Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1"

На правах рукописи

ЛЯБИН ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ мРНК УВ-1

03 00 03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□з1В8зее

Пущино - 2008

003168366

Работа выполнена в Институте бежа РАН

Научный руководитель академик РАН,

доктор биологических наук, профессор Овчинников Лев Павлович

Официальные оппоненты

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Липкин Валерий Михайлович

кандидат биологических наук Воронина Анна Сергеевна

Ведущая организация

Институт физико-химической биологии им АН Белозерского МГУ им МВ Ломоносова

Защита состоится 2008 г в N часов на заседании

диссертационного совета Д002 038 01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, г Пущино, Московская область, ул Институтская, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН Автореферат разослан " & " О Ч 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ТИ Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Внутриклеточный мультифункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) входит в семейство белков с доменом холодового шока Этот ДНК- и РНК-связывающий белок участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия (Скабкин и др, 2004) Нокаут гена YB-1 у мышей приводит к серьезным нарушениям эмбрионального развития и к ранней (пренатальной) гибели животных (Lu et al, 2005, Uchiumi et al, 2006) YB-1 участвует в адаптации клеток к росту при субоптимальных температурах (Matsumoto et al, 2005), увеличивает их устойчивость к ионизирующей радиации и ксенобиотикам (Ohga et al, 1996) Содержание этого белка существенно выше в клетках ряда опухолей, и в некоторых случаях YB-1 рассматривается как один из наиболее ярких маркеров рака (Matsumoto et al, 2006) Увеличение концентрации YB-1 в клетках за счет дополнительного синтеза с плазмиды может вызывать нестабильность набора хромосом, частичную анеуплоидию и раковую трансформацию (Bergmann et al, 2005) Однако в других случаях повышение содержания YB-1 может, наоборот, предотвращать онкогенную трансформацию клеток, например по инозитол-З-фосфат/АкЬкиназному сигнальному пути (Bader et al, 2003) В большинстве клеток YB-1 находится в цитоплазме, а увеличение доли клеток с ядерной локализацией этого белка рассматривается в качестве одного из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости раковых клеток (Bargou et al, 1997, Kuwano et al, 2004)

Участие YB-1 в широком спектре внутриклеточных процессов объясняется, прежде всего, его почти уникальной способностью взаимодействовать как с ДНК, так и с РНК, а также со многими клеточными белками (Kohno et al, 2003) Связываясь с определенными нуклеотидными последовательностями (Y-бокс последовательностями) в промоторах ряда важнейших генов, YB-1 позитивно или негативно влияет на их транскрипцию (Kohno et al, 2003) Таким образом YB-1 регулирует транскрипцию генов факторов роста и генов, участвующих в делении клеток, апоптозе, иммунном ответе, в развитии множественной лекарственной устойчивости, в стрессовых ответах, в регуляции опухолевого роста, а также транскрипцию ряда вирусных генов Кроме того, YB-1 обладает повышенным сродством к участкам ДНК с нарушенной вторичной структурой и способствует процессу репарации ДНК, а ускоряя обмен комплементарных нуклеотидных последовательностей в

двойных спиралях ДНК, он, как предполагается, может участвовать в рекомбинации ДНК (Skabkin et al, 2001, Ise et al, 1999) Имеются данные о вовлечении YB-1 и в процесс репликации ДНК (Levenson et al, 2000)

YB-1 связывается с молекулами мРНК в момент их синтеза на хромосомах и сопровождает их на протяжении всей их жизни (Sommerville et al, 1993, Soop et al, 2003) При этом YB-1 участвует в альтернативном сплайсинге предшественников мРНК в ядре (Chansky et al, 2001), упаковывает молекулы мРНК в цитоплазме, определяет их функциональную активность, стабильность, а также локализацию транслирующихся мРНК на актиновом скелете (Davydova et al, 1997, Evdokimova et al, 2001, Ruzanov et al, 1999)

Характер действия YB-1 на клеточные процессы зависит от его содержания в клетке и от его распределения между ядром и цитоплазмой YB-1 может переходить в клеточное ядро под действием ксенобиотиков, повреждающих ДНК, и ультрафиолетового облучения (Koike et al, 1997, Stem et al, 2001, Gaudreault et al, 2004), а также в определенный период митотического цикла (Jurchott et al, 2003) или при активации некоторых сигнальных путей клетки (Stenina et al, 2001, Higashi et al, 2003) Было показано, что в некоторых случаях переход YB-1 в клеточное ядро является результатом протеолитического удаления С-концевой части молекулы YB-1 с сигналом цитоплазматического удержания (Stenina et al, 2001, Jurchott et al, 2003) под действием 20S протеасомы (Sorokin et al, 2005) В транспорте YB-1 в клеточное ядро может принимать участие супрессор опухолей р53 (Zhang et al, 2003), а также фактор сплайсинга SRp30c (Raffetseder et al, 2003)

Содержание YB-1 в клетке зависит от скорости его синтеза и распада, а скорость синтеза определяется как эффективностью транскрипции гена YB-I (Makino et al, 1996, Uramoto et al, 2002), так и эффективностью трансляции его мРНК (Skabkina et al, 2003, Fukuda et al, 2004)

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что регуляция синтеза YB-1 осуществляется при участии ~ 80-нуклеотидной регуляторной последовательности, находящейся в 3' нетранслируемой области (3' НТО) мРНК YB-1 С этой последовательностью специфически взаимодействуют два мажорных белка цитоплазматических мРНП - сам YB-1 и поли(А)-связывающий белок (РАВР) Было выяснено, что РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 в отсутствие 3'-концевой поли(А)-последовательности (Skabkina et al, 2003), a YB-1 ее избирательно ингибирует при относительно низких концентрациях, которые оптимальны для трансляции других клеточных мРНК (Скабкина и др , 2004)

Цель и задачи исследования Настоящая работа посвящена изучению молекулярных механизмов, регулирующих трансляцию мРНК YB-1 В связи с

этим были поставлены следующие экспериментальные задачи 1) определить стадию трансляции, на которой YB-1 ингибирует, а РАВР стимулирует синтез YB-1, 2) локализовать сайты специфического связывания YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1,3) установить, конкурируют или не конкурируют белки YB-1 и РАВР за места своего специфического связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1, 5) исследовать влияние 3' концевого полиаденилирования мРНК YB-1 на ее трансляционную активность в бесклеточной системе белкового синтеза

Научная новизна работы Данным исследованием установлено, что YB-1 ингибирует, а РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, на этапе присоединения 43 S преинициаторного комплекса или на более раннем этапе взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции Локализованы сайты специфического связывания белков YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1 Обнаружено, что сайты связывания этих двух белков перекрываются, и что YB-1 и РАВР конкурируют между собой за связывание с регуляторной последовательностью Показано, что избирательное ингибирование трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 и ее стимулирование под действием РАВР обусловлено присутствием специфических сайтов связывания двух белков в регуляторной последовательности мРНК YB-1 В бесклеточной системе белкового синтеза РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB-1 Предложена модель координации синтеза двух мажорных белков цитоплазматических мРНП - YB-1 и РАВР Обнаружено, что полиаденилирование мРНК YB-1 приводит к значительному снижению ее трансляционной активности

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Translational Control" Meeting (Cold Spring Harbor, New York, USA, 2004), "Protein Synthesis and Translation Control" Meeting (EMBL Heidelberg, Germany, 2005), "Translational Control" Meeting (Cold Spring Harbor, New York, USA, 2006), 8th International Engelhardt Conference on RNA-protein interactions (Sergiev Pasad, Russia, 2006), на ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино, 2005 и 2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи

Структура диссертации Диссертация состоит из следующих разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы" Работа содержит 26 рисунков и 3 таблицы

РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 УВ-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК на стадии инициации, подавляя присоединение к мРНК 438 преинициаторного комплекса

В бесклеточной системе трансляции (БСТ) на основе лизата ретикулоцитов кролика мы исследовали влияние белка УВ-1 на трансляцию кодирующей его мРНК и мРНК люциферазы (в качестве контроля) В экспериментах использовали либо кэпированные и неполиаденилированные (К+А'), либо кэпированные и полиаденилированные (К+А+) мРНК Смесь мРНК УВ-1 и люциферазы транслировали в БСТ в присутствии [358]-метионина и увеличивающихся количеств экзогенного УВ-1 Белки разделяли БОБ-гель-электрофорезом, а [358]-меченные продукты трансляции детектировали авторадиографией (Рис 1)

А Б

Рис 1 УВ-1 избирательно ингибирует собственный синтез в бесклеточной системе трансляции мРНК УВ-1 и люциферазы (по 0,15 пмоль каждой) транслировали в БСТ в течение 1 часа при 30°С в присутствии [358]-метиошша и УВ-1 в увеличивающихся количествах (3, 6, 9, 12, 15 пмоль в пробе - дорожки 3-7, соответственно) Продукты трансляции разделяли ЗОБ-гель электрофорезом [З53]-меченные продукты трансляции детектировали авторадиографией А К+А" мРНК, Б К+А+ мРНК

На рисунке видно, что при использованных относительно низких соотношениях УВ-1/мРНК, УВ-1 избирательно подавляет трансляцию как поли(А)", так и поли(А)+мРНК УВ-1 (Рис 1А и 1Б, соответственно), трансляция мРНК люциферазы при использованных соотношениях УВ-1/мРНК не только не ингибировалась, а наоборот, несколько стимулировалась Эти данные, полученные в опытах по трансляции смеси двух мРНК в одной системе белкового синтеза, согласуются с данными, полученными нами ранее в экспериментах по трансляции разных мРНК по отдельности (Скабкина и др, 2004) Полученные

результаты свидетельствуют в пользу существования специфической авторегуляции синтеза УВ-1

Для того чтобы определить, на какой стадии УВ-1 ингибирует трансляцию кодирующей его мРНК, мы проанализировали распределение экзогенной мРНК УВ-1 после 10 мин инкубации в БСТ В этом эксперименте мРНК УВ-1 инкубировали указанное время в присутствии экзогенного УВ-1 при соотношении УВ-1/мРНК, обеспечивающем избирательное ингибирование трансляции мРНК УВ-1 в использованной системе Контролями к этому опыту служили 1) БСТ, инкубированная то же время без экзогенного УВ-1, 2) БСТ, в которую вместо экзогенного УВ-1 был добавлен аналог кэп-структуры мРНК т7СрррО,

В

80S 60S 48S

J_I_I

0 2 4 6

10 12 14

Рис 2 YB-1 ингибнрует присоединение 43S прешшциаторного комплекса к мРНК YB-I

0,15 пмоль К+А" мРНК YB-I транслировали в БСТ в течение 10 мин при 30°С в присутствии 5,6 пмоль YB-1 (Б), 1 мМ юп-апалога (В), 2 цМ эдеина (Г) или без них (А) Пробы центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы 15-30% Распределение мРНК YB-1 во фракциях градиента анализировали Northern-dot гибридизацией с [ Р]-меченным фрагментом кДНК YB-1 Относительное количество радиоактивности во фракциях градиента определяли с помощью системы «Циклон» (Cyclone®StoragePhosphorSystem, Packard Instrument Company Inc , программа OptiQuant, ver 03 00) — профиль поглощения при 254 нм, распределение мРНК YB-I по фракциям градиента

ингибирующий трансляцию на стадии инициации, на этапе присоединения к мРНК фактора инициации eIF4E, и 3) БСТ с эдеином (вместо YB-1), который ингибирует инициацию трансляции на этапе присоединения 60S субчастиц рибосом к малым субчастицам рибосом, ассоциированным с мРНК После инкубации пробы центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы Распределение мРНК YB-1 анализировали гибридизацией с [32Р]-меченной кДНК YB-1 методом Northern-dot

На рисунке 2 видно, что после трансляции мРНК YB-1 в отсутствие экзогенного YB-1 (Рис 2А) значительная часть мРНК YB-1 находилась в зоне седиментации 80S и выше, что отражает связывание транслируемой мРНК с рибосомами В БСТ с m7GpppG (Рис 2В) мРНК YB-1, как и ожидалось, обнаруживалась в форме свободных мРНП, а в БСТ, инкубированной в присутствии эдеина (Рис 2Г), - в более тяжелых частицах, седиментировавших медленнее рибосом, но быстрее свободных мРНП, что соответствует комплексам мРНК с одной или несколькими малыми субчастицами рибосом После инкубации БСТ с экзогенным YB-1, ингибирующим трансляцию (Рис 2Б), мРНК YB-1 обнаруживалась в зоне седиментации свободных мРНП, что свидетельствует в пользу ингибирования трансляции мРНК YB-1 преимущественно на стадии инициации, на этапе присоединения мРНК к 43S преинициаторному комплексу или на более ранних этапах взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции (eIF4F, eIF4A, eIF4B)

3.2. РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, стимулируя присоединение к мРНК 43S преинициаторного комплекса

Чтобы выяснить, какую стадию трансляции мРНК YB-1 стимулирует РАВР, смесь мРНК YB-1 (К+А~) и мРНК люциферазы (К+А") транслировали в БСТ в присутствии [358]-метионина и увеличивающихся количеств фрагментов поли(А), которые специфично связывают РАВР На рисунке ЗА видно, что при добавлении поли(А) трансляция мРНК YB-1 сильно подавлялась, несмотря на то, что мРНК YB-1 не содержала 3'-концевой поли(А)-последовательности Уровень трансляции контрольной поли(А)" мРНК люциферазы при этом не изменялся

Для определения стадии трансляции, на которой происходит подавление синтеза УВ-1 при связывании РАВР фрагментами поли(А), мы проанализировали распределение мРНК УВ-1 после фракционирования БСТ, инкубированной в присутствии поли(А) или без нее, в градиенте концентрации сахарозы (Рис ЗБ)

А поли(А)

_ I ис — YB-

1 2 3 4 5

Рцс. 3 Поли(А) ингибирует присоединение 43S прешшцнаториого комплекса к мРНК YB-1

А К+А" мРНК УВ-1 и К+А" мРНК люциферазы (по 0,15 пмоль каждой) транслировали в БСТ в течение 1 часа при 30°С в присутствии [355]-метионина и увеличивающихся количеств поли(А) (0,075, 0,15, 0,225, 0,3 пмоль - дорожки 2-5, соответственно) [358]-меченные продукты трансляции разделяли SDS-гель электрофорезом и детектировали авторадиографией Б [32Р]-меченную К+А' мРНК YB-1 транслировали в БСТ в течение 10 мин при 30°С в присутствии 0,225 пмоль поли(А) ( ) или без него Пробы

центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы 15-30% Радиоактивность мРНК во фракциях градиента измеряли по Черенкову в счетчике LS-100 (Beckman) и определяли относительное количество радиоактивности мРНК YB-1 во фракциях градиента

В контроле (без поли(А)) значительная доля мРНК УВ-1 находилась в составе транслируемых мРНП в зоне седиментации 80S и выше После инкубации в присутствии фрагментов поли(А) мРНК УВ-1 перераспределялась в зону седиментации свободных мРНП Таким образом, недостаток в системе трансляции доступного РАВР, вызванный добавлением фрагментов поли(А), приводил к избирательному ингибированию инициации трансляции мРНК YB-1 на этапе присоединения к мРНК 43 S преинициаторного комплекса и/или на более ранних этапах взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции Следовательно, РАВР стимулирует трансляцию мРНК УВ-1 на этих этапах инициации

Результаты проведенных экспериментов дают основание утверждать, что два белка, специфически взаимодействующие с регуляторной

Б

b0s 60s 48s

фракции

последовательностью в 3' НТО мРНК УВ-1, оказывают противоположное действие на трансляцию мРНК УВ-1 РАВР ее стимулирует, а УВ-1 ее ингибирует Оба белка оказывают свое действие на стадии инициации, и скорее всего, на одном и том же этапе этого процесса Это может быть этап взаимодействия мРНК с РНК-связывающими факторами инициации трансляции е!Р4Р, е1Р4А, е1Р4В и/или присоединения к ней 438 преинициаторного комплекса

3 3 Локализация сайтов связывания УВ-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК УВ-1 методом футиринтинга

Для картирования сайтов связывания УВ-1 и РАВР в регуляторной последовательности в 3' НТО мРНК УВ-1 был использован метод футпринтинга (Рис 4) Для этого УВ-1 или РАВР предынкубировали с [32Р]-меченным по 5' концу фрагментом 3' НТО мРНК УВ-1 (1127-1205 н), содержащим регуляторную последовательность, и затем обрабатывали РНКазой Т1 (в случае комплексов с РАВР) или диэтилпирокарбонатом (ЭЕРС) и анилином (в случае комплексов с УВ-1) РНКаза Т1 расщепляет РНК после в Диэтилпирокарбонат модифицирует РНК по адениловым остаткам, по которым затем происходит расщепление анилином Продукты расщепления разделяли в секвенирующем 12% ПААГ с 8 М мочевиной и детектировали авторадиографией На рисунке 4 видно, что белок УВ-1 защищал от расщепления два участка РНК ЦССАОСАА и АвиСАиССААСА. содержащих 7-нуклеотидные последовательности (подчеркнуты), отличающиеся друг от друга одним нуклеотидом в пятом положении (в - в первом случае и А - во втором) Найденный мотив иССА°/АСА почти совпадает с установленным ранее специфическим сайтом связывания гомолога УВ-1 из мыши М8У2/МБУ4 - иССАиСА (вю^ни е1 а1, 2001)

РАВР защищал от расщепления РНКазой Т1 А-богатую последовательность (-50 % А) длиной около 50 нуклеотидов в конце исследуемого участка 3' НТО мРНК УВ-1 Длина этого участка достаточна для посадки двух молекул РАВР, так как известно, что РАВР садится на РНК с периодичностью 27 нуклеотидов (Ваег й а1, 1980)

Важно подчеркнуть, что второй участок связывания УВ-1 (иССАОСАА) перекрывается с местом посадки РАВР (Рис 4Б)

А

Б

1127

I

СССиииАбиСАиССААСААОААвААА^^и^дАА^иСС^СДА

ЦААСАААЦСААСАААА&А_Ци СЗСА_<ЗС ААСЗАСС

1205

Рис. 4. Картирование сайтов связывания Л'В-1 и РАВР в рсгуляторной последовательности мРНК УВ-1. А. 5'-[32Р]-меченный фрагмент 3' НТО мРНК УВ-1 (1127-1205 н.) с регуляторной последовательностью (0,4 пмоль, -20000 имп/мин) инкубировали 15 мин при 30°С с УВ-1 (2,8; 11,2; 22,4 пмоль - дорожки 4-6, соответственно) или без него (дорожка 3) или с РАВР (0,14; 0,28; 074 пмоль - дорожки 9-11, соответственно) или без него (дорожка 8). Образцы 3-6 обрабатывали ЭЕРС при 20°С в течение 25 мин и анилином при 60°С. рН 4,5 в течение 20 мин в темноте для химического расщепления РНК по адениловым остаткам. К образцам 8-11 добавляли РНКазу Т1 (0,5 ед.) и инкубировали в течение 10 мин при 30°С. Образцы анализировали в 12% секвенирующем ПААГ с 8 М мочевиной и детектировали авторадиографией. Дорожка 1 - исходный фрагмент 3' НТО мРНК УВ-1 с регуляторной последовательностью без обработок; дорожки 2 и 7 - такой же фрагмент после ограниченного щелочного гидролиза. Б. Нуклеотидная последовательность регуляторного участка 3' НТО мРНК УВ-1. Подчеркнуты участки РНК, защищаемые от расщепления белками УВ-! ( ) или РАВР (— — —).

3.4. Подтверждение специфичности взаимодействия УВ-1 и РАВР с сайтами их связывания в регуляторной последовательности мРНК УВ-1, идентифицированными методом футпринтинга

Для подтверждения специфичности УВ-1 к последовательностям мотива иССАА/0СА мы провели замену нуклеотидов в этом мотиве и исследовали влияние таких замен на относительное сродство фрагментов РНК к УВ-1 (Рис. 5).

-UCCGG CGI I

-UCCAa/gCA-

Н I

-UGGA AGA-

РНК 39 н.

COGAAGA UCCAACA UOCGCCG UCCAGCA

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 5. Проверка специфичности связывания YB-1 с последовательностью

UCCAa/gCA. А. Фрагменты РНК длиной 39 нуклеотидов были синтезированы методом транскрипции in vitro и содержали 7-нуклеотидные мотивы, защищаемые YB-1 от расщепления, либо мотивы с показанными нуклеотидными заменами. Б. [32Р]-меченный фрагмент РНК, содержащий последовательность UCCAACA, инкубировали 15 мин при 30°С с 2,2 пмоль белка YB-1 в присутствии в качестве конкурентов немеченых фрагментов РНК, содержащих ту же последовательность (дорожки 6-8), либо последовательности UCCAGCA (дорожки 12-14), UGGAAGA (дорожки 3-5) и UCCGGCG (дорожки 9-11), либо без конкурентов (дорожка 2). РНК-белковые комплексы подвергали электрофорезу в ПААГ в неденатурирующих условиях и детектировали авторадиографией.

Для этого ['2Р]-меченный 30-нуклеотидный фрагмент РНК, содержащий последовательность UCCAGCA, инкубировали с белком YB-1 в присутствии в качестве конкурентов немеченых фрагментов РНК той же длины с исходным или измененным, как показано на рисунке 6А, специфическим мотивом. Пробы подвергали электрофорезу в неденатурирующем ПААГ и проводили авторадиографию (Рис. 5Б). На рисунке 5Б видно, что в присутствии YB-1 появляется радиоактивный компонент с меньшей подвижностью (Рис. 5Б, дорожка 2), чем подвижность свободной РНК (Рис. 5Б, дорожка 1). Этот компонент соответствует комплексу РНК с YB-1. При добавлении немеченых фрагментов РНК с исходными специфическими последовательностями (UCCAACA или UCCAGCA) в возрастающем количестве происходит

уменьшение, а затем и полное исчезновение радиоактивного комплекса (Рис 5Б, дорожки 6-8 и 12-14) В то же время немеченые фрагменты РНК с мутированным сайтом связывания УВ-1 не способны вытеснять УВ-1 из комплекса с меченым фрагментом РНК (Рис 5, дорожки 3-5 и 9-11)

В пользу специфического характера связывания РАВР с А-богатой частью регуляторной последовательности свидетельствуют эксперименты, проведенные с фрагментом мРНК УВ-1 (1070-1240 н) с полной регуляторной последовательностью 1137-1204 н (^ЛТ), либо того же фрагмента с 31-нуклеотидной делецией (1174-1204 н) части А-богатой регуляторной последовательности, защищаемой РАВР от действия РНКазы Т1 и не перекрывающейся со специфическим сайтом связывания УВ-1 (ДРАВР) (Рис 6)

Фрагмент мРНК УВ-1 ДРАВР

— УВ-1 связывающие сайты (11ССА(А/С)САА)

— — РАВР-связывающий сайт

Рис 6 Фрагменты мРНК УВ-1 из У НТО с полной регуляторной последовательностью и с делецией части РАВР-связывающего сайта, использованные для подтверждения специфического характера взаимодействия РАВР Фрагмент мРНК УВ-1 дикого типа (1070-1240 н) (\УТ) содержал регуляторную последовательность (1136-1204 н) В регуляторной последовательности сплошной линией показаны два сайта, защищаемые УВ-1 от расщепления (1137-1144 н и 1164-1171 н ), а пунктирной - А-богатый сайт, защищаемый РАВР Поскольку второй из УВ-1-защищаемых сайтов перекрывается с областью, защищаемой РАВР, была удалена только часть сайта, защищаемого РАВР (1174-1204 и) Полученный фрагмент мРНК УВ-1 обозначен как ДРАВР

Эти фрагменты мРНК УВ-1 и фрагмент неспецифической контрольной РНК были биотинилированы по 3' концу, иммобилизованы на стрептавидин-сефарозе и использованы для выделения белков лизата ретикулоцитов кролика Белки, связавшиеся с РЖ, разделяли 8В8-гсль-электрофорезом и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Интересующие нас РАВР и УВ-1 детектировали с помощью соответствующих антител

■ УВ-1

Нешецифнческая

АРАВР рнк

РАВР -

12345 6789 10

Рис. 7. Влияние делеции РАВР-защищаемого сайта в регуляторном фрагменте мРНК УВ-1 на взаимодействие с РАВР. А. фрагменты мРНК УВ-1 (1070-1240 н. "ЛП" и АРАВР) и фрагмент неспецифической контрольной РНК были биотинилированы по 3' концу, иммобилизованы на стремтавидин-сефарозе и использованы для выделения белков лизата ретикулоцитов кролика. Белки, связавшиеся с РНК, разделяли ЭОБ-гель-электрофорезом и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Интересующие нас РАВР и УВ-1 детектировали с помощью соответствующих антител. Б. [32Р]-меченный фрагмент мРНК УВ-1 (1070-1240 н.), содержащий регуляторную последовательность исходного типа, инкубировали 10 мин при 30°С с рекомбинантным РАВР в присутствии увеличивающихся количеств (0,4; 0,8 и 1,6 пмоль) немеченых фрагментов 3' НТО мРНК УВ-Г. 1) исходного типа (дорожки 2-4), 2) с делецией части сайта связывания РАВР (дорожки 5-7), и 3) неспецифического фрагмента 3' НТО мРНК УВ-1 (1205-1329 н.) (дорожки 8-10). РНК-белковые комплексы были облучены ультрафиолетом и обработаны смесью РНКаз. Пробы разделяли БОЗ-гель-электрофорезом и авторадиографировали.

Как видно на рисунке 7А, дорожка 2, исходный регуляторный фрагмент связывал как УВ-1, так и РАВР. Связывание специфическое, поскольку эти белки не выделяются на неспецифическом контрольном фрагменте (Рис. 7А, дорожка 1). С фрагментом с делетированной частью РАВР-защищаемого сайта (ДРАВР) эффективное связывание УВ-1 сохранялось, в то время как связывание РАВР резко снижалось (Рис. 7А, дорожка 3). Сходные результаты были получены в опытах по ковалентным сшивкам РНК с рекомбинантным РАВР под действием ультрафиолета. В этом опыте [32Р]-меченный фрагмент мРНК УВ-1 (1070-1240 н.) \\ПГ инкубировали с РАВР в присутствии увеличивающихся количеств немеченых фрагментов: фрагмента \УГ, фрагмента ДРАВР, а также неспецифического фрагмента 3' НТО мРНК УВ-1 (1205-1329 н.). РНК-белковые комплексы были облучены ультрафиолетом и обработаны смесью РНКаз. Затем образцы разделяли ЗОБ-гель-электрофорезом и проводили авторадиографию. На рисунке 7Б видно, что фрагмент неспецифической РНК не способен

вытеснять меченый специфический фрагмент дикого типа (\УТ) (дорожки 8-10) Фрагмент ДРАВР (дорожки 5-7), вытеснял радиоактивно меченный специфический фрагмент из комплекса с поли(А)-связывающим белком значительно хуже, чем исходный регуляторный фрагмент (дорожки 2-4) Таким образом, удаление нуклеотидов с 1174 по 1204 из регуляторной последовательности мРНК УВ-1 привело к значительному снижению ее сродства кРАВР

В совокупности, эксперименты по мутагенезу в регуляторной последовательности подтверждают специфический характер взаимодействия УВ-1 и РАВР с участками РНК УВ-1, установленными методом футпринтинга

3 5. РАВР и УВ-1 способны вытеснять друг друга из комплекса с регуляторной последовательностью мРНК УВ-1

Данные по картированию сайтов связывания УВ-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК УВ-1 позволяют предположить, что эти белки должны конкурировать между собой за связывание с регуляторной последовательностью поскольку их сайты связывания перекрываются В связи с этим мы проверили, способен ли РАВР вытеснять УВ-1 с регуляторной последовательности 3' НТО мРНК УВ-1 [32Р]-меченный фрагмент мРНК УВ-1 (1127-1205 н ), содержащий регуляторную последовательность, предынкубировали с белком УВ-1, затем добавляли РАВР, и после дополнительной инкубации РНК-белковые комплексы разделяли в неденатурирующем ПААГ (Рис 8)

На рисунке 8А видно, что в присутствии УВ-1 образовывался комплекс (Рис 8А, дорожка 2), имевший меньшую подвижность, чем свободная РНК (Рис 8А, дорожка 1) По мере добавления РАВР происходило уменьшение и полное исчезновение этого комплекса (Рис 8А, дорожки 3-7) и образование вместо него менее подвижного комплекса, соответствовавшего одной молекуле РАВР на РНК (Рис 8А, дорожка 8), который постепенно замещался еще менее подвижным комплексом, соответствовавшим двум молекулам РАВР на РНК (Рис 8А, дорожка 9) Таким образом, РАВР может эффективно конкурировать с УВ-1 за место специфического связывания в регуляторной последовательности мРНК УВ-1 и вытеснять его из комплекса с этой последовательностью Если [32Р]-меченный фрагмент с регуляторной последовательностью предварительно проинкубировать с РАВР, а затем добавить в реакционную смесь белок УВ-1 в возрастающих количествах, то можно наблюдать уменьшение количества комплекса РАВР-РНК и замещение его комплексом УВ-1-РНК (Рис 8Б, дорожки 3-7) Это означает, что УВ-1 также способен вытеснять РАВР из комплекса с фрагментом, содержащим регуляторную последовательность

А РАВР Б УВ-1

УВ-1 -++++++ РАВР -++ + + + +--

РНК - РАВР комплекс 2 РНК-РАВР комплекс 1 * РНК- УВ-1 комплекс (Р! РНК - РАВР комплекс 2 РНК - РАВР комплекс 1 ** РНК- УВ-1 комплекс ы «ШёуУ 1-5? У'

несвязанная _^ РНК ш несвязанная_* РНК" У -' II

1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 3 456789

В УВ!

|>АВР <■

РАИР-»! я* а» я» \lll-» »«В

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 8. РАВР и УН-1 способны вытеснять друг друга с регуляторной последовательности мРНК УВ-1. А. [32Р]-меченный фрагмент (1127-1205 н.) 3' НТО мРНК УВ-1 (0,06 пмоль, -10000 имп/мин) инкубировали 10 мин при 30°С с 2,2 пмоль белка УВ-1 (дорожки 2-7) или без него (дорожки 1, 8 и 9). Инкубацию продолжали в присутствии увеличивающихся количеств РАВР (0,12 пмоль, дорожки 3 и 8; 0,42 пмоль, дорожка 4; 1,28 пмоль, дорожка 5; 2,57 пмоль, дорожка 6; 7,7 пмоль, дорожки 7 и 9). РНК-белковые комплексы разделяли в ПААГ в нсденатурирующих условиях и детектировали авторадиографией. Б. [32Р]-меченпый фрагмент (1127-1205 н.) 3' НТО мРНК УВ-1 (0,06 пмоль, -10000 имп/мин) инкубировали 10 мин при 30°С с 0,28 пмоль (дорожки 2-7) или 2,57 пмоль (дорожка 8) РАВР или без него (дорожки 1 и 9). Инкубацию продолжали в присутствии увеличивающихся количеств УВ-1 (3 пмоль, дорожки 3 и 9; 6 пмоль, дорожка 4; 9 пмоль, дорожка 5; 12 пмоль, дорожка 6; 15 пмоль, дорожка 7). РНК-белковые комплексы разделяли в ПААГ в денатурирующих условиях и детектировали авторадиографией. В. [32Р]-меченный фрагмент (1127-1205 н.) 3' НТО мРНК УВ-1 (-100000 имп/мин) предынкубировали 10 мин при 30°С с 0,14 пмоль РАВР. Инкубацию продолжали в присутствии увеличивающихся количеств УВ-1 (0,14 пмоль, дорожки 1 и 3; 0,28 пмоль, дорожка 4; 0,56 пмоль, дорожка 5; 1,12 пмоль, дорожка 6; 2,24 пмоль, дорожка 7). Пробы облучали ультрафиолетом, обработали смесью РНКаз и разделяли БОБ-гель электрофорезом.

Аналогичный результат был получен методом ковалентных сшивок под действием ультрафиолета. Для этого [л2Р]-меченный фрагмент (1127-1205 н.) 3' НТО мРНК УВ-1 предынкубировали с белком РАВР. Инкубацию продолжали

в присутствии увеличивающихся количеств УВ-1 Пробы были облучены ультрафиолетом, обработаны смесью РНКаз и подвергнуты БОЗ-гель-электрофорезу

На рисунке 8В видно, что при увеличении количества УВ-1 в реакционной смеси (дорожки 3-7) РАВР полностью вытеснялся из комплекса с фрагментом мРНК УВ-1, содержащим регуляторную последовательность Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод, что связывание УВ-1 и РАВР с регуляторной последовательностью мРНК УВ-1 является взаимоисключающим, что, в свою очередь, может определять трансляционный статус мРНК УВ-1

3 6. Влияние мутаций в УВ-1- и РАВР-связывающих сайтах мРНК УВ-1 на её трансляцию

Возникает вопрос, как повлияют мутации в обнаруженных специфических сайтах связывания белков УВ-1 и РАВР в мРНК УВ-1 на синтез УВ-1 и/или на его регуляцию под действием УВ-1 и РАВР

Эксперименты в БСТ показали, что мРНК УВ-1 с мутированными сайтами связывания УВ-1 (мРНК УВ-1 ши1УВ-1), где сайты специфического связывания УВ-1 иССАА/0СА были заменены на иХШАииА), транслируется несколько лучше и ингибируется значительно слабее белком УВ-1 (Рис 9, дорожки 4-6) по сравнению с исходной мРНК УВ-1 (Рис 9, дорожки 1-3)

Рис 9. Влияние нуклеотидных замен в \'В-1-связывающем сайте мРНК УВ-1 на ингабированне ее трансляции под действием УВ-1. 0,15 пмоль К+А" мРНК УВ-1 (дорожки 1-3) и 0,15 пмоль К+А" мРНК УВ-1 ти1УВ-1 (дорожки 4-6) транслировали в БСТ в течение 1 часа при 30°С в присутствии [355]-метионина и УВ-1 в увеличивающихся количествах (3 и 6 пмоль - дорожки 2 и 3, 5 и 6, соответственно) [358]-меченные продукты трансляции разделяли БОБ-гель электрофорезом и детектировали авторадиографией

Делеция части РАВР-связывающего сайта из мРНК УВ-1 существенно понижала ее трансляционную активность в бесклеточной системе трансляции (Рис 10) На основании проведенных экспериментов можно утверждать, что

мРНКУВ-1 мРНКУВ-1

\УТ пиита-!

-УВ-1

1 2 3 4 5 6

влияние и УВ-1, и РАВР на трансляцию мРНК УВ-1 действительно обусловлено связыванием этих белков со специфическими сайтами в регуляторной последовательности в 3' НТО мРНК УВ-1

Рис 10 Влияние делеции части сайта связывания РАВР из регуляторной последовательности 3' НТО мРНК УВ-1 на трансляцию мРНК УВ-1 К+А" мРНК УВ-1 и К+А мРНК УВ-1 ДРАВР (по 0,075 пмоль) транслировали в БСТ в течение 1 часа при 30°С в присутствии [358]-метионина [358]-меченные продукты трансляции разделяли БОБ-гель электрофорезом и детектировали авторадиографией

3.7. РАВР восстанавливает трансляцию мРНК УВ-1, подавленную белком УВ-1

Мы предположили, что трансляционная активность мРНК УВ-1 напрямую зависит от того, какой из двух белков, УВ-1 или РАВР, взаимодействует с регуляторной последовательностью в 3' НТО мРНК УВ-1 Поскольку при увеличении соотношения УВ-1/РАВР в пользу УВ-1 происходит подавление трансляции мРНК УВ-1 (Рис 1), можно ожидать, что при последующем увеличении количества РАВР произойдет восстановление трансляционной активности мРНК УВ-1 за счет вытеснения УВ-1 с регуляторной последовательности мРНК УВ-1 Для проверки этого предположения мРНК УВ-1 (К+А") предынкубировали с белком УВ-1, затем добавляли в увеличивающихся количествах РАВР и транслировали мРНК в БСТ В качестве внутреннего контроля использовали мРНК люциферазы (К+А") На рисунке 11 видно, что при увеличении количества белка УВ-1 в системе, трансляция мРНК УВ-1 избирательно подавлялась (Рис 11, дорожки 2-4) Однако по мере возрастания количества РАВР в такой заингибированной системе, синтез белка УВ-1 восстанавливался до исходного уровня (Рис 11, дорожки 5-7) Наблюдаемое восстановление синтеза УВ-1 не является простой стимуляцией белкового синтеза под действием РАВР, поскольку, в отсутствие

экзогенного УВ-1, РАВР (в количествах, использованных в эксперименте) не стимулировал трансляцию ни мРНК УВ-1, ни мРНК люциферазы (Рис 11, дорожки 8-10)

Рис. 11 РАВР восстанавливает трансляцию мРНК УВ-1, подавленную белком УВ-1. К+А" мРНК УВ-1 и К+А" мРНК люциферазы (по 0,075 пмоль каждой) инкубировали 10 мин при 30°С в присутствии 5,6 пмоль (дорожка 3) или 11,2 пмоль (дорожки 4-7) белка УВ-1 или без него (дорожки 2, 8-10), а затем дополнительно инкубировали 10 мин в присутствии РАВР 0,7 пмоль (дорожки 5 и 8), 1,4 пмоль (дорожки 6 и 9), 2,8 пмоль (дорожки 7 и 10) мРНК транслировали в течение 1 часа при 30°С в присутствии [355]-метионина. [358]-меченные продукты трансляции разделяли БОБ-гель электрофорезом и детектировали авторадиографией

Трансляция мРНК УВ-1 с делецией части РАВР-связывающего сайта (мРНК УВ-1 ДРАВР) также сильно подавлялась под действием УВ-1 (Рис 12, дорожки 1-3) Однако по мере возрастания количества экзогенного РАВР в такой заингибированной системе синтез белка УВ-1 не восстанавливался до исходного уровня (Рис 12, дорожки 4-6)

Рис. 12 РАВР не восстанавливает трансляцию мРНК ТЙ-/ЛРЛВР,

подавленную белком УВ-1. К+А" мРНК УВ-1 АРАВР и К+А мРНК люциферазы (по 0,075 пмоль каждой) инкубировали 10 мин при 30°С в присутствии 5,6 пмоль (дорожка 2) или 11,2 пмоль (дорожки 3-6) белка УВ-1 или без него (дорожки 1, 7-9) Пробы дополнительно инкубировали 10 мин в присутствии РАВР 0,7 пмоль (дорожки 4 и 7), 1,4 пмоль (дорожки 5 и 8), 2,8 пмоль (дорожки 6 и 9) мРНК транслировали в течение 1 часа при 30°С в присутствии |355]-мстаонина, [358]-мечснные продукты трансляции разделяли БОБ-гель электрофорезом и детектировали

авторадиографией

3 8. Влияние полиаденилирования на трансляцию мРНК УВ-1

Хорошо известно, что полиаденилирование подавляющего большинства исследованных мРНК стимулирует их трансляцию на стадии инициации В качестве одной из причин такой стимуляции рассматривается циклизация мРНК за счет взаимодействия РАВР, ассоциированного с поли(А) на 3' конце

23456789 10

мРНК, с фактором инициации трансляции е1Р40, связанным с мРНК вблизи 5' концевой кэп-структуры. Предполагается, что такая циклизация облегчает рециклирование рибосом.

Поли(А) богатая область в регуляторной последовательности мРНК УВ-1 функционально может соответствовать поли(А) хвосту на других мРНК. Так же как поли(А) хвост в комплексе с РАВР, она может служить РАВР-зависимым энхансером трансляции, связывая РАВР, который так же, как РАВР, сидящий на поли(А)-хвосте мРНК, потенциально способен циркуляризовать мРНК и облегчать рециклирование рибосом по мРНК. В связи с этим возникает вопрос, как может повлиять на трансляцию мРНК УВ-1 ее полиаденилирование.

А

2000

1600

T о 1200

D

_J Q 800

400

мРНК люциферазы

К~А+

К'А'

К"А"

К+А~

Рис. 13. Влияние полиаденилирования на трансляцию мРНК YB-1. (А) мРНК YB-1 (К~А~, ЮА+, К+А", KW) (0.075 пмоль) транслировали в БСТ. не обработанной микрококковой нуклеазой, в течение 1 часа при 30°С в присутствии [353]-метионина. (Б) По 0,075 пмоль мРНК люциферазы (К"А", К"А+, К+А', К+А+) и глгокуронидазы (GUS) К+А" транслировали в БСТ, обработанной микрококковой нуклеазой, в течение 1 часа при 30°С в присутствии [35S]-метионина. [355]-меченные продукты трансляции разделяли ЗПБ-гель-элеюрофорезом и детектировали авторадиографией. Радиоактивность в полосах белков в гелях (справа) определяли в условных единицах DLU (digital light units) (гистограммы слева) с помощью системы «Циклон» (Cyclone®StoragePhosphorSystem, Packard Instalment Company Inc.).

Напомним, что большинство предыдущих опытов было проведено на поли(А)"мРНК YB-1 В следующем эксперименте мы сравнили трансляционную способность поли (А)" с поли(А)+ мРНК YB-1 В этом опыте четыре возможных варианта мРНК YB-1 (КА", К"А+, К+А", К+А+) (Рис 13А) и такие же варианты мРНК люциферазы (Рис 13Б) транслировали в БСТ в присутствии [35S]-метионина В качестве внутреннего контроля использовали или эндогенную мРНК липоксигеназы (LOX) - в первом случае, или экзогенную мРНК глюкуронидазы (GUS) - во втором

На рисунке 13 видно, что трансляция кэпированной и полиаденилированной мРНК YB-1 значительно снижена по сравнению с трансляцией кэпированной мРНК YB-1 без поли(А)-хвоста В то же время трансляция мРНК люциферазы стимулировалась при добавлении как кэп-структуры, так и поли(А)-хвоста Другими словами, трансляционная активность мРНК YB-1 при полиаденилировании меняется прямо противоположно тому, что происходит в случае большинства других мРНК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы обнаружили, что YB-1 ингибирует, а РАВР стимулирует трансляцию поли(А)" мРНК YB-1 на стадии инициации на этапе присоединения 43 S преинициаторного комплекса к мРНК или на более ранних этапах взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции Мы установили, что наблюдаемое специфическое действие двух белков на трансляцию мРНК YB-1 обусловлено их селективным связыванием с регуляторной последовательностью в 3' НТО этой мРНК Мы локализовали сайты специфического связывания двух белков в регуляторной последовательности и показали, что эти сайты перекрываются В результате два белка конкурируют между собой за регуляторную последовательность Это приводит к тому, что ингибирование трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 преодолевается при повышении концентрации РАВР

С другой стороны, известно, что трансляция мРНК РАВР авторегулируется за счет специфического связывания РАВР с 60-нуклеотидным А-богатым элементом в 5' НТО своей мРНК (de Meló Neto et al, 1995) В совокупности три обнаруженных системы контроля синтеза YB-1 и РАВР позволяют поддерживать концентрацию и соотношение эти двух белков на определенном уровне Ранее установлено, что все клеточные мРНК находятся в комплексе с

белками в составе мРНП При этом трансляционный статус всех или большинства мРНК зависит от содержания и соотношения двух мажорных белков цитоплазматических мРНП - УВ-1 и РАВР Для активно транслирующихся полисомных мРНП характерно одновременное присутствие на мРНК этих двух белков, в то время как свободные нетранслируемые мРНП содержат в два раза больше УВ-1 и лишены РАВР Описанная в этой работе регуляторная система, способна поддерживать концентрацию УВ-1 и соотношение УВ-1 и РАВР на уровне, оптимальном для общего белкового синтеза в клетке (Рис 14)

мРНК РАВР мРНК УВ-1

Рис 14 Схема перехода мРНП частиц из активного (транслируемого) состояния в неактивное (нетранслируемое) Связь с регуляцией трансляции мРНК УВ-1 В цитоплазме подавляющая часть УВ-1 находится в ассоциации с транслируемыми и нетранслируемыми мРНК, формируя мРНП частицы УВ-1 определяет их физико-химические свойства и функциональную активность Переход мРНК из неактивного состояния в активное сопровождается уменьшением количества УВ-1, связанного с мРНК, и появлением на мРНК поли(А)-связывающеш белка РАВР, и наоборот, инактивация мРНК сопряжена с увеличением количества УВ-1 и вытеснением РАВР из состава мРНП Изменение количества связанных с мРНК двух мажорных белков УВ-1 и РАВР является ключевым фактором общей регуляции трансляции мРНК В то же время РАВР и УВ-1 контролируют трансляцию мРНК УВ-1 Связываясь с 3' нетранслируемой областью мРНК УВ-1, РАВР избирательно стимулирует синтез УВ-1 на стадии инициации трансляции, а УВ-1 его избирательно иигибирует на той же стадии Данная регуляторная система, поддерживает концентрацию УВ-1 и его соотношение с РАВР в клетке на уровне, обеспечивающем оптимальный белковый синтез

Стимулирующий эффект РАВР на трансляцию поли(А)" мРНК УВ-1 при его связывании с А-богатым участком в регуляторной последовательности мРНК УВ-1 может достигаться в результате вытеснения с регуляторной последовательности белка УВ-1, ингибирующего трансляцию Кроме того,

весьма вероятно, что стимуляция под действием РАВР может дополнительно происходить по тем же механизмам, по которым она происходит при связывании РАВР с поли(А) хвостами на других мРНК, в том числе, в результате циклизации мРНК УВ-1 Механизм избирательного ингибирования трансляции мРНК УВ-1 на этапе инициации под действием УВ-1 предстоит выяснить

В этой работе мы также показали, что полиаденилирование мРНК УВ-1 оказывает ингибирующее действие на ее трансляцию Выяснение механизма этого ингибирования требует дальнейших экспериментов Простейшее предположение могло бы сводиться к тому, что полиаденилирование мРНК УВ-1 приводит к перемещению РАВР с регуляторной последовательности на поли(А) хвост, к которому РАВР имеет большее сродство Такое перемещение могло бы сохранить циклизацию мРНК, но одновременно вызвать ингибирование ее трансляции за счет связывания УВ-1 с регуляторной последовательностью, освободившейся от РАВР

