Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты с помощью тандемных систем производных олигонуклеотидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гайдамаков, Сергей Алексеевич, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

ГАЙДАМАКОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ ^

РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К НАПРАВЛЕННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НА НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ С ПОМОЩЬЮ ТАНДЕМНЫХ СИСТЕМ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

03.00.04.-биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.х.н., чл.-корр. РАН Власов В.В., к.х.н. Добриков М.И.

Новосибирск 1999

Содержание

Содержание....................................................................................................2

Список сокращений..........................................................................................4

Введение........................................................................................................5

Гдава 1. Применение олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных для изучения и регуляции экспрессии генов (обзор литературы).................................................7

1.1. «Антисенс»-стратегия: воздействие на мРНК с использованием антисмысловых олигонуклеотидов и их производных..................................................................................7

1.2. «Антиген»-стратегия: использование олигонуклеотидных производных для воздействия на регуляторные элементы или факторы транскрипции..............................10

1.3. Фотореакционноспособные олигонуклеотидные производные как инструмент для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты......................................................10

1.4. Олигонуклеотидные производные, содержащие псорален........................................11

1.5. Взаимодействие фотоактивируемых производных олигонуклеотидов с регуляторными районами генов.........................................................................................14

1.6. Взаимодействие фотоактивируемых производных олигонуклеотидов с факторами транскрипции......................................................................................................................15

1.7. Использование фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов для направленного мутагенеза..................................................................................................17

1.8. Использование фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов для воздействия на ДНК в составе хромосом ...... Л.^у.:^;::^.^....,.........................................18

1.9. Олигонуклеотидные производные, содержащие интеркалирующие красители.......19

1.10. Олигонуклеотидные производные, содержащие азиды и перфторированные азиды, использование эффекторов для повышения степени модификации................................24

1.11. Взаимодействие олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных с нуклеиновыми кислотами - мишенями в составе тандемных комплексов......................27

1.12. Безизлучательная передача энергии между флуорофорами, присоединенными к олигонуклеотидам..............................................................................................................31

Глава 2. Материалы и методы................................................................................................35

2.1. Ферменты.....................................................................................................................35

2.2. Реактивы.......................................................................................................................35

2.3. Плазмиды, бактериофаги и штаммы микроорганизмов.............................................35

2.4. Олигонуклеотиды........................................................................................................36

2.5. Субклонирование фрагментов ДНК............................................................................36

2.6. Выделение бактериофагов и их одноцепочечной ДНК..............................................37

2.7. Выделение ДНК плазмид и RF-формы бактериофага М13 из клеток E.coli методом осветленного лизата с последующим центрифугированием в двухступенчатом градиенте хлористого цезия................................................................................................................38

2.8. Приготовление препаратов плазмидной ДНК с разной степенью суперспирализации .............................................................................................................................................39

2.9. Метод геномного секвенирования..............................................................................40

2.10. Получение алкилирующих производных смеси олигонуклеотидов........................40

2.11. Алкилирование ДНК адресованными реагентами...................................................41

2.12. Получение фотоактивируемых реакционноспособных производных олигонуклеотидов Ол2Я2 и ОлЗЮ....................................................................................41

2.13. Выделение олигонуклеотидных производных методом ВЭЖХ.............................42

2.14. Синтез пиреновых производных олигонуклеотидов Ол181 и Ол281.....................42

2.15. Синтез бензантраценового производного олигонуклеотида Ол2Б2........................43

2.16. Синтез периленового производного олигонуклеотида Ол2БЗ.................................44

2.17. Определение Smax производных олигонуклеотидов..................................................44

2.18. Гашение флуоресценции бензантраценовых производных.....................................45

2.19. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды................................................45

2.20. Получение фрагментов одноцепочечной ДНК.........................................................45

2.21. Фотомодификация нуклеиновых кислот..................................................................45

2.22. Электрофоретический анализ продуктов модификации, авторадиография и денситометрия....................................................................................................................46

2.23. Определение степени и позиционной направленности модификации ДНК-мишени .............................................................................................................................................47

2.24. Определение каталитических свойств фотосенсибилизатора..................................47

Глава 3. Результаты и обсуждение........................................................................................49

3.1. Многокомпонентные системы алкилирующих реагентов на основе олигонуклеотидов, полученных контролируемой фрагментацией полинуклеотидов.........................................49

3.2. Комплементарно-адресованная модификация дц-ДНК плазмид. Влияние степени суперспирализации на эффективность адресованной модификации...................................54

3.2.1. Направленная модификация суперспирализованной ДНК плазмиды риС19-С2 алкилирующими производными олигонуклеотидов, полученных фрагментацией полинуклеотидов................................................................................................................54

3.2.2. Сайт-специфичная модификация суперспирализованных ДНК плазмид р160, р163 алкилирующими производными синтетических олигонуклеотидов................................56

3.3. Бинарные системы олигонуклеотидных конъюгатов для высокоспецифичной фотомодификации нуклеиновых кислот...............................................................................61

3.3.1. Принцип действия бинарных систем для направленной фотомодификации нуклеиновых кислот...........................................................................................................61

3.3.2. Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотидной матрицы М1. Пиреновое производное олигонуклеотида в качестве сенсибилизатора..........................64

3.3.3. Позиционная направленность фотомодификации...................................................77

3.3.4. Использование бензантрацена в качестве сенсибилизатора...................................82

3.3.5. Температурная зависимость эффективности фотомодификации...........................84

3.3.6. Каталитические свойства бинарной системы, определение числа оборотов фотосенсибилизатора.........................................................................................................85

3.3.7. Использование перилена в качестве фотосенсибилизатора...................................86

3.3.8. Сенсибилизированная фотомодификация оц-ДНК бактериофага М13Ьтг4.........88

3.3.9. Сравнение селективности действия бинарных систем и реагентов для прямой

модификации НК................................................................................................................90

3.3.9. Применение системы бинарных реагентов для выявления и характеризации белков, специфически взаимодействующих с регуляторным районом гена СУР102......94

Выводы........................................................................................................97

Список использованной литературы....................................................................99

Примечания..................................................................................................116

Список используемых сокращений

ГТААГ полиакриламидный гель

НК нуклеиновые кислоты

РНК рибонуклеиновая кислота

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

оц- одноцепочечная

дц- двухцепочечная

Ол1 олигонуклеотид 3' ТАСАААТТОАр

Ол2 олигонуклеотид 3' АСАААТТ<ЗАСр

ОлЗ олигонуклеотид З5 рТАСТТОААХЗА

Ол4 олигонуклеотид 3' рСТСТАТТАССТА66ТТ6Т

Ол5 олигонуклеотид 3' СТСТАТТАСр

Олб олигонуклеотид 3' рСТАОСТТСТ

М1 мишень олигонуклеотид 5 ' АТСТТТААСТОАТ(ЗААСТТСТ

М2 мишень смесь фрагментов одноцепочечной ДНК бактериофага М13ВМЯ4

МЗ мишень олигонуклеотид 5 'АСААССЗАСАТААТОвАТССААСАС

М4 мишень олигонуклеотид 5' СОАСАТААТСОАТСАААСА

М5 мишень олигонуклеотид 5' СОАСАОААТССАТСАААСА

Мб мишень олигонуклеотид 5* ССАСАОААТССАТССААСА

М7 мишень олигонуклеотид 5' бСАСАТААТСКдАТААААСА

М8 мишень олигонуклеотид 5» (ЗСЗАСАТААТСЗС сенсибилизатор пиренил-1 -метиламин

82 сенсибилизатор 5-фтор-7-метилбензо [Ь] антраценил-12-уксусной кислоты 2-аминоэтиламид

83 сенсибилизатор 3-периленилметиламин

Ш реагент и-азидотетрафторбензальгидразон-Ы-пропиониламина

112 реагент и-азидотетрафторбензамид

и линкер -КН-(СН2)з-№1-

Ь5 линкер -МН-(СН2)5-МН-.

Префикс "<Р при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклеотидных пар и мономерных звеньев дезокси- ряда для краткости написания опущен.

ВВЕДЕНИЕ

Создание методов направленного химического воздействия на нуклеиновые кислоты является важным направлением современной молекулярной биологии. Одним из перспективных подходов является использование адресованных реагентов на основе синтетических олигонуклеотидов (Belikova étal, 1967; Кнорре и др., 1977; Кнорре и др., 1991). Метод нашел широкое применение для решения большого круга задач как в системах in vitro, так и in vivo. К адресованным реагентам предъявляются различные требования в зависимости от объекта, на который воздействуют реагенты, и ожидаемых эффектов.

Для решения целого ряда молекулярно-биологических задач необходимы реагенты, направленные на определенные, но достаточно протяженные участки нуклеиновых кислот (100-300 н о ), так называемые ген-адресованные реагенты. С помощью такого подхода направленное на определенный ген воздействие может быть осуществлено даже в тех случаях, когда точное положение функционально важных участков в пределах гена неизвестно. Создание системы реагентов для эффективной модификации в пределах протяженного участка определенного гена является необходимым условием для разработки универсального метода определения наиболее функционально важных участков генов.

Адресованные реагенты успешно применяются в настоящее время для сайт-специфичной модификации одноцепочечных нуклеиновых кислот и двухспиральных ДНК по участкам, содержащим гомопурин - гомопиримидиновые последовательности. Однако, вопрос о возможности направленной модификации двухцепочечной ДНК по произвольно выбранному участку, не содержащему гомопурин-гомопиримидиновых последовательностей, остается открытым до настоящего времени. Поскольку в эукариотических клетках ДНК в основном находится в двухцепочечной форме, недоступной для действия классических олигонуклеотидных реагентов, разработка подходов для направленного воздействия на двухцепочечную ДНК является актуальной задачей.

Особый интерес представляют реагенты, обладающие повышенной селективностью модификации нуклеиновых кислот при физиологических условиях. Увеличение избирательности воздействия реагентов, исключение неспецифического воздействия на биополимеры, не являющихся мишенью, также является важной задачей при совершенствовании адресованных реагентов.

Целью данной работы является разработка новых подходов для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты, а именно:

а) разработка метода для направленной химической модификации протяженных участков определенных нуклеиновых кислот. Создание системы реакционно способных производных на основе олигонуклеотидов, получаемых генноинженерными методами;

б) разработка подхода для сайт-специфичной модификации двухцепочечной ДНК плазмид по произвольным участкам, не содержащим гомопурин-гомопиримидиновых последовательностей. Исследование влияния степени суперспирализации ДНК плазмид на доступность действию комплементарноадресованных реагентов;

в) создание системы олигонуклеотидных реагентов для адресованной фотомодификации нуклеиновых кислот, обладающих повышенной селективностью, путем использования принципа тандемных систем и группировок, обладающих свойствами бинарных реагентов.

1. Применение олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных для изучения и

регуляции экспрессии генов (обзор литературы)

В настоящее время олигонуклеотиды и их реакционноспособные производные широко используются как для изучения регуляции экспрессии генов, так и для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты в составе живых клеток с целью создания инструмента для изменения экспрессии определенных генов in vivo.

Применение немодифицированных и модифицированных олигонуклеотидов, комплементарных матричным РНК, для понижения уровня трансляции называют «антисенс»-стратегией. Изменение экспрессии генов на уровне транскрипции получило название «антиген»-стратегии (Helene, 1990).

1.1. «Антисенс»-стратегия: воздействие на мРНК с использованием антисмысловых ,

олигонуклеотидов и их производных

Применение антисмысловых олигонуклеотидов основано на их способности образовывать комплексы с доступными участками матричной РНК. Образование гетеродуплексов олигодезоксирибонуклеотид-РНК активирует РНКазу Н, которая гидролизует цепь РНК в составе таких гибридов (Cohen, 1989; Agrawal et al., 1990; Giles and Tidd, 1992).

Используя модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды, возможно активировать и другие РНКазы. В настоящее время активно разрабатывается стратегия использования антисмысловых олигонуклеотидов с ковалентно присоединенным 5'-монофосфорилированными 2'-5'-сшитьми-олигоаденилатами. Модифицированные таким образом антисмысловые олигонуклеотиды получили название «2-5А антисенсы». Как и 2'-5'-олигоаденилаты, «2-5 А антисенсы» способны активировать РНКазу L в клетках (Maitra et al., 1995; Xiao, 1996; Glasser, 1996; Cirino et al., 1997; Bhan et al., 1997; Xiao, 1997; Torrence et al., 1997; Kondo et al., 1998; Maran et al., 1998; Player et al., 1998).

Антисмысловые олигонуклеотиды и 2-5А антисенсы широко используются в разработке противовирусных препаратов.

Начало таким работам было положено в конце 70-х годов Замечником с соавторами (Zamecnik et al., 1978), показавшими, что обработка инфицированных клеток комплементарными олигонуклеотидами подавляет размножение вируса саркомы Рауса.

Пожалуй, наибольшее количество исследований с применением антисмысловых олигонуклеотидов направлено на разработку препаратов для терапии СПИДа в связи с

исключительной актуальностью создания средств лечения этого заболевания. Многочисленные эксперименты выявили способность различных антисмысловых олигонуклеотидов и их аналогов ингибировать размножение вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-I) в культуре клеток (Zamecnik et al., 1986; Matsukura et al., 1987; Goodchild et al., 1988; Agraval et al., 1988; Sarin et al., 1988; Agraval et al., 1989; Zamecnik and Agraval, 1991; Lisziewicz et al., 1992, Svinarchuk et al., 1993; Покровский и др., 1993; Lisziewicz et al., 1993).

В работе Бонора с соавторами (Bonora et al., 1998) было показано, что короткие антисмысловые олигонуклеотиды (12-меры) с присоединенным высокомолекулярным монометоксиполиэтиленгликолем линейной структуры защищают МТ-4 клетки от заражения ВИЧ в еще большей степени, чем немодифицированные олигонуклеотиды.

Получены данные о подавлении репликации респираторного синцитиального вируса (вируса RSP) в эпителиальных клетках трахеи человека с применением 2-5 А-олигонуклеотидных производных (Cirino et al., 1997).

В 1998 году появилось сообщение о создании первого противовирусного лекарственного препарата на основе антисмысловых олигонуклеотидов (Genetic Engineering News, 1998). Лекарственный препарат фомивирсен ("fomivirsen"), выпускаемый фирмой Isis Pharmaceuticals, успешно прошел клинические испытания Ш фазы. Олигонуклеотиды, входящие в состав фомивирсена, специфически взаимодействуют с мРНК генов раннего ответа цитомегаловируса человека, в результате чего происходит подавление репликации вируса (Marwick, 1998). Препарат был создан для лечения заболевания сетчатки глаза, вызываемого цитомегаловирусом, и успешно опробован на больных СПИДом (Perry and Balfour, 1999).

Фосфоротиоатные производные олигонуклеотидов, комплементарные РНК вируса герпеса (HSV - herpes simplex virus), входят в новый лекарственный препарат под названием ISIS 4015, который в настоящее время проходит испытания на токсичность (Flores-Agular et al., 1997).

Фосфоротиоатные олигонуклеотиды, комплементарные последовательности миниэкзона, который присутствует во всех мРНК внутриклеточного паразита лейшмании (Leishmania amazonensis), были успешно использованы для ингибирования трансляции мРНК и подавления размножения этого простейшего в клетках (Ramazeilles et al., 1994; Compagno et al., 1999).

В последнее время антисмысловые олигонуклеотиды все чаще предлагают использовать для противораковой терапии. Наиболее популярными мишенями в таких исследованиях

являются гены - ингибиторы апоптоза (Bloem and Lockhotst; 1999; Koty et al., 1999) и онкогены (Гринева и др., 1998).

Кэмпбел с соавторами предлагают использовать олигонуклеотиды, комплементарные мРНК, кодирующ