Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные исследования АТФ-зависимой LON-протеазы ESCHERICHIA COLI

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные исследования АТФ-зависимой LON-протеазы ESCHERICHIA COLI"

p'rfi OA-

v » u Московский

д. n ^3§лсип Трудового Красного Знамени 2 ^ _Физико-Технический Институт

на правах рукописи

УДК 577.32.4: 577.34.52.0: 577.152.34:577.152.361:577:29

Лыков Игорь Петрович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АТФ-ЗАВИСИМОЙ LON-ПРОТЕАЗЫ ESCHERICHIA COLI.

03.00.02 - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА 1995

ч

Работа выполнена в Лаборатории Химии Протеолитических Ферментов Института Биоорганической Химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук.

Научный руководитель: доктор химических наук Гуревич А.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Месянжинов Вадим Викторови кандидат биологических наук Втюрин Николай Николаевич.

Ведущая организация:

Кафедра химической энзимологии Химического Факультета Московского Государственного Университета им.М.М.Ломоносова

Защита диссертации состоится 13 июня 1995 года в 14 часов 30 минут на заседании спецз зированного ученого совета К 063.91.10 при Московском Физико-Техническом Институ адресу: г.Долгопрудный Московской области, Институтский пер, д.9., аудитория 113.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московскского Физико-Технического Института.

Автореферат разослан: 5 мая 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 063.91.10

кандидат физико-математических наук Киреев В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Исследование процессов протеолитического расщепления белковых молекул в клетках является одной из важных задач современной биохимии.

Последние годы все большее внимание исследователей привлекает протеолитическое разрушение чужеродных, регуляторных и утративших свои биологические функции белков - так называемая протеолитическая деградация.

Этот вид протеолиза широко распространен в живой природе, причем при исследованиях на клетках прокариотов было установлено, что до 90% протеолитической деградации сопряженно с гидролизом АТФ.

Ферменты, осуществляющие АТФ-зависимый протеолиз в прокариотах наиболее хорошо исследованы в Е.соН. Одним из представителей класса АТФ-зависимых протеиназ является Ьоп-протеаза Е.соН. Она является первым ферментом этого класса, который был выделен в чистом виде, охарактеризован энзиматически, и для которого была определена аминокислотная последовательность.

Ьоп-протеаза является представителем уникального класса протеолити-ческих ферментов, в которых в одной полипептидной цепи присутствуют два различных, но функционально взаимосвязанных активных центра.

Установлено, что Ьоп-протеаза является сериновой протеиназой и осуществляет гидролиз чужеродных, мутантных и некоторых регуляторных белков. При дальнейших исследованиях оказалось, что Ьоп-протеаза не только выполняет функции деградации неактивных белковых молекул, но и влияет на протекание многих других процессов жизнедеятельности клетки.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в изучении свойств и структурных особенностей Ьоп-протеазы, многие аспекты строения и функ-

ционировакия фермента до сих пор остаются неясными. Из-за высокой лабильности функционально активного комплекса Ьоп-протеазы и невысокого уровня содержания фермента в клетках практически отсутствуют данные о вторичной и третичной структуре протеазы. Сложности, возникающие при выделении и очистке фермента, а также большие размеры молекулы (784 а.к.) не позволяют исследовать пространственное строение Ьоп-проте-азы методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса. В настоящее время строение активных центров Ьоп-протеазы и локализация аминокислотных остатков, принимающих участие в катализе точно не установлены. Существует также ряд теоретических положений о структурно^-функциональных особенностях Ьоп-протеазы, не подтвержденных экспериментально. В последнее время появилось значительное количество данных о первичных структурах родственных Ьоп-протеазе ферментов, выделенных из разных источников. Однако публикации имеют ориентацию на определение первичных структур, а не на анализ данных. Поэтому подробный сравнительный анализ всех известных аминокислотных последовательностей АТФ-зависимых Ьоп-протеаз до сих пор не осуществлялся.

Из вышеизложенного следует, что систематический компьютерный анализ аминокислотных последовательностей, исследование структурно-функциональных особенностей Ьоп-протеазы, расчет элементов ее

пространственной структуры_и—экспериментальная—проверка—гипотез—а

строении и локализации активных центров фермента являются актуальной проблемой для изучения как молекулярных механизмов, так и молекулярной эволюции ферментов протеолиза.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Данную работу проводили в рамках осуществляемых в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН комплексных исследований АТФ-зависимых протеолитических ферментов.

