Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови. Изучение условий образования и свойств олигонуклеотид-белковых комплексов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови. Изучение условий образования и свойств олигонуклеотид-белковых комплексов"

хч

л РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи УДК 577.123 + 57.083.3

РЫКОВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С БЕЛКАМИ СЫВОРОТКИ КРОВИ. ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ ОБРАЗОВАНИЯ И СВОЙСТВ ОЛИГОНУКЛЕОТИД - БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ.

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1994 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научные руководители : чл. - корр. РАН В.В. Власов

к.б.н. Л.В. Паутова

Официальные оппоненты: д.х.н. Г.А. Невинский

к.б.н. Э.А. Баричева

Ведущая организация : Институт клинической иммунологии СО АМН

Защита диссертации состоится " 9 " ноября 1994 г. в .

заседании специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского Института биооргакической химии СО РАН.

Автореферат разослан " 7 " октября 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук * } О.С. Федором

Актуальность проблемы.

Представления о функциях нуклеиновых кислот в течение долгого времени ограничивались исключительно их участием во внутриклеточном матричном синтезе биополимеров. Однако в настоящее время накопились убедительные доказательства того, что РНК и ДНК, обнаруживаемые во внеклеточном пространстве, могут вызывать специфические биологические эффекты, воздействуя на клетки определенного вида непосредственно или в составе нуклеиново -белковых комплексов. Есть основания предполагать, что ДНК и РНК появляются во внеклеточном пространстве не только в процессе гибели клеток и во время развития таких патологических состояний, как онкологические и аутоиммунные заболевания, но и в результате нормальных метаболических процессов. Проблема исследования биологических эффектов, вызываемых воздействием внеклеточных нуклеиновых кислот, приобретает большое значение в связи с развитием методов генной инженерии и терапии олигонуклеотидами, когда экзогенные нуклеиновые кислоты искусственно вводятся в организм. В последние годы были достигнуты успехи в использовании олигонуклеотидов и их модифицированных производных для подавления размножения вирусов, и модуляции генной экспрессии в клеточных культурах. Появились сообщения об антивирусной активности олигонуклеотидов в организме животных, начаты клинические испытания. Однако, кроме положительных эффектов были выявлены такие свойства экзогенных нуклеиновых кислот в организме, как токсичность, иммуногенность и способность активировать иммунную систему. В ряде работ показано, что использование модифицированных производных олигонуклеотидов вызывает такие последствия, как гиперплазия лимфоузлов и селезенки, активация натуральных киллеров, повышение уровня выработки цитокинов. Очевидно, что дальнейшее развитие перспективного направления ген - специфической терапии невозможно без подробного изучения механизмов взаимодействия экзогенных нуклеиновых кислот с макромолекулами клеток и тканей организма, поскольку имеется возможность развития побочных патологических эффектов.

Цель работы.

Проведенные ранее исследования показали, что независимо от способа введения меченых олигонуклеотидов в организм животных, они распределяются по органам и тканям через кровоток. Таким образом, олигонуклеотиды могут взаимодействовать с компонентами крови уже в первые минуты после попадания в организм. По - видимому, такое взаимодействие олигонуклеотидов и их производных с биополимерами крови влияет на их дальнейшую судьбу в организме и вызываемые биологические эффекты.

Целью представляемой работы было, во - первых, изу ать спектр белков крови, взаимодействующих с олигонуклеотидами, выяснить специфичность, аффинность и возможные механизмы взаимодействи сывороточных белков с различными олигонуклеотидами и их модифицированными производными, что необходимо для понимания процессов, связанных с функционированием внеклеточных нуклеиновых кислот in vivo и разработки стратегии использования олигонуклеотидов в терапии.

Второй задачей настоящей работы было изучение взаимодействия олигонуклеотидов с компонентами иммунной системы, а именно, иммуноглобулинами и иммунокомпетентными клетками. Исследование механизмов и возможных последствий взаимодействия олигонуклеотидов с клетками иммунной системы необходимо для решения вопроса о неспецифическом иммуностимулирующем действии, обнаруженном при длительном использовании олигонуклеотидов как в культуре клеток, так и в организме.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В настоящей диссертационной работе было впервые проведено исследование белков сыворотки крови, взаимодействующих с олигонуклеотидами. С помощью алкилирующих производных олигонуклеотидов были выявлены сывороточные белки, вступающие в низкоаффинные взаимодействия с олигонуклеотидами, среди них - альбумин и иммуноглобулины классов М и G. Сравнительный анализ взаимодействия различных производных олигонуклеотидов с этими тремя сывороточными белками показал, что константы ассоциации с белками некоторых модифицированных производных, например, холестеринового производного и фосфоротиоатных аналогов олигонуклеотидов, существенно выше, чем для обычных фосфодиэфирных аналогов. Оказалось, что константы ассоциации олигонуклеотидов с белками зависят от длины олигонуклеотида и не зависят от последовательности нухлеотидов. На основе полученных данных можно прогнозировать появление побочных эффектов при использовании олигонуклеотидов и их производных для терапии, причем полученное представление о преимущественно ионном характере олигонуклеотид - белкового взаимодействия, возможно, позволит предотвратить эти эффекты путем использования конкурентов полианионной природы, или изменением длины олигонуклеотида.

Локализованный на молекуле иммуноглобулина участок взаимодействия с олигонуклеотидом представляет интерес и плане изучения структуры и функций иммуноглобулинов. Представление о существовании такого полианиои -связывающего участка неподалеку от neiiip.i >знавания .антигена на молекуле иммуноглобулина может объяснять природу полиспецифичности, обнаруженной

4

для многих природных антител, моноклональных антител и аутоантител, в том числе, антител к ДНК. В работе было впервые показано, что олигонуклеотид в составе ковалентного комплекса с иммуноглобулином О связывается с несколькими линиями иммунокомпетентных клеток за счет взаимодействия с Рс - рецепторами. Вероятно, один из путей выведения олигонуклеотидов из кровотока осуществляется через взаимодействие с сывороточными иммуноглобулинами и Рс -рецепторами различных клеток. Учитывая, что Рс - рецепторы имеют широкую распространенность практически на всех типах клеток иммунной системы и фактически осуществляют связь между гуморальным и клеточным звеньями иммунной системы, можно предполагать, что взаимодействие с Рс - рецепторами в комплексе с иммуноглобулинами - это один из возможных механизмов влияния олигонуклеотидов на активацию иммуной системы.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже XXI века", посвященной памяти академика Энгельгарта ( 1994 г.).

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 103 страницах, включающих 14 рисунков, 4 таблицы и список литературы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки кроши

Взаимодействие сывороточных белков с олигонуклеотидами бчло исследовано с помощью химической модификации алкилирующими пронзнодными олигонуклеотидов, меченых радиоактивно. В данной работе была использована реакционноспособная алкилирующая ароматическая 2 - хлорлшламино группа, которая может взаимодействовать как с нуклеиновыми кислотами, так и с белками. Для выявления сывороточных белков, взаимодействующих с олигонуклеогидами, цельную сыворотку крови человека инкубировали с Р меченым алкилнрующим производным р(Т>1б (37°, 45 мин ). Продукты реакции модификации анализировали методом электрофореза в ПАА геле с последующей радиоавтографией. Как видно из рис.1, в цельной сыворотке происходит

1 2 3 4 5 6 7 кЭа -

23- Ц Ц

Рис. 1. Модификация белков сыворотки крови человека алкилирующим производным олигонуклеотида

С1Я СНг КН р( Т )хб. Электрофорез в градиентном вЭЭ - ПАА геле. Белки сыворотки инкубировали с реагентом < в концентрации 10 мкМ ) в течение 30 мин при 37° : 1 - ДО, 2 - ^М, 3 -БСА, 4-7 -сыворотку крови человека, инкубировали с 1,25, 2,5, 5,0, 10 мкМ реагента.

модификация нескольких белков, среди которых по электрофоретической подвижности можно идентифицировать альбумин и иммуноглобулины С и М.

Для того, чтобы определить специфичность и аффинность взаимодействия олигонуклеотидов с выявленными белками, была изучена концентрационная зависимость степени модификации этих белков реакционноспособными производными олигонуклеотида на чистых препаратах альбумина, и ^М. Белки модифицировали меченым *"Р алкилирующим производным олигонуклеотида в диапазоне концентраций от 1 до 30 мкМ. Степень модификации определяли как интенсивность радиоактивной метки (в ерш ) в полосах белка на электрофореграмме. Для всех исследованных белков зависимость степени модификации от концентрации олигонуклеотида имеет насыщающий характер ( рис.2 ). Константы диссоциации ( К<1 ) для иммуноглобулинов М, С и альбумина были определены как 4, 6 и 20 мкМ соответственно.

