Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Подавление трансляции матричных РНК с помощью олигонуклеотидов и их производных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Подавление трансляции матричных РНК с помощью олигонуклеотидов и их производных"

РГ6 ов

" ............РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.217.35 + 616.988.25

НОМОКОНОВА Наталья Юрьевна

ПОДАВЛЕНИЕ ТРАНСЛЯЦИИ МАТРИЧНЫХ РНК С ПОМОЩЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск — 1993 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель - чл.-корр. РАН В.В.Власов

Официальные оппоненты: д.б.н. С.Н.Загребельный к.х.н. М.А.Зенкова

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится ¿.г*_ 1993 г. в ^Л часов

на заседании Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан & Л -*• 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат химических наук р О.С.Федорова

Актуальность проблемы. Разработка методов селективного воздействия на определенные нуклеинод^з кислоты с целью регуляции их функций в клетке является ванным направлением исследований для создания новых подходов к решению ряда проблем молекулярной биологии и медицины. В практическом плане наиболее важным приложением таких методов является борьба с инфекционными заболеваниями, например, с вирусными инфекциями. Второй важной задачей, которая могла бы быть решена при наличии эффективных методов воздействия на определенные гены, является контроль ди^фэренцировки и пролиферации эукариотических клеток, в первую очередь, как средство борьбы с опухолевыми заболеваниями.

Успехи последних лет в области конструирования и исследования производных олигонуклеотидов позволяют рассматривать их как новый класс биологически активных веществ, избирательно воздействующих на нуклеиновые кислоты и регулирующих экспрессию определенных генов. В связи с этим актуальной задачей в настоящее время является изучение закономерностей взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с мРНК на стадии трансляции. Использование для этих целей простых модельных систем трансляции позволяет исключить трудоемкую работу по выбору оптимальной последовательности-мишени в структуре определенной мРНК для олигонуклеотидных воздействий на более сложных системах - на уровне клеток и организма в целом.

Цель работы. Целью настоящей работы являлся поиск последовательностей в структуре мРНК вирусов гриппа и клещевого энцефалита, наиболее чувствительных к олигонуклеотидным воздействиям In uitro, а также анализ закономерностей процесса ингибирования трансляции с помощью олигонуклеотидов применительно к этим матрицам. Поскольку в клетках ингибирование трансляции олигонуклеотидами может быть опосредовано активностью РНКазы Н, расщепляющей мРНК в месте образования гетеродуплекса, и зависит от наличия этого фермента, необходимо было исследовать возможность использования реакционноспо-собных производных олигонуклеотидов с целью имитации необратимого повреждения мРНК, вызываемого РНКазой Н.

В задачу исследования входило изучение специфичности действия используемых олигонуклеотидов и их производных на трансляцию определенных мРНК, выбранных в качестве мишеней как в бесклеточной системе так и на культуре клеток.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей

работе проведено исследование влияния олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам мРНК-MI вируса гриппа и мРНК, кодирущих белки вируса клещевого энцефалита на их трансляцию в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика и выявлены. олигонуклеотиды, селективно и наиболее эффективно подавляющие трансляцию соответствующей мРНК. Результаты этого исследования могут быть использованы при конструировании различных производных олигонуклеотидов с целью создания высокоэффективных ингибиторов, подавляющих размножение вирусов в клетках.

Впервые в бесклеточной системе трансляции было показано, что 4-(К-2-хлорэтил-И-метиламино)бензиламидное производное олигонуклеотида, комплементарного мРНК легкой цепи иммуноглобулина G, выделенной из миеломных клеток, является более эффективным ингибитором трансляции этой матрицы по сравнению с олигонуклеотидом, не содержащим реакционноспособной группы. . .

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано ? печатных работ. Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиуме "Структура, биосинтез и функции молеку- ' лярных элементов иммунной системы (Пущино,' 1987), Международном рабочем совещании "Перспективы терапевтического и диагностического применения производных олигонуклеотидов" (Новосибирск, 1988), Международном совещании "Биосинтез белка" (Пущино,.1991) и на Международном совещании по биологическим эффектам антисмысловых олигонуклеотидов (Франция, 1992).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 145 страницах, включающих 28 рисунков, 9 таблиц и список литературы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Подавление трансляции мРНК-MI вируса гриппа с помощью олигонуклеотидов, комплементарных инициирующей области матрицы.

Матричная РНК-М1 вируса гриппа, штамм Weybrldge, кодирующая мембранный белок М1 вириона, является одной из наиболее детально изученных мРНК этого вируса.

В работе использовали комплементарные 5'-концевой области

МРНК-К1 олигонуклеотида N1-N4, S1 и S2 (рис.1).

5 ' И> zo 3Q 40 во 3 '

AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGAGTCTICTAACCGAGGTCGAAACGTAC...

n-

}72~--

ti4

U3

ЕГ

52~

Рис.1. Структура б'-коицввого ™í ~ йасполот-

¿юйаавданхарйчх »то<! об.«яетя {шгаэЕдэощаа. йшщщрущий кодон выделен жирным шрифтом.

Каядый из олигонуклеотидов группы N, добавленный в систему трансляции in vitro по отдельности к суммарной РНК гриппа, приводил к подавлению трансляции мРНК-М1 максимально на 50-60% при концентрации олигонуклеотида 50-100 мкМ. Относительно низкая эффективность этих олигонуклеотидов, комплементарных иницкпрушай области мРНК, очевидно, объясняется тем, что олигонуклеотида такой длины (14-15 оснований), связываясь с юРНК, слабо влияют на пространственную структуру матряде, о значит, я на форасровевие ишяг.'з-торного комплекса на стадии инициации трансляции.

Согласно сканирующей модели иници&щи трансляции на первом этапе инициации происходит связывание 403 субъедкници с 5'-концом 1ЛРНК и факторами инициации и продвижение этого комплекса вдоль матрицы к стартовому кодону. Ишщшруищй комплекс обладает определенной расплетающей активностью к разрушает вторичную структуру 5*-НТО, однако достаточно стабильные протяженные дуплексы в этой области могут препятствовать продвижению сканирующей 40S рибосокы и формированию активной 80S рибосомы на уровне инкцкирущего кодо-на. Мы попытались усилить эффективность действия олигонуклеотидов, увеличив длину гетеродуплекса за счет одновременного введения в систему олигомеров, имеющих примыкающие друг к другу участки связывания в инициирующей области мРНК-М1 (олигонуклеотида N1-N3). Были проведены эксперименты по подавлению биосинтеза бежа Ш двумя и тремя олигонуклеотвдами, комплементарными 5'-концевой области мРНК-М1. Исследования показали, что эффективность ингибирующего действия этих олигонуклеотидов на трансляцию МРНК-М1 зависит как от концентрации олигонуклеотидов так и от длины формирующегося ге-

теродуплекса.

Табл.1. Подавление трансляции in vitro мРНК-М1 вируса гриппа с помощью двух олигонуклеотидов, комплементарных инициирующей области матрицы. Результаты получены сканированием полос радиоавтографов гелей, отражающих наработку белка М1 в ретикулоцитной системе трансляции без добавления олигонуклеотидов (10056), либо в присутствии олигонуклеотидов соответствующей концентрации и отражают среднее значение из 3-х опытов. Средняя ошибка среднего не превышала 10%.

Олигонуклеотиды Концентрация, мкМ

0,63 2 ю 25 50

Уровень синтеза белка Ml, %

без олигонукл. 100 100 100 100 100

N1+N2 90 90 86 43 39

N2+N3 95 96 50 В 0

N1+N3 43

S1+S2 100 96 54 50 50

N2+S2 36 18

S1+N3 21 12

В результате использования различных сочетаний олигонуклеотидов групп N и Б было показано, что полного подавления трансляции мРНК-М1 можно достичь только в случае применения двух олигонуклеотидов Ц2+Ю общей длиной 29 оснований, взаимодействующих с участком мРНК-М1, в центре которого находится кодирующий А1ге-кодон. Сокращение длины гетеродуплекса с любого конца на 3 нуклеотидных пары сказывалось на эффективности действия олигонуклеотидов, а использование укороченных олигонуклеотидов Б1+Б2 резко снижало эффективность ингибирования трансляции (табл.1).

При увеличении длины гетеродуплекса в инициирующей области мРНК-М1 за счет добавления в бесклеточную систему трансляции одновременно трех коротких олигонуклеотидов Я1+Я2+Ю, имеющих смежные сайты связывания на матрице, практически полного подавления биосинтеза белка М1 достигали уже при концентрации каждого олигомера 10 мкМ (рис.2).

Рис.2. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения по Лэммли белков, синтезированных в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Содержание дорожек: 1- мРНК вируса гриппа в пробе - от-. сутствует; 2-7 - продукты трансляции мРНК вируса гриппа в отсутствие (2) и в присутствии олигонуклеоти-дов N1+N2+N3 (3-7) в концентрации 0,63; 2; 10; 25 и 50 мкМ соответственно; 8 - t^S]-меченные белки вируса гриппа.

Необходимо отметить селективный характер подавления трансляции мРНК-Ш, так как используемые олигонуклеотиды, комплементарные мРНК-М1 не влияли на трансляции других вирусных ¡¿РЖ (рнс.Я).

Кодирующая область мЕНК-М1 оказалась менее чувствительной к олигонуклеотндным воздействиям. Низкая эффективность ингибирования трансляции мРНК-М1 олигонуклеотидами, комплементарными ее кодирующей области, очевидно, объясняется структурированностью этой мРНК и незначительным содержанием в системе рибонуклеазы К, инактивиру-ющейся в процессе замораживания-оттаивания ретикулоцитного лизата.

На основании полученных нами результатов можно рекомендовать применение нескольких коротких олигонуклеотидов, имеющих смежные сайты связывания в инициирующей области мРНК-MI и способных селективно и полностью подавлять биосинтез вирусного белка M1 in vttro для конструирования на их основе высокоэффективных противоворусйых препаратов.

2. Исследование влияния на трансляцию In vitro мРНК вируса клещевого энцефалита олигонуклеотидов. комплементарных кодирующей области матрицы.

Инициирующая.область мРНК не всегда доступна для взаимодействия с олигонуклеотидами. Например, вследствие высокой степени структурированности последовательности 5*-конца РНК ВКЭ, воздейст-

2 3 4 5 6 7 3

М1-

вив на эту область РНК олигонуклеотидами, очевидно, было бы затруднено. Поэтому мы пытались найти другие участки РНК ВКЭ, перспективные в качестве мишеней для олигонуклеотидов.

После образования комплекса с мРНК и начала трансляции рибосома приобретает способность расплетать структурированные участки матрицы и легко разрушает комплексы, образованные олигонуклеотидами в кодирующей области мРНК. Поэтому олигонуклеотиды, связывающиеся с последовательностями в кодирующей области мРНК, могут эффективно ингибировать трансляцию только в случае, если в системе имеется РНКаза Н, расщепляющая мРНК в составе гетеродугщексов.

Нами были проведены опыты по исследованиях) факторов, влияющих на эффективность ингибирования трансляции in vitro мРНК, кодирующих фрагменты генома ВКЭ (рис.3) олигонуклеотидами, комплементарными кодирующей области матриц (табл.2).

к.

РНК ВКЭ

С ы Е пв1 2а 2Ъ 3 4а 4Ъ . 5

Б.

мРНК

Е'

971 1981

2BNS3

4186 6458

NS3

4592 6458

NS34A4B'

4592

7009

Рис.3. А. Схема организации генома ВКЭ. Б. Матричные РНК, использовавшиеся в опытах с олигонуклеотидами. Кодирующие области матриц соответствуют участкам генома ВКЭ.

Для выбора доступных для связывания олигонуклеотидов участков в исследуемых мРНК, кодирующих белки ВКЭ, а также для сравнения влияния на их трансляцию олигонуклеотидов, направленных в участки с различной вторичной структурой, вторичная структура матриц была оценена с помощью компьютерного анализа.

Олигонуклеотиды группы А, комплементарные первой трети кодирующей последовательности мРИК-ЖЗ, независимо от вторичной структуры участка их связывания с матрицей, не оказывали заметного влияния на трансляцию мРНК-МЗЗ при концентрации олигонуклеотвда до 50 мкМ. Возможно, слабое влияние этих олигонуклеотидов на трансляцию мРНК-ЫБЗ объясняется т?м, что они направлены на начало кодирующей последовательности и не успевает произойти их связываете с мРНК, а транслирующие рибосомы маскируют комплементарные олигонуклеотидам последовательности в структуре мРНК.

Табл. 2. Структура олигонуклеотидов, использовавшихся е экспериментах по подавлению трансляции мРНК, кодирующих белки вируса клещевого энцефалита.

Олигонуклеотиды (5•-3') Комплементарные участки в структуре MFHK-NS3 и в геноме ВКЭ (в скобках)

А1 CGCCGCCCCTCTGGT 214-228 (4759-4773)

А2 TAGGGCCCTGCGACG 246-260 (4791-4805)

АЗ TTTTCCGCCTCACCCT 554-569 (5099-5114)

А4 TGCCCTTTTGCTGTCC 611 -626 (5156-5171 )

А5 ТСТТСССАТТСАА 769-781 (5314-5326)

Аб TGACCCTCTTCCGATT 772-787 (5317-5332)

В1 TCACACGTCTGGTCCCTG 1388-1405 (5933-5950)

В2 TGTTGTTATGTTGTCAA 1538-1554 (6083-6099)

ВЗ TTTCTTTTOTCTTCAGr 1630-1646 (6175-6191)

В4 TCCGACTTGTCAC 1723-1735 (6268-6280)

В5 CCTTCCCACGTCCAGTT 1735-1751 (6280-6296)

01 AAATGACCCGCCACCTC 1606-1622 (6151-6167)

С2 CTTCAGTGAGGCGG 1623-1636 (6168-6181)

сз AATGCTTTCTTTTCT 1637-1651 (6182-6196)

F1 TTTCTTTTCTCTTCAG 1631-1646 (6176-6191)

F2 ТТТСТТТТСТСТТСА 1632-1646 (6177-6191)

13 тттсттттстстт 1634-1646 (6179-6191 )

F4 стттсттттсгстт 1634-1647 (6179-6192)

Олигонуклеотиды груш В, с и F комплементарные кодирующей области MPHH-NS3, ближе к ее 3'-концу, в целом оказывали более существенное влияние на трансляцию этой мРНК in vi tro. Наиболее эф-

фективными ингибиторами биосинтеза белка оказались олигонуклеотиды

В2, ВЗ и СЗ, комплементарные одноцепочечным (по расчетным данным)

участкам MPHK-NS3 (рис.4).

1390 1 400 1410 1 420 1430 1440

gagctcaoagggaccagacgtgtgaccacggcctctgcggcccaacgccgtgggagagtcggaag <---044 <043 <-------------042

В1******************

1450 1 460 1 470 1480 1 490 1500 1510

acaggagggaagaacagatgaatacatatactctggacagtgtgatgatgatgatagtggacttg

<---------------041 <---040

1520 1530 1540 1550 1560 1570

tgcagtggaaggaagcgcagatacttcttgacaacataacaacactgcgggggcctgtggctacc 04б->047-> 048-> <-048 <

В2*****************

1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640

ttctatggaccagagcaggacaagatgccagaggtggcgggtcatttccgcctcactgaagagaa -047 049-> <-049 <-046

Q1***************** Q3***********

С2**************

1650 1660 1670 1680 1690 170б3****

aagaaaggattttggacatgttctcácccaotgtgagtigagggcgtggctagcatggcacgtcg

****** 050----> 051—>

***********

1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770

cagcaaacgtgtctagtgtgacaagtcggaactggacgtgggaaggtoctgaggagaacaccgtg <—051 <----050 052>

04*************

Q5*****************

Рис.4. Фрагмент последовательности MPHK-NS3. Стрелками указаны комплементарные последовательности, вероятно, образующие двухцепо-чечные участки в структуре MPHK-NS3. Звездочками указаны последовательности, комплементарные олигонуклеотидам групп В и С.

При добавлении каждого из олигонуклеотидов этих груш в систему трансляции в концентрации от 2,5 мкМ до 50 мкМ количество полноразмерного белка гшЗ значительно уменьшалось и происходила наработка коротких белковых продуктов, длина которых коррелирует с остановкой трансляции в месте образования комплекса олигонуклеотида с матрицей (рис.5). Кроме этого, как при добавлении РНКазы Н так и без нее образовывались аналогичные продукты трансляции, по размеру меньше белка пвЗ (рис.5,Б). Все это свидетельствовало об остановке трансляции в месте комплексообразования матрицы и олигонуклеотида и могло быть результатом расщепления мРНК в месте образования дуплексов РНК-ДНК. Действительно, в результате проведенных опытов было показано, что в присутствии используемых олигонуклеотидов,

комплементарных мРНК-МЗЗ. как при добавлении в бесклеточную систему трансляции РНКэзи н так и без добавления, образуются одинаковые по длине фрагменты мРНК-ЖЗ, отсутствующие в пробах, не содержащих антисмысловые олигонуклеотиды (рис.6).

А Б

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3

____ - —тшт -

"*" ^ Е-*

Рис.5. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения белков по Лэммли, синтезированных в бесклеточной ретикулоцитной системе и выделенных иммунопреципитацией. Продукты трансляции мРНК-НБЗ и мРНК-Е': А. 1 - без добавления олигонуклеотидов; 2-7 -в присутствии олигопуклеотидов: С2, С1, СЗ, С1+С2+СЗ, В1 и В2 соответственно. Концентрация олигонуклеотидов - 50 мкМ. Б. 1 - без добавления олигонуклеотидов; 2,3 - в присутствии 2,5 мкМ олигонук-леотида ВЗ; в пробу 3 добавлена РНКаза Н (10 ед/мл).

Рис.6. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения в 4% ПААГ с 1 :30 бис-АА В трис-боратном буфере, рН 8,3 меченной [3^Р1 мИЖ-ЖЗ. Меченную [32Р1 мРНК-ИБЗ выдерживали в трансляционной смеси 1ч при 37°С, затем выделяли из смеси фенольным методом. 1 - без добавления олигонуклеотидов; 2,3 - в присутствии олигонук-леотида ВЗ; 4,5 - в присутствии олигонуклеотида А4. В пробы 3,5 добавляли РНКазу Н (10 ед/мл). Концентрация олигонуклеотидов составляла 2 мкМ.

¿»ч

Олигонуклеотиды В2, ВЗ и СЗ, эффективно подавляющие трансля-

цию MPHK-NS3, были использованы для дальнейших опытов на матрицах, которые соответствуют более длинным фрагментам генома ВКЭ - мРНК-2BNS3 и MPHK-NS34A4B' (рис.3). Для этих матриц возможна вторичная структура, отличающаяся от структуры mfhk-NS3. Компьютерный анализ вторичной структуры всех трех матриц показал наличие общей для них локальной стабильной структуры, а олигонуклеотиды В2, ВЗ и СЗ направлены на одноцепочечвые районы этого участка. Как показано на рис.7 эти олигонуклеотиды в концентрации 2,5 мкМ ингиСируют биосинтез In vitro соответствующего полноразмерного белка и происходит наработка более коротких продуктов трансляции, в то время как олигонукяеотид А1 не оказывал влияния на трансляцию.

нием олигонуклеотидов: А1, В2, ВЗ и СЗ соответственно; 7 - с добавлением олигонуклеотида ВЗ. Концентрация олигонуклеотидов составляла 2,5 мкМ.

Таким образом, в результате проведенных исследований были найдены олигонуклеотиды, эффективно и специфично подавляющие трансляцию In vitro мРНК, кодирующих фрагменты генома вируса клещевого энцефалита.

3. Подавление трансляции иммуноглобулиновой мРНК in vitro с помощью алкилирующего производного олигонуклеотида, комплементарного кодирующей области матрицы.

Некоторые мРНК отличаются нуклеотидной последовательностью только в ее кодирующей области. Так, мРНК иммуноглобулинов отличаются в участке, кодирующем гипервариабельную область белка. Поэтому актуальной задачей является развитие подходов к воздействию олигонуклеотидами на уникальные последовательности в структуре мРНК. Поскольку эффективность ингибирования трансляции с помощью

1 2 3 4 5 6 7

Рис.7. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения белков по Лэммли синтезированных в бесклеточной ретикулоцитной системе и выделенных иммунопре-ципитацией. Продукты трансляции МРНК-2ВЖЗ (1-5) И МРНК-Ы334А4В' (6,7), Дорожки 2-5 - с добавле-

антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных кодирующей области матрицы зависит от вторичной структуры мРНК и тесно связана с наличием в системе РНКазы Н. расщепляющей мРНК в составе гетеродуп-лексов, мы попытались исследовать возможность использования реак-ционноспособных производных олигонуклеотидов, которые, реагируя с нуклеиновой кислотой в месте присоединения олигонуклеотида, нано^ сят ей необратимые повреждения.

Наш было исследовано действие на трансляцию In vitro мРНК легкой цепи иммуноглобулина G реакционноспоссбного производного олигонуклеотида, комплементарного кодирущей области этой матрицы:

.—у ° 4- Ш-2-хлорэтил-Н-метилами-

с. но)бензил-5'-фосфамидное

0~ производное олигонуклеотида

Опыты с олигонуклеотидом, комплементарным мРНК легкой цепи IgG, показали, что при повышении его концентрации в системе до 600 мкМ не наблюдается подавления синтеза легкой цепи. Пятизвен-ный олигонуклеотид не оказывает никакого влияния на синтез обеих белковых цепей даже в концентрации Ю-3 М.

На рис.8 представлены данные одного из опытов по исследованию влияния алкилирувдего производного олигонуклеотида ClRCHgNH-pTGCTCTGGTTT на трансляции мРНК IgG в бесклеточной системе из ре-тику лоцитов кролика. Опыты проводили в двух вариантах - с предин-.кубацией мРНК с реакционноспособным производным олигонуклеотида в течение 1 часа при 37°С и без нее. Оказалось, что при непосредственном введении в систему трансляции реагент в концентрации 10 мкМ не влияет на синтез белка in vitro. Предварительная инкубация мРНК IgG с этим производным олигонуклеотида перед проведением трансляции в концентрации 10 мкМ приводит к эффективному подавлению синтеза иммуноглобулина G и заметно снижает уровень белкового синтеза при концентрации реагента 1 мкМ (рис.8). Этот факт, очевидно, обусловлен тем, что время полупревращения производных 4-Ш-2-хлор-зтил-Я-метиламино)-бензиламина в реакционноспособные частицы составляет 1 час при 37°С - температурные условия трансляции, - а основное количество белка нарабатывается в бесклеточной системе трансляции из ре тику лоцитов кролика в течение первых 20 мин. Алки-лирумцее производное олигонуклеотида ClRCHgNH-pTGCTC в аналогичных

условиях и в такой т концентрации не оказывало ингибирующего действия на трансляцию, очевидно, в силу неспособности образовывать прочный комплекс с мРНК (рис.8).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис.8. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения по Лэммли белков, синтезированных в бесклеточной системе из рети-кулоцитов кролика и выделенных иммунопреципитацией. Содержание дорожек: 1-10 - продукты трансляции мРНК IgG (1), мРНК IgG в присутствии реагента RClpTGCTC в концентрации 10 мкМ (2,9); реагента RClpTGCTCTGGTTT (3-6) в концентрации 10; 1; 0,1 и 0,01 мкМ соответственно; в отсутствие (7) ив присутствии олигонуклеотида pTGCTCTGGTTT (8); в присутствии реагента RClpTGCTCTGGTTT в концентрации 10 mkí.í (10); 11 - проба не содержит мРНК IgG; 12 - белки, синтезированные в системе без нуклеазной обработки (эндогенный синтез). Пробы 1-6 предварительно инкубировали 1 ч. при 37°С.

Интересным оказался тот факт, что наряду с ингибироваяием легкой цепи наблюдалось подавление синтеза и тяжелой цепи иммуноглобулина G. Полученные данные согласуются с описанным ранее явлением взаимозависимости синтеза тяжелых и легких цепей в клетках миеломы МОРС 315 мыши. По-видимому, взаимозависимость синтеза цепей иммуноглобулина G, наблюдающаяся ln vivo, сохраняется и при трансляции суммарной поли (А)-РНК в бесклеточной системе, что свидетельствует о регуляции процесса образования полной молекулы IgG балансом концентраций легких и тяжелых цепей белка. Для исключения вероятности проявления неспецифического эффекта реагента за счет образования несовершенных комплексов с мРНК тяжелой цепи IgG была

просканирована последовательность мРНК, кодирующая тяжелую цепь IgG шеломы МОРС 21. Оказалось, что используемый олигонуклеотид pTGCTCTGGTTT имеет максимально 6 оснований, комплементарных последовательности мРНК тяжелой цепи в участке 458-463 структуры этой матрицы. В условиях реакции трансляции (37°С) образование такого комплекса маловероятно.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что реакционно-способные производные комплементарных олигонуклеотидов являются перспективными ингибиторами трансляции, поскольку они могут подавлять трансляцию мРНК в условиях, когда олигонуклеотиды, не несущие реакционюспосоСных груш, неэффективны.

Таким образом, проведенные в системе in vitro исследования свидетельствуют о наличии как минимум двух механизмов действия олигонуклеотидов на трансляцию мРНК-мишени:

-образование достаточно протяженного гетеродуплекса за счет взаимодействия олигонуклеотидов с мРНК в районе стартового кодона предотвращает образование инициаторного комплекса и инициацию трансляции;

-необратимое повреждение мРНК с помощью олигонуклеотидов опосредовано действием РНКазы Н либо реакционноспособными производными олигонуклеотидов.

4. Подавление размножения вируса клещевого энцефалита в культуре клеток с помощью производных олигонуклеотидов Для исследования влияния производных олигонуклеотидов на размножение ВКЭ в культуре клеток СПЭВ были выбраны производные оли-гонуклеотвда F4, эффективно подавляющего наработку белков ВКЭ в системе in vitro. Олигонуклеотид F4 комплементарен участку 61926179 генома ВКЭ (табл.2).

В опытах использовали производные олигонуклеотидов, способные улучшить их действие на клеточном уровне: холестериновые, алкили-рующие и фосфотиоатные производные. Степень ингибирующего действия олигонуклеотидов и их производных на размножение ВКЭ в клетках оценивали по снижению титра вируса в культуральной жидкости по сравнению с контролем. Было также проведено исследование неспецифического влияния используемых производных олигонуклеотидов на биосинтез клеточных белков. Обнаружено, что 4-(N-2-хлорэтил-Н-метиламино)бензиламидные и фосфотиоатные производные в концент-

рации 1, 10 и 50 месМ не оказывали заметного влияния на биосинтез клеточных белков. Холестериновые производные олигонуклеотидов в концентрации 10 и особенно 50 мкМ значительно подавляли биосинтез клеточных белков неспецифично.

Фосфотиоатные производные как комплементарного РНК ВКЭ, так и контрольного некомплементарного геному ВКЭ олигонуклеотидов в концентрации до 25 мкМ включительно не оказывали заметного влияния на размножение ВКЭ в культуре клеток.

В опытах по подавлению размножения ЕКЭ с помощью реакционно-способного 4-Ш-2-хлорэтил-Н-метиламино)бензиламидного производного олигонуклеотида, комплементарного РНК ВКЭ, было показано, что в его присутствии в концентрации 5 и 25 мкМ происходит задержка развития вируса клещевого энцефалита (табл.3).

Таким образом, опыты, проведенные на культуре клеток, свидетельствуют о перспективности использования реакционноспособных производных олигонуклеотидов в качестве противовирусных препаратов.

Таблица 3. Зависимость подавления размножения ВКЭ в культуре клеток СПЭВ от концентрации реакционноспособного производного олигонуклеотида Е4-11С1 и дозы ВКЭ

Концентрация 1Ч-ЛС1 (мкМ) Доза ВКЭ ТЦЦ 50 Разница титров ВКЭ ТВД 50 4-й день 5-й день 6-й день

25 5,8 3,0 2,29 2,29

3,8 2,75 0,75 0,75

5 5,8 3,33 3,33 2,86

3,8 2,17 0,28 0

1 5,8 1,33 0,33 0,33

3,8 2,17 1,71 0,87

0,2 5,8 1,17 0,33 0,16

3,8 1,71 0 0

ЕНБОдН

1. Исследовано влияние ка трансляцию олигонуклзотидов, комплементарных иницирующей области мРНК, кодирующей белок Ml вируса гриппа. Обнаружено, что полное подавление трансляции мРНК-М1 с пс'сщьп опггонуклеотидов происходит при формировании на ее 5' -конце протяженного гетеродуплекса. При этом наиболее чувствительным к воздействию олигонуклеотидами оказался участок .16-44 в структуре «¡THi-ili, в центре которого ячтеотгея пшЕВфзтавВ коден, .а СОКр«-щышб длины гетеродуплекса с любого конца на 3 основания снижает эффективность ингибирования трансляции на 15-20%.