Целью работы является:

1. Проведение систематического сравнительного анализа первичных структур Lon-протеаз, полученных из различных источников и построение филогенетического дерева семейства Ьоп-протеаз.

2. Построение модели вторичной структуры Ьоп-протеаз и определение границ функциональных доменов.

3. Получение с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза мутантных форм Ьоп-протеазы E.coli с аминокислотными заменами в предполагаемых активных центрах функциональных доменов.

4. Сравнительное изучение ферментативной активности мутантных форм Ьоп-протеазы E.coli.

5. Исследование взаимного влияния функциональных доменов на ферментативные активности Ьоп-протеазы.

6. Построение модели механизма действия фермента.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В данной работе был проведен подробный структурно-функциональный анализ полученных из различных источников аминокислотных последовательностей Ьоп-протеаз - ферментов, играющих важную роль в процессах внутриклеточной деградации белков и пептидов.

На основании проведенного анализа получено филогенетическое дерево белков семейства Ьоп-протеаз, позволяющее судить о процессе эволюции АТФ-зависимых протеолитических ферментов. По результатам анализа предложено выделить три эволюционно и функционально различных группы АТФ-зависимых Ьоп-протеаз.

Построена модель вторичной структуры Ьоп-протеазы с достоверностью 70-80%.

Определены границы функциональных доменов фермента, ранее постулированных на качественном уровне. Это позволяет приступить к работам

по конструированию химерных белков, содержащих отдельные домены Ьоп-протеазы, что позволит изучить значение энергозависимости фермента.

Экспериментально проверена гипотеза о строении активных центров фермента, получены достоверные данные о локализации каталитически важных аминокислотных остатков.

Полученные результаты позволяют лучше понять молекулярную организацию и механизм действия столь сложного фермента как Ьоп-протеаза. Данные об активных центрах и элементах пространственной структуры белка открывают возможности дальнейшего изучения механизма действия Ьоп-протеазы, механизма распознавания ферментом денатурированных белковых молекул, и механизма энергозависимости протеолиза.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты диссертационной работы были представлены в докладах на II Российско-Израильском симпозиуме по пептидам и белкам (Москва 1992), на III симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993) и на I Всероссийская отчетно-плановая конференция по направлению "Генная Инженерия" (Москва, 1994). По результатам проведенных исследований опубликовано 6 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, методы исследования и список литературы. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 7 таблицами. Список цитируемой литературы состоит из 152 работ. В "обзоре литературы освещены проблемы, касающиеся АТФ-зависимой деградации белков и пептидов в про- и эукариоти-ческих клетках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Имеющиеся в литературе данные о вторичной и третичной структуре Lon-протеаз недостаточны для построения моделей строения активных центров фермента и понимания механизма их действия.

Одним из возможных подходов к решению этой задачи является анализ подобия структур родственных Lon-протеазе E.coli ферментов, выделенных из разных источников.

Построив на основании такого анализа пространственную модель Lon-протеазы можно было бы, используя олигонуклеотид-направлнный мутагенез получить экспериментальное подтверждение расчетным данным.

Решению этой проблемы и посвящена настоящая работа.

1. Анализ первичных структур семи АТФ-зависимых Ьоп-нротеаз, выделенных из различных источников

Поиск гомологий первичных структур Lon-протеаз осуществляли с помощью программных пакетов DARWIN, GENEBEE и FASTA. С использованием программного пакета GENEBEE для семи известных первичных структур Lon-протеаз нами было построено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей. Для каждой нары аминокислотных последовательностей были проанализированы гомологии и построены парные выравнивания. Множественное выравнивание построено на основании анализа всех парных выравниваний. При расчетах использовали алгоритм DotHelix и матрицу Дейхоффа вероятности замен аминокислотных остатков в белках в процессе эволюции.

Для анализа мы использовали не только данные, опубликованные в литературных источниках, но и аминокислотную последовательность гомологичного Lon-протеазе E.coli фермента из мозга человека, установленную в Лаборатории Химии протеолитических ферментов ИБХ РАН.

Проведенный анализ позволил определить участки, наименее изменившиеся в ходе эволюции, что говорит об их функциональной важности, и высказать предположения о локализации аминокислотных, остатков, входящих в активные центры Ьоп-протеазы.

2. Построение модели вторичной структуры Ьоп-протеазы и определение границ функциональных доменов

Для каждой первичной структуры Ьоп-протеазы рассчитана вероятная модель вторичной структуры с помощью программного пакета PREDICT PROTEIN. Использованный метод позволяет предсказывать вторичную структуру белков с достоверностью 70-80%.

На основании полученных результатов нами была установлена закономерность расположения элементов вторичной структуры в ферментах из различных источников. Оказалось, что предсказанные элементы вторичной структуры во всех семи Ьоп-протеазах имеют практически одинаковую протяженность и расположены по аминокислотной цепи в одинаковой последовательности. Интересно отметить, что "эквивалентность" расположения и протяженности элементов вторичных структур наблюдается не только в центральной и С-концевой части фермента, которые обладают высокой гомологией аминокислотных последовательностей, но и в N-концевой части белка, в которой гомология первичных структур очень низка.-

На основании обнаруженных закономерностей нами было скорректировано множественное выравнивание первичных структур, полученное на первом этапе работы.

При анализе пространственного строения белков, имеющих доменную структуру было установлено, что внутренние протяженные участки'белковой цепи, не имеющие гомологии в структурах родственных ферментов, располагаются в междоменных областях, образуя так называемые "междоменные петли".

Таким образом, при сравнении первичных структур родственных ферментов, по расположению "междоменных петель" с высокой ¡достоверностью можно установить границы функциональных доменов.

До сих пор существование доменов в Lon-протеазе постулировалось лишь на качественном уровне. Выравнивания первичных структур, выполненные с помощью пакетов программ DARWIN, FASTA и GENEBEE, использующих разные алгоритмические подходы, а также выравнивания, предлагаемые в литературе, различаются между собой расположением "междоменных петель" в структурах Lon-протсаз. Сравнительные выравнивания первичных структур Lon-протеаз из E.coli и S.cerevisiae, полученные на основании расчетов по алгоритму Gönnet, по методу точечной матрицы, а также предложенные в литературе, схематически представлены на рисунке 1. Границы доменов, определенные на основе выравниваний, рассчитанных по разным алгоритмам, приведены в таблице 1.

Рисунок 1. Схематическое сравнение выравниваний первичных структур Lon-протеаз из E.coli и S.cerevisiae, полученные на. основании расчетов по алгоритму Gönnet (1), по методу точечной матрицы(2), а также предложенные в литературе (3) и (4)

Lon S.cerevisiae

1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Lon E.coli

(1) алгоритм G. Gönnet (Ö\RWIN)

1 180 181 560 561 1%\

(2) мях>д точечной шгрицы (GENEBEE)

1 161 162 572 573 784

(3) алгоритм претраммы BLAST

ЕШЭЁЖЗ г:: ■■:■••■:■■■: 1 [3 г ■::■■::■:■■:■:■:■,:■:■■■:■:■:»:■:■:■:■■■:■!■■■:*:■:■:■::■:■:::■:•■■■■:■:■:-:::■::■:■::■•■■■■■::ч Г ' I h1"""--' I

1 159 160 595 596 784

(4) алгоршм 'Took Up" (FASTA)

1 107 108 621 622 784

Таблица 1. Границы доменов, определенные на основе выравниваний, рассчитанных по разным алгоритмам. Анализируемые выравнивания схематически представлены на рисунке 1.

Программный пакет (алгоритм) N-концевой домен Центральный домен С-концевой домен

DARWIN (G.Gonnet) 1-180 181-560 568-784

GENEBEE (DotHelix) 1-161 162-572 573-784

BLAST 1-155 160-595 596-784

FASTA (Look Up) 1-107 108-621 622-784

"Уточненное" выравнивание 1-107 108-563 564-784

Из приведенных в таблице и на рисунке данных видно, что разные алгоритмы сравнения первичных структур дают заметные различия при определении границ функциональных доменов.

Получение множественного выравнивания аминокислотных последовательностей АТФ-зависимых Ьоп-протеаз, основанного не только на гомологии первичных структур, но и на анализе закономерностей расположения элементов вторичной структуры, позволило нам определить границы функциональных доменов Ьоп-протеазы с большей степенью достоверности, чем при анализе только гомологии первичных структур.

По результатам выполненного сравнительного анализа мы установили следующие границы функциональных доменов Ьоп-протеазы E.coli.

N-концевой домен фермента, функциональное значение которого пока не установлено, включает аминокислотные остатки с 1 по 107.

Центральный домен, содержащий АТФазный активный центр фермента, состоит из аминокислот со 108 по 563 (455 а.к.).

С-конпевой домен фермента, являющийся непосредственно протеазой, начинается с 564 аминокислоты (220 а.к.).

3. Построение филогенетического дерева ферментов семейства АТФ-зависимых Ьоп-протеаз

Построите филогенетических деревьев есть, в некотором смысле, конечная цель анализа аминокислотных последовательностей белков. Такие деревья полезны дня согласования информации о гомологичности последовательностей с общебиологическими представлениями об эволюции соответствующих организмов.

В качестве основы для построения филогенетических деревьев мы использовали "уточненное" множественное выравнивание первичных структур Lon-протеаз, полученное на предыдущих стадиях исследования.

В результате расчетов с применением пакета программ GENEBEE и разработанной в Commutational Biochemistry Research Group (CBRG, ETH, Zurich) программой PhiloTree были получены два филогенетических дерева, представленных на рисунках 2 и 3.

LonllS LonEC LonBB LonSC LonMXZ LonBS LonMXl

Рисунок 2. Филогенетическое дерево, построенное с использованием программного пакета GKNHB.EE.

LonHS

Рисунок 3. Филогенетическое дерево, полученное с использованием программы PhiloTree.

Филогенетические деревья, полученные в результате анализа гомоло-гий первичных структур АТФ-зависимых Ьоп-протеаз состоят из двух основ-

ных ветвей, соответствующих ферментам, выделенным из про- и эукариоти-ческих организмов.

Интересной особенностью полученных данных является образование двух, достаточно сильно различающихся между собой ветвей Ьоп-протеаз из прокариотических клеток. Две формы Ьоп-протеазы, выделенные из Мухо-coccus xantbus - 1 и 2, определяют два разных подсемейства ферментов.

Форма 1 Ьоп-протеазы Myxococcus xanthus расположена на филогенетическом дереве гораздо ближе к белкам из других источников - E.coli, B.brevis, и B.subtilis, чем к Ьоп-протеазе второй формы из M.xanthus. Это говорит о возможном эволюционном и функциональном сходстве белков этой ветви.

Форма 2 Ьоп-протеазы Myxococcus xanthus является единственным представителем отдельной ветви прокариотических ферментов, что хорошо согласуется с экспериментальными данными о роли разных форм протеазы в процессах жизнедеятельности микроорганизмов Myxococcus xanthus.

Таким образом, согласно представленным данным семейство АТФ-зависимых Ьоп-протеаз можно разделить на три эволюционно и функционально различающихся группы ферментов. Полученные результаты суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Предлагаемое разделение белков семейства Ьоп-протеаз на подгруппы.

Подгруппа белки функции

1 Ьоп-протеазы эукариотов LonHS LonSC Обеспечение функционирования митохондрий эукариотических клеток

2 Ьоп-протеазы прокариотов подгруппа 1 LonEC LonBB LonBS LonMXl деградация нефункциональных и регуляторных белков в основных процессах жизнедеятельности прокариотических клеток.

3 Ьоп-протеазы прокариотов подгруппа 2 LonMX2 Обеспечение некоторых специальных процессов в клетках, например образование спор.

4. Построение модели механизма взаимодействия доменов в Ьоп-нротеазе

При сравнении структуры центрального домена, содержащего АТФазный центр Ьоп-протеазы, с первичными структурами хорошо охарактеризованных АТФ-связывающих ферментов было установлено, что размер большинства АТФаз (около 200 аминокислотных остатков) гораздо меньше размера домена - 445 аминокислотных остатков. Результаты сравнительного анализа приведены на рисунке 4. Из рисунка видно, что непосредственно АТФаза занимает, по видимому, только часть центрального домена - с 340 по 563 аминокислотные остатки.

Другая часть домена, состоящая из протяженных альфа-спиральных участков, выполняет, по всей видимости, регуляторные функции, обеспечивающие взаимосвязь АТФазной и протеолитической активностей в Ьоп-протеазе.

Ьоп-протеаза Е.соЦ

с-концевойдомен Центральный домен Ы-конисиой домен.

I-Н-в-1-и-

АМФ-киназа (E-coIi) И-

АМФ-киназа (porcine) АМФ-киназа (yeast) I ■ (

фосфофрукто киназа (E.coli) 1-е-

фосфофруктокпназа (Binaroihsrmoptiiliu!) I-в-RecA (E.coii) I я

Gin тРНК-синтетаза (E.coli) I ■ I I Met тРНК-синтетаза (E.coli) I-■-

фосфогпииерат киназа (yeast) I"

Рисунок 4. Выравнивание первичных структур Ьоп-протеазы Е.соН и АТФаз. Участки первичной структуры АТФаз, необходимые для связывания и гидролиза нуклеотидов отмечены черными квадратами: ( в )- консенсус СххххСКТ/Б, (И) - участок связывания магния. Светлыми квадратами ( О ) отмечены участки связывания субстрата. Символом (10 - границы доменов Ьоп-протеазы. Данные по АТФазам взяты из литературы.

Рассмотрим возможные схемы взаимодействия доменов:

1) А Р : АТФазный домен регулирует активность протеолитического.

2) А Р : Протеолитический домен регулирует активность АТФазного.

3) А^=>Р : Активности доменов взаимосвязаны.

В литературе, на основании данных ингибиторного анализа, постулируется третья схема взаимодействия доменов - ингибирование протеолиза приводит к уменьшению АТФазной активности, и наоборот, ингибирование гидролиза АТФ пропорционально уменьшает протеолитическую активность.

На основании анализа вторичной структуры "регуляторной" области Ьоп-протеазы, и сравнения ее с известными по данным ренгеноструктурного анализа пространственными структурами белок-связывающих центров других ферментов мы предложили схему функционирования Ьоп-протеазы, основанную на следующих положениях:

1) Ьоп-протеаза имеет два центра распознавания и связывания белковых субстратов, имеющих разную степень сродства к белкам. Один из них -регуляторный - расположен в центральном домене, а другой - протеолити-ческий - в С-концевом.

2) Мы постулируем, что С-концевой домен фермента сам по себе может гидролизовать пептидную связь с очень низкой эффективностью (по сравнению с полным ферментом) из-за невысокой степени сродства к белкам субстрат-связывающего центра домена. (Это может объяснять невысокую эффективность ингибирования Ьоп-протеазы субстрат-подобными низкомолекулярными ингибиторами, такими как БГР)

3) Мы постулируем, что предполагаемый белок-связывающий центр, расположенный в центральном домене, высокоэффективно распознает и связывает денатурированные белки-субстраты. Это положение основано на наличии протяженных альфа-спиралей в структуре домена. Наличие таких спиралей характерно для белок-связывающих центров некоторых ферментов. Особенностью альфа-спиралей центрального домена Ьоп-протеазы является большое количество гидрофобных аминокислот, предположительно расположенных на одной "стороне" спирали. Такое расположение гидрофобных аминокислот может объяснять высокую эффективность распознавания Ьоп-протеазой денатурированных белковых молекул, в которых гидрофобные участки оказываются экспонированными на поверхности

белковой глобулы. Сродство к субстрату этого центра определяет сродство к субстрату нативной Ьоп-протеазы.

4) Взаимное расположение субстрат-связывающих центров может меняться в зависимости от того, АТФ или АДФ находится в АТФазном центре Ьоп-протеазы. При нахождении АТФ в нуклеотид-связывающем центре белок-субстрат связывается одновременно как с С-концевым, так и с центральным субстрат-связывающими центрами и эффективно гидролизуется.

4а) При связывании АТФ в нуклеотидном центре сродство "регуля-торного" центра к субстрату превышает сродство "протеолитического" белок связывающего центра. Взаимное расположение центров таково, что белковый субстрат связывается одновременно в двух центрах. В таком конформа-ционном состоянии фермента происходит распознавание и связывание денатурированных белковых субстратов.

46) При связывании АДФ в нуклеотидном центре за счет конформа-ционных изменений происходит увеличение сродства к субстрату связывающего центра С-концевого домена, и "фиксация" уже связанного субстрата в этом центре. Высвобождение белка-субстрата (или пептида - продукта гидролиза) из "протеолитического" связывающего центра возможно лишь при удалении АДФ из нуклеотид-связывающего центра.

Схема предложенного механизма действия приведена на рисунке 5.

Согласно такой схеме реализуется первый вариант взаимодействия доменов (А -> Р): центральный домен является "активатором" протеоли-тической активности С-концевого домена фермента.

Для проверки сформулированной схемы взаимодействия доменов мы предложили получить методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза рекомбинантные белки двух типов: а) с инактивированным АТФазным центром, и б) с инактивированным протеолитическим центром.

Особенностью поставленной задачи являлось то, что расположение протеолитического центра фермента и входящих в него аминокислотных остатков точно не установлено.

1 2 АА

Р1

Рисунок 5. Предлагаемая схема действия фермента. Ш7ШШ молекула белка-субстрата ^^ Протсолитичсский домен А Цснтратьный домен -^ч/^ч регуляторный центр и /Ж^у АТФаза

5. Экспериментальная проверка локализации аминокислотного остатка лизина -в положении 362 в АТФ-азном активном центре Ьоп-протеазы-

АТФазный центр Ьоп-протеазы был идентифицирован при сравнении первичной структуры Ьоп-протеазы со структурами других нуклеотид-связы-вающих белков, таких как белок ИесА и аденилат киназа.

Для ферментов, осуществляющих гидролиз АТФ, установлено что ключевую роль в процессе катализа играет остаток аминокислоты лизина, расположенной в высококонсервативной области СххххСКТ/Б. Замена этого остатка на другую аминокислоту приводит к утрате ферментом способности гидролизовать АТФ.

В первичной структуре Ьоп-протеазы был идентифицирован описанный консенсус, и было предположено, что остаток лизина в положении 362 Lon-протеазы соответствует каталитически важным остаткам лизина в других АТФ-связывающих ферментах.

Для проверки этого предположения методом олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза в З'-концевой Pstl-Pstl фрагмент Ion гена E.coli, клонированный в плазмидном векторе pSP64, мы ввели мутацию, приводящую к аминокислотной замене остатка лизина в положении 362 на глутамин. Расположение олигонуклеотидов-мутагенгов на структуре Ьоп-гена и стратегия секвенирования приведены на рисунках 6 и 7.

Был реконструирован полный мутантный ген lon-K362-Q, кодирующий мутантную форму Ьоп-протеазы. Ген клонирован в плазмиде pBR327 вместе со своей регуляторной областью, и находится под контролем собственного промотора теплового шока. Схема реконструкции полноразмерного гена приведена на рисунке 8. Используя в качестве хозяйского штамм E.coli АВ-1899, дефектный по синтезу нативной Ьоп-протеазы, мы получили штамм-продуцент мутантной формы фермента E.coli АВ 1899/pBR327-Ion-КЗ 62-Q.

Рисунок 6. Схема расположения олигонуклеатидов-мутагенов на структуре Ion-гена. Тонкими стрелками обозначена стратегия секвенирования Ion-гена для подтверждения внесенных мутаций. Кодирующая область Ion-гена зачернена.

S36J KJ6« S,)T s«™ S6»

EcoRI PstI Kpnl Hpa I Sphl Pst I

Рисунок 7. Расположения олигонуклеотидов-мутагенов на структуре Уол-гена. Знаком # отмечены некомплиментарные матрице нуклеотиды.

олигонуклеотид(1) K-362-Q # #

О V О <3 I S L ООО OTA ООТ CAO АСС ГСТ СТТ

CCQ CCQ ООО GTA GGT ААА АСС ТСТ СТТ GGT CAG тсс ATT GCC ААА GCC АСС GGG CGT ААА ТАТ GTC

Р Р G V а к т S L G ч S I А К А Т G R К Y V

олигонукпеотид(2) S-368-Q * #

L а Q А I А К

тт ООТ CAO ОСТ АТТ осс ААА

CCG CCG GGO GTA GGT ААА АСС ТСТ СТТ GGT CAG тсс АТТ GCC ААА GCC АСС GGG CGT ААА ТАТ GTC

Р Р G V G К т 3 L G 6 S I А К А Т G R К Y V

олигонуклеотид(З) S-637-A # *

V м Q Е А I Q

О ATO CAO ОДА ОСС АГТ CAO

АДА GGC ААА CTG АСС ТАГ АСС GGT TCG стс GGC GAA GTG ATG CAG GAG ТСС АТТ САЗ GCG

к а к l Т Y т G S L G Е V М ^ •Е S I 0 А

олигонуклеотид(4) S-679-A «##

с к D . а Р А А а I А

сса ЛАД ОАГ ООТ ССО асс ОСС ООТ АТТ ОС

САС GTA CCG GAA GGT GCG ACG ccg ААА GAT GGT сса AGT GCC GGT АТТ GCT ATG TGC

Н V Р Е G А т Р К D а р 8 А G I А К С

олигонухлеотид(5) S-690-A

* #

A L V А с ь т

со сто отт оса гас сто АСС О

асс аса сто gtt ТСТ TGC ctg АСС ggt аас ccg gtt cgt gcc gat

Т A L V s с L т G N р V R а D

Рисунок 8. Схема реконструкции полноразмерного /ол-гена.

Выделенный из продуцента мутантный белок был очищен по стандартной методике и были охарактеризованы его энзиматические свойства. Исходя из предположения, что мугантная форма фермента утрачивает свои энзиматические активности, идентификацию фракций с Ьоп-протеазой. осуществляли по результатам гель-электрофореза.

Результаты измерений приведены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты измерений энзиматических свойств мутантной формы Ьоп-протеазы Е.соИ Ьоп-К362-() и сравнение с соответствующими показателями нативного фермента. Протеолитическая активность выражена в мкг [^С]-ацетил-альфа-казеина в 1 час на 1 мкг фермента. АТФазная активность выражена в нмоль превращенного АТФ в 1 час на 1 мкг фермента.

Форма фермента Протеолитическая активность АТФазная активность

-АТФ + АТФ

нативная форма 0 170 750

Ьоп К 362 - д 0 50 0

Из таблицы видно, что мутантная форма Ьоп-протеазы не только теряет способность гидролизовать АТФ, но и утрачивает протеолитическую активность. Таким образом, гидролиз АТФ необходим для расщепления пептидной связи Ьоп-протеазой.

В результате проведенных исследований экспериментально подтверждено что остаток лизина в положении 362 Ьоп-протеазы Е.соН находится в активном центре и участвует в гидролизе АТФ.

6. Исследование влияния замены аминокислотных остатков серина, консервирующихся в известных первичных структурах Ьоп-протеаз, на процесс гидролиза пептидной связи ферментом

Ьоп-протеаза является представителем уникального класса протеоли-тических ферментов. Известно, что фермент является сериновой протеазой, т.е. имеет в протеолитическом активном центре остаток серина. Однако первичная структура Ьоп-протеазы не имеет характерных для "классических" сериновых протеаз консенсусов в области расположения каталитически важных аминокислотных остатков. Поэтому определить входящие в активный центр аминокислоты методом аналогий не представляется возможным.

Для идентификации каталитически важного остатка серина было проведено сравнение первичных структур Ьоп-протеаз, полученных из разных источников.

В результате анализа мы установили, что во всех известных первичных структурах консервативными являются четыре аминокислотных остатка серина: в положениях 368, 637, 679 и 690. Согласно современным представлениям об эволюции ферментов, только эти остатки могут претендовать на роль каталитически активных. Как было установлено на первых стадиях работы, остатки серина в положениях 637 и 690 находятся в менее консервативном окружении, и, соответственно, их участие в активном центре менее вероятно. При анализе результатов сравнительного анализа вторичных структур оказалось, что остатки серина в положениях 368, 637 и 690 находятся в регулярных альфа-спиральных участках, а остаток в положении 679 находится в неструктурированной области, характерной для расположения групп активных центров. Таким образом, по нашему мнению наиболее вероятным каталитически важным остатком является серин" в положении 679.

Остатки серина в положениях 368 и 679 ранее уже постулировались в литературе как каталитически активные.

Для точного определения остатка серина, входящего в протеолитичес-кий активный центр фермента мы получили методом олигонуклеотид-нап-равленного мутагенеза четыре рекомбинантные плазмиды: pBR327-lon-S368-A, pBR327-lon-S637-A, pBR327-lon-S679A и pBR327-lon-S690-A, кодирующие мутантные формы Ьоп-протеазы E.coli, имеющих аминокислотные замены остатка серина в положении 368, 637, 679 или 690 на остаток аланина, и создали соответствующие штаммы-продуценты мутантных форм фермента. (E.coli AB-1899/pBR327-lon-S36S-A), (E.coli AB-lS99/pBR327-lon-S637-A), (E.coli AB-1899/pBR327-lon-S679-A) и (E. coli AB-1899/pBR327-lon-S690-A).

Выделенные из иггаммов-продуцентов мутантные формы Ьоп-протеазы были очищены по стандартной методике и их основные энзимати-ческие свойства были охарактеризованы. Исходя из предположения, что мутантная форма фермента может утрачивать свои энзиматические активности, идентификацию фракций с Lon-протеазой осуществляли по результатам гель-электрофореза. Результаты измерений представлены в таблице 4. Измерения проводились сотрудниками