот, может свидетельствовать о существовании схожего механизма и у высших организмов.

1. РЕГУЛЯЦИЯ ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У БАКТЕРИИ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Структура и функции элонгационного комплекса РНК-полимеразы 1.1.1. Функциональные участки РНК-полимеразы

Используя нуклеозидтрифосфаты (ТМТР) в качестве субстрата, РНК-полимераза синтезирует РНК по матрице ДНК. Минимальный фермент (кор) РНК-полимеразы, осуществляющий элонгацию транскрипции, у бактерий состоит из четырех субъединиц (Р', р, 2а и со) массой около 0.4 МДа. В ходе обширных биохимических и генетических исследований локализован активный центр РНК-полимеразы [17-19], а также участки связывания нуклеиновых кислот, необходимых для стабильности элонгационного комплекса [20-24]. Выяснилось, что три остатка аспарагиновой кислоты в консервативном у всех многосубъединичных РНК-полимераз мотиве ИА1)Р1Ю1) самой большой субъединицы (Р') хелатируют каталитический ион Mg2+. Субъединицы Р' и р формируют три сайта связывания: 1) сайт связывания дуплекса ДНК из -10 п.о. перед активным центром, 2) сайт связывания гибридного участка РНК-ДНК длиной 8-9 п.о., образующегося в "транскрипционном пузырьке" из 12-15 п.о. расплавленной ДНК, и 3) сайт связывания одноцепочечного участка РНК, удаленного на ~8—14 нуклеотидов от З'-конца РНК [25] (рис. 1).

Транскрипционный пузырек 12-15 п.о.

Гибридный участок Дуплекс ДНК РНК-ДНК 8-9 п.о. ~10п.о.

Рисунок 1. Модель элонгационного комплекса РНК-полимеразы. Схематично показано расположение нуклеиновых кислот в составе комплекса, черный кружок символизирует активный центр фермента с каталитическим ионом магния.

Установление пространственной структуры кора РНК-полимеразы Thermus aquaticus [26] позволило предложить модель элонгационного комплекса, в котором нуклеиновые кислоты расположены в соответствии с данными, полученных с помощью фотоаффинных сшивок белка с ДНК и РНК [27]. Затем определили пространственную структуру эукариотической РНК-полимеразы II из Saccharomyces cerevisiae и обнаружили ее поразительное структурное сходство с бактериальным ферментом как в общем плане строения, так и в относительном расположении функциональных элементов [28-29]. Позже удалось установить пространственные структуры реконструированных элонгационных комплексов РНК-полимеразы Thermus thermophilus и дрожжевой РНК-полимеразы II [30-34]. В них нуклеиновые кислоты представлены короткими цепочками ДНК и РНК, полученными химическим синтезом. В этих комплексах РНК частично комплементарна матрице ДНК в пределах неспаренной нуклеотидной последовательности ДНК (искусственного "транскрипционного пузырька"). Информация о молекулярных деталях пространственной организации элонгационного комплекса позволила выделить вероятные структурные элементы РНК-полимеразы, ответственные за стабильность, процессивность и отклик на регуляторные сигналы. Важную особенность РНК-полимеразы представляют подвижные домены, необходимые для катализа и перемещения фермента по матрице ДНК. При построении структурной модели РНК-полимеразы ее домены, а также функционально значимые полипептидные петли получили специальные наименования, основанные с их расположением или предполагаемой функцией (рис. 2).

Выяснилось, что в элонгационном комплексе передний (по ходу движения РНК-полимеразы) дуплекс ДНК располагается в основном канале между субъединицами р' и р. Прямые контакты РНК-полимеразы с участком ДНК из ~10 п.о. образуют функциональный сайт связывания ДНК. Подвижный домен Р', названный "зажимом" (clamp), удерживает ДНК в канале [27, 30, 32].

Вероятно, непосредственно перед активным центром, расположенном в конце основного канала, происходит плавление ДНК (позиция +2, считая от нуклеотидсвязывающего участка в положении +1) [30, 35]. Полипептидная петля субъединицы р, "петля вилки-2" (fork 1оор-2, аминокислотные остатки 413-451 в РНК-полимеразе Т. thermophilus) стерически блокирует дальнейшее поступление спирали ДНК в активный центр, играя, по-видимому, главную роль в расплетании дуплекса ДНК и поддержании переднего края транскрипционного пузырька. В этом месте ДНК изгибается под углом -90°, и далее формируется гибридный участок РНК-ДНК длиной 8-9 п.о. [21, 30, 32-33]. Гибрид РНК-ДНК полностью укрыт в канале, стенки

которого образованы субъединицами Р' и р. Доступ к активному центру через основной канал блокирован нуклеиновыми кислотами. Однако под активным центром располагается вторичный канал (secondary channel), который очевидно служит для поступления нуклеотидов к каталитическому участку и связыванию З'-концевого одноцепочечного участка РНК при возвратном смещении фермента (см. ниже). Вторичный канал имеет вид воронки, постепенно сужаясь в направлении активного центра (рис. 2).

