Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы E. coli и ее мутантных форм

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Мельников, Эдвард Эдуардович

Список сокращений

Введение

Структура и функция АТР-зависимых протеиназ Е. coli обзор литературы)

1. Сериновая Ьоп-протеиназа

1.1. Эндогенные субстраты Ьоп-протеиназы

1.2. Ферментативная активность Ьоп-протеиназы in vitro

1.3. Структура пептидгидролазного центра Ьоп-протеиназы

2. Металлозависимая FtsH-протеиназа

3. С1р-протеиназы

3.1. АТР-азные компоненты С1р(А/Х)Р-протеиназ

3.2. Пептидгидролазный компонент сериновых С1р(А/Х)Р-протеиназ

3.3. Треониновая HslUV (ClpYQ)-npoTenHa3a

4. Структурная гомология регуляторных компонентов

АТР-зависимых протеиназ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы E. coli и ее мутантных форм"

Функционирование иротеолитических ферментов внутри клетки направлено на поддержание гомеостаза. Условно можно выделить две основные функции протеиназ, имеющие существенное значение для жизнеспособности организмов: регуляторную и деструктивную.

В первом случае протеолитические ферменты осуществляют процессинг белков и контроль содержания в клетке регуляторных белков.

Во втором случае протеолиз позволяет устранять нефункциональные "балластные" белки, образующиеся, например, при случайной ошибочной экспрессии генов, в результате временного пребывания организма под влиянием общих факторов стресса (биохимическое голодание, экстремальные значения температуры, повреждающее излучение, химическое воздействие и т.п.), или чужеродные белки. Деструктивный протеолиз носит "защитный" характер и направлен на обеспечение организма аминокислотным и пептидным материалом.

Установлено, что ключевую роль при внутриклеточном протеолизе играют энергозависимые ферменты, сопрягающие протеолитическую активность с гидролизом АТР. Эти протеиназы отличаются достаточно сложной структурной организацией, выраженной субстратной селективностью и выполняют, по-видимому, комплексную функцию (проявляют свойства и деструктивных протеиназ и регуляторных).

Lon-протеиназа Е. coli - первый обнаруженный представитель АТР-зависимых протеиназ. Можно указать на следующие структурно-функциональные особенности этого фермента, отличающие его от классических протеиназ: (1) зависимость протеолиза от гидролиза АТР; (2) высокая селективность по отношению к белкам-мишеням; (3) процессивный характер деградации белков при отсутствии специфичности по отношению к расщепляемой пептидной связи; (4) наличие четвертичной структуры (гомоолигомер); (5) локализация АТР-азиого и пептидгидролазного центра в пределах одной полипептадной цепи.

В настоящее время установлено, что ферменты, сопрягающие протеолитическую активность с АТР-азной (в том числе и Lon-протеиназы) широко представлены в клетках самых разнообразных организмов. В Е. coli обнаружено уже несколько АТР-зависимых иротеолитических ферментов.

Несмотря на относительные успехи в изучении функции этих ферментов на клеточном уровне методами биохимической генетики, основные молекулярноэнзимологические проблемы, общие для АТР-зависимых протеиназ, во многом не решены и представляют собой весьма актуальную научную задачу. Важное значение имеют вопросы, связанные с выяснением принципов узнавания этими ферментами своих субстратов (проблема селективности) и принципов сопряжения гидролиза АТР и протеолиза (проблема сопряжения).

В представляемой работе эти проблемы рассматриваются при исследовании функционирования in vitro Lon-протеиназы Е. coli.

Структура и функция АТР-зависимых протеиназ Е. coli (обзор литературы)

Внутриклеточный протеолиз играет важную роль в поддержании определенного уровня белка, необходимого живой клетае [1]. Можно выделить следующие группы белков, подвергающиеся внутриклеточной деградации:

1) нефункциональные (аномальные) белки (неправильно свернутые и мутантные белки, белки, синтезированные с аномальными аминокислотами, укороченные белки); такие белки являются нестабильными и подвергаются быстрой деградации как у прокариот, так и у эукариот [1,2];

2) короткоживущие белки, необходимые клетке в течение ограниченного периода времени или при специфических метаболических условиях (примерами таких белков служат белки, выполняющие свои функции в условиях стресса [3]);

3) белки, "лишенные партнеров", стабильные в составе олигомерных комплексов отдельные субъединицы таких белков, образующиеся в результате недостаточного или избыточного биосинтеза, подвергаются быстрой деградации и считаются "условными субстратами" [4].

В цитозоле, ядре и митохондриях эукариотических клеток и в цитоплазме бактериальных клеток внутриклеточная деградация осуществляется главным образом мультимерными АТР-зависимыми протеиназами. Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТР. Это свойство АТР-зависимых протеиназ выделяет их в особую группу протеолитических ферментов. Среди ферментов из прокариот наиболее исследованы Lon- и С1р-протеиназы Е. coli [5]. У эукариот значительная часть внутриклеточного протеолиза осуществляется 26S протеасомными комплексами [6].

В представляемом обзоре обобщены сведения о структурной организации и основных свойствах энергозависимых ферментов внутриклеточной деградации белков, функционирующих в Escherichia coli.

В клетках Е. coli обнаружено несколько растворимых АТР-зависимых протеиназ [7-12]: Lon, ClpAP, ClpXP (сериновые протеиназы) и HslUV (или ClpYQ, каталитически активный остаток пептидгидролазного центра - треонин). Обнаружена также мембрано-связанная Zn-зависимая металлопротеиназа - FtsH (или Hfl В) [13].

В Lon- и FtsH-протеиназах протеолитический и АТР-азный центры локализованы в одной полипептидной цепи, и эти ферменты функционируют как гомоолигомеры (иногда их относят к внутриклеточным белкам типа AAA

ATPase Accosiated with a variety of cellular Activities).

ClpAP, ClpXP и HslUV (ClpYQ) относятся к типу протеиназ, связанных с шаперонами (Chaperon Linked Proteases), и представляют собой гетроолигомеры, состоящие из протеолитических (ClpP и HslV) и регуляторных (ClpA, ClpX и HslU) субъединиц. Регуляторные субъединицы (АТР-азы) обладают шапероноподобными свойствами.

In vivo АТР-зависимые протеиназы проявляют высокую селективность по отношению к своим белковым мишеням: Lon-протеиназа участвует в деградации белков SulA [14], RscA [15], N-белка фага X [16]; субстратами протеиназы ClpAP in vivo являются MazE [17] и некоторые гибридные белки, полученные на основе ß-галактозидазы [18]; ClpXP проявляет избирательность по отношению к О-белку фага X [10, 19], а также к ряду других белков [20-22]; одним из установленных субстратов FtsH является фактор с32 [13, 23].

Наряду с протеолизом, рассматриваемые протеиназы (по результатам исследования как in vivo, так и in vitro) могут осуществлять АТР-зависимое изменение конформации белков (белковое ремоделирование), функционируя, таким образом, подобно молекулярным шаперонам [24].

1. Сериновая Lon-протеиназа

Ьоп(Ьа)-протеиназа из E.coli - исторически первая энергозависимая протеиназа [25-27], выделенная из экстрактов E.coli как фермент, требующий наличия АТР для деградации казеина [26]. Протеиназа La впоследствии была идентифицирована в работах [26, 27] как продукт гена Ion и получила название Lon-протеиназы.

Клонирование гена Ion и определение его структуры было осуществлено одновременно в лаборатории химии протеолитических ферментов Института б.иоорганичеек0Н,химви.■.■РАН-[28.]. и вл1абаратории,-проф^ АХ^. Goldberg^ США. .

29]. ." . . 7 ^ . "V :

Регуляторная последовательность гена Ion содержит--418-п.н. Структурная часть этого гена кодирует белок, состоящий из 784 аминокислотных остатков [28]. Анализ первичной структуры Lon-протеиназы с учетом данных о ее ферментативной активности позволил выдвинуть предположение о том, что субъединица Lon-протеиназы имеет функционально-доменную организацию [30] и состоит из центрального АТР-азного домена (A-домен), содержащего так называемые мотивы Уолкера А и В, ответственные за продуктивную для гидролиза АТР координацию трифосфата нуклеотида и иона Mg2+ в АТР-азном центре [31]; С-концевого - протеолитического домена (Р-домен), включающего каталитически активный остаток серина 679 [32] (рис.1); N-концевой часта (N-домен), вариабельной в подсемействе Ьоп-протеиназ.

1 107 566 784

Мотив А Мотив В

Рис. 1. Схема строения Lon-протеиназы Escherichia coli. Показаны границы предполагаемых доменов, локализация мотивов А и В Уолкера и фрагмента, включающего каталитический остаток серина.

По первичной структуре Ьоп-протеиназа не обнаруживает гомологии с другими известными протеиназами (в том числе и сериновыми). Молекула фермента представляет собой гомоолигомер, образованный субъединицами с молекулярной массой 87,4 кДа. Методом гель-фильтрации в препаратах Lon-протеиназы были обнаружены тетра- и октамерные формы [33]. Физиологически активная форма Ьоп-протеиназы, вероятно, представляет собой тетрамер [34, 35]. Существуют наблюдения, свидетельствующие в пользу кооперативного функционирования активных центров фермента [33, 34].

Интересное и малоизученное свойство фермента - его способность связываться с ДНК [36]. Следует отметить, что впервые Ьоп-протеиназа была выделена именно как ДНК-связывающий белок [37], что, в свою очередь, позволило предположить ее участие в регуляции экспрессии генов. В работе [36] показано, что одноцепочечпая ДНК активирует протеолитическую и белок-активируемую АТР-азную активность фермента; мРНК и тРНК не обладают таким действием [33]. В работе [38] установлено, что Ьоп-протеиназа специфически связывается с TG-богатыми участками нуклеотидной последовательности ДНК. Физиологическая роль связывания ДНК к настоящему времени не определена.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мельников, Эдвард Эдуардович

выводы

1. Изучены кинетические аспекты функционирования Ьоп-протеиназы. Выявлена регуляторная роль свободных ионов Mg2+ - активатора протеолитической и пептидгидролазной активности фермента и ингибитора базовой АТР-азной активности (для физиологических концентраций АТР и магния). Показано, что активация гидролиза АТР при связывании белкового субстрата сопровождается устранением ингибирующего действия ионов Mg2+.

2. Получены и охарактеризованы формы Ьоп-протеиназы E.coli с мутациями в АТР-азном домене: K362Q, Т363А, D387N, D423N, Y493F. Установлено ключевое значение остатков К362 и Т363 из мотива А Уолкера АТР-азного центра не только для катализа гидролиза АТР, но и для сопряжения гидролиза АТР и протеолиза. Показано, что остаток D387 не является каталитически активным, как было постулировано в литературе. Продемонстрировано формальное участие в системе передачи сигнала остатков D423 из мотива В Уолкера и Y493.

3. Выявлено отсутствие прямой корреляции между АТР-азной и пептидгидролазной активностями при функционировании как нативного фермента, так и его мутантных форм.

4. Подтверждено существование в Ьоп-иротеиназе дополнительного центра связывания белкового субстрата, локализованного вне протеолитического домена фермента.

5. Показано, что мутации в АТР-азном центре Ьоп-протеиназы понижают стабильность четвертичной структуры фермента. Высказано предположение о локализации АТР-азных центров в области контакта субъединиц.

6. Обнаружено, что ADP-Mg- (ингибитор нативной Ьоп-протеиназы) активирует пептидгидролазный центр в субъединице фермента, содержащего мутацию K362Q. Постулировано существование в нативном ферменте двух путей передачи сигнала ог АТР-азных центров к протеолитическим виутрисубъединичного и межсубъединичного.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Мельников, Эдвард Эдуардович, Москва

1. Goldberg A.L. Degradation of abnormal proteins in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1972, v.69, pp.422-426.

2. Goldberg A.L., John ASC. Intracellular protein degradation in mammalian and bacterial cells // Ann. Rev. Biochem., 1976, v.45, pp.747-803.

3. Gottesman S., Maurizi M.R. Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets // Microbiol.Rev., 1992, pp. 592-621.

4. Gottesman S. Proteases and their targets in Escherichia coli II Ann. Rev. Genet., 1996, v. 30, pp. 465-506.

5. Maurizi M.R. Degradation in vitro of bacteriophage lambda N protein by Lon protease from Escherichia coli II J. Biol. Chem., 1987, v. 262, pp. 2696-2703.

6. Koster A.J., Walz J., Lupas A., Baumeister W. Structural features of the archaebacterial and eukariotic proteasome // Mol. Biol. Rep., 1995, v. 21, pp. 120.

7. Goldberg A.E. The mechanism and functions of ATP-dependent proteases in bacterial and animal cells // Eur. J. Biochem., 1992 , v. 203, pp. 9-23.

8. Gottesman S., Maurizi M.R. Regulation by proteolysis: Energy-dependent proteases and their targets // Microbiol. Rev., 1992 ,v. 56, pp. 592-621.

9. Maurizi M.R. Proteases and protein degradation in Escherichia coli II Experientia, 1992, v. 48, pp. 178-201.

10. Wojtkowiak D., Georgopoulos C., Zylicz, M. ClpX, a new specificity component of the ATP-dependent Escherichia coli Clp protease, is potentionally involved in X DNA replication // J. Biol. Chem., 1993, v.268, pp. 22609-22617.

11. Kessel M., Wu W.-F., Gottesman S., Kocsis E., Steven A., Maurizi M.R. Six-fold rotational symmetry of ClpQ, the E.coli homolog of the 20S proteasome, and its ATP-dependent activator, ClpY // FEBS Lett., 1996, v. 398, pp. 274-278.

12. Mizusawa S., Gottesman S. Protein degradation in Escherichia coli : the lon gene controls the stability of the SulA protein // Proc. Natl. Acad. Sei. USA,1983,v. 80, pp. 358-362.

13. Torres-Cabassa A.S., Gottesman S. Capsule synthesis in Escherichia coli K-12 is regulated by priteolysis // J. Bacteriol., 1987, v. 169, pp. 987-989.

14. Gottesman S., Gottesman M.E., Shaw J. E., Pearson M.L. Protein degradation in E. coli: the lon mutation and bacteriophage lambda N and ell protein stability // Cell, 1981, v. 24, pp. 225-233.17