Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез гена ингибитора протеиназ (эглин С) и его экспрессия в Escherichia coli. Получение биотинилированных олигодезоксирибонуклеотидов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез гена ингибитора протеиназ (эглин С) и его экспрессия в Escherichia coli. Получение биотинилированных олигодезоксирибонуклеотидов"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

"г: • од

V U /'i!/ 7 На пРаЕах рукописи

- I 'Ы I ; 1 /

ОСИПОВ АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

СИНТЕЗ ГЕНА ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ (ЭГЛИН С) И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В Escherichia coli. ПОЛУЧЕНИЕ БИОТИНИЛИРОВАННЫХ ОЛКГОДЕЗОКСИРИБО-НУКЛЕОТИДОВ.

(03.00.03 - Молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: кандидат химических наук, заведующий лабораторией биоорганической химик В.П.Вейко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Г.Г.Честужна доктор химических наук Ю.С.Дркгин

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии РАН.

Защита диссертации состоится " 1 " ноября 1984 г.

в__ часов на заседании Специализированного совета Д 093.12.01.

при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции'промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, I Дорожный проезд дом I.

С диссертацией можно ознакошться в библиотеке "ГосНИИгенетика" Автореферат разослан "_" сентября 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

Актуальность тема диссертации. В последние годы особое внима-ie исследователей привлечено к ферментам протеолиза. Причиной та->го пристального внимания.является не только необходимость полудня фундаментальных знаний о природе взаимодействия белок-субст-1Т, но и роль протеиназ, в частности эластаз, в развития целого ¡да заболеваний человека: эластазы вовлечены в развитие эмфиземы ¡гких, хронического бронхита, панкреатитов и других заболеваний, связи с этим все большую актуальность' приобретает получение пре-¡ратов-ингибиторов протеиназ. Одним из потенциальных лекарствен-к средств, обладающих антипротеиназной активностью, является эг-ш С - выделенный из пиявок Kirudo medicinalis высокоактивный и 1еш-:фичный ингибитор катепсина Q, панкреатической и лейкоцитарной ¡астаз человека. Проведенное ранее изучение биологических и физи->-хиккческих свойств зглива С показало не только его высокие ин-йируюцке свойства и селективность действия, но и отсутствие ток-ганости в исследованиях на лабораторных животных^ Зглкя С прояв-[ет высокую терио- и кислотостабшшность, что является необходи-ш условием для применения препарата белковой природы в качестве )тенциального терапевтического средства.

Все вышесказанное и предопределило задачу синтеза гена эг-ша С, конструирования экспрессионного вектора и получения штам-»-продуцента соответствующего белка.

Одной из -областей применения синтетических олигодезоксири-)Нуклеотидов является создание зондов, используемых как в меди-шской диагностике, так и при проведении научных исследований в пекулярной биологии. Основное преимущество таких зондов, по )авнению с ДНК-зондами, заключается в возможности обнаружения то-;чных замен, что особенно важно при выявлении генетических забо-гваний. В качестве' репортерных в олигонуклеотидах могут выступать адиоактивные или флуоресцентные соединения, красители, группы, щвляеыые под действием ферментативных систем (биотин), ферменты гелочная фосфатаза, перокскдаза). Нерадиоактивно меченные олиго-гклеотиды обладают достаточно высокой чувствительностью в гибри-¡зации, стабильностью и безопасностью в работе.

Как правило, введение репортерных групп осуществляли моди-;кацией гетероциклических оснований либо модификацией 3'- или -конца олигонуклеотида. Эти способы затрудняли использование инфицированных олигонуклеотидов для дальнейших ферментативных ¡акций in vitro. Все"это предопределило актуальность задачи соз-

дания принципиально новых нерадиоактивно меченных олигонуклеотид-ных зондов, модифицированных по межнуклеотидным фосфатным группам.

Цель работа: Целью работы являлось: химический синтез гена ингибитора протеиназ зглин С, конструирование экспрессионного век-■ тора, получение штамма-продуцента соответствующего белка, отработка метода наделения полипептида' и изучение его ингибирующих' свойств по отношению к а-химотрипсину и эластазе. В задачу входила также разработка нового универсального способа"получения нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов.

Научная новизна. Предложены варианты метода сборки генов прямой амплификацией смеси синтетических олигонуклеотидов. Определены оптимальные параметры проведения такой сборки.- Создан высокоэффективный штамм-продуцент эглина С. Предложена и отработана,новая схема получения аминоолигонуклеотидов и, на их основе, получены биотинилированные олигонуклеотидкые зонды. Показано, что синтезированные по данной схеме зонды могут быть использованы практически во всех ферментативных реакциях, применяемых в генной инженерии, а внесение модификации по межнуклеотидной фосфатной группе не приводит к существенному понижению температуры плавления комплекса оли-гонуклеотид-ДНК.

Практическая ценность работы. Разработана схема и оптимизированы условна сборки фрагментов ДНК прямой амплификацией смеси синтетически:! л{Х1Ймеров. Практическая применимость схемы продемонстрирована на примерах сборки генов эглина С из пиявки и в-эн-дорфина человека. Получен штамм-продуцент и отработана схема выделения высокоэффективного ингибитора протеиназ - эглина С. Охарактеризована 1шгиР!?рую1дая способность полученного полипептида.

Предложена новая схема получения нерадиоактивно меченных оли-годезоксирибонуклеотидов, позволяющая вводить любые репортерные группы в состав олигонуклеотида. Полученные по новой схеме олигонуклеотидные зонды могут быть использованы практически во всех ферментативных реакциях, применяемых в генной инженерии.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, еыводов и списка цитируемой литературы (144 ссылки). Обьем диссертации составляет 148 страниц основного текста, включает 41 рисунок и 3 таблицы.

Апробадгш работа. Материалы исследования по теме диссертации представлена на Международном Биохимическом конгрессе в Иерусалиме

1991г.), на Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклео-иды: проблемы к перспективы практического применения", Москва 1991г.), на XIII Международном симпозиуме по пептидам, Эдмонтон, лнада (1993г.), на IV конференции Российской федерации "Новые аправления биотехнологии" г.Пущшо (1994г.), а .тагсхе на семинарах-;екции биоинженерии белков и нуклеиновых кислот Ученого совета осНШгенетика.

Список сокращегей. PCR- полимеразная цепная реакция, олиго-уклеотиды - олигодезоксирибонуклеотиды, п.осн. - пар оснований.

МАТЕРИАЛЫ И ГгЕТОДЫ.

Еактериальнкё штаммы. В работе использовали штаммы Е. coli: 61 (К12, Д(1ас-рго), supE, thi, hsdD5/F'traD36, ргоА4^, laglq, acZÛM15); XLl Blue (RècAl, endAl, syrA96, thi, hsdR17-{rk" Mk+ >, upE44,relAl Д~ Cr'proAl, lacIqlacZÛM15, Tnl0(tetr)3, полученные 3 коллекции ГосНИИгенетики и Saccharomyces cerevisiae 618 MATleu21ys4his4ura3 STA+), любезно предоставленный к.б.н. Бенево-енским C.B.

Препарата фернектов. Зндонуклеазы рестрикции Pstl, BamHI ф!ф-ы "Pharmacia" (Швеция). BglII, EcoRI, Xbal - НПО "Ферментас" Литва) а также Т4-ДНК-лигазу фирмы "An-iershan" (Англия), полинук-еотидкиназу фага^Т4, наборы "Амплификация" и "Сиквенс II" произ-одства НПО "Ферментас"(Литва). Ферменты использовали в соответст-ии с рекомендациями фирм - изготовителей.

Химический синтез олнгакукяеотадов проводили твердофазным ме-одом с использованием цианозтилфосфоамидитов на автоматическом интезаторе " Brosearch 8700 " (США).

Получение аикноалкнльного производного олгагонуклеотида осу-ествлялвг при проведении конденсации по Н-фосфонатной схеме Froehler В..Matteucci-M.D.,1986). Введение аминогруппы проводили еакцией Атертона-Тодда с использованием 1,7-гептаметилендиамина. локирование свободной аминогруппы проводили ангидридом трифторук-усной кислоты.

Введение остатка бжязша по межнуклеотидной алифатической «пгагрупле проводили с помощью раствора N-оксисукшшишдного эфи-а биотина ("Fluka", Швейцария) в N.N'-диметилформамиде.

П1бридкзащ«>-биотнш«гированяого акя-онуклеотида с пробами ДКК эоводили с использованием нитроцеллюлозных мембран ("Amersham",

Англия). Колориметрическое определение биотипа проводили по методу (Chan V.T.,1985) с использованием коньюгата стрептавидина и щелочной фосфатазы ("Calbíochem", США).

Проведение- псшмеразной цепной реакции (PCR) осуществляли на приборе "Techne РНС-2".

Здектрофоретический анализ белков проводили по методу (Schagger S- von J agon, 1S87)

Тестирование ингибирующей активности эглина С проводили согласно (Fink Е., Nettelbeck R. ,1386) по ингибированию ct-химотрипси-на и панкреатической эластазы с использованием Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-р-нитроанилида ("Sigma",США) в качестве субстрата. Референс-стандартом являлся рекомбинантный зглин С фирмы "Sigma" (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Среди многочисленных работ по, получению синтетических фрагментов ДНК можно выделить два основных методических подхода: традиционный подход, связанный с полным химическим синтезом двух' цепей ДНК (Khorana 1968,1979, Itakura 1977), и подход, основанный на ферментативной достройке частично комплементарных синтетических олигонуклеотидов до двуцепочечных фрагментов ДНК (Rossi et al.1982 Scarpulla et al.1982).

■Получение достаточно протяженных синтетических генов предполагает предварительное фосфоршшрование олигонуклеотидов (Т4-поли-нукяеотидкиназа) и их последующее дотирование (Г4-ДНК-лигаза).

■Цитирование многокомпонентной смеси синтетических олигонуклеотидов проходит с низким выходом и затрудняет последующее клонирование. Поэтому часто на первом этапе собирают несколько субфрагментов гена, проводят их промежуточное клонирование в соответствующих векторах, а затем последовательным субклонированием получают полноразмерный синтетический ген. Однако, многоступенчатые варианты сборки, требуют значительных материальных и временных затрат. Кроме того, промежуточное клонирование фрагментов гена имеет определенные ограничения, связанные с необходимостью создания уникальных внутренних сайтов рестрикции, что не всегда достижимо даже с использованием явления вырожденности генетического кода. .

Таким образом, следует отметить, что даже с развитием методов химического синтеза олигонуклеотидов и появлением современных автоматических синтезаторов, получение протяженных синтетических генов с использованием "классических" подходов является достаточно

- 5 -

трудоемкой и многостадийной задачей.

Разработанный в последние годы метод амплйфийации фрагментов ДНК с помощью PCR позволил существенно упростить процедуру сборки синтетических генов. В этом случае не имеет существенного значения эффективность дотирования (она может быть крайне мала), т.к. в результата последующей PCR количество полученного гена возрастает в несколько тысяч раз. Метод получения синтетических генов с помощью PCR применен в работе (Jayaranian,1989). В данном варианте получения синтетических генов, олигонуклеотиды предварительно кинировали и дотировали.

В работах (Sandhu et al.1932, Prodromou 1992) списано получе-' ние синтетических генов с помощью PCR непосредственно из олигонуклеотидов без предварительного кинирования и дотирования. Сборка генов по данному методу осущствдяется в один этап: олигонуклеотиды - PCR - синтетический ген. По данному методу планируемая синтетическая последовательность разбивается на несколько частично перекрывающихся (17-20 осн.) олигонуклеотидов. При проведении PCR в результате многократных достроек олигонуклеотиды взаимодостраиваются во все более крупные фрагменты и, в конечном итоге, образуется полноразмерный синтетический ген.

• Однако, разбивка планируемой последовательности на частично перекрывающиеся олигонуклеотиды не является единственным вариантом проведения сборки синтетических генов в PCR. Для получения синтетических генов эглмна С и ß-эндорфина нами были предложены иные' схемы проведения сборки генов непосредственно из отдельных олиго-нуклеотидов.

С целью оптимизации условий сборки целевогр гена зглина п в PCR без предварительного кинирования и дотирования олигонуклеоти-дов,' ми исследовали эффективность проведения амплификационной сборки протяженных фрагментов ДНК в зависимости от концентрации олигонуклеотидов на примере упрощенной модельной схемы.

1. Прсшаденке модемных сборок алотонуклеогавоз.

Для этого были синтезированы олигонуклеотиды А"^"1" и В-А-, у которых участки А+,А" и В+,В~ взаимно комплементарны. Структуры олигонуклеотидов и схема взаимных достроек олигонуклеотидов представлены на рис.1.--Повторение циклов: денатурация-отжиг-достройка приводит к увеличению длины продукта амплификации. На основании

а+ в +

5' тасттсастстссастассатстассссасоттсст

СТАСАТССССТССААССААТСААСТСАСАССТСАТС 5'

в" ..............................

5'

а

+

в

в

в

РСЯ

+

в

5'

5'

5'

а+ в +

А

в

+

в

а в

! рси

5'

а ' в рси

а+ в+ а+

РСЙ

Рис.1. Схема взаимных достроек и структура олшгонуклеотидов А+В+ и В~А~.

данной схемы взаимных достроек в результате PCR можно ожидать образования набора дуплексов ДНК различной длины с повторяющимся шагом в 36 п. осн. Амплификацию проводили в ЮОмкл общей смеси, в которую вносили от 10 до ЮОрМ каждого из олигонуклеотидов и 2,5 ед.акт. Тач-полимеразы. Реакция выполнена в следующем режиме • (мин/°С): первоначальный нагрев 1/95, 20 циклов - 1/95, 1/45, 1/72. В ходе проведенного исследования было показано, что при амплификации от 10 до 50рМ олигонуклеотидов наблюдается обратнопропорцио-кахькая зависимость размеров продуктов PCR от количества внесенных олигонуклеотидов. При амплифюации 65-75pM олигонуклеотидов такая закономерность отсутствует, образуются низкомолекуляркые продукты достроек, г. при использовании по ЮОрМ А+В+ и В"А~, олигонуклцотиды достраиваются только до дуплекса в 54 п.осн.

Тагам образом, - на основании проведенных модельных зкспегамен-тсз экспериментов показано, что протяженные участки двуцепочечной ДНК можно получать прямой амплификацией смеси олигонуклеотидов. Определено, что концентрация олигонуклеотидов, приводятся к эффективной достройке с образованием протяженных подинуклеотидных цепей, должна быть не выше Ю-7 - 5х10-7 М. Многократные циклы PCR ведут it Образованию полинуклеотидных цепей с повторяющейся нуклео-тидной последовательностью. Данный принцип и был использован при сборке гена эглина С прямой амплификацией из отдельных олигонуклеотидов без использования Т4-полинуклеотидкиназы и Т4-ДНК-лигазы.

2. Идзшгровакие синтеза гена згхина С.

Перекодировка аминокислотной последовательности зглина С в полинуклеотидну» выполнена с учетом наиболее часто встречающихся кодонов аминокислот в геноме Е. coli. Варианты последовательностей гена эглина С были проанализированы с помощью разработанного во ГосНЖгенетика пакета математических программ "DNA-sun" (Миронов А.А.). Планирование синтеза олигонуклеотидов проведено с учетом минимальной вероятности образования нежелательных самокомплементарных структур. На рис.2 представлена оптимизированная полинук-леотидная последовательность, кодирующая эглин С.

1 11 21 31 41 51 61

ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrValAspGln

actgegttcggttctgagctgaaatctttcccggaagttgttggtaaaactgttgaccag

tgactcaagccaagactcgactttagaaagggccttcaacaaccattttgacaactggtc

61 .71 81 91 101 .. 111 121

AlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProSlnTyrAspValTyrPheLeuProGlußly 41 gctcgtgaatacttcactotg^actacccgcagtacgacgtttacttcctgccggagggt cgagcacttatgaagtgagaciitgatgggcgtcatgctgcaaatgaaggacggcctccca

121 131 141 151 161 171 181

SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThr 61 tccccggttactctggacctgcgttacaaccgtgttcgtgttttctacaacccaggtact aggggccaatgagacctggacgcaatgttggcacaagcacaaaagatgttgggtccatga

181 191 201 211

AsnValValAsnHlsValProHisValGly 71

aacgtagttaaccatgtaccgcacgttggt

ttgcatcaattggtacatggcgtgcaacca

Рис.2. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая структур- ную часть гена-зглина С.

Для получения гена зглина С были синтезированы олигонуклеоти-ды 1, 2 и 3, последовательность которых Включает в себя кодирующую' цепь гена зглина С и олигонуклеотвды 4 и 5, комплементарные участкам стыковки олигонукдеотидов кодирующей цепи. Сайты рестрикции и другие вспомогательные элементы были заложены в структуру прайме-роэ и присоединялись к гену зглина С в результате проведения PCR (олигонуклеотиды 6-9, табл.1., см. рис.3).

Таблица 1. Структура синтезированных олигонукдеотидов, использованных при сборке гена ^глина С •

No нуклеотидная последовательность

п/п

1. - ACTGAQTTCSGTTCTSAGCTGAAATCTTTCCCGQM6TTETTGGTAAAACT-

-GTTGACCAGGCTCGTGAA

2. TACTTCACTCTGCACTACCCGCAGTAC6ACGTTTACTTCCTGCCGGA6G6T- / -TCCCCGGTTACTCTGGACCTGCGTTACAAC

3. CGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTAGTTAACCATGTACCG-

-CACGTTGGT

4. GTAGT6CA6AGT6AAGTÄTTCACSÄSCCTG6TCAAC'

5. GTAGAAAACACGAACACS3TTGTAACGCAGGTCCAG

6. TATGAATTCGAACAeGAGACTTTCTGATeACTGAGTTCGGTTCTGAGCTG

7. CATGCCTGCAGaATCCTTÄCTAAGCaACGTGCGGTACA

8. ATTATTGGATCCACTGAGXTCGGTTCTGAG

9. ÄATCAGCT6CAGATCTTACTAACCMCGTGCGGTACA

Структура синтезированных: олигонуклеотидов позволяет осуществить два подхода при получении: синтетического гена зглина С.

Первый подход аналогичен описанному в литературе и связан с предварительным фссфорилированием ir лигированием олигонуклеотидов при получении матрицы для PCR. На следующем этапе продукт лигазной реакции использовался в качестве матрицы в PCR. В результате поли-меразной реакции образуется двуцепочечный фрагмент ДНК*. содержащий ген зглина С, фланкированный регуляторными элементами и сайтами для клонирования (рис.За).

Второй подход имеет принципиальное отличие и заключается в том, что матрица без предварительного кинирования и литерования олигонуклеотидов образуется иэ отдельных олигонуклеотидов непосредственно в процессе PCR (рис,3б).

3. Сборка гена зглина С из отдельных одхгонуклеотидав " ' без применения Т4-ДНК-лигазн.

Зависимость эффективности сборки гена эглина С от концентрации олигонуклеотидов в PCR исследовали при получении фрагмента ДНК в 243 п. осн. Для получения фрагмента ДНК использовали олигонуклео-тиды 1-5, 8 и 9 (табл.1). PCR проведена в объеме 100мкл. В каждую реакционную смесь добавляли по 2 ед.акт. Taq-псшшеразы. Учитывая результаты модельных экспериментов, влияние количества олигонуклеотидов на эффективность сборки гена исследовали в диапазоне концентраций от 1078 до 5х10~7М.

PCR выполнена в следующем режиме (мин/°С): первоначальный нагрев 1/95, 10 циклов - 1/95, 1/45, 1,5/72; последующие 15 циклов - 1/95, 1/58, 1,5/72. Температура первоначального отжига в 45°С установлена на основании расчетной температуры плавления комплементарных участков олигонуклеотидов.

р—^— р_1

4 5

ЦЫёаиоп

л___—

7 ^тскК 9

ЕсоШ зр С ВатШ ВатН! С В^1П

12 3

1 2 3

4 5 7

4 - 5 9

РСЕ

ЕсоМ ЯП ВлтН! ВатН!

ЕяНп С ВеШ

Рис.3. Схема сборки гена эглина С а) с применением предварительного литерования. б) прямой амплификацией синтетических одигонук леотвдов. Цифрами обозначены использованные олигонуклеотиды (табл.1).

При сборке гена зглина С не происходит, как в случае дотирования, предварительного соединения ковалеятной связью алигонуклео-тидов кодирующей цепи гена. Олигонуклеотиды объединяются в поли-нугаеотидную цепь в результате последовательных достроек с участием полимеразы. Формально этот процесс аналогичен соединенззо отдельных олигонуклеотидов в протяженную цепь с помощью лигазы, однако, по своей сущности, это объединение протекает по совершенно Другому механизму. .

Результаты фракционирования продуктов амплификации олигонуклеотидов представлены на рис.4. Увеличение количества олигонуклеотидов 1-5 от 1рМ до ЮрМ не вызывает качественных отличий в продуктах PCR: доминирует зона псшшуклеотидного материала, со-этветствутацая гену зглйка С. Увеличение количества исходных'драйверов до 25рМ приводит к наработке только следовых количеств фрагмента, соответствующего гену зглина С. Дальнейшее повышение количества олигонуклеотидов в амшгафикаяиояной смеси до 50рМ зкончательно подазлшет образование целевого двуцепочечюго фраг-«ента.

Таким образом, изучение эффективности сборки гена зглина С b ¡ависидости от концентрации исходных олигонуклеотидов, а также мо-1ельные сборки с участием системы праймеров А+В+/А~В_ указывают на •о, что сборка достаточно протяженных фрагментов-ДНК эффективно роисходит при значениях концентрации олигонуклеотидов до Ю-8 - -0-7М. При более высоких количествах олигонуклеотидов выход це-евого дуплекса резко уменьшается.

Сборка гена эглшна С с применением Т4-ДНК-лигазы выполнена в ачестве контрольного эксперимента. Олигонуклеотиды 2 и 3 были осфорилированы с помощью Т4-полинуклеотидкиназы. После термичес- ' эй ийактивации полинуклеотидкиназы'В реакционную смесь были до-авлены по 80рМ олигонуклеотидов 1, 4, 5 и проведен отжиг плавным снижением температуры (2 часа) от 90° до 25°С. Олигонуклеотиды 1, и 3, кодирующие структурную часть гена, были соединены' в поли-гклеотидную цепь с помощью Т4-ДНК-лигазы (16 часов при 4°С). Пос-: завершения реакции лигазную смесь разбавили дистиллированной )дой и использовали в качестве матрицы при проведении PCR.

Амплификация проведена в обьеме 50мкл, краевые праймеры 1зяты в количестве по 50рМ. PCR выполнена в следующем жиме (сек/°С): первоначальный нагрев 60/94, 3 цикла - 45/94, /45 и"50/72; 20 циклов - 45/94, 60/55, 90/72.

_д -а -» -Ч -1-1

>/№» а-ш яв ю г,5« 5-ш

Рис 4 Электрофоретический анализ продуктов амплификации олиго-нуклеотидов в 1,52 агарозном геле. Над треком указана молярная концентрация каждого из олигонуклеотвдов в реакционной смеси.

Оптимизация условий получения протяженных фрагментов прямой амплификацией синтетических олигонуклеотидов позволила-провести синтез двух вариантов гена зглина С, предназначенных для изучения экспрессии этого гена в Е. coli (олигонуклеотиды 1-7, табл.!, 260 п. осн.) и в Saccharomyces cerevisiae (олигонуклеотиды 1-5, 8, 9, табл.1, 243 п. осн.). На рис.5 представлены результаты получения с помощью PCR различных вариантов reirá зглина С. В результате, проведения амплификации в оптимальном рesms в реакционной смеси ирису тстеузт практически только целевые фрагменты ДНК.

4. ССорг.а гека й-з^лрфкяа бэз пржепезж! ■И-патпнуклестид-К12533И и Т4-£НК-%Егггзи.

С использование!! аналогичного подхода, без применения Т4-по-- линуклеотидккназы к Т4-ДНК-лигазы, была получена полкнуклеотидая последовательность, кодирующая ß-зндорфик человека.

Для перекодировки аминокислотной последовательности в- зндор-фина в полинукдеотидяую, гик и в случае гена зглина С, использовали наиболее часто встречающиеся кодоны аминокислот в геноме Е.coli (рис.б).

1 11 ' 21 31 41 51 61

TyrGlyGlyPbeMetThrSerGluLysSerGlnThrProLeuValThr acttggatccatgtacggtggcttcatgacttccgaaaaatctcagaccccgctggttac ■ • tgaacctaggtacatgccaccgaagtactgaaggctttttagagtctggggcgaccaatg "BamHl

61 ' 71 81 91 101 111 121

LeuPheLysAsnAlallelleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu : :

agacaaatttttgcgatagtaatttttgcgtatgtttttcccacttactatccagctgttat

"SalGl .

Рис.6. Последовательность фрагмента ДНК, кодирующая в-эндорфин человека.

Первичная структура синтетических олигонуклеотидов и их ориентация представлены в табл.2 й на рис.7. Только олигонуклеотиды 3 и 4 имеют комплементарные участки, олигонуклеотиды 1 и 2, 2 и 3

1 2 3 А 5

Рис.5. Зшеетрофоретическое разделение в 1,5 2 агарозном геле ва- ' риантов гена эглина С: Ген эглина С (260 п.осн.), полученный: 1 - амплификацией лигазной смеси, 2 - прямой амплификацией олиго-нумеотидов. 3 Х/РбИ. Ген зглина С (243 п.орн.), полученный: 4 - амплификацией лигазной смеси, 5 - прямой амплификацией олиго-нуклеотидов.

имеют гомологичные участки.

" Таблица 2. Структуры синтезированных олигонуклеотидов, использованных для сборки гена ß-эндорфина

Wo нуклеотидяая'псследовательность

п/п

1. ACTTGSATCCATGTACGGTGGCTTCATGACTT

2. TACGGTGGCTTCATGACTTCCGAAAAATCTCAGACCCCGCTGGTTACTCTGTTTAÂA

3. CGCTGGTT ACTCTGTTT AAAAACGCTATCATTAAAAACGCAT ACAAAAAGGGTGAA : 4. TATTGTCEACCTATCATTCACCCTTTTTGTATßCGT •.

При получении гена ß-эндорфина была применена схема ачшшфи-кационной сборки (рис.7), принципиально отличающаяся от схемы сборки полинуклеогидной последовательности зглина С. Сборка гена начинается с отжига олигонуклеотидов .3 и 4. В результате последующий полимеразной достройки олигонуклеотид 4 достраивается до дву-. цепочечного фрагмента, который отжигается с олигонуклеотидом 2. 'Таким образом, в данной схеме в'каждый последующий- цикл■амплификации вступают новые олигонуклеотиды и последовательность удлиняется от 3'- к 5'-концу фрагмента. В конечном итоге получается целевой фрагмент ДНК, кодирующий ß-эндорфин человега.

Амплификация проведена в обьеме 100мкл. В каждую реакционную смесь добавлено по 2 ед.акт. Taq-полимеразы. PCR была выполнена в следующем режиме. Олигонуклеотиды 1, 2, 3 и 4 в количестве по 1СГ2рМ амшшфицирозали по программе (сек/°С): первоначальный нагрев. 60/35, 10 циклов - 45/95, 60/50, 45/72. После этого в реакционную смесь дополнительно вносили по lOOpM олигонуклеотидов 1 и 2 и PCR была продолжена в режиме: 25 циклов - 45/95, 60/63, 45/72.

Полученный прямой амплификацией синтетических олигонуклеотидов -фрагмент ДНК был расщеплен эндонуклеазами рестрикции (BamHI и SalGI) и клонирован в составе. ДНК фгга М13 (tgl31). Первичная последовательность клонированного фрагмента, определенная по методу Сзнгера, полностью соответствовала запланированной.

5' 1 3'

5'

2 З1

3 -у

3'-

5'

РСИ

5,ВатН1 /3~Епс1огрЫп

3' —---«-<у

• БаЮ!0 •

Рис.7. Ориентация олигонуклеотидов, примененных при сборке гена В-эндорфина. Цифрами указаны номера олигонуклеотидов (табл.2)

- 17 -

Таким образом,- на основании проведенных экспериментов по ^ сборке генов зглина С и в-зндорфина, можно утверждать, что предложенные высокоэффективные варианты получения протяженных фрагментов ДНК прямой амплификацией синтетических олигонуклеотидов позволяют существенно упростить и ускорить проведение генно-инженерных ра- • бот, связанных с реконструкцией ДНК. Определена оптимальная концентрация олигонуклеотидов при проведении такой сборки.

5. . Конструирование вектора для изучения экспрессии гена зглииа С в Е. coli.

Полученный в'Результате прямой амплификации синтетических олигонуклеотидов фрагмент ДНК, содержащий ген эглина С (рис.5), был фланкирован сайтами рестрикции. EcoRI и BamHI для удобства клонирования в составе плазмиды pPR-TGATG-1 (Masbko S.V. et al.1990). Наличие в составе плазмиды.гена температурочувствительного репрес-сора X clts857 позволает. эффективно контролировать экспрессию чужеродного гена и.после, культивирования клеток E.coll•(28°С), де-. репрессировать.экспрессию, гена повышением температуры(45°С).

При клонировании чужеродного гена в составе вектора pPR--TGATG-1 необходимо было проводить ряд технически сложных экспериментов; обеспечивающих точную -состыковку TGATG-последовательности с клонируемой последовательностью. Ранее это достигалось расщеплением плазмиды зндонуклеазой рестрикции Sac 1с последующим затуплением. "липких" концов ДНК. Последующее клонирование фрагмента ДНК осуществляли по "тупым" концам. Известно, что такого рода клониро-. ..вание может:_приводить .к неоднозначным результатам и осложняет последующий. скрининг трансфорыантов.

Для того, чтобы избежать этих операций при планировании синтеза гена эглина С, в его первичную последовательность исходно были заложены регуляторные элементы (SDtrpD, 'trpE) и необходимые • -..сайты эндонуклеаз.рестрикции.EcoRI и._Ваз]Н1. Внесенные изменения существенно упростили. .получений рекомбинантной плазмиды pTEG.

После расщёшхения. фрагмента ДНК, содержащего ген зглина С, и _ шгаашдвой .ДНК зндонуклеаззмн рестрикции EcoRI и BamHI, проводшш •цитирование, с использованием Т4-ДНК-1игазы. Структура полученного вектора изображена.на рис.8. Полученной смесью трансформировали штамм E.coli TG-1. Скрининг трансформантов с целью отбора целевых плазмид проводили гибридизацией In situ с использованием биотини-

iE. з А s

Рис. 8. Об:цая схема экспрессионного вектора pTEGl и анализ белков клеточных лизатов штамма-продуцента зглкиа С (pTEGl): 1 - общий лизат белков биомассы до термоиндукции; 2 - спесь белков маркеров (14,4, 20,1 30, 43 и 94 кДа~); 3,4 - общий лизат биомассы после термоиндукции 3 и 7 часов; 5 - лизат биомассы Е. coli XL1.

лированного праймера.

6. Синтез биоткнилированннх олигонуклеотидных зондов.

Как правило, введение биотина и иных репортерных групп осуществляли модификацией гетероциклических оснований либо модификацией 3'- или 5'- конца олигонуклеотида. Эти методы довольно трудоемки, дорогостоящи, многостадийны и зачастую не позволяют использовать модифицированный олигонуклеотид для дальнейших ферментативных реакций in vitro, что существенно сужает круг задач, решаемых с помощью олигонуклеотидного зонда. Кроме того, не все репортерные группы могут быть подвергнуты обработке реагентами, используемыми на стадиях конденсации и при деблокировании олигонуклеотидной цепи. Все зто предопределило актуальность разработки метода получения нерадиоачтивно меченных олигонуклеотидных зондов, лишенного вышеуказанных недостатков.

При разработке такой схемы мы избрали получение аминоолиго-нуклеотидов, как промежуточных соединений. Несмотря на то, что олигодезоксирибонуклеотид является соединением с достаточно большим количеством реакционных центров, наиболее подходящей для проведения подобной модификации является межнуклеогидная фосфатная группа,т.к. при этом остаются открытыми важные.для ферментативных реакций 5'- и З'-концевые гидроксильные группы, а также не модифицируются важные для образования комплекса ДНК-олягонуклеотид гетероциклические основания.

В качестве модифицирующего реагента нами был выбран алифатический диамин, позволяющий получить устойчивую связь по межнуклео-тидному фосфатному узлу и одновременно ввести алифатическую аминогруппу, химические свойства которой в достаточной степени отличаются от потенциально активных центров в составе олигодезоксири-Сонуклеотида. Это дало возможность в последующем провести избирательную модификацш выделенного аминоолигонуклеотида. Кроме того, эта методология не ограничивала местоположение модифицируемой фосфатной группы в олигонуклеотидной цепи, а также количество вводимых групп, что необходимо при получении различного рода адресованных реагентов на основе олигонуклеотидов.

Мы предложили вариант синтеза модифицированных олигонуклеоти-дов, содержащих алифатическую аминогруппу, введенную по межнуклео-тидной фосфатной группе в процессе твердофазного наращивания оли-

гонуклеотидной цепи (рис.9). После проведения конденсации по Н-фосфонатной схеме, введение аминогруппы осуществляли обработкой полимерного носителя 0,3 М раствором 1,7-гептаметилендиамина в присутствии иода либо с использованием реакции Атертона - Тодда.

Для предотвращения побочных процессов, которые могли бы протекать по аминогруппе при дальнейшем нарапшваяии олигонуклеотидной цепи, введенные аминогруппы блокировали трифторацетильными остат- -ками, удаляемыми в процессе стандартной обработки олигокуклестид-ной цепи концентрированным, водным раствором аммиака. После проведения келирования синтез продолжали по фосфитамиднок шш Н-фосфонатной схеме до получения целевого олигонуклеотида.

В качестве модельного олигонуклеотида был выбран "универсальный праймер" d(GTAAAACGACGGCCAGT), используемый при определении первичной последовательности ДНК по Сзнгеру. Введение аминогруппы осуществляли как по центральному, так и по 5'-концевому фосфодиз-фирным узлам аяигануклеотидной цепи (рис.9). Выделение синтезированных олигодегоксирибонуклеотидов (I) к (II), несущих модификацию по межнуклеотиднои фосфатной группе, проводили препаративным электрофорезом. в ЛААГ. Здекгрофоретическая подвижность модифицированных олигонуклеотвдоЕ (I) и (II) одинакова, но существенно меньше по сравнению с соответствующим немодкфицированным олигомером, что упрощает процедуру их идентификации и выделения.

С. цель» проверки эффективности предлагаемой методологии на основе синтезированных модифицированных олигонуклеотидов были получены биотшшшрованные зонды. Введение биотинового остатка осуществляли обработкой выделенных аминоолигонуклеотидов раствором N-оксисукцинимидного эфира биотипа. Биотинилированные олигонуклео-.тиды (III) и (IV) выделяли с помощью обрзщенно-фазовой ВЗНХ. Биотип был выбран в качестве репортерной группы с учетом его высокого сродства со стрептавидином: константа диссоциации такого комлекса составляет 10"14 М.

При введении.СЭ2Р]-фосфатной группы по 5'-концу полученных биотинилированвых олигодегоксирибонуклеотидов с помощью полинукле-отидкиназы фага Т4 нами было обнаружено, что в отличие от модифицированного по центральному фосфатному остатку олигонуклеотвда, его изомер, несущий модификацию по 5"-концевому фосфодизфирному узлу, не.вступал, в.реакцию.ферментативного фосфорилирования. Поэтому, во избежание неоднозначных результатов при использовании ки-назы или полимеразы, взодимая модифицирующая группа не должна на-

Р~Т —> наращивание олигонуклеотидной цепи по фосфитамидной

00 00 000 0 схеме —> Т-р-С-р-А-р-С-р-С-р-С-р-С-р-С + Ше0)2ТгА-р-0"—>

СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ

0000 0 000 -> Р^Т-р-С-р-А-р-С-р-С-р-С-р-й-^-С-р-АТг (МеО) г 11111111 СЕСЕСЕСЕСЕСЕСЕН

00000000 -> Р~Т-р-а-р-А-р-С-р-С-р-С-р-С-р-С-р-АТт (МеО) 2 11111111 . СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ тЧШ2)7-ШС-СР3

-> продолжение наращивания олигонуклеотидной цепи по фосфитамидной

Н

1.Ш2-(СН2)7-Ш2 ->

2. (СР3С0)2

8-

или Н-фосфонатной схеме

МНд

I (II) +

II

Оч

о-в^

и

о

-с

(1 (СрТрАрАрАрАрСрСрАрСрСрСрСрСрАрБрТ) I

(I) №ЫСН2)7-Щ>

(КСрТрАрАрАрАрСрСрАрСрСрБрСрСрАрСрТ) I

Ш-(СН2)7-КН2 (II)

(1 ((ЗрТрАрАрАрАрСрСрАрСрСрСрСрСрАрСрТ) I

Ш-(СН2)7-Ш-ВШ

(3 (БрТрАрАрАрАрСрСрАрСрСрСрСрСрАрСрТ) I

"Ш-(СН2)7-Ш-В^

Рис. 9. Схема синтеза аыиноолигонуклеотидов и нерадиоактивно меченых (биотинилированных) зондов на их основе.

- 22 -

холиться вблизи 5'- или 3'-концов праймеров.

На рис.10 приведены кривые плавления, биотинилированного (III) и немодифйцированного "универсального." праймеров. Оба прай-мера были фосфоршшрованы [32РЗ. Из приведенных кривых плавления следует, что температуры плавления комплексов одигонуклеотид/ДНК существенно, не отличается друг от друга.' Полученные данные, показывают, что модифицированный.по предложенной схеме биотинилированный • .пранмер .можно .использовать в стандартных для олигонуклеотидов условиях отжига.

Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды (III) и (IV) были использованы лакже при определении первичной последовательности ДНК. В.качестве-контроля .в этом .случае применяли немадифицированный "универсальный праймер". При этом оба биотинилированных олиго-вуклеотвда (III) м (IV) обеспечивали прайнирование и позволяли однозначно определить первичную структуру исследуемого участка ДНК. ' Детекцию в этом случае осуществляли радиоавтографией. .....С. использованием .разработанного метода был синтезирован биотинилированный. праимер, аналогичный праймеру 4 табл.1. Этот био' тивсодержащкй зонд использовали для проведения скрининга in situ при поиске клонов Е. coli, содержащих плазмиду pTEG. Для сравнения чувствительности радиоактивного и нерадиоактивного методов выявления комплексов ДНК-сишгонуклеотид, биотинилированный праймер бьщ фйсфоршшроваа введением L32P3-фосфатной группы. Выявление наличия ..комплексов. олигонуклеотид-ДНК проводили вначале радиоавтогрзфией, а затем гот же. фильтр обрабатывали раствором конъюгата стрептави-дин-щелочная фосфатаза. Безусловно, чувствительность выявления с помощью радиоавтографии выше, чем в случае выявления остатка биотина, но все основные положительные сигналы в двух вариантах выявления совпадают.

Таким образам, предложена новая схема твердофазного синтеза . яминоодигонукяеотидов.-и нерадиоактивно меченных зондов на их осно-. ве.. Получаемые олиговуклеотидвые вонды могут быть использовавы . практически.во -всех, ферментативных реакциях, применяемых в генной инженерии (кштрование, элонгация полимеразаыи, включая амплификацию), и, следовательно, лишены-большинства ограничений, присуща меченных по 5'-, 3'- концевым гироксильным группам или гетероциклическим основаниям одигонуклеотидаы.

7. Исследование экспрессии гена аглина С в Е. coli.

! cpm X 1000 ' cpm

T°C

—— Series 1 —f—Series 2 Series 3

Рис. 10. Кривые температуры плавления комплекса ДНК-праймер: 1 - немодифицированный."универсальный" праймер; 2 - биотиня-лироваяный "универсальный" праймер (III, рис.9); 3 - неспецифическая сорбция олигонуклеотида на нитоцеллшозном фильтре.

5 отобранных скринигом In situ бактериальных клонов культивировали в LB и из полученной биомассы выделали плазмиду. Определе-. ние первичной последовательности клонированного фрагмента по Сзн-геру подтвердило соответствие, полученной последовательности и запланированной в эксперименте во.всех пяти клонах. Выделенной плаз-мидой трансформировали штаммы Е. coli TS-1 и XL-1 неполученные таким образом штаммы-продуценты культивировали в колбах в среде LB. Анализ содержания эглина в полученных биомассах шташов-продуцен-тов показал,. что jb Т6-1 уровень биосинтеза достигал бмг/г сырой биомассы, а в штамме XL-1 - 9мг/г. Исходя из этих данных, в качестве экспериментального штамма-продуцента для дальнейших исследований был выбран штамм на основе XL-1 (рис.8).

С целью наработки опытной партии эглина С штамм-продуцент культивировали в лабораторных ферментерах (лай. оптимизации процессов ферментации ГосНШгенетика, зав.лаб. Соколов А.К.). Посевным материалом служила культура продуцента, выращенная на L-бульоне в колбах на качалке при температуре 28°С ("ночная" культура). Непосредственно после посева в культуральную среду вводили ампициллин в количестве 0,1 г/л. Культуру выращивали до плотности А540 0,6. Затем температ/ру повышали до 45°С (добавление горячего LB) и инкубировали при этой температуре 15 минут. Затем температуру понижали до 42°С и культивирование продолжали при этой температуре еще 5-6 часов. Содержание эгдшна в клетках-Е.coli, определенное, по ингибированию а-химотрипсина, составило 11мг/г сырой биомассы, что соответствовало 100 - 110мг/д культурадьвой жидкости. Достаточно высокий уровень.экспрессии эглина С, по-видимому, определяется не.-только эффективной транскрипцией и трансляцией гена эглина С в составе ..сконструированного зкспрессиошюго вектора, но и устойчивостью синтезируемого белка к действию протеинаа Е. coli. Кроме того, высокий уровень биосинтеза эглина С позволяет утверждать, что данный белок не токсичен по отношению к Е. coli. Этот факт позволяет надеяться на создание конструкций для проведения конститутивного синтеза белка.

8. Исследование, уравия секреции аглина С в. Saccharomyces -cerevisiae.

Исследование выполнено совместно с Козловым Д.Г. (Сектор био-

технологии дрожжей,.'ГосНШгенетика, зав. сект, к.б.н. Беневоленский C.B.).

Эффективная секреция гетерологичных полипептидов в дрожжах обеспечивается сигнальной (лидерной) последовательностью дрожжевого секретируемого .белка, например, лидерным .пептидом, «-фактора.

В качестве исходного.дрожжевого.экспрессионного вектора использовали плазмиду типа YEp (Yeast Episomal Plasmid).

В результате клонирования „а составе.ллазмидн..фрагмента.243 .л.осн. (рис.5), .синтетический ген амина С был состыкован с полинук-леотидной последовательностью сигнального пептида сс-фактора, по. . добная. конструкция. обеспечивала..секрецию эглинд С.в культуральную жидкость.. Следует отметить, что-.в данном случае зглин с содержал (после зндопептидазного расщепления цепи предшественника протеазой КЕХ2 за димером Lys-Arg) N-концевой "довесок" состава Asn-Ser-Gly-Ser. Ранее в литературе было показано, что делеция первых 6-7 аминокислотных остатков в эглине С не сказывается на термо-, кисло-..тастабкльности .и .инглбирувдей. активности белка, поэтому дополнк-.. ..тельные аминокислотные остатки.не должны были сказаться на свойствах эглина С, что и .было доказано нами экспериментально.

Анализ культуральной жидкости на содержание эглина С показал, что количество секретируемого варианта эглина С составляет 6-8 мг/л. Показано также, 'Что зглин'"С в дрожжевой'культуральной жидкости стабилен, по крайней мере, в течение 60 часов при 20°С.

Хотя уровень_экспрессии-.в.зтой системе недостаточно высок, ..однако, эглин..С..можат. быть использозан в качестве репортерного гена для. оценки, эффективности .конструкций,, предназначенных для проведения гетерологичной экспрессии и секреции в дрожжах.

9. Вццеление реиоыбииантного эглнна С.

После разрушения.биомассы Е. coli ультразвуком выделение эг-_ .. лина.С .проводили.а два .этапа...На первом, этапе осаждали балластные белки смесью этилового спирта с водой (8:1), при этом эглин С оставался в растворе. После, центрифугирования водно-спиртовый раствор упаривали"на ротационном испарителе. На втором этапе эглин С .. очишдди гель-фильтрацией, на хроматографической колонке с Сефадек-сом G-50. В качестве злюента использовали 0,1М раствор уксусной кислоты в__воде.. Присутствие эглина С.в элгаате подтверждали по ин-гибированию гидролиза хромогенногосубстрата а-химотрипсином.

- фракции, содержащие эглин С, объединяли .и лиофшшзировали.

Образцы выделенного рекомбинавтного белка имейт идентичную электрофоретическую подвижность с рекомбинантныы эглином С фирш "Sigma" (рис.11).

10,.. Ияклпдпвянир. баштгнческой ашзпшосхн реионбкиаит-ного зглина С.

_ . Активность, полученного зглина С тестировали по ингибировангео -бычьего а-химотрипсина и свиной панкреатической гластазы. В качестве .хромогенного-субстрата был. использован Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-.-ргнитроаншшд.. В экспериментах всегда присутствовал референс-пре-парат, в качестве которого использовали рекомбинантный эглин С фирмы "Sigma" (США).

На рис.12 приведены кривые ивгибирозания полученным рекомби-нантным эглином а-химотрипсина и элаптазы, соответственно. Хорошое совпадение кривых ингибирования в сравнении с референс-препаратом свидетельствует об идентичности ингибирующеи активности образцов полученного рекомбинантного эглина С и рекомбинантного зглина С фирш "Sigma".

Т.о. в результате выделения получен рекомбинантный эглин С идентичный по своей гомогенности и биологическими свойствам'реком-бинантному эглину С фирмы "Sigma".

1 Z Ъ 4 hi

Рис.11. Злектрофоретическое разделение белков: 1, 2 - выделенный рекомбинантный эглин С; 3 - рекомбинантный эглин С ("Sigma", США); 4 - белки-маркеры.

chymotrypsin

*f 1ш С, mkf

8»rk»t 1 -1- Series 2

rSflin С гГ;Ьл С,

А 405 пта ELASTASE

Zflla С. mXg

Рис.12. йнгибирование ферментативной активности а-химотрипсина (А) и зластазы (Б): 1 - рекомбинантный эглин С; Z - рекомбинантный эглин С, "Sigma", США.

1. Предложены варианты метода.получения протяженных фрагментов ДНК из синтетических олигодезоксирибонуклеотидов без применения Т4-полинуклеотидкиназы и Т4-ДНК-лигазы, Определены оптимальные -условия проведения-яикай. сборки_4>рагыентов ДКК. Z. С использованием предложенного подхода получены синтетические последовательности тенов. эглина С (специфического ингибитора протеиназ) и 0-эндорфина человека. .

3. Сконструированы „векторы для.экспрессии эглина С в Е. coli и —Saccharomyces cerevisiae. На_основе.. зкспрессионных веторов и соответствующих. штаммов-реципиентов созданы штаммы-продуценты эглина С. Показано, что уровень экспрессии гена эглина С в E.coli составляет НОмг/л культуральной жидкости (В-6842). Уровень секретируемого Saccharomyces cerevisiae эглина С составлял б-8мг/л культуральной жидкости.

4.. Отработана схема выделения, эглина С из биомассы Е. coli. Эглин С выделен в гомогенном состоянии.

5. Исследована, ингибирующая активность полученного рекомбинантного эглина С по отношению к «-хиыотрипсину и зластазе. Показана идентичность ингибирующих свойств полученного рекомбинантного полипеп-. тида и зглина С фирмы "Sigma" (США).

6. Разработана новая схема твердофазного синтеза алшоолигонуклео-тидов. Алифатическая аминогруппа группа по разработанной схеме вводится ло. межнуклеотидной фосфатной группе, оставляя, тем самым,

' ^модифицированными 5'- и З'-концевые гидроксильные группы и гетероциклические основания олигонуклеотидов. На основе аминоолигонук-леотидов получены биотиншшрованные олигонуклеотидные зонды. Показано, что такие олигонуклеотиды, в отличие от описанных в литературе, могут быть использованы практически во всех генно-инженерных работах.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Вейко В.П., Ратманова К.И., Осипов A.C. "Твердофазный синтез биотинированных олигодезоксирибонуклеотидов." Перспективные направления и новые.методы в молекулярной биологии, г.Рига, • 4-11. 11. 1990., с. 57.

- 30 -

2. Вейко В.П., Ратманова К.И., Осипов А.С., Вейко Н.Н., Карпухин А.В., Дебабов В.Г. "Твердофазный синтез биотинираванных олигодезоксирибокуклеотидов." .Докл. АН СССР,1990, т.313 N1,с.214-216.

3. Вейко В.П. .Ратманова К.И., Осипов А.С..Буленков М.Т., Пугачев В.В. "Направленное введение аминогрупп по межнукдеотидной фосфатной группе при твердофазном синтезе олигодезоксирибонуклео-твдов. Получение биотинилированных олигонуклеотидиых зондов." , Биоорганическая химия 1991,т.17, N5, с. 625-629.

4. VeikoV.P., Ratmanova К.I., Osipov A.S. "Simple solid phase synthesis of biotinylated oligonucleotides", Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application, Moscow, 23-30. 06. 1991, p. 119

5. Veiko V.P., Ratmanova К. I., Osipov A.S. "Simple solid phase synthesis of amino-oligonucleotides for obtaining non-radioactive probes", Nucleic acids Research, Symposium series No 24, 1991, p.237

6. Veiko V.P., Osipov A.S., Schechter I.I., Bulenkov M.Î., Ratmanova К.I., Errais L.L. "Synthesis and expression of the protease inhibitor eglin С gene. Using eglin С for Structure-functional investigation of proteins. "Thirteenth American Peptide Symposium". Abstacts. Edmonton. Alberta. Canada.1993. p. 2-207.

7. Осипов А.С., Гулько Л.Б., Окорокова H.А., Вейко В.П. "Химический синтез гена эглина С и экспрессия в E.coli", Новые направления в биотехнологии, г._ Пущине, 24-26. 05. 1994., с. 110.

8. Вейко В.П., Осипов А.С., Шехтер И.И., Буленков М.Т., Ратма-. нова К.И., Гулько Л.Б., Чибискова Н.А., Зрраис Л.Л., Деревшдаова

Е.Б., Дебабов В.Г. "Химический синтез гена ингибитора протеиназ (эглин С) без использования Т4-ДНК-лигааы и его экспрессия в Е. coli", Биоорганическая химия, 1994 (в печати).