Модификация

Рис.2. Зависимость степени модификации белков

сыворотки крови ( в % ) от концентрации СШ СН2 N11 р( Т )16. Белки ( 1 мкМ )

инкубировали с реагентом в забуференном

физиологическом растворе при 37° 30 мин. Модификация

сывороточных белков :----

ДО, —-1ЁМ, -—БСА.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

kDa

72 -

66- о

23 -

/.л bi «•v»

■iU:

«Cc

Рис.3. Влияние конкурентов на модификацию белков сыворотки крови реагентом СЩ СН2 Ш р< Т )15

( 10 мкМ ). , Анализ продуктов модификации электрофорезом в БОБ -ПАА геле. Радиоавтограф геля : 1 - 5 -модификация альбумина, 6-10-модификация 1&М, 11-15-

модификациа 1,6, 11 - в

присутствии 1,0 мг/мл ДНК (0,5мкМ), 2,7,12-50 мкг/мл гепарина, 3, 8, 13 - 10 мкМ

рТСАСССТСТТСССАТТ, 4, 9, 14 -10 мкМ р( Т ) 16, 5, 10, 15,-без конкуренции.

52 -

Эксперименты по модификации белкоз в присутствии конкурентов позволили установить сродство к исследованным белкам олигонуклеотидов различной длины и последовательности, модифицированных производных и фосфоротиоатных аналогов олигонуклеотидов ( таблица 1 ). В условиях насыщения связывания (концентрация производного С1Яр(Т))^ 10 мкМ для иммуноглобулинов и 30 мкМ для альбумина ) аффинная модификация белков зависит от присутствия в реакционной среде соединений, способных взаимодействовать с тем же участком связывания, что и олигонуклеотид ( рис.3 ). Константы конкуренции вычисляли по формуле : Кс = Кг х Г [С]/[И] ] х ¡1/ ( Мо/Мс - 1 )}, где [С] - концентрация конкурента,

[И] - концентрация алкилирующего производного,

Мо, Мс - радиоактивность белковых полос ( в сргп > в отсутствие или в присутствии конкурента.

Рис.4. Зависимость константы диссоциации комплексов

олигонуклеотидов с белками сыворотки крови от длины олигонуклеотида. Константы ( Кс ) определены в

экспериментах по конкуренции олигонуклеотидов в реакции модификации IgG, IgM и BSA алкилирующим производным CIR CIb МП р( Т >16.

> Me S.

>li¡

Tí

t..,' i

IgM IgG Ut'A

I.<■ ikji i i.inopoiKH K]»)np

Рис.5. Константы

диссоциации (Кс )

комплексов сывороточных белков с различными производными олигонуклеотидов и

гепарином. Значения

констант определяли в экспериментах по

конкуренции

олигонуклеотидов и

гепарина в реакции модификации ^М и

1>СА алкилирующим

производным СИ? СН2 N11 р( Т )16.

Полученные данные свидетельствуют о том, что сродство олигонуклеотидов к иммуноглобулинам и альбумину не оавис чт о г последовательности нуклеотидов. Олигонуклеотиды одинаковой длины с различной последовательностью характеризуются сходными константами (таблица 1 ). Из рисунка видно, что сродство олигонуклеотидов с исследованными белками возрастает с увеличением длины олигонуклеотида ( рис.4 ). Оказалось, что наиболее высоким сродстгом к иммуноглобулинам обладает полимерная одноцсппчечная ДНК.

Присоединение ароматических группировок по 5' - концевому фосфату олигонуклеотида приводит к заметному увеличению сродства этих производных к иммуноглобулинам и особенно к альбумину. Для альбумина было обнаружено 3-х кратное снижение константы диссоциации комплекса с холестериновым производным олигонуклеотида по сравнению с его обычным аналогом p(T)|¿ ( рис.5 ). Замена кислорода на а р> в фосфоротиоатных аналогах олигонуклеотидов существенно мовыпмсi и\ сродство ко всем исследованным белкам ( рис.5 ). Константы диссоциации urr. .аюв обычных олигонуклеотидов с белками в 10 раз выше, чем в случа. и\ ¡ ,Ьп,:отиоатных аналогов. Оказалось, что их сродство к иммуноглобулинам уси.. :вается с увеличением длины фосфоротиоатного олигонуклеотида. как и л c¡ <'сфодиэфирных аналогов.

В качестве конкурентов модификации были использованы различные соединения полианионного характер:'', к;:.- например, гепарин, декстран сульфат, а также некоторые анионные красители. Оказалось, что сродство некоторых полианионов к иммуноглобулинам характеризуется константами, сходными со значениями констант для 10 - 20 мерных олигонуклеотидов. Особенно успешно

Таблица 1. Константы диссоциации комплексов сывороточных белков с производными олигонуклеотидов и полианионами.

Соединение IgM, Kd IgG, Kd BSA, Kd

[ 2 ] р[ ТТ] 80 120 250

[ 4 ] р[ G AT С ] 80 115 240

[ 6 ] [ 8 ] р[ ССТСТС ] 55 110 240

р[TTTTTGTT] 42 90 75

[ Ю ] р[ TCTTTTTGTT] 30 75 150

[ 15 ] I ТСССТСССТСТТАТС ]р 15 30 45

[ 16 ] р[ Т...Т ] 16 15 30 48

[ 16 ] р[ TGACCCTCTTCCCATT] 15 30 45

[ 18 ] [CTTTCTTTTCCTCTCGCT]р 12 24 32

[ 44 ] В256 р 7 16 25

[ 16 ]-СЬо1 Chol-p[ ATACCCTGCTTTTGCT ] 8 12 15

[ ¡6 1-РЬеп Phen-p[ TGACCCTCTTCCCATT ] 10 34 -

[ 16 ] -Ргос Ргос-р[ TGACCCTCTTCCCATT ] 12 18 -

8 [ 16 ] Sp[ TGACCCTCTTCCCATT] 2 3 1,5

8 [ 28 ] Sp[ C...C ] 28 1 1,5 1

с^ОЫА плазмида pTZ18R 12 15 50

3 5 25

гепарин ( Sigma ) 16 17 1

Dextran sulfate ( Sigma ) 10 6 1

Trypan blue ( Flow ) - 8 0,5

активный красный 3 - 20 1,5

Значения констант ( мкМ ) определены в экспериментах по конкуренции

исследуемых веществ в реакции модификации белков реагентом

C1R СН2 NH р< Т )16.

полианионы ингибировали взаимодействие алкилирующего производного олигонуклеотида с альбумином ( Кс гепарина при взаимодействии с альбумином превышает Кс р( Т более, чем на порядок ). На основании этих данных было сделано предположение о том, что взаимодействие олигоиуклеотидов с иммуноглобулинами и альбумином имеет преимущественно ионный механизм. Вероятно, в формировании комплекса основную роль играет взаимодействие между фосфатным остовом олигонуклеотида и катионным участком ( или участками ) на поверхности сывороточных белков.

Взаимодейстаис олигонуклсотиЛм с иммуноглобулинами.

Дальнейшие исследования были посвящены взаимодействию олигонуклеотидов с иммуноглобулинами класса в. Сывороточные иммуноглобулины выполняют много различных функций. Одной из наиболее важных функций принято считать их взаимодействие со специфическим антигеном, которое приводит к нейтрализации токсинов, опсонизации чужеродных микроорганизмов и распознаванию белков, экспрессмруемых на поверхности генетически отличающихся клеток. Другой не менее важной функцией является

1 2 3 4 5

кйа

Рис.6. Влияние специфического

антигена (миоглобин человека), на модификацию моноклональных антител мыши алкилирующим производным (Ж СН2 ЯН р( Т )16 : 1 - миоглобин человека, 2, 4 - антитела ( 1 мкМ ) клонов 4Б4 и 806, 3, 5, - антитела ( 1 мкМ) клонов 404 и 806 в присутствии 4 мкМ миоглобина человека инкубировали с 10 мкМ реагента. Анализировали методом электрофореза в вОБ - ПАА геле, с последующей радиоавтографией..

взаимодействие с системой комплемента с последующей ее активацией. Было необходимо установить конкретный участох связывания олигонуклеотидов с иммуноглобулинами, поскольку локализация места связывания в определенном домене давала бы возможность, прогнозировать влияние олигонуклеотидов на различные функции иммуноглобулинов в системе взаимодействий: антитело -антиген, антитело - клетка, антитело - система комплемента.

Ключевым этапом в процессе локализации было выяснение того факта, что антитела в составе иммунного комплекса со специфическим антигеном не взаимодействуют с олигонуклеотидом, в отличие от свободных антител. Впервые ингибнрующее влияние специфического антигена было показано для моноклональных антител к миоглобину человека. Использованные в эксперименте антитела клонов 404 и 806 имеют высокое сродство к миоглобину человека ( константы диссоциации иммунного комплекса - 6 и 1 нМ соответственно ). Как показано на рис.6, реакционноспособное производное р( Т ) к, в концентрации 10 мкМ модифицирует оба иммуноглобулина. В дальнейшем. ингибирование аффинной модификации под действием специфического антигена было установлено для нескольких произвольно выбранных антител с различной антигенной специфичностью : к миоглобину человека, N8 - 1 белку вируса клещевого энцефалита и РНК - полимеразе Е.соН. Можно предполагать два вероятных механизма конкуренции связыванию олигонуклеотида со стороны антигена :

52

«5»

23 -

18 -

ЧГ.

...■«ч

а

1 2 3

б

1 2 3

IgG 2b

Fc -

Rsb- p *")

S .fri

Г

f"

■ ■ и

Рис.7. Анализ методом

электрофореза в ЭОЗ - ПАА геле фрагментов миеломного 2Ь

мыши, полученных в результате пепсинового гидролиза. ( а ) -иммуноглобулин предварительно модифицирован алкилирующим производным меченого -"Р р(Т)^. Радиоавтограф геля. Инкубация с пепсином 1) - 5 часов, 2) - 2 часа, 3) - 0 часов. ( б ) -нитроцеллюлозный блот с геля, окрашенный коллоидным серебром. Инкубация с пепсином 1) - 0 часов, 2) - 2 часа, 3) - 5 часов.

1 - участок взаимодействия с олигонуклеотидом локализован непосредственно в центре узнавания антигена антителом либо вблизи от этого центра, поэтому антиген может экранировать этот участок взаимодействия,

2 - участок взаимодействия расположен таким образом, что кснформациошше изменения, происходящие при специфическом иммунном взаимодействии, препятствуют образованию комплекса с олигонуклеотидом.

Для локализации участка взаимодействия с олигонуклеотидом, было проведено расщепление молекулы иммуноглобулина, предварительно модифицированного алкилирующим производным р( Т >16. на фрагменты путем ферментативного, либо химического гидролиза. Под действием пепсина расщепляли мышиные моноклональный IgG 1 и миеломннй IgG 2b на Fc и Fab фрагменты, продукты пиролиза анализировали методом электрофореза. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что участок связывания олигонуклеотида находится на Fab - фрагменте молекулы. Из данных, представленных на рис.7 видно, что именно этот фрагмент является меченым продуктом ферментативного расщепления IgG 2b, тогда как Fc - фрагмент фактически не содержит связанной с олигонуклеотидом метки. Для более точной локализации места связывания олигонуклеотида с молекулой иммуноглобулина проводили одноударное расщепление моноклонального IgG 1 мыши бромцианом по остаткам метионина.

а б в

Мин 15 30 60 90 90 60 30 15 90 60 30 15 «Да

Рис.8. Анализ фрагментов моноклонального 1,

полученных в результате бромцианового гидролиза. ( а ) Радиоавтограф 808 - Г1АА геля. Расщеплению подвергали суммарную молекулу 1^0 1, предварительно модифицированную алкилирующим производным 32р р(Т),6. ( б ) Нитроцеллюлозный блот с БИЗ - ПААГ, окрашенный коллоидным серебром. Расщепление суммарной молекулы 1. ( в ) Расщепление тяжелой цепи

иммуноглобулина.

На рис.8 приведены данные электрофоретического . анализа полученных фрагментов иммуноглобулина, содержащего ковалентно связанный радиоактивно меченый олигонуклеотид р(Т>15. Как видно из радиоавтографа, наибольшее содержание метки и накопление ее при увеличении времени гидролиза обнаруживалось во фрагменте с молекулярным весом 20 кДа. Сравнительный анализ фрагментов, образующихся при гидролизе нативной молекулы и при расщеплении отдельно тяжелой и легкой цепей показал, что фрагмент с молекулярным весом 20 кДа принадлежит легкой цепи и соответствует N -концевому пептиду длиной 178 аминокислот.

Однако, эти результаты не отрицали возможность совпадения участка связывания олигонуклеотида с активным центром молекулы иммуноглобулина, по которому происходит узнавание специфического антигена. Поэтому следующим этапом в определении участка взаимодействия было исследование влияния олигонуклеотида на связывание антител со специфическим антигеном. Логично предположить, что если ковалентное присоединение олигонуклеотида происходит по антиген связывающему центру молекулы, то олигонуклеотид может препятствовать связыванию иммуноглобулина с антигеном. Были проведены эксперименты по изучению взаимодействия модифицированных олигонуклеотидом моноклональных антител со специфическим антигеном ( миоглобином человека ) в твердофазном иммуноферментном анализе. Инкубация 'антител клона 404 в

Конном гриппа антител клона 4Dl (ыкг/ил)

Рис.9. Влияние

олигонуклеотида на

взаимодействие антител клона 404 с антигеном (миоглобином человека) в иммуноферментном анализе. Антитела клона 404 'взаимодействуют с антигеном, сорбированым на поверхности

поливинилхлоридных планшетов, в присутствии р(Е)1б с концентрацией 5 мкМ.

КСШфОЛЬ

, в присутствии олиго

растворе с концентрацией 5, 30 и 100 нМ с сорбированным на планшетах антигеном, в присутствии 5 мкМ p(E)jg не приводит к снижению связывания антител по сравнению с контролем ( рис.9 ). В другом эксперименте, когда олигонуклеотиды добавляли в трех различных концентрациях ( 5, 25 и 125 мкМ ), связывание антител с антигеном ц присутствии олигонуклеотида не только не снижается по сравнению с контролем, но даже недостоверно увеличивается.

Тем не менее, нельзя было исключить возможность совпадения участка связывания олигонуклеотидов с антиген связывающим центром, поскольку молекула иммуноглобулина имеет бивалентный характер и взаимодействие может происходить за счет второго активного центра. Однозначно установить, что олигонуклсотид, ковалентно связанный с иммуноглобулином, не препятствует иммунному взаимодействию, стало возможно в результате экспериментов с одиночными Fab - фрагментами моноклонального иммуноглобулина, модифицированного алкилирующим производным радиоактивно меченого р( Т

Рис.10. Взаимодействие

фрагментов моноклонального IgG 1 мыши, полученных папаиновым гидролизом, с аффинным сорбентом

( миоглобин - сефароза ). Фрагменты, связавшиеся с сорбентом, элюировали кислым буфером и анализировали методом электрофореза в SDS -ПАА геле в неденатурирующих условиях. Радиоафтограф геля. Инкубация с папаином в течение : 1) - 1 часа, 2) -2 часов. 3) - тяжелая и легкая цепи иммуноглобулина.

1 2 3

»Ш-

IgG 1-

Fab - ff'

-52

l^i - 23

Как видно из рисунка 10, моновалентные Fab - фрагменты моноклональных антител к миоглобину человека, содержащие ковалентно связанный радиоактивный олигонуклеотид, взаимодействуют с антигеном в условиях аффинной хроматографии. На основании полученных данных был сделан вывод о том, что участок связывания олигонуклеотида на молекуле иммуноглобулина не совпадает с его антиген - связывающим центром, но расположен неподалеку от него, и образование комплекса антигена с антителом его экранирует. Этот результат кажется интересным, поскольку может быть связан с известной полиспецифичностью антител. Полиспецифические антитела характеризуются способностью взаимодействовать с различными структурно неродственными антигенами, причем остается неясным, происходит ли взаимодействие с различными антигенами по одному активному центру, либо на молекуле существуют различные участки связывания. Полученные данные о существовании полианион связывающего участка на молекуле иммуноглобулина позволяют предложить одно из возможных объяснений природы полиспецифичности аутоантител к нуклеиновым кислотам, появляющихся при системной красной волчанке и других аутоиммунных заболеваниях. Алкилирующие производные олигонуклеотидов могут быть полезным и инструментом при изучении таких антител.

Взаимодействие иммуиоглобулииа, ковалентно связанного с олигонуклеотидом, с клетками различных линий.

Было показано, что взаимодействие олигонуклеотида с иммуноглобулином, происходящее в Fab - фрагменте молекулы, не затрагивает антиген - связывающей функции иммуноглобулина. Необходимо было выяснить, влияет ли взаимодействие с олигонуклеотидом на другие функции антител. Казалось вероятным, что комплекс антитело - олигонуклеотид будет иметь те же свойства, что и иммунные комплексы антиген - антитело. В работе изучалось распределение иммуноглобулина, модифицированного меченым олигонуклеотидом, между компонентами цельной крови с целью оценить возможность выведения такого комплекса из кровотока посредством обычных для иммунных комплексов механизмов. Известно, что в норме наибольшее количество иммунных комплексов выводится за счет взаимодействия с рецепторами к компонентам комплемента ( CR ) ча эритроцитах и Fc рецепторов на лимфоцитах (до 70 % комплексов связывается с эритроцитами в течение первых нескольких минут после введения их в кровь). Как видно из рисунка 11, комплекс иммуноглобулина с олигонуклеотидом, первоначально содержащийся в плазме, со временем

Рис. 11. Распределение

иммуноглобулина,

модифицированного

32р СЖ СН2 КНр(Т)16,

между компонентами цельной крови. Модифицированный человеческий иммуноглобулин инкубировали с цельной гепаринизиро ванной кровью человека при 37°, разделяли на ' фракции

центрифугированием на

растворе фиколла, измеряли радиоактивность, связанную с каждой фракцией.

во

Время ( шш. ]

перераспределяется в лейкоцитарную фракцию и не взаимодействует с эритроцитами. Такой характер распределения комплекса иммуноглобулин -олигонуклеотид позволяет предполагать, что этот комплекс не обладает способностью активировать систему комплемента и выведение его из плазмы будет происходить за счет связывания с лейкоцитами через Ис - рецепторный механизм.

Далее было исследовано взаимодействие иммуноглобулинов, содержащих ковалентно связанный олигонуклеотид, с несколькими линиями иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих различные 'типы рецепторов к Рс -фрагменту иммуноглобулина : человеческими - моноцитарной и - 937, эритромиелоидной К - 562 и мышиной макрофагальной Р -'388. Наиболее высокий уровень связывания наблюдали для линий К - 562 и Р - 388. Клетки миелоидной линии и - 937 несут на поверхности Рс - рецепторы, эффективно связывающие свободные ДО, а клетки линии К - 562 экспрессируют рецепторы с высокой аффинностью к иммунным комплексам. В опытах по конкуренции было показано, что иммунные комплексы значительно более эффективно ингибируют связывание модифицированных олигонуклеотидом иммуноглобулинов с клетками, чем свободные иммуноглобулины. Добавление свободного иммуноглобулина в концентрации на порядок более высокой, чем концентрация иммунных комплексов, приводит к менее выраженному ингибиpvющeмy эффекту на взаимодействие комплекса иммуноглобулин - олигонуклеотид с клетками К - 562 (рис.12). Результаты этих экспериментов позволяют считать, что комплекс

р ИМИ)

3001) i

В пик).

! Рис. 12. Концентрационная ' зависимое п. снизывании

иммуноглобулина ( мкМ ), : модифицирование! о

32р C1R СН2 N11 р< Т )16, с ! клетками линии К - 562. ! Инкубацию клеток с модифицированным иммуноглобулином проводили ! без конкурентов ( контроль ), ' в присутствии свободного IgG : ( IgG ), в присутствии i иммунных комплексов ( ИК ). | На графике представлены _., „„ 0 и значения радиоактивности Koimem puiuiH модон^ишцюпашюпГ^О ( имл/мин ), связанной с

2 х 10° клеток.

контроль ■

IgG

ИК

иммуноглобулин - олигонуклеотид имеет свойства, характерные для иммунного комплекм. Вероятно, присоединение олигонуклеотида к иммуноглобулину сопровождается тшежм* щ.с ьоифвумациоюшми изменениями, которые происходят при обрамимав тдатмюм «тиши с «тело«.