Биологическое значение аномального поведения мРНК УВ-1 при полиаденилировании мРНК (ингибирование ее трансляции) могло бы состоять в поддержании концентрации УВ-1 на достаточно низком уровне, требующемся для активной трансляции других клеточных мРНК Наоборот, активация трансляции мРНК УВ-1 при тотальном деаденилировании мРНК требуется для доупаковки всех мРНК белком УВ-1 при их освобождении из полисом и переходе в маскированное состояние

выводы

1 Установлено, что УВ-1 избирательно ингибирует, а РАВР стимулирует трансляцию мРНК УВ-1 на стадии инициации, на этапе присоединения к мРНК 43Б преинициаторного комплекса или на более раннем этапе взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции

2 Методом футпринтинга локализованы сайты специфического связывания белков УВ-1 и РАВР в регуляторной последовательности в 3' НТО мРНК УВ-1 Обнаружено, что сайты специфического связывания этих двух белков перекрываются, и что УВ-1 и РАВР конкурируют между собой за связывание с регуляторной последовательностью

3 Методами точечного и делеционного мутагенеза показано, что специфическое ингибирование трансляции мРНК УВ-1 под действием УВ-1 и ее стимулирование под действием РАВР обусловлены присутствием специфических сайтов связывания этих двух белков в регуляторной последовательности мРНК УВ-1

4 Показано, что в бесклеточной системе белкового синтеза РАВР восстанавливает трансляцию мРНК УВ-1, подавленную белком УВ-1 Предложена модель координации синтеза двух мажорных белков цитоплазматических мРНП - УВ-1 и РАВР

5 Обнаружено, что полиаденилирование мРНК УВ-1 оказывает ингибирующее действие на ее трансляцию, в то время как трансляция большинства других мРНК, наоборот, активируется при полиаденилировании

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах•

1 Скабкин М А , Лябин Д Н . Овчинников Л П (2006) Неспецифическое и специфическое взаимодействие Y-бокс-связывающего белка 1 (YB-1) с мРНК и посттранскрипционная регуляция белкового синтеза в животных клетках Молек биол , 40, 4 620-633

2 Skabkina О V , Lyabin D N , Skabkin М А, and Ovchinmkov L Р (2005) YB-1 autoregulates translation of its own mRNA at or prior to the step of 40S nbosomal subumt joining Mol Cell Biol, 25(8) 3317-23

3 Скабкина О В , Скабкин М А , Лябин Д Н, Овчинников Л П (2004) Мажорный белок цитоплазматических мРНП p50/YB-l регулирует свой синтез Докл АН, 395, 4 548-550

4 Skabkina О V, Skabkin М А, Popova N V, Lyabin D N and Ovchinmkov L (2003) Poly(A) Binding Protein Positively Affects YB-1 mRNA Translation through Specific Interaction with YB-1 mRNA J Biol Chem , 278 18191-8

5 Lyabin D N, Eliseyeva IA , Skabkina О V and Ovchinmkov L P (2007) A mechanism of negative regulation of YB-1 mRNA translation by poly(A) tail "Protein Synthesis and Translation Control" meeting, p 186, EMBL Heidelberg, Germany

6 Lyabin DN, Eliseyeva IA , Skabkina О V and Ovchinmkov L P The negative effect of poly(A) tail on YB-1 mRNA translation In "Translational Control" abstract book (2006), p 199, Cold Spring Harbor, New York

7 Lyabin D N, Skabkina О V, Eliseeva IA and Ovchinmkov L P (2006) Specific regulation of YB-1 mRNA translation by 3'UTR and by the poly(A) tail "RNA-protein interactions" - The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, p 35, Buran Conference Center, Moscow Region, Russian Fed

8 Lyabin D N, Skabkina О V , Skabkin M A and Lev P Ovchinmkov YB-1 and PABP regulate YB-1 mRNA translation by competing for binding to a regulatory sequence in 3' UTR In "Protein Synthesis and Translation Control" abstract book (2005), p 185, EMBL Heidelberg, Germany

9 Lyabin D N , Skabkina О V , Skabkin M A and Ovchinmkov L P YB-1 autoregulates translation of its own mRNA In "Translational Control" abstract book (2004), p 330, Cold Spring Harbor, New York

Подписано в печать 03 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 237 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лябин, Дмитрий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Мультифункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1).

1. История открытия и номенклатура семейства Y-бокс-связывающих белков.

2. Свойства и структурно-функциональная организация Y-бокс-связывающих белков.

2.1. Общие свойства Y-бокс-связывающих белков.

2.2. Свойства Y-бокс-связывающего белка 1 (YB-1).

2.2.1. Взаимодействие YB-1 с белками.

2.2.2. Особенности взаимодействия YB-1 с ДНК и РНК.

3. Функции YB-1 в ядре.

3.1. Участие YB-1 в транскрипции.

3.2. Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК.

3.3. Участие YB-1 в сплайсинге мРНК.

4. Функции YB-1 в цитоплазме.

5. Перераспределение YB-1 между ядром и цитоплазмой.

6. Участие YB-1 в эмбриональном развитии.

7. YB-1 и раковая трансформация клеток.

8. Структура гена YB-1 и регуляция его экспрессии.

И. Роль 3' НТО мРНК в регуляции трансляции.

1. Регуляция с участием белков, взаимодействующих с 3' НТО.

2. Регуляция трансляции микрорегуляторными РНК, специфически связывающимися с 3' НТО.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Использованные в работе плазмиды. Получение конструкций, содержащих ген YB-1 с мутациями в регуляторной последовательности.

2. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК.

3. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli.

4. Обработка плазмиды рестриктазой.

5. Лигирование Т4-ДНК-лигазой.

6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

8. Выделение рекомбинаитного РАВР.

9. Выделение рексшбинантного YB-1.

10. Бесклеточная система трансляции (БСТ) из ретикулоцитов кролика.

11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

12. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы.

13. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле в присутствии мочевины.

14. Метод замедления подвижности РНК-белковых комплексов в геле (Gel-shift assay).

15. РНК-белковые сшивки под действием ультрафиолетового облучения.

16. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы.

17. Получение суммарной РНК из лизата ретикулоцитов кролика.

18. Получение меченого фрагмента кДНК (ДНК-зонда).

19. Детекция мРНК YB-1 при помощи радиоактивного зонда (Northern-dot анализ)

20. Дефосфрилирование фрагмента РНК.

21. Мечение фрагмента РНК по 5' концу.

22. Картирование сайтов связывания белков с фрагментом РНК.

23. Биотинилирование РНК.

24. Выделение белков лизата ретикулоцитов кролика с использованием биотинилированной РНК.

25. Иммунологический анализ белковых препаратов (иммуноблоттинг).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. YB-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК на стадии инициации, подавляя присоединение к мРНК 43 S преинициаторного комплекса.

2. РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, стимулируя присоединение к мРНК 43 S преинициаторного комплекса.

3. Локализация сайтов связывания YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1 методом футпринтинга.

4. Подтверждение специфичности взаимодействия YB-1 и РАВР с сайтами их связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1, идентифицированными методом футпринтинга.

5. РАВР и YB-1 способны вытеснять друг друга из комплекса с регуляторной последовательностью мРНК YB-1.

6. Влияние мутаций в YB-1- и РАВР-связывающих сайтах мРНК YB-1 на её трансляцию.

7. РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB-1.

8. Влияние полиаденилирования на трансляцию мРНК YB-1.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Регуляция трансляции мРНК YB-1 и её место в общей регуляции белкового синтеза.

2. Возможные механизмы влияния YB-1 и РАВР на трансляцию мРНК YB-1.

3. Специфическое взаимодействие YB-1 с РНК.