\'Крышка" 5'-конец РНК

Домен "зажим"

Вторичный канал

в основном канале

"Петля вилки-1

3'-конец РНК "Петля вилки-

Спираль-спиральный участок домена "зажим"

5'-конец РНК

Дуплекс РНК-

Спираль-спиральный участок у вторичного канала

"Триггерная (TL)

-мостик"

Рисунок 2. Структура элонгационного комплекса РНК-полимеразы Thermus thermophilics. Выделены функциональные мобильные элементы белковой структуры, которые могут играть ключевую роль в цикле присоединения нуклеотидов, поддержании транскрипционного пузырька и во взаимодействии с РНК и дуплексом РНК-ДНК. Расположенные в активном центре фермента ионы магния показаны сферами. Также отмечены спираль-спиральные домены, взаимодействующие с элонгационными факторами (см. текст далее). Справа представлено сечение атомной модели элонгационного комплекса вдоль оси основного канала. Отмечено положение основного и вторичного каналов, а также дуплексов ДНК и РНК-ДНК. Рисунки подготовлены с помощью программ Accelris DS-Visualizer и RasMol, с использованием координат атомов элонгационного комплекса (номер депонирования 205J) из Банка белковых структур (Protein Data Bank) (см. также [30-31]).

После синтеза 9 н. цепь РНК отделяется от ДНК. Петля ß'-субъединицы, названная "крышкой" (lid, аминокислотные остатки 525-539), стерически препятствует образованию более протяженного гибрида РНК-ДНК, облегчая вытеснение РНК [33, 36-39]. Восстановление дуплекса ДНК на заднем крае транскрипционного пузырька также вносит вклад в отделение РНК [36, 39]. В стабилизацию гибридного участка вовлечены, вероятно, еще петля "руль" (rudder, аминокислотные остатки 582-602) ß'-субъединицы [40] и "петля вилки-1" (fork 1оор-1, аминокислотные остатки 387-395) ß-субъединицы. Три полипептидные петли "крышка", "руль" и "петля вилки-1" образуют сеть межмолекулярных взаимодействий как между собой, так и с нуклеиновыми кислотами, формируя задний край транскрипционного пузырька [30]. Структурные элементы РНК-полимеразы у обоих концов гибридного участка РНК-ДНК обеспечивают поддержание постоянной его длины в ходе элонгации транскрипции.

Петля ß' "крышка" (lid) и участок ß "седловина" (saddle) формируют узкую пору, через которую проходит одноцепочечная РНК после отделения от гибрида РНК-ДНК [30, 32-33]. Далее растущая цепь РНК попадает в более широкий канал между доменами ß' "застежка" (zipper, аминокислотные остатки 26-47) и "цинковый палец" (аминокислотные остатки 51-83) с одной стороны и доменом ß "заслонка" (flap, аминокислотные остатки 703-830) с другой (рис. 2). Эти элементы РНК-полимеразы, по-видимому, вовлечены в узнавание сигналов терминации и антитерминации, а также пауз, зависящих от шпильки в РНК [41-43].

Предполагается, что все три участка связывания нуклеиновых кислот аллостерически взаимодействуют с активным центром фермента, модулируя каталитические свойства РНК-полимеразы. Очевидно, что эти функциональные участки наряду с вторичным каналом могут служить мишенями для регуляторных факторов элонгации/терминации.

Из-за проблем с кристаллизацией РНК-полимеразы Е. coli пространственные структуры высокого разрешения для этого фермента недоступны. Применение крио-электронной микроскопии позволило провести структурный анализ РНК-полимеразы Е. coli лишь с разрешением 15Á [44]. Поскольку субъединицы РНК-полимераз высоко консервативны в эволюции, то, вероятно, большая часть третичной структуры РНК-полимеразы Е. coli очень схожа, если не идентична, с известной структурой РНК-полимераз из термофильных бактерий [45]. Однако большие субъединицы ß' и ß Е. coli и Thermus содержат протяженные включения аминокислотных последовательностей (>40 а.о.), не являющиеся общими между этими видами и отсутствующие в других видах бактерий. Многие из этих доменов могут бы�

Информация о работе

Прошкин, Сергей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.03

Диссертация

Механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы