Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сиквенс-специфическая химическая модификация двуцепочечной ДНК алкалирующими производными олигонуклеотидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сиквенс-специфическая химическая модификация двуцепочечной ДНК алкалирующими производными олигонуклеотидов"

на правах рукописи

ДЕМЧЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

СИКВЕНС-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ

ДВУЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК АЛКИЛИРУЮЩИМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

03.00.04. - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 1998

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО PAII

Научные руководители: д.х.н., чл. корр. РАН Власов В.В.

к. х. н. Бросалина Е.Б.

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Колчанов H.A.

к.х.н. Левина A.C.

Ведущая организация: Институт Молекулярной Биологии

Государственного Научного Центра Вирусологии и Биотехнологии "Вектор" Российской Федерации

(ГНЦ ВБ "Вектор")

Защита состоится " 3 0 "/О^ЛО К-Д 1998 г. В / О _часов на заседании

диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск 90, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан " ,?- " (< Хл^-^Тло/ьД! 998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук

Федорова О.С.

Актуальность проблемы. Создание методов необратимой инактивации и регуляции экспрессии определенных генов является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Наиболее перспективным подходом к решению этой задачи является направленное воздействие на конкретные генетические программы с помощью олигонуклеотидов и их производных, способных избирательно взаимодействовать с характерными для этих программ нуклеотидными последовательностями, модулируя эффективность их функционирования. Перспективным представляется создание методов направленного воздействия на определенные участки генов, так как в этом случае, в отличие от методов, основанных на действии антисмысловых олигонуклеотидов, возможно необратимое изменение генетических программ и достижение долговременных эффектов. Прямым подходом к созданию препаратов, избирательно действующих на заданные нуклеотидные последовательности в составе определенных генов, является использование гомопуриновых и гомопиримидиновых олигонуклеотидов, способных образовывать комплексы с соответствующими участками двуцепочечной ДНК (дцДНК). Для направленной химической модификации дцДНК и, соответственно, для необратимой инактивации или модуляции экспрессии отдельных генов на уровне транскрипции могут быть использованы реакционноспособные производные гомопиримидиновых и гомопуриновых олигонуклеотидов. Одним из наиболее перспективных классов реакционноспособных производных олигонуклеотидов для модификации ДНК являются конъюгаты олигонуклеотидов с алкилирующими группировками. В связи с этим, актуальной задачей является конструирование производных олигонуклеотидов, способных с высокой степенью избирательности связываться с регуляторными либо кодирующими участками определенных генов и эффективно модифицировать их, вызывая подавление экспрессии нежелательных генов.

Цель работы. Целью настоящей работы являлось изучение специфичности и эффективности алкилирования дцДНК реакционноспособными производными пиримидиновых и пуриновых олигонуклеотидов, несущих алкилирующую группу на 5'-и 3'- концевых фосфатах; изучение закономерностей образования комплексов олигонуклеотидов с дцДНК в различных условиях; разработка методов повышения специфичности и эффективности модификации дцДНК-мишени реакционноспособными производными олигонуклеотидов.

Научная новизна работы. С помощью реакционноспособных производных пуриновых олигонуклеотидов впервые показано, что пуриновые олигонуклеотиды связываются с полипурин-полипиримидиновыми участками ДНК в ориентации антипараллельной по отношению к пуриновой цепи дуплекса. Показано, что бифункциональные реагенты, несущие реакционноспособные группы на 3'- и 5'-концах олигонуклеотида, могут эффективно алкилировать одновременно обе цепи ДНК, приводя к ковалентной сшивке двух цепей. Разработан метод количественной модификации дцДНК алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов, заключающийся в последовательных обработках ДНК реагентом в возрастающих концентрациях, без удаления предыдущей порции гидролизованного реагента. Доказано, что при низких рН в присутствии ионов магния пиримидиновые

олигонуклеотиды образуют с дцДНК два типа тройных комплексов причем алкилированис протекает с высокой эффективностью только в составе одного из них.

Практическая ценность работы. Исследованные в работе закономерности образования несовершенных триплсксов в различных условиях позволяют с высокой вероятностью выбирать участки генов для наиболее эффективного воздействия на их функционирование. Разработанный метод количественной модификации дцДНК-мишени позволяет существенно повысить эффективность воздействия на функционирование выбранного гена. Использование бифункциональных апкилирующих производных олигонуклеотидов для направленной модификации дцДНК позволяет вносить более глубокое повреждение в заданном участке гена -ковалентно связывать две цепи ДНК и ингибировать транскрипцию. Бифункциональные алкилирующие производные олигонуклеотидов могут быть использованы в качестве «химических рестриктаз» для геномного секвенирования.

Публикации и апробация работы. Результаты диссертации опубликованы в 4 печатных работах. Материалы работы докладывались на Международных симпозиумах "Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical appplication", Москва, 23-30 июня, 1991; "French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression", Новосибирск, 1-5 июля, 1995г.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста, он включает 27 рисунков, 2 таблицы, список цитируемой литературы из 193 наименований. Работа состоит из 3 глав, введения и выводов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В данной работе в качестве мишени для исследования эффективности и специфичности реакции алкилирования хлорэтильными производными олигонуклеотидов мы использовали дцДНК вектора р72-4, сконструированного на основе вируса бычьей папилломы. Плазмида может быть размножена в бактериальных клетках; будучи трансформированной в эукариотические клетки, она существует в виде мини хромосом, не встраиваясь в геном клетки. Такие линии клеток являются суперпродуцентами человеческого у-интерферона, легко детектируемого в культуралыюй среде иммуноферментными методами. Плазмида содержит полный геном вируса бычьей папилломы, последовательность pML2Dl, включающую район репликации pBR322, и функциональный ген /3-лактомазы. Далее расположен энхансер вируса мышиной саркомы Молони (MSVEN), происходящий из провирусного концевого повтора (LTR), затем металлотиониновый промотор мыши (MTPR0), полная кодирующая последовательность гена человеческого у-интерферона, включающая сигнальный пептид, ранний интрон SV40 и сайт полиадепилирования (SV40 (А)„).

Для исследований нами были выбраны три последовательности ДНК-мишени: I - в кодирующей области гена у-интерферона; II - в промоторе этого гена; III - в области сигнала сплайсинга. Все эти последовательности расположены во фрагменте плазмиды EcoRI-BamHI (Fl), который ранее не был детально охарактеризован. Поэтому нами был проведен рестриктный анализ этого фрагмента, результаты которого представлены на рисунке 1.

37 205 141 50 189 475 12

843

610

ЗаиЗА

280 J_I

920

Есо 130 [_

131544

63 73 154 491 СЙ" 131 |[||| I_

927344 556

н«ш 1_Л11_

428

НшП

Г6

гз

563

Г4

Г5

1332

1072

1162

640

126 313

Е2

"Г

590

24

Г7

917

915

109 83! 556

III

И

-) 2842

Есо Ш

Ват Н1

Рис. 1. Рестриктная карта фрагмента ЕсоШ-ВатН1 (Р1) плазмиды р72-4. I, II, III-места расположения ДНК-мишеней.

Ниже представлены нуклеотидные последовательности мишеней и олигонуклеотидов, использованных в этой части работы Реакционноспособные группы -11С1 и -Я С1 были присоединены по 5'-концевому фосфату олигонуклеотидов.

5' рСТТТСТССТСТСССТ 1

5' рССТТТСТССТСТСССТ 2

5 1 - ААТТ ССАААСАССАСАСТСЗАСАСАА-

3 ' -ТТААССТТТСТССТСТСАСТСТСТТ- Мншень I

3' ТТСТССТСССТТССТСр 3

3' СТТСТССТСССТТССТССр 4

51-СТАССТТСТССТСАСТТАСТСССТАСС-

3 ■ -САТССААСАССАСТСААТСАСССАТСС- Мишень II

5' 5' 3'

рТТТТТТСТТСТСТТТСС -CTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA--GAGGTTTTTTCTTCTCTTTCCAT-

Мишень III

/ \м-СНз

ch2ch2ci -rc1

—nhch2ch2ch2-

OS

CH2CH2CI

-r*c1

Видно что, мишень III состоит из полностью гомопурин-гомопиримидинового тракта 17 п.о., тогда как гомопурин-гомопиримидиновые тракты мишени I (16 п.о.) и мишени II ( 19 п.о.) содержат, соответственно, одно и два пиримидиновых основания в пуриновых цепях. Согласно работе (Griffin & Dervan, 1989), при наличии в пуриновой цепи дцДНК-мишени остатка тимидина, наименьшую дестабилизацию в образование тройного комплекса вносит находящийся в третьей цепи (в нашем случае олигонуклеотиде) гуанозин. Поэтому, для образования триплексов были выбраны следующие олигонуклеотиды: олигонуклеотид 5, направленный на мишень III -гомопиримидиновый, и олигонуклеотиды 1, 2, 3, 4 содержащие один или два гуанозиновых остатка в положениях, соответствующих тимидиновым остаткам в пуриновой цепи ДНК- мишени.

Модификация мишени I алкилирующими производными пиримидиновых

Была исследована реакция алкилирующих производных олигонуклеотидов I и 2 с фрагментом ¥2, содержащем мишень I. Реакцию алкилирования фрагмента Р2 производным олигонуклеотида 1 проводили в 50 мМ ЫаОАс, рН 5,4, содержащем 0.15 М и 1 мМ ЕОТА, в течение 20 часов при 22°. Концентрация ДНК - 4 10"9 М, концентрация реагента - 8.8 Ю"6 М. Такие условия являлись стандартными для данной работы. Показано, что продукты с более низкой электрофоретической подвижностью, соответствующие ДНК с присоединенным олигонуклеотидом, образуются только с цепью, меченной по сайту НшЛ, то есть реакция происходит только по пуриновой цепи мишени. Далее, для определения конкретного места алкилирования, продукты реакции обрабатывали пиперидином, что приводило к расщеплению ДНК по алкилированным основаниям и образованию более коротких меченых продуктов. Электрофоретический анализ продуктов реакции показал, что алкилирование происходит по 0287 (считая от меченного НМI сайта). При обработке фрагмента ¥2 реагентом 2-КС1 в концентрации 8.8 10"6 М степень модификации составила 12%. Такой низкий выход объясняется тем,

олигонуклеотидов 1 и 2.

что N7 гуанозииа преимущественно занят в образовании водородной связи с цитозином третьей цепи и защищен в составе трехцепочечной структуры олигонуклеотидной частью реагента. Алкилирование производным олигонуклеотида 1 (1-КС1), который короче олигонуклеотида 2 на одно основание, в результате чего 02?л ДНК-мишени не участвует в образовании триплекса, было более эффективным: степень модификации составила 41% при концентрации реагента 8.8 10"6 М. Еще более высокий выход модификации (65% при концентрации реагента 4410"6 М) достигался при использовании реагента 1-11 С!, в котором алкилирующая группа (остаток 4-(-3-амино) пропил (М-2-хлорэтил, М-метил) анилина) имеет большую конформационную подвижность.

Аналогичная эффективность алкилирования достигалась и при 37°. Присутствие 10 шМ 5 гпМ Со(МН3)6С13 и 5 шМ спермина не оказывало

воздействия на степень модификации. Более высокая эффективность модификации наблюдалась в присутствии 1 М №С1.

При изучении зависимости степени модификации мишени I (фрагмент Р2) реагентом 1-ЯС1 от рН обнаружено, что комплекс образуется при рН ниже 5.8. Для проверки специфичности взаимодействия производных олигонуклсотидов с более протяженными последовательностями ДНК, плазмида р72-4 была модифицирована реагентом 1-ЯС1 в 50 мМ №ОАс, рН 5,4, 0.15 М ЫаС1 и 1 мМ ЕБТА в течение 20 часов при 22°. Показано, что при проведении реакции в данных стандартных условиях имеется единственное место расщепления и, следовательно, единственное модифицированное основание внутри фрагмента П. Специфичность и эффективность алкилирования мишени I реагентом 1-ЯС1 в составе плазмиды соответствует тем, которые наблюдались при модификации изолированного фрагмента Р2. Таким образом, в данных условиях мы наблюдали высокоспецифичную реакцию модификации мишени I, причем эффективность реакции алкилирования зависела от расположения реакционноспособного центра мишени относительно алкилирующей группы производного олигонуклеотида, а также от длины линкерной структуры, связывающей олигонуклеотид и реакционноспособную группу.

Модификация мишеней II и III алкилнрующими производными пиримндиновых

олнгонуклеотндов 3, 4, 5.

Далее нами были предприняты попытки модифицировать мишень II (фрагмент Р5) реагентами 3-ЯС1 и 4-И.С1 и мишень III (фрагмент Р7) реагентом 5-11С1. При использовании стандартных условий (50 мМ ЫаОАс, рН 5,4, 0.15 М №С1 и 1 мМ ЕБТА, 20 часов, 22°) модификации не наблюдалось ни в одной из этих систем. В случае мишени III отсутствие модификации объяснятся тем, что реакция, как это уже упоминалось, идет по гуанозинам, находящимся только в пуриновой цепи мишени. В данном случае гуанозины содержит пиримидиновая цепь и, видимо, реакционноспособный центр оказывается вне досягаемости алкилирующей группы. В мишени II гуанозины, по которым предположительно должна идти реакция, находятся в пуриновой цепи мишени, но мишень II содержит в пуриновой цепи два тимидина, и в соответствующие позиции олигонуклеотидов нами были введены гуанозины. В случае мишени I, имеющей в пуриновой цепи один тимидин, и олигонуклеотидов 1 и 2, содержащих по одному гуанозину, мы наблюдали достаточно прочное связывание.

Направленные на мишень II олигонуклеотиды 3 и 4 содержат по два гуанозина, что, по-видимому, приводит к значительному уменьшению прочности комплексов олигонуклеотидов с мишенью. Этот вывод был подтвержден в экспериментах но гибридизации олигонуклеотидов с дцДНК. Для гибридизации использовали плазмиду рТ21811-Р1, содержащую фрагмент Р1 (2842 п.о.), включающий в себя мишени I, II, III, и контрольную плазмиду рТ218Я. Показано, что олигонуклеотиды 1 и 5 образуют комплекс с плазмидой pTZ18R-Fl и не взаимодействуют с контрольной плазмидой рТ21811. В случае олигонуклеотида 3 не наблюдается связывания ни с контрольной плазмидой, ни с плазмидой рТ218Я-Р1, содержащей мишень II. Следовательно, подтверждается предположение о том, что в случае мишени II отсутствие модификации обусловлено тем, что в данных условиях олигонуклеотид 3 практически не образует комплекса с ДНК-мишеныо.

Таким образом, было подтверждено, что реакция модификации идет только по гуанозинам, находящимся в пуриновой цепи мишени; присутствие двух неканонических АТ в триад в составе 16-звенного триплекса является критическим для образования комплекса.

Модификация дцДНК производными пуриновых олигонуклеотидов.

Метод химической модификации мишени с помощью коныогата триплексобразующего олигонуклеотида с реакционноспособной группой предполагает получение однозначной информации об ориентации связывания олигонуклеотидов в тройной комплекс. В работе были использованы алкилирующие производные нескольких олигонуклеотидов, несущие на 5'-конце остатки 4-(-3-амино) пропил (N-2-хлорэтил, М-метил) анилина (К С1). Анализ картины модификации различных участков ДНК-мишени реакционноспособными производными пуриновых олигонуклеотидов показал, что связывание происходит антипараллельно пуриновой цепи дцДНК. Продемонстрировано, что пуриновые олигонуклеотиды образуют тройные комплексы как при кислых, так и при нейтральных рН только в присутствии поливалентных катионов Mg2+, 2п2+, Со3+ (использовались 10 мМ MgCl2, 10 мМ 2п804, 5 мМ Со(Ъ1Н3)6С13). Степень модификации варьирует от 5 до 20% в зависимости от длины олигонуклеотида и рН. Для модификации мишени IV использовались производные длинного (14- звенного) и короткого (7- звенного) олигонуклеотидов.

5 ' -АСТСТСТССТСТТСТССТАССТ- Мишень IV 3' -ТСаАСА(яАССАСАА(эАССАТССА-

К*С1рАСАССАСААСАССА 31 6

Я*С1рАСАССАС 3 ' 7

(РЬп)рААСАССА 3' 8

В случае 14-звенного олигонуклеотида 6 модификация протекает специфично по заданному основанию. Использование 7-звенного алкилирующего олигонуклеотидного производного 7-К С1 приводит к снижению степени модификации в области полной комплементарное™ олигонуклеотида и появлению сайта

модификации пне мишени, в области частичной комплементарности, причем уровень неспецифической модификации выше, чем в районе мишени. По-видимому, меньшая стабильность несовершенного комплекса компенсируется в данном случае более удачным расположением реакционноспособного центра в молекуле ДНК. Использование коротких олигонуклеотидов-эффекторов 8 и 8-Phn, несущего на 5'-концевом фосфате интеркалирующую группу (остаток Ы-(2-гидроксиэтил) феназиния), -не приводит к увеличению степени модификации.

Таким образом, было показано, что связывание пуриновых одноцепочечных участков ДНК в тройной комплекс с дцДНК (с образованием триплетов АА*Т и GG*C) осуществляется в антипараллельной ориентации по отношению к пуриновой цепи дуплекса.

Разработка метода количественной модификации дцДНК алкилирующим производным пирнмидинового олигонуклеотида 1.

Для достижения эффективного подавления процесса транскрипции нежелательного гена в биологических исследованиях часто бывает важным количественно модифицировать дцДНК. Мы разработали оригинальную и простую экспериментальную процедуру для эффективной модификации гуанозинов, находящихся в гомопуриновой цепи дцДНК рядом с местом связывания реагента. Повысить степень модификации можно с помощью повторных обработок ДНК реагентом, при этом каждый раз удаляя избыток гидролизованного реагента, чтобы избежать конкуренции за места связывания. Нами было показано, что ни степень модификации, ни специфичность реакции не зависят от концентрации реагента в интервале 0.5 10'6 М - 50 10~6 М, в котором неспецифичность реакции пренебрежимо мала. Поэтому мы использовали ступенчатое повышение концентрации реагента с промежуточными периодами инкубации реакционной смеси без поэтапного выделения ДНК и удаления гидролизованного производного олигонуклеотида. Фрагмент F2 обрабатывали 1.210"6 М 1-RCI, инкубировали в стандартных условиях, затем добавляли свежий реагент до концентрации 8.8 10 "6 М и повторно инкубировали. На следующем этапе концентрацию реагента повышали до 55 10"бМ. В результате степень алкилирования G2g7 в составе мишени I превышала 90%.

Таким образом, был разработан метод количественной модификации дцДНК в тройном комплексе in vitro 5'-алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов, заключающийся в последовательных обработках ДНК реагентом в возрастающих концентрациях без удаления предыдущей порции гидролизованного реагента.

Модификация дцДНК в составе несовершенных тройных комплексов.

Для контроля специфичности взаимодействия производного олигонуклеотида 1 в экспериментах по модификации фрагмента F2 (мишень I) использовались некоторые другие участки полного фрагмента F1 (EcoRI-BamHI). При этом мы обнаружили, что контрольный фрагмент F6 ( Hinfl- Haelll ) имеет два сайта модификации, степень модификации составляла менее 5%. Нуклеотидная последовательность фрагмента F6 была неизвестна, поэтому нами было проведено его

секвенирование с помощью метода Максама-Гилберта. В нуклеотидной последовательности F6 были найдены частично комплементарные олигонуклеотиду 2 участки, по которым, вероятно, может происходить связывание реагента. Можно предположить, что алкилированис фрагмента F6 происходит из несовершенных комплексов. При проведении реакции при рН ниже 5.0 появляются дополнительные места модификации в F6 (стандартными "кислыми" условиями являлись: 50 мМ NaOAc, рН 4,4 содержащий 0.15 М NaCl и 1 мМ EDTA или 10 мМ MgCl2, 20 ч., 22°.). Реагент 2-RC1 алкилирует гуанозины G[82 CjG|S5 G189 фрагмента F6. Рядом с алкилированными гуанозинами находятся частично перекрывающиеся последовательности AGAGGAGAA и AGAGGA, способные образовывать короткие комплексы с одной либо двумя молекулами реагента. Связывание одной молекулы реагента может приводить к алкилированию G18j, G]84 и Gi85 , причем Gi82 наиболее доступен для модификации. Реакция по G189 может происходить при связывании второй молекулы реагента. Степень модификации значительно повышается в присутствии MgCl2.

Были проведены эксперименты по модификации реагентом 2-RC1 более длинных последовательностей ДНК, включающих в себя фрагмент F6: меченых по EcoRl сайту фрагментов Fl, F3 и полной плазмиды р72-4. Данные показали, что при проведении реакции в кислой среде (рН 4.4) модификация во всех фрагментах проходит по одному и тому же участку ДНК, расположенному во фрагменте F6.

Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что при кислых рН, в присутствии ионов поливалентных металлов наряду с протяженными совершенными комплексами, триплексы образуются даже со сравнительно короткими Ри-Ру последовательностями.

Модификация дцДНК [32Р]-меченым алкилмрующим производным олигонуклеотида 2.

В описанных выше экспериментах реакцию модификации детектировали, используя меченую дцДНК. Основания, по которым произошла реакция, определяли с помощью расщепления ДНК пиперидином. Этот метод является несомненно удобным для определения конкретного модифицированного основания и сравнения степени модификации различных участков ДНК при варьируемых условиях. Однако при необходимости анализа модификации длинных фрагментов ДНК или целой плазмиды этот метод становится трудоемким. Для того, чтобы наблюдать общую картину модификации на протяженном участке ДНК мы применили другой подход, основанный на использовании [32Р]-меченого реагента.

В качестве объекта исследований использовали плазмиду pTZ18R-Fl, содержащую последователыюсти-мишени I-III и удачно расположенные для рестриктного анализа сайты рестрикции. Плазмиду инкубировали с [32Р]-меченым 2-RC1 в 50 мМ NaOAc, рН 5,4, содержащем 0.15 М NaCl и 10 мМ MgCl2, в течение 20 ч. при 22°. Затем плазмиду расщепляли эндонуклеазами рестрикции и определяли количество радиоактивной метки, связанной с различными фрагментами ДНК, что позволило определить эффективность модификации различных участков плазмиды. В ходе выделения плазмиды после обработки ДНК фенолом и электрофореза была обнаружена частичная потеря метки, что объясняется, очевидно, апуринизацией алкилированных оснований. Вследствие этого, данные по мечению отдельных

фрагментов не могли быть оценены количественно. Было показано, что при расщеплении фрагмента Б1 эндонуклеазой ЗаиЗА метка содержалась во фрагментах соответствующих 843, 610, 475 и 205 п. о. Фрагмент 843 п.о. включает в себя фрагмент Б2, содержащий мишень I, модифицируемую реагентом 2-КС1. Фрагмент 475 п.о. содержит фрагмент Г4 с участками, частично комплементарными реагенту 2-КС1. Принимая во внимание результаты экспериментов с фрагментом Р6, в случае которого наблюдалась модификация в составе достаточно коротких комплексов, мы проанализировали нуклеотидные последовательности фрагментов 610 п.о., 205 п.о. и 154 п.о. и обнаружили участки, которые могут образовывать тройные комплексы с реагентом. Ниже приведены последовательности, в которых подчеркнуты нуклеотиды, предположительно входящие в состав комплексов.

3 ' -САС^АСААС*;- 3 ' -СА(^ТТСАТСАСЮАС-

3'-САААСАСААСААА- 3'-ААвСАСА- 3'-ССАСАА-

Таким образом, продемонстрирована возможность взаимодействия олигонуклеотидов с достаточно короткими пурин-пиримидиновыми последовательностями при низких рН. Следовательно, для достижения высокой специфичности воздействия модификацию дцДНК олигонуклеотидными производными необходимо проводить при рН, максимально приближенных к физиологическим.

Модификация дцДНК алкилирующимн производными олигонуклеотидов, несущими реакционноспособные группы на З'-концевом фосфате, либо на 5'- и 3'-концевых фосфатах одновременно.

В данной части работы для модификации дцДНК использовались алкилирующие производные пиримидинового олигонуклеотида 1, несущие остатки 4-(3-амино) пропил (М-2-хлорэтил, М-метил) анилина на З'-концевом фосфате или на 5'- и 3'- концевых фосфатах одновременно. Фрагмент Б 2 (400 п. о.) является частью фрагмента Б2 (522 п. о.), представленного на рисунке 1. Реакцию алкилирования фрагмента Б 2 проводили в 50 мМ №ОАс рН 5.4, 0.15 М №С1, 1 мМ ЕЭТА , либо в 50 мМ №0Ас рН 4.0, 0.15 М ЫаС1 в присутствии 10 мМ К^С12 при 22° в течение 20 часов.

На рисунке 2 приведена картина электрофоретического разделения продуктов модификации фрагмента Б 2 реагентом Я С1-1-11 С1.

Из рисунка видно, что реакция проходит по остаткам гуанозинов в обеих цепях ДНК (дор. 2 и 10). 5'-концевая алкилирующая группа модифицирует 028? в пуриновой цепи ДНК, находящийся рядом с местом связывания олигонуклеотида. 3'-концевая алкилирующая группа модифицирует ближайший к 3'- концу олигонуклеотида 01]8 в пиримидиновой цепи ДНК и 02б9 в пуриновой цепи, расположенный через два основания от места связывания.

Специфичность реакции и степень модификации 3'-, 5'-бифункционалы1ым алкилирующим производным олигонуклеотида 1 полностью соответствуют специфичности и степени модификации, которые мы наблюдали при модификации ДНК соответствующими монофункциональными производными Я С1-1 и 1-Я С1. Следовательно, можно предположить, что реакционноспособные группы на 3'- и 5'-концах олигонуклеотида реагируют с дцДНК независимо друг от друга. Степень модификации дцДНК для каждой из алкилирующих групп составила примерно 50%.

1234567891011

Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов модификации фрагмента К 2 реагентом 11*С1-1-11*С1. Электрофорез в 6% денатурирующем ПААГ.

Дор. 1-7 - фрагмент Р*2 мечен но НтЯ сайту. Дор. 8-11 фрагмент Р 2 мечен по Муа1 сайту. 1 -контрольный интактный фрагмент И 2; 2 и 10 -фрагмент Р 2, модифицированный реагентом 11*С1-1-11*С1 при рН 5.4; 3 и 9 - фрагмент Р*2, модифицированный реагентом Я С1-1-11 С1 при рН 4.0;. 4-7 - специфическое расщепление по основаниям в, А+О, С+Т и С соответственно; 8 - специфическое расщепление по основаниям в; 11 - контрольный интактный фрагмент Р*2.

Справа и слева расположены маркеры длины ДНК, приведены участки последовательностей меченых цепей ДНК. Звездочками обозначены основания, подвергающиеся алкилированию.

Далее нами было показано, что направленность алкилирования можно варьировать, используя короткие олигонуклеотиды. Например, рядом с участком связывания олигонуклеотида 1 находится последовательность

5' -СА(ЗАААААТАА-31 -СГСТТТТТАТТ-

В том случае, когда при проведении модификации дцДНК 3'-, 5'-бифункциональным алкилирующим производным ЯСМ-Я С1 в реакционную смесь был добавлен олигонуклеотид рТСТТТТТСГТ (210"5 М), образующий тройной

комплекс с указанной последовательностью ДНК, 02б9 защищался от алкилирования, а бифункциональный реагент модифицировал только С287 и 0118, расположенные в разных цепях ДНК.

Из рисунка 2 также следует, что высокая степень специфичности реакции достигалась только в том случае, когда модификация проводилась при рН 5.4 (дор. 2 и 10). При проведении реакции при рН 4.0 в присутствии 10 мМ М§С12 в составе фрагмента ДНК Р°2 (НМ I - М\'а I) обнаруживаются еще несколько мест связывания реагента К*С1-1-И*С1. Исходя из данных по алкилированию 3'- и 3'-, 5'- производными олигонуклеотида 1, эти участки были локализованы для обеих цепей фрагмента ДНК. Приведены последовательности и точки модификации двух дополнительных участков связывания реагента II С1-1:

5 1 -ССААААСАСТ(ЗТС-БАСАССАТСААСС- 5 '-САААААСАААССАСАТСАСТТСС -

3 ' -ССТТТТСТСАСАС-СТСТССТАСГТСС- 3 1 -ОТТТТТСТТ^СТСТАСТСААОС -

ТТТСТС С С СТр ТТ ' 5'СТТТ СТСТ I '

5'С СТ Т С 1**01 С С СССТрК*С1

т

Как правило, такие участки содержат по две структуры длиной 4-6 пар нуклеотидов, комплементарные участкам олигонуклеотида. Предположительно, связывание олигонуклеотида может происходить с выпетливанием нескольких оснований олигонуклеотида (или участков двойной спирали ДНК), либо происходит связывание двух молекул реагента с одним участком ДНК-мишени. Для стабилизации этих структур обязательны высокая степень протонирования цитидинов и присутствие ионов

Таким образом, было показано, что алкилирующая группа, присоединенная к З'-концевому фосфату триплексобразующего олигонуклеотида, реагирует с гуанозинами, находящимися в обеих цепях дцДНК, в то время как 5'-концевая алкилирующая группа реагирует только с гуанозинами пуриновой цепи. Показано, что бифункциональные реагенты, несущие реакционноспособные группы на 3'- и 5'-концах олигонуклеотида, могут алкилировать обе цепи одновременно.

Определение структуры несовершенных комплексов.

Для детального установления структуры комплексов, образующихся с короткими участками ДНК-мишени, были синтезированы олигонуклеотиды 9-12, содержащие различные фрагменты олигонуклеотида 1, и соответствующие 3'-алкилирующие производные этих олигонуклеотидов.

5'- СТТТСТССТСТСССТрН*С1 1

51 - ТТТТСТССТСТТАТСрЯ*С1 9

5'- СТТТСТТТТССТСТСЕСТРК'С1 10

5'- ТТТТСТСТСТСТАТСрК*С1 11

5'- ТСССТСССТСТТАТСрИ'С! 12

Образование тройных комплексов детектировалось с помощью реакции дцДНК с диметилсульфатом в присутствии и в отсутствие олигонуклеотидов 1, 9-12 в условиях образования несовершенных триплексов (50 мМ №ОАс, рН 4,0, содержащий

0.15 М ЫаС1 и 10 мМ М§С12). Показано, что олигонуклсотиды образуют тройные комплексы с соответствующими полипурин-полипиримидиновыми

последовательностями дцДНК, при этом защита N7 положений определенных гуанозинов от алкилирования позволяет выявить основания в составе участков ДНК (А, Б, В), участвующие в образовании триплексов с олигонуклеотидами 1, 9-12. Данные для олигонуклеотида 1 приведены на рисунке 3.

400

•<*■

237

210

210

123

Рис. 3. Электрофоретическое разделение продуктов алкилирования ОМБ фрагмента Р 2, меченного по НМI сайту. Электрофорез в 6% денатурирующем ПААГ. (а) и (б) -верхняя и нижняя части геля. 1- специфическое расщепление фрагмента Р*2 по основаниям А+в; 2 и 4 - фрагмент Р 2, алкилированный БМЭ; 3 - фрагмент Р 2, алкилированный ОМ5 в присутствии олигонуклеотида 1. Концентрация олигонуклеотида 10"5М. Структуры тройных комплексов олигонуклеотида 1 и участков А, Б и В ДНК-мишени приведены справа. (+) - отмечены гуанозины, защищенные в тройном комплексе от модификации БМ8.

Видно, что гуанозииы, расположенные с обеих сторон от основания Т в пуриновой цепи (участок А), не защищены олигонуклеотидом 1 от алкилирования диметилсульфатом. Таким образом, введение остатка гуанозина в З'-область пиримидинового олигонуклеотида напротив тимидина в пуриновой цепи ДНК не приводит к образованию структуры, вносящей положительного вклад в образование тройного комплекса. Заслуживает внимания тот факт, что гуанозин, находящийся в пуриновой цепи рядом с 3'- концевой областью полностью (без выпетливаний) связанного олигонуклеотида, проявляет значительное повышение реакционной способности в реакции с DMS (примерно десятикратное по сравнению с гуанозинами в свободной дцДНК). Подобное увеличение реакционноспособности нуклеотидов в составе дцДНК при связывании с пиримидиновыми олигонуклеотидами наблюдалось и ранее в реакции с медь-фенантролином (Francois at al, 1988). Повышение реакционной способности в обоих случаях, по-видимому, является отражением структурных изменений в районе одной-двух нуклеотидных пар на границе между дуплексом и дцДНК в составе тройного комплекса. Эксперименты с З'-алкилирующими производными R*C1-1, R*Cl-9, R*C1-10, R*C1-11 и R*C1-12 представлены па рисунке 4.

Рис. 4. Электрофоретическое разделение продуктов модификации меченого по Муа I сайту фрагмента Р 2 алкилирующими производными олигонуклеотидов 1 и 9-12. Электрофорез в 6% денатурирующем ПААГ. Реакцию проводили в 50 мМ N30Ас рН 4.0, 0.15 М №С1 в присутствии 10 мМ при 20° в течение

20 часов. Концентрация реагентов и олигонуклеотидов 5 10"6 М.

I - контрольный интактный фрагмент Р 2; 2, 3, 4, 7 и

9 - фрагмент Р 2, модифицированный реагентами R*Cl-l, R*Cl-9, R*Cl-10, ^*С1-11 и R*Cl-12 соответственно; 8 - фрагмент Р 2, модифицированный реагентом R С1-11 в присутствии олигонуклеотида 12;

10 - фрагмент Р*2, модифицированный реагентом Я*С1-12 в присутствии олигонуклеотида 11; 13 -фрагмент Р 2, модифицированный реагентами R С1-

II и R*Cl-12, 5 и 11 - специфическое расщепление по основаниям в; 6 и 12 - специфическое расщепление по основаниям А+в.

А - область полной комплементарное™ для реагента 1-Я*С1;

Б, В - области неполной комплементарное™ для реагента 1-Я С1.

1 2 34 5 б 7 8 9 10 11 12 13

Все пять реагентов с равной эффективностью алкилируют ^118 в пиримидиновой цепи Б 2, находящийся вблизи места полной комплементарное™ олигонуклеотида 1. Видно, что олигонуклеотид 11 полностью ингибирует реакцию модификации мишени А алкилирующим производным 12-Я С1, что свидетельствует о более высокой константе связывания олигонуклеотида 11.

Также из рисунка видно, что для протекания реакции модификации в присутствии ионов (рис.4, дор.9) достаточным является даже слабое

взаимодействие, при котором только пять оснований олигонуклеотида 12 могут находиться в комплексе с ДНК-мишенью. Такой комплекс в данных экспериментальных условиях не регистрируется с помощью реакции ДНК с ОМ8.

Ниже суммированы данные, свидетельствующие об образовании комплексов олигонуклеотидов 1, 9-12 с участком ДНК А (место полной комплементарное™ олигонуклеотида 1). Отмечены алкилированные основания (Т)и основания, защищенные соответствующими олигонуклеотидами от модификации диметилсульфатом (+).

4+ + ++ + 5' -ТТССАААСАС<ЗАОАСТ13АСАС-3' -ААССТТТСТССТСТСАСТСГС-

5' Е*С1рСТТТСТССТСТ |

СССТрК*С1

+ ++ +

5 " -ТТССзАААСАССзАСАСТСАСАС-3'-ААССТТТСТССТСТСАСТСГС-

ТТТСТССТСТ I 5' Т ТАТСрК*С1

10

+ + ++ +

5 • -ТТв(лАААО-АС(ЗАСдАОТСАСАС-3' -ААССТТТС-ТССТСТСАСТСТС-

5' СТТТС ТССТСТ I

Т Т СССТрК*С1

т

11 + + + +

5 1 -ТТССААА(ЗАС-ОАСАСТСАСАС-3' -ААССТТТСТС-СТСТСАСТСТС-

ТТТСТС СТСТ Т 5' Т Т АТСрИ*С1

12

51 -ТТССАААСАССАСАСТСАСАС-3' -ААССТТТСТССТСТСАСТСТС-

51 ССТСТ т

5' ТСССТС ТАТСрК*С1

Таким образом, при образовании частично комплементарных тройных комплексов в присутствии ионов магния при кислых рН прослеживаются следующие закономерности: а) допустимо выпетливание нескольких оснований олигонуклеотида; б) гуанозин в пиримидиновом олигонуклеотиде, введенный напротив тимидина в пуриновой цепи ДНК, не участвует в образовании тройного комплекса; в) модификация достаточно эффективно протекает даже в составе слабых комплексов, не регистрируемых в данных условиях с помощью химического футпринтинга.

Аналогичным образом был проведен анализ взаимодействия производных олигонуклеотидов Я'СМ, К*С1-9, Я'СЫО, Я*С1-11 и 11*01-12 с участками Б и В ДНК-мишени. В результате анализа этих данных выявлено несколько дополнительных закономерностей образования несовершенных тройных комплексов: а) допустимо наличие в пуриновой цепи ДНК одиночных остатков Т или С, олигонуклеотид в этом месте должен содержать несколько выпетливающихся оснований, предпочтительно тимидин; б) реакция модификации дцДНК проходит с большей эффективностью в составе структур, в которых 5'-концевая область олигонуклеотида образует совершенный комплекс с ДНК-мишеныо, в то время как З'-концевая область с алкилирующей группой вследствие неполной комплементарное™ имеет большую конформационную свободу; в) конформациониые изменения в дцДНК, вызываемые образованием тройного комплекса с 5'-концом олигонуклеотидов, могут облегчать связывание единичных цитидинов на З'-конце олигонуклеотидов с соответствующими вС парами ДНК, несмотря на присутствие некомплементарных участков, состоящих обычно из одной пары оснований дуплекса; г) выпетливания ДНК из комплекса не происходит; д) не происходит связывания двух молекул олигонуклеотида в одном полипурин-полипиримидиновом участке ДНК.

Модификация дцДНК в составе тройного комплекса алкилирующими производными длинного (15-мера) и короткого (6-мера) пиримидиновых

олигонуклеотидов.

В данной части работы для модификации V*! фрагмента дцДНК (400 п.о.) использовались алкилирующие производные длинного пиримидипового олигонуклеотида (15-мер) и короткого олигонуклеотида (6-мер), представляющего собой 5'-концевой участок 15-мера, несущие 2-хлорэтильную группу на 5' концевом фосфате. Использовался также олигонуклеотид- эффектор, несущий на 5' концевом фосфате феназиниевую группу.

*287

5' -ААТТССАААСАССАСАСТСАСАОААААА -3'-ТТААССТТТСТССТСТСАСТСТСТТТТТ -

5' рСТТТСТССТСТСССТ -15-мер

5' рСТТТСТ -6-мер

5' рССТСТС эффектор

Алкилирование проводили в 50 мМ ШОАс, 0.15 М №С1, рН 5.4 (условия 1), либо в 50 мМ ШОАс, 0.15 М №01, 10 мМ рН 4.0 (условия II).

На рисунке 5 представлены результаты электрофоретического разделения продуктов модификации (после расщепления пиперидином) фрагмента ДНК Р 2 алкилирующими производными 15-мера и 6-мера.

Видно, что при инкубации Р 2 в условиях I степень модификации производными 15-мера (реагент 1) составляла 60% при концентрации олигонуклеотидов 2 10"5 М, тогда как степень модификации производным 6-мера

(реагент 2) была незначительной (рис. 5, дор. 2, 3). Добавление олигонуклеотида-эффектора в реакционную смесь, содержащую реагент 2, приводит к усилению модификации. В случае, если олигонуклеотид-эффектор несет феназиниевую группу на 5' концевом фосфате, его присутствие не ведет к усилению модификации реагентом 2 (рис. 5, дор.4, 5).

1 2 345 6 7891011 12

Т Т

0*287 О А А А й А в а

А в А О Т в А С А

Рис. 5. Электрофоретическое модификации фрагмента Р 2 алкилирующими

производными пиримидиновых

олигонуклеотидов (15-мер и 6-мер).

Электрофорез в 6 % денатурирующем ПААГ. 1-5 реакцию проводили в 50 мМ №0Ас, рН 5.4, содержащем 0.15 М ЫаС1. 7-12 реакцию проводили в 50 мМ №ОАс, рН 4.0, содержащем 0.15 М №С1 и 10 мМ Концентрация олигонуклеотидов и реагентов

2 10"5 М.

2 и 7 - фрагмент Р 2, алкилированный Я С1-15-мером, 3 и 8 - фрагмент Р*2,

алкилированный Я С1-6-мером, 4 и 9 -

фрагмент Р 2, алкилированный Я С1-6-мером в присутствии олигонуклеотида-эффектора, 5 и 10 - фрагмент Р*2, алкилированный 11*С1-6-мером в присутствии олигонуклеотида-эффектора, несущего феназиниевую группу,

6 - А+в специфическое расщепление Р 2, 11-фрагмент Р 2, алкилированный 11*С1-6-мером в концентрации 510"5М, 1 и 12 - контрольный интактный Р 2. Звездочкой отмечено алкилированное основание 028?-

По-видимому, наличие РЬп-группы в эффекторе приводит к нарушению кооперативного эффекта при связывании олигонуклеотидов; возможно, интеркаляция РЬп-остатка в дцДНК приводит к излому ДНК-мишени в точке контакта олигонуклеотидов. В условиях II картина модификации Р 2 существенно меняется: степень модификации реагентом 2 достигает 100 % (дор. 8), тогда как степень модификации реагентом 1 меняется незначительно. Наличие олигонуклеотида эффектора в реакционной смеси, наоборот, приводит к уменьшению степени модификации производным короткого олигонуклеотида, наличие феназиниевой группы в составе эффектора приводит к отмене этого эффекта (дор. 9,

10). Повышение концентрации реагента 2 до 5 10"5 М вызывает появление дополнительной точки модификации за счет образования несовершенного комплекса вблизи с основным местом связывания (дор. 11).

Таким образом, в условиях I степень алкилирования дцДНК-мишени коррелирует с длиной олигонуклеотида, то есть со стабильностью триплекса. В условиях II степень алкилирования ДНК-мишени обратно пропорциональна стабильности комплекса.

Оценка скорости образования комплекса 15-мера с ДНК-мишеныо в различных условиях с помощью гель-электрофореза в неденатурирующнх условиях.

Скорость образования комплекса 15-мера с ДНК-мишеныо (концентрация олигонуклеотида 10"5 М) была оценена с помощью гель-электрофореза в неденатурирующнх условиях. Результаты электрофоретического разделения продуктов комплексообразования в зависимости от времени инкубации показали, что после инкубации 15-мера с ДНК-мишеныо в течение 30 минут при 20° в условиях I 15-мер количественно связывается с ДНК (для электрофореза использовали 50 мМ трис-ацетатный буфер, рН 5.5, содержащий 10 мМ Mg(OAc)2). Электрофоретический анализ продуктов, образующихся в условиях II, в геле, содержащем буферную систему, максимально приближенную к условиям II (50 мМ трис-ацетат, рН 4.0, 10 мМ Mg(OAc)2), показывает, что комплексообразование в этих условиях протекает гораздо быстрее: после 30 секунд инкубации F 2 с 15-мером фрагмент ДНК количественно связывается в комплекс F 2 15-мер. Анализ продуктов, образующихся в условиях II, в геле, содержащем 50 мМ трис-ацетат, рН 5,5, 10 мМ Mg(OAc)2, показывает, что после инкубации в течение 30 секунд примерно 50% ДНК связывается в комплекс F 2 15-мер, соотношение F*2:F2 15-мер остается неизменным после инкубации в течение 2 часов. Комплекс F 2 6-мер таким методом не детектируется.

На основании этих данных был сделан вывод о том, что в условиях II быстро образуются два типа комплексов, один из которых стабилен при рН 5.5 в присутствии ионов магния, другой - нет, и оба типа комплексов стабильны в условиях II. При инкубации F-2 с 15-мером в условиях I образуется только один тип триплекса, стабильный при рН 5.5 в присутствии ионов магния.

Изучение эффективности модификации ДНК-мишени алкнлирующим производным 15-мера в составе двух типов комплексов.

Была изучена эффективность модификации ДНК-мишени алкилирующими производными 15-мера в составе каждого из двух типов комплексов, образующихся в условиях II. Для этого комплексы были предформированы инкубацией в условиях II в течение 5 минут. Затем, для создания условий, в которых оставался стабильным только один из комплексов (сходных с теми, что были использованы при гель-электрофорезе в неденатурирующнх условиях), реакционная смесь была разбавлена в 100 раз 50 мМ ЫаОАс, рН 5.5, 10 мМ МеС12 до концентрации олигонуклеотида 10"8 М. В качестве контроля использовалась проба без стадии предформирования комплексов в условиях

II: концентрация алкилирующего производного 15-мера 10~8 М. Опытные и контрольный образцы инкубировали в течение 20 часов при 20°. Показано, что в контрольном образце модификации почти не наблюдается, тогда как степень модификации в образце, разбавленном 50 мМ ШОАс, рН 5.5, 10 мМ Г^С12 такая же как и в образце, проинкубированном в условиях II без разбавления (концентрация алкилирующего производного 15-мера 10"6 М). Отсюда следует, что степень модификации в условиях II обеспечивается модификацией, протекающей в составе триплекса, стабильного при рН 5.5 в присутствии ионов магния. Образование второго типа триплекса не вносит вклада в модификацию ДНК-мишени. То есть, в условиях II мы имеем ситуацию, когда в растворе примерно в одинаковом количестве существуют два типа триплексов, стабильных в условиях модификации (20 часов, 20°), при этом в составе одного из них модификация протекает практически количественно, в составе другого не происходит вообще. На основании этих данных можно предположить, что в случае алкилирующего производного 6-мера именно высокая скорость обмена олигонуклеотида между двумя типами комплексов обеспечивает количественную модификацию в условиях II.

Таким образом, показано, что при рН 4.0 (условия II) модификация идет в составе только одного типа комплекса - остающегося стабильным при повышении рН.

Изучение зависимости степени модификации ДНК-мишени производными 6-мера и 15-мера от рН в различных солевых условиях.

Была изучена зависимость степени модификации ДНК-мишени производными 6-мера и 15-мера от рН в различных солевых условиях. Модификацию проводили 20 часов при 20° в 50 мМ NaOAe, содержащем 150 мМ NaCl (условия А), 150 мМ NaCl и 10 мМ MgCl2 (условия Б) или 10 мМ MgCl2 (условия В). Из рисунка 6а видно, что для всех условий в случае 15-мера заметная модификация наблюдается при снижении рН до 5.6, при этом для условий В степень модификации достигает своего максимального значения, то есть присутствие в реакционной смеси ионов Mg2+, видимо, способствует образованию такой конформации Хугстеновского триплекса, из которой алкилирование протекает более эффективно. Условия Б, в данном случае, являются промежуточными, так как ионы Na+ конкурируют с ионами Mg2+ за связывание с фосфатами ДНК. Понижение рН до 5.2 приводит к увеличению степени модификации до максимальной для условий А и Б, причем в условиях Б степень модификации сравнима со степенью модификации в условиях В. Таким образом, понижение рН в присутствии ионов магния способствует образованию конформационно более выгодного для алкилирования Хугстеновского комплекса. Снижение рН до 4.8 в присутствии ионов магния (условия В) приводит к образованию другого типа триплекса, алкилирование в составе которого не происходит. Отсутствие обмена олигонуклеотидного производного (15-мер) в этих условиях приводит к снижению степени модификации ДНК-мишени. В случае промежуточных условий Б образование нехугстеновского комплекса, а, значит, и снижение степени модификации происходит при более низких рН (4.4). В отсутствие ионов Mg2+ снижение степени модификации наблюдается только при рН 4.0.

а)

100 х

1 s-мйп

б)

100 т ВА6"меР

3,6 4 4,4 4,8 5,2 5,6 6

рН

3,6 4 4,4 4,8 5,2 5,6 6

рн

Рис. 6. Зависимость степени модификации фрагмента F 2 алкилирующими производными 15-мера и 6-мера от рН в различных солевых условиях: а) -модификация фрагмента F 2 R Cl-15-мером, б) - модификация фрагмента F 2 R С1-6-мером. Инкубация в течение 20 часов при 20° в 50 мМ NaOAc, содержащем :оответственно: А- (•) 0.15 М NaCl; Б- (■) 0.15 М NaCl, 10 мМ MgCl2; В- ( ► )10 мМ MgCl2.

При модификации ДНК-мишени алкилирующими производными 6-мера также наблюдается повышение степени модификации в присутствии ионов магния и при понижении рН. Так для условий В существенное повышение модификации происходит при рН 4.8, а для промежуточных условий Б эффект повышения степени модификации начинает проявляться при более низких рН (4.4). Однако, в данном :лучае не наблюдается снижения степени модификации при дальнейшем понижении эН. Возможно, появление в реакционной смеси нехугстеновских комплексов нивелируется высокой скоростью обмена олигонуклеотида между двумя типами гриплексов.

Очевидно, что эти два типа комплексов не могут быть оба сформированы на эснове Хугстеновских триплетов и отличаться лишь небольшими конформационными вменениями, так как для переформирования интересующего нас типа комплекса в классический необходима его диссоциация. В эксперименте по оценке скорости эбразования комплекса 15-мера с ДНК-мишеныо при вхождении в гель (для )лектрофореза использовали 50 мМ трис-ацетатный буфер, рН 5.5, содержащий 10 мМ М§(ОАс)2) образца, инкубированного в условиях II, происходит смена рН и юхугстеновский комплекс диссоциирует. Очень большое отличие в мектрофоретической подвижности фрагмента дцДНК (400 п. о.) и 15-мера приводит к гому, что концентрация олигонуклеотида в геле в окружении ДНК-мишени слишком шзка для ассоциации в классический триплекс. Это свидетельствует о том, что

перестройки одного типа комплекса в другой без диссоциации комплекса не происходит.

Был осуществлен анализ модификации ДНК-мишени диметилсульфатом в отсутствие и в присутствии 15-мера в условиях II. Показано, что в этих условиях гуанозины пуриновой цепи дцЦНК, участвующие в образовании триплексов, количественно защищены от модификации DMS. Таким образом, можно сделать вывод о том, что N7 положение гуанозинов участвует в образовании водородной связи в составе нехугстеновских триплетов, также как и в составе классических триплетов.

Известно, что СТ-содержащие олигонуклеотиды способны образовывать дуплексы (ориентация цепей антипараллельна) за счет образования С С+ неканонических пар в кислой среде в присутствии ионов магния (Gray et al., 1988). Мы предположили, что такого типа дуплексы могут служить основой для образования нехугстеновских триплексов. Гуанозин в такой ситуации имеет возможность образовать две водородные связи с экзоциклическими аминогруппами С и С+. N7 положение гуанозина может участвовать в образовании водородной связи, что соответствует данным по модификации ДНК диметилсульфатом.

ВЫВОДЫ

1. На примере фрагментов гена человеческого у-интерферона исследована направленность и эффективность модификации дцДНК алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов, образующими трехцепочечные комплексы с полипурин - полипиримидиновыми трактами. Продемонстрирована высокая специфичность реакции алкилирования. Показано, что алкилирующая группа, присоединенная к З'-концевому фосфату триплексобразующего олигонуклеотида, реагирует с гуанозинами, находящимися в обеих цепях дцДНК, в то время как 5'-концевая алкилирующая группа реагирует только с гуанозинами пуриновой цепи. Бифункциональные реагенты, несущие реакционноспособные группы на 3'- и 5'-концах олигонуклеотида, могут алкилировать одновременно обе цепи ДНК, приводя к ковалентной сшивке двух цепей, что открывает возможности для расщепления определенного выбранного участка ДНК по обеим цепям. Продемонстрировано, что эффективность реакции алкилирования зависит от расположения реакционноспособного центра мишени относительно алкилирующей группы, а также от длины линкера, связывающего олигонуклеотид и реакционноспособную группу.

2. Изучена специфичность образования комплексов пуриновых олигонуклеотидов с полипурин-полипиримидиновыми участками дцДНК. С помощью реакционноспособных производных пуриновых олигонуклеотидов впервые показано, что их связывание происходит в антипараллельной по отношению к пуриновой цепи дуплекса ориентации.

3. Разработан метод количественной модификации дцДНК алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов, заключающийся в последовательных обработках ДНК реагентом в возрастающих концентрациях без удаления предыдущей порции гидролизованного реагента.

4. Доказано, что в присутствии ионов магния при кислых рН пиримидиновые олигонуклеотиды и их реакционноспособные производные могут образовывать

комплексы с участками дцДНК-мишени, содержащими последовательности с неполной комплементарностью. Показано, что 1). При наличии в пуриновой цепи ДНК одиночных остатков Т или С, олигонуклеотид в этом месте должен содержать несколько выпетливающихся оснований, предпочтительно тимидин. 2). Гуанозин в пиримидиновом олигонуклеотиде, введенный напротив тимидина в пуриновой цепи ДНК, не участвует в образовании тройного комплекса. 3). Модификация может протекать эффективно даже в составе слабых комплексов, не регистрируемых в данных условиях. 4). Реакция модификации дцДНК проходит с большей эффективностью в составе структур, в которых 5'-концевая область олигонуклеотида образует совершенный комплекс с ДНК-мишеныо, в то время как З'-концевая область с алкилирующей группой вследствие неполной комплементарное™ имеет большую конформационную свободу.

5. Обнаружено, что при низких рН в присутствии ионов магния пиримидиновые олигонуклеотиды образуют с дцДНК два типа тройных комплексов, причем алкилирование протекает с высокой эффективностью только в составе одного из них (канонического Хугстеновского).

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Е.В. Brossalina, E.N. Demchenko, V.V. Vlassov, S.V. Mamaev Sequence-specific alkylation of dsDNA with derivatives of pyrimidine oligonucleotides conjugated to 2-chloroethylamine groups, 1991, Antisense Res. Devel., 1, 229-242.

2. E. Brossalina, E. Demchenko, V. Vlassov Effect of magnesium ions and low pH on interaction of pyrimidine oligonucleotides with dsDNA: affinity modification study, 1991, Nucleic Acids Res., Sym. Ser., 24, 107-111.

3. E. Brossalina, E. Demchenko, V.Vlassov Sequence specific alkylation of dsDNA by 2-chloroethylamine derivatives of purine oligonucleotides, 1991, Nucleic Acids Res., Sym. Ser., 24, 262.

4. E.B. Brossalina, E.N. Demchenko, V.V. Vlassov Specificity of interaction of pyrimidine oligonucleotides with DNA at acidic pH in the presence of magnesium ions: affinity modification study, 1993, Antisense Res. Devel., 3, 357-365.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Демченко, Елена Николаевна, Новосибирск

£/ ff- Л / * г . ^ •

/ *" 7

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи

ДЕМЧЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

С ИКВ ЕН С-СП ЕЦИФИ ЧЕС КАЯ ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДВУЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК АЛКИЛИРУЮЩИМИ ПРОИЗВОДНЫМИ

ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

03.00.04. - биохимия

Научные руководители: д. х. н., чл. корр. РАН Власов В В.

к.х.н. Бросалина Е.Б.

Новосибирск, 1998

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ 2

ВВЕДЕНИЕ 5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7

ГЛАВА 1 8

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8

ТРЕХЦЕПОЧЕЧНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 8

1.1. Открытие тройных комплексов 8

1.2. Структура триплексов 10

1.2.1. Нуклеотидные последовательности, способные образовывать триплексы 10

1.2.2. Ориентация третьей цепи. 15

1.2.3. Конформация триплексов 16

1.3. Межмолекулярные и внутримолекулярные триплексы 19

1.4. Геометрия триплексов 24

1.5. Специфичность образования триплексов 27

1.6. Стабилизация триплексов 30

1.6.1. Стабилизация триплексов с помощью уменьшения отталкивания

полинуклеотидных цепей 31

1.6.2. Влияние рН на сстабильность триплексов 35

1.6.3. Зависимость стабильности триплексов от длины РиРу тракта и третьей цепи 37

1.6.4. Влияние гидрофобных заместителей в основаниях третьей цепи на

стабильность триплексов 40

1.6.5. Стабилизация тройных комплексов триплекс-специфичными лигандами 41

1.6.6. Некоторые особенности стабилизации межмолекулярных и

внутримолекулярных триплексов 43

1.7 Воздействие на основные генетические процессы с помощью триплекс образующих олигонуклеотидов 44

ГЛАВА 2 50

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 50

2.1. Описание выбранной модельной системы и сё характсризация. 50

2.2. Модификация мишени I алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов 1 и 2. 55

2.3. Модификация мишеней II и III алкилирующими производными

пиримидиновых олигонуклеотидов 3, 4,5 61

2.4. Модификация дцДНК производными пуриновых олигонуклеотидов 65

2.5. Разработка метода количественной модификации дцДНК алкилирующим

производным пиримидинового олигонуклеотида 1 69

2.6. Модификация дцДНК в составе несовершенных тройных комплексов 70

2.7. Модификация дцДНК [32Р]-меченым алкилирующим производным

олигонуклеотида 2 75

2.8. Модификация дцДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов, несущими реакционноспособные группы на З'-концевом фосфате, либо на 5'- и 3'-

концевых фосфатах одновременно 78

2.9. Определение структуры несовершенных комплексов 83

2.10. Модификация дцДНК в составе тройного комплекса алкилирующими производными длинного (15-мера) и короткого (6-мера) пирмидиновых

олигонуклеотидов 90

2.11. Оценка скорости образования комплекса 15-мера с ДНК-мишенью в различных

условиях с помощью гель-электрофореза в неденатурирующих условиях 93

2.12. Изучение эффективности модификации ДНК-мишени алкилирующим

производным 15-мера в составе двух типов комплексов 94

2.13. Изучение зависимости степени модификации ДНК-мишени производными 6-мера и 15-мера

от рН в различных солевых условиях. 98

ГЛАВА 3 101

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 101

3.1. Материалы 101

3.2..Методьт 102

3.2.1. Буферные системы 102

3.2.2. Трансформация клеток Е. coíi. 102

3.2.3. Выделение дцДНК. 103

3.2.4. Введение 5'-конецевой 32Р метки в олигонуклеотидьг. 104

3.2.5. Синтез производных олигонуклеотидов, несущих остатки

4-(Н-2-хлорэтил-Н-метиламино) бензил амина на 5-концевых фосфатах. 104

3.2.6. Синтез феназиниевого производного одигонукдеотида - эффектора. 105

3.2.7 Секвенирование фрагментов ДНК. 106

3.2.8 Дот-гибрвдиизация 32Р-меченных пиримидиновых олигонуклеотидов с дцДНК 107 ВЫВОДЫ 108

ЛИТЕРАТУРА 110

ВВЕДЕНИЕ

Создание методов необратимой инактивации и регуляции экспрессии определенных генов является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Наиболее перспективным подходом к решению этой задачи является направленное воздействие на конкретные генетические программы с помощью олигонуклеотидов и их производных, способных избирательно взаимодействовать с характерными для этих программ нуклеотидными последовательностями, модулируя эффективность их функционирования.

Метод регуляции экспрессии генов с помощью комплементарных матричным РНК олигонуклеотидов (антисмысловых олигонуклеотидов), впервые предложенный Н. Гриневой (ВеИкоуа а1., 1967), оказал большое влияние на пути развития современной медицинской химии (\Vickstrom, 1991). Еще более перспективным представляется создание методов направленного воздействия на определенные участки геномной ДНК, так как в этом случае возможно необратимое изменение генетических программ и достижение долговременных эффектов. Прямым подходом к решению этой проблемы является использование гомопуриновых и гомопиримидиновых олигонуклеотидов, способных образовывать комплексы с соответствующими участками двуцепочечной ДНК (дцДНК) (ЗоуГег & Ро1ашап, 1996).

Связывание олигонуклеотидов с ДНК может приводить к нарушению взаимодействия специфических регуляторных белковых молекул и ферментов с ДНК, или к изменению хода биологических процессов в результате стабилизации дуплексной структуры нуклеиновой кислоты. С помощью реакционноспособных производных гомопиримидиновых и гомопуриновых олигонуклеотидов может быть осуществлена направленная химическая модификации дцДНК и необратимая инактивация или модуляция экспрессии отдельных генов. Одним из наиболее перспективных классов реакционноспособных производных олигонуклеотидов для модификации ДНК являются конъюгаты олигонуклеотидов с

алкилирующими группировками. Возможность расщепления ДНК по алкилированным основаниям позволяет точно определять направленность и глубину модификации. Механизм алкилирования одноцепочечной ДНК производными олигонуклеотидов был детально исследован, изучены свойства продуктов модификации (Кпогге е* а1., 1989). Потенциальная пространственная доступность основных мишеней алкилирования, N7 атомов гуанозинов для реакционноспособной группы олигонуклеотидных конъюгатов, связывающихся в большой бороздке дцДНК, позволяет надеяться, что алкилирующие производные олигонуклеотидов могут быть использованы для эффективной модификации дцДНК. Возможность осуществления такой модификации дцДНК алкилирующими производными олигоцитидилатов в составе трехцепочечного комплекса бьша впервые продемонстрирована в работе (Кнорре и др., 1988).

Целью настоящей работы является изучение специфичности и эффективности алкилирования дцДНК реакционноспособными производными пиримидиновых и пуриновых олигонуклеотидов, несущих алкилирующую группу на 5- и 3'- концевых фосфатах; изучение закономерностей образования комплексов олигонуклеотидов с дцДНК в различных условиях; разработка методов повышения специфичности и эффективности модификации дцДНК-мишени реакционноспособными производными олигонуклеотидов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А DP - аденозиндифосфат

DMSO - диметштсульфоксид

DMF А - димегилформамид

DMS - диметилсульфат

EDTA - этилендиаминтеграуксусная кислота

N-Melm - N-метилимидазол

РЬзР - трифенилфосфин

(PyS)2 - дипиридилдисульфид

SDS - додецилсульфат натрия

ß-МЭ - ß-меркаптоэтанол

дцДНК - двуцепочечная ДНК

ТФО - триплексформирующие олигонуклеотиды

ТЭА - триэтиламин

е. а. - единица активности

o.e. - оптическая единица

п.о. - пара оснований

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ТРЕХЦЕПОЧЕЧНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1Л. Открытие тройных комплексов

Впервые о существовании трехцепочечных нуклеиновых кислот было сообщено в работе Feisenfeld с соавторами в 1957 году (Felsenfeld et al.,1957): с помощью спектрофотометрических методов было доказано образование комплекса, состоящего из одной цепи poly(A) и двух цепей poly(U). Дальнейшие исследования этих же авторов позволили выявить ряд особенностей трехцепочечных нуклеиновых кислот (Rich, 1958). Кинетические исследования показали, что образование тройных комплексов происходит медленнее, чем образование дуплексов. Увеличение ионной силы раствора приводит к уменьшению отталкивания между отрицательными зарядами фосфатов полинуклеотидных цепей, ускоряя процесс образования триплексов; двухвалентные катионы оказывают более сильное влияние на формирование триплексов, чем одновалентные. Было высказано предположение, что уридин, принадлежащий третьей цепи, образует две водородные связи с аденозином, находящимся в дуплексе, образованном с помощью Уотсон-Криковского взаимодействия. Продемонстрировано, что полинуклеотиды poly(I) и poly(A) также могут образовывать тройной комплекс следующего состава: poly(I)»poly(A)*poly(I).

Рентгеноструктурные исследования (Hoogsteen, 1959) показали, что водородные связи между дуплексом и третьей цепью образуются отличным от Уотсон-Криковского взаимодействия образом. Данный тип образования водородных связей получил название Хугстеновского взаимодействия.

Вскоре было сообщено о существовании комплексов с отличным от poly(A)*poly(U)*poly(U) составом. Было исследовано взаимодействие poly(C) с короткими олигонуклеотидами GG и GGG (Lipsett, 1964) и показано, что при нейтральных pH образуется стехиометрический комплекс 1G:1C, а при понижении pH ниже 6.0 в результате протонирования остатков цитозина образуется комплекс 1G:2C. Было также обнаружено, что при нейтральных pH образуется триплекс со стехиометрией 2G:1C. Взаимодействие молекул poly(C) и poIy(G) происходит в соотношении 1:1, тройной комплекс 2G.1C образуется только при существенном уменьшении степени полимеризации (Pochon, & Michel son, 1965). Было сделано предположение о том, что структурная организация длинных молекул нуклеиновых кислот не допускает образования протяженных трехцепочечных комплексов; разрывы же в дуплексе и (или) третьей цепи способствуют формированию триплексов. Эксперименты показали, что образование триплексов в системе poly(G) + poly(C) в отличии от системы poly(A) + poly(U) является более сложным и зачастую невоспроизводимым процессом (Haas & Guschlbauer, 1976). Кроме присутствия катионов, нейтрализующих отрицательные заряды фосфатов полинуклеотидных цепей, требуется наличие дополнительных стабилизирующих триплексы факторов.

Более поздние исследования показали, что в определенных условиях такой комплекс не является метастабильной структурой (Marek & Thiele, 1978). Знания о возможном составе тройных комплексов расширились после того, как была доказана возможность существования poly(dT)»poly(dA)*poly(U) триплекса (Rich, 1960).Стало известно, что в образовании тройных комплексов способны принимать участие как РНК, так и ДНК цепи. В своих исследованиях Morgan и Wells продемонстрировали образование триплексов poly [d(T-C)]e poly [d(G-A)]*poly[(U-C)], доказав этим, что тройные комплексы могут образовывать не только гомополимерные цепи, но и гомопуриновые и гомопиримидиновые полимеры смешанной последовательности (Morgan & Wells, 1968).

Таким образом, некоторые особенности образования тройных комплексов были исследованы достаточно давно. Однако, значительный интерес к структурам триплексов появился только в середине 80-х годов, когда были сделаны два независимых открытия. Во-первых, было обнаружено, что в суперспирализованных плазмидах гомопурин-гомопиримидиновые тракты принимают необычную форму, включающую в себя в качестве важнейшего структурного элемента триплексные структуры (Lyamichev et al., 1986; Mirkin et al., 1987). Во-вторых, несколько различных исследовательских групп продемонстрировали, что гетерогенные гомопиримидиновые и некоторые гомопурин-богатые олигонуклеотиды могут образовывать стабильные сиквенс-специфические комплексы с соответствующими гомопурин-гомопиримидиновыми участками дцДНК ( Le Doan et al., 1987; Moser &Dervan, 1987). Бьшо показано, что эти структуры являются тройными комплексами, а не D-петлями, в которых олигонуклеотид замещает одну из цепей дуплекса. Эти открытия вызвали значительный рост интереса к исследованиям в области строения и биологических функций трехцепочечных нуклеиновых кислот.

1.2. Структура триплексов

1.2.1. Нуклеотидные последовательности, способные образовывать триплексы

Было показано, что триплексы могут образовываться гомопурин-гомопиримидиновым дуплексом, сформированным с помощью Уотсон-Криковских водородных связей, и третьей гомопиримидиновой или шмопуриновой цепью, которая образует с пуриновой цепью дуплекса водородные связи Хугстеновского типа (Morgan & Wells, 1968; Broitman et al., 1987). Таким образом, тройные комплексы могут быть двух

типов: либо пиримидин - пурин - пиримидин содержащие (РуРиРу), либо пиримидин - пурин - пурин содержащие (PyPuPu). Тройные комплексы могут формироваться как ДНК, так и РНК цепями,

* +

Мономерными звеньями РуРиРу триплексов являются канонические триады CG С и

ТА*Т (UA*U) (Ри* - триплексобразующая пуриновая цепь) (рис. 1). Для образования

Хугстеновских водородных связей с дуплексом, третья цепь должна располагаться в

большой бороздке двойной спирали (Hoogsteen, 1963). Изоморфизм обеих канонических

триад позволяет образовывать регулярную трехцепочечную спираль. Возможность

образования таких структур ограничена частотой встречаемости протяженных шмопурин-

гомопиримидиновых трактов в последовательности ДНК. Важной особенностью РуРиРу

триплексов является то, что формирование таких структур происходит при кислых рН, так £ .

как образование CG С триады требует протонирования N3 цитозина третьей цепи (Morgan & Wells, 1968; Lee et al, 1979).

Первоначально считалось, что PyPuPu триплексы могут включать в свой состав только CGG и ТА А триады (Broitman et al., 1987; Kohwi & Kohwi-Shigematsu 1988; Beraues et al., 1990). Более поздние исследования с помощью методов ДНКазнош футпринтинга, олигонуклеотид-направленного расщепления, ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования показали, что, несмотря на нарушение оптимальных условий для спаривания оснований и конформации рибозофосфатного остова, в состав PyPuPu триплексов может быть включено некоторое количество ТА*Т триад (Beal & Dervan, 1991; Radhaktishnan et ai., 1991). Таким образом, термин PyPuPu триплекс не является исчерпывающим по отношению к химической природе третьей цепи (рис.2). Триады PyPuPu триплексов менее изоморфны, чем триады РуРиРу триплексов.

Следует заметить, что триады, содержащие в третьей цепи тимин, цитозин и гуанин, могут существовать в двух изомерных конфигурациях (обзор: Thuong & Helene, 1993). В одной из этих конфигураций (нормальное Хугстеновское взаимодействие) третье основание

Рисунок 1. Канонические триады РуРиРу триплексов, образованные с помощью Хугстеновских водородных связей. Третья пиримидиновая цепь имеет син- конформацию гликозидных связей.

Рисунок 2. Основные триады РуРиРи триплексов, образованные с помощью обращенных Хугстеновских водородных связей. Третья пуриновая цепь имеет анти- конформацию гликозидных связей.

ориентировано согласно схеме предложенной Хугстеном (Hoogsteen, 1959). В другой конфигурации (обращенное Хугстеновское взаимодействие) основания третьей цепи повернуты на 180° относительно их положения в предложенной схеме. Аденин в третьей цепи образует две водородные связи и может принимать только одну конфигурацию (обращенную Хугстеновскую). Отличием между двумя типами тройных комплексов является то, что в PyPuPu триплексах для существования стекиншвого взаимодействия между CG G, ТА А и ТА Т триадами требуется образование водородных связей по обращенно Хугстеновскому типу (Beal & Dervan, 1991).

В то время, как в РуРиРу триплексах последовательность третьей цепи полностью определяется последовательностью дуплекса, для PyPuPu триплексов ситуация не столь очевидна. Третья цепь может состоять из трех оснований G, А и Т, при этом положение гуанина соответствует положению гуанина в пуриновой цепи дуплекса, тогда как аденин или тимин могут соответствовать аденину дуплекса. Недавно было показано, что для конкретных

олигонуклеотидных систем константы связывания двадцатизвенных G,T- и G, А-содержащих

¿ i 7 1

олигонуклеотидов в триплекс могут существенно отличаться: 10 М" и 2.510 М" соответственно (Alunni-Fabbroni et al., 1996).

При кислых рН может также образовываться триада CG А (рис.2), в которой протонированный аденин третьей цепи соответствует гуанину дуплекса (Malkov et al.,1993).

Менее изучены гибридные триплексы, состоящие из ДНК и РНК цепей. В принципе возможно существование восьми комбинаций РНК и ДНК цепей внутри триплекса. По недостаточно понятным причинам результаты исследований разных групп ученых об относительной стабильности гибридных РуРиРу триплексов каждого типа существенно отличаются (Roberts & Crothers, 1992; Escude et al., 1993; Han & Dervan, 1993). Это может быть объяснено различиями в последовательностях изучаемых объектов и (или) в условиях, в которых проводилось формирование триплексов. Тем не менее, все данные согласованно

указывают на то, что комплексы более стабильны, если в качестве гомопуриновой триплексобразующей цепи дуплекса выступает цепь ДНК, а не РНК.

1. 2. 2. Ориентация третьей цепи.

Одним из важнейших вопросов при изучении тройных комплексов является взаимная ориентация химически гомологичных цепей, которая теоретически может быт