Получсвше лквшые предполагают возможность появления различных побочных эффектов при использовании олигонуклеотидов для терапевтического воздействия in vivo в результате взаимодействия свободных нуклеиновых кислот с белковыми молекулами клеток и организма. Как известно из различных работ, ДНК, конъюгированнаа с белковым носителем, характеризуется повышенной устойчивостью к деградации и усиленным проникновением в клетки. Кроме того, ДНК в составе конъюгатов с белком, обладает иммуногенностью, которая нехарактерна для свободной нуклеиновой кислоты. Эти факты позволяют предполагать, что способность олигонуклеотидов образовывать комплексы с сывороточными белками может не только способствовать увеличению срока их жизни и циркуляции, но и обеспечивать их повышенную иммуногенность.

Взаимодействие олигонуклеотидов с иммуноглобулинами кажется весьма интересным в связи с перспективой изучения возможных механизмов иммуностимулирующего влияния нуклеиновых кислот, обнаруженного при длительном использовании олигонуклеотидов как в культуре клеток, так и in vivo. Полученные результаты свидетельствуют о том, что иммуноглобулины в комплексе с ковалентно связанными олигонуклеотидами могут _ взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками через Fe - рецепторный механизм. Вероятно, таким может быть один из путей иммуностимулирующего влияния олигонуклеотидов на Fe - рецептор содержащие клетки.

Выводы.

1. Установлено, чго реакционноспособные производные олигонуклеотидов, несущие на 5' - концевом фосфате остаток 4 - [ ( N-2-хлорэтил-М-метил ) амино] бензиламина, взаимодействуют с белками сыворотки крови : иммуноглобулинами классов М н G и альбумином. Константы диссоциации комплексов олигонуклеотида с белком были определены с помощью аффинной модификации чистых сывороточных белков алкилирующим производным олигонуклеотида р(Т)]б. Величины К<1 для комплексов C1R СН2 N11 р( Т ) кз с белками сыворотки составляют 4 мкМ для IgM, 6 мкМ для IgG и 20 мкМ для альбумина.

2. 1'езультаты .жспсриментов по ингибированию аффинной модификации этих белков олигон\клеотидами различной длины и последовательности, их модифицированными производными, фосфоротиоатными аналогами олиюнуклеотидов, полимерной ДНК и полианионами, показали, что основную роль в формировании комплексов олигонуклеотидов с белками играют ионные взаимодействия. Сделано предположение о существовании полианион -связывающего участка на молекуле иммуноглобулина G.

3. Показано, что олигонуклеотиды взаимодействуют с Fab - фрагментом молекулы иммуноглобулина на участке, соответствующем N - концевому пептиду легкой цепи длиной 178 аминокислот. Специфический антиген способен ингибировать присоединение олигонуклеотида к иммуноглобулину, однако иммуноглобулин, ковалентно связанный с олигонуклеотидом, сохраняет способность взаимодействовать С антигеном. Сделан вывод о том, что участок, на котором происходит взаимодействие олигонуклеотида с иммуноглобулином, расположен вне антиген - связывающего центра.

4. Установлено, что иммуноглобулин, ковалентно связанный с олигонуклеотидом, сохраняет эффекторные функции, осуществляемые Fc -

областью молекулы. Комплекс иммуноглобулина с олигонуклеотидом связывается с клетками, имеющими рецепторы к Fc - фрагменту. Это взаимодействие обеспечивает медленный Fc - рецепторный механизм выведения таких комплексов из крови лейкоцитами. Быстрая элиминация таких комплексов через клетки, несущие рецепторы к компонентам комплемента, не обнаружена.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах :

1. В.В.Власов, Л.В.Паутова, Е.Ю. Рыкова, Л.АЯкубов. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови. Биохимия, 1993, т.58, с. 1247 - 1251.

2. KYu-Rykova, L.V.Pautova, LAYakubov, V.N.Karamyshev, V.V.Vlassov. Serum immunoglobulins interact with oligonucleotides. FEBS Letters, 1994, v.344, p.96 -98.

3. Л.В.Паутова, П.П.Лактионов, КЮ.Рыкова, Л.АЯкубов, В.В.Власов. Исследование участка связывания олигонуклеоп^дов на молекуле иммуноглобулина. Мол. биологня, 1994, т.28, с.1106 - 1112.