4. Негативный эффект полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляцию как новый способ регуляции синтеза YB-1.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1"

Мультифункдиональный ядерно-цитоплазматический Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) входит в обширную группу белков, содержащих домен холодового шока. Этот ДНК- и РНК-связывающий белок участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. Нокаут гена YB-1 у мышей приводит к серьезным нарушениям эмбрионального развития и к ранней (пренатальной) гибели животных. YB-1 обладает онкогенной и антионкогенной активностью, повышает устойчивость клеток к ксенобиотикам и ионизирующей радиации и является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости.

Участие YB-1 в широком спектре внутриклеточных процессов объясняется, прежде всего, его почти уникальной способностью взаимодействовать как с ДНК, так и с РНК, а также со многими клеточными белками. В ядре он участвует в регуляции транскрипции многих генов, вовлечен в процессы репликации и репарации ДНК, а также сплайсинга пре-мРНК. В цитоплазме YB-1 упаковывает мРНК в мРНП, стабилизирует мРНК и регулирует их трансляцию.

Характер действия YB-1 на клеточные процессы зависит от его содержания в клетке и от его распределения между ядром и цитоплазмой. YB-1 может переходить в клеточное ядро под действием ксенобиотиков, повреждающих ДНК, и ультрафиолетового облучения, а также в определённый период митотического цикла или при активации некоторых сигнальных путей клетки. Содержание YB-1 в клетке зависит от скорости его синтеза и распада, а скорость синтеза определяется как эффективностью транскрипции гена YB-1, так и эффективностью трансляции его мРНК.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что регуляция синтеза YB-1 осуществляется при участии ~ 80-нуклеотидной регуляторной последовательности, находящейся в 3' нетранслируемой области (3' НТО) мРНК YB-1. С этой последовательностью специфически взаимодействуют два мажорных белка цитоплазматических мРНП - сам YB-1 и поли(А)-связывающий белок (poly(A)-binding protein, РАВР). Было выяснено, что РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 даже в отсутствие З'-концевой поли(А)-последовательности у мРНК (Skabkina et al, 2003), a YB-1 её избирательно ингибирует при относительно низких концентрациях, которые оптимальны для трансляции других клеточных мРНК (Скабкина и др., 2004).

Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению молекулярных механизмов, регулирующих трансляцию мРНК YB-1. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) определить стадию трансляции, на которой YB-1 ингибирует, а РАВР стимулирует синтез YB-1; 2) локализовать сайты специфического связывания YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1; 3) установить, конкурируют или не конкурируют белки YB-1 и РАВР за места своего специфического связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1\ 4) исследовать влияние 3'-концевого полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляционную активность в бесклеточной системе белкового синтеза.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лябин, Дмитрий Николаевич

выводы

1. Установлено, что YB-1 избирательно ингибирует, а РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, на этапе присоединения к мРНК 43 S преинициаторного комплекса или на более раннем этапе взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции.

2. Методом футпринтинга локализованы сайты специфического связывания белков YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности в 3' НТО мРНК YB-1. Обнаружено, что сайты специфического связывания этих двух белков перекрываются, и что YB-1 и РАВР конкурируют между собой за связывание с регуляторной последовательностью.

3. Методами точечного и делеционного мутагенеза показано, что специфическое ингибирование трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 и её стимулирование под действием РАВР обусловлены присутствием специфических сайтов связывания этих двух белков в регуляторной последовательности мРНК YB-1.

4. Показано, что в бесклеточной системе белкового синтеза РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB-1. Предложена модель координации синтеза двух мажорных белков цитоплазматических мРНП - YB-1 и РАВР.

5. Обнаружено, что полиаденилирование мРНК YB-1 оказывает ингибирующее действие на её трансляцию, в то время как трансляция большинства других мРНК, наоборот, активируется при полиаденилировании.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лябин, Дмитрий Николаевич, Пущино

1. Скабкин М.А., Скабкина О.В. и Овчинников Л.П. (2004) Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов. Успехи биол. химии, 44, 3-52.

2. Скабкина О.В., Скабкин М.А., Лябин Д.Н., Овчинников Л.П. (2004). Мажорный белок цитоплазматических мРНП р50/УВ-1 регулирует свой синтез. Докл. АН395, 548-550.

3. Abaza I., Coll О., Patalano S. and Gebauer F. (2006) Drosophila UNR is required for translational repression of male-specific lethal 2 mRNA during regulation of X-chromosome dosage compensation. Genes Dev, 20, 380-389.

4. Ansari S.A., Safak M., Gallia G.L., Sawaya B.E., Amini S. and Khalili K. (1999) Interaction of YB-1 with human immunodeficiency virus type 1 Tat and TAR RNA modulates viral promoter activity. J Gen Virol, 80 ( Pt 10), 2629-2638.

5. Aoki M., Blazek E. and Vogt P.K. (2001) A role of the kinase mTOR in cellular transformation induced by the oncoproteins P3k and Akt. Proc Natl Acad Sci U SA, 98, 136-141.

6. Bader A.G., Felts K.A., Jiang N., Chang H.W. and Vogt P.K. (2003) Y box-binding protein 1 induces resistance to oncogenic transformation by the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 100, 1238412389.

7. Bader A.G. and Vogt P.K. (2005) Inhibition of protein synthesis by Y box-binding protein 1 blocks oncogenic cell transformation. Mol Cell Biol, 25, 20952106.

8. Baer B.W. and Kornberg R.D. (1980) Repeating structure of cytoplasmic poly(A)-ribonucleoprotein. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 1890-1892.

9. Bagga S., Bracht J., Hunter S., Massirer K., Holtz J., Eachus R. and Pasquinelli A.E. (2005) Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs results in target mRNA degradation. Cell, 122, 553-563.

10. Barends S., Bink H.H., van den Worm S.H., Pleij C.W. and Kraal B. (2003) Entrapping ribosomes for viral translation: tRNA mimicry as a molecular Trojan horse. Cell, 112, 123-129.

11. Barnard D.C., Cao Q. and Richter J.D. (2005) Differential phosphorylation controls Maskin association with eukaryotic translation initiation factor 4E and localization on the mitotic apparatus. Mol Cell Biol, 25, 7605-7615.

12. Barnard D.C., Ryan K., Manley J.L. and Richter J.D. (2004) Symplekin and xGLD-2 are required for CPEB-mediated cytoplasmic polyadenylation. Cell, 119, 641-651.

13. Behm-Ansmant I., Rehwinkel J., Doerks Т., Stark A., Bork P. and Izaurralde E. (2006) mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4:NOT deadenylase and DCP1-.DCP2 decapping complexes. Genes Dev, 20, 1885-1898.

14. Blobel G. (1972) Protein tightly bound to globin mRNA. Biochem Biophys Res Commim, 47, 88-95.

15. Bouvet P., Matsumoto K. and Wolffe A.P. (1995) Sequence-specific RNA recognition by the Xenopus Y-box proteins. An essential role for the cold shock domain. J Biol Chem, 270, 28297-28303.

16. Capowski E.E., Esnault S„ Bhattacharya S. and Malter J.S. (2001) Y box-binding factor promotes eosinophil survival by stabilizing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor mRNA. J Immunol, 167, 5970-5976.

17. Castagnetti S. and Ephrussi A. (2003) Orb and a long poly(A) tail are required for efficient oskar translation at the posterior pole of the Drosophila oocyte. Development, 130, 835-843.

18. Chansky II.A., Ни M., Hickstein D.D. and Yang L. (2001) Oncogenic TLS/ERG and EWS/Fli-1 fusion proteins inhibit RNA splicing mediated by YB-1 protein. Cancer Res, 61, 3586-3590.

19. Chen C.Y., Gherzi R., Andersen J.S., Gaietta G., Jurchott K., Royer H.D., Mann M. and Karin M. (2000) Nucleolin and YB-1 are required for JNK-mediated interleukin-2 mRNA stabilization during T-cell activation. Genes Dev, 14, 12361248.

20. Colegrove-Otero L.J., Minshall N. and Standart N. (2005) RNA-binding proteins in early development. Crit Rev Biochem Mol Biol, 40, 21-73.