2. Показано, что ингибирование трансляции мРНК ВКЭ с помощью оли-гонуклеотидов, комплементарных кодирующей области матрицы, происходит в случае наличия в системе активности РНКазы Н,.причем наиболее эффективно ингибируют трансляцию олигонуклеотида, комплементарные одноцепочечным участкам мРНК, которые были выявлены путей компьютерного моделирования вторичной структур;! -¿атрлин. Одка аз оптимальных для воздействий ояигонуклеотидами последовательностей обнаружена в участке 6175-6191 генома вируса клещевого энцефалита. 0. На примере мРНК, кодирующей легкую цепь иммуноглобулина G, впервые продемонстрирована возможность повышения пнтибируэдей активности антисмыслового олигонуклеотида путем присоединения к кегду реакционноспособной группы - 4-Ш-2-хлорэтп-М-метиламино)с5ензил--амина, которая может ковалентяо связываться с РИК-мисенья. При концентрации реагента в системе 10 мкМ полностью прекращался синтез иммуноглобулина, в то время как олигонуклеотида, не несущие реакционноспособных групп, в аналогичных условиях ке оказывали влияния на трансляцшо иммуноглобулиновой мРНК.

4. Исследовано действие производных олигонуклеотида, эффективно подавлящего трансляцию мРНК ВКЭ in vitro, на размножение вируса клещевого энцефалита в культуре клеток. Показано, что холестериновое производное в концентрация 10 мкМ и более подавляет синтез клеточных белков неспецифично. Фосфотиоатные аналоги олигонуклео-твдов в концентрации до 25 мкМ не оказывают существенного влияния на разложение ВКЭ в клетках. Реакционноспособное 4-(М-2-хлорэтил-Г1-метиламино)бензиламядное производное эффективно И' специфично подавляет размножение ВКЭ в клетках в зависимости от концентрации производного.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. Matvienko N.Yu., Vlassov V.V., Godovikov A.A., Zarytoya V.P., Ivanova E.M. Inhibition of the mouse immunoglobulin kappa light chain mBNA translation by oligodeoxyribonucleotide derivatives Abstracts. Intern, symposium. Pushchlno,1987, p.77

2. Matvienko N.Yu., Godovikov A.A. Arrest of IgG synthesis by oligonucleotide derivatives in MOPS-21 cells. Abstracts. Intern.workshop. Novosibirsk, 1988, p.23

3. Номоконова Н.Ю., Власов В.В., Годовиков А.А., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М. Подавление трансляции иммуноглобулиновой мРНК In vitro с помощью алкилируюцего производного олигонуклеотида. Молекуляр. биология, т.24, 1990, вып.1, с.173-178

4. Nomokonova N.Yu., Vlassov V.V., Gorn Y.V., Fokina T.N., Yur-chenko L.V. Inhibition of the influenza virus M protein mRNA translation in vitro with complementary oligonucleotides. Nucleosides and Nuleotides, 1991, v.10, Л1-2, p.649-650

5. Номоконова Н.Ю., Власов B.B., Горн B.B., Фокина Т.Н., Юрченко Л.В. Подавление трансляции in vitro мРНК белка М1 вируса гриппа с помощью антисмысловых олигонуклеотидов. Молекуляр.биология, 1991, Т.25, ВЫП.5, с.1332-1337

6. Nomokonova N.Yu., Abramova T.V., Ivanova E.M., Vlassov V.V., Fokina T.N., Yurchenko L.V. 'Suppression of Influenza virus biopolymers functions and reproduction of the virus by oligodeoxynucle-otid derivatives. Nucl.Acicls Res., Symposium series, 1991, v.24, p.301

7. Номоконова Н.Ю., Горн В.В., Власов В.В. Подавление трансляции in vitro фрагментов РНК вируса клещевого энцефалита с помощью антисмысловых олигонуклеотидов. Молекуляр.биология, 1993, т.26, вып.2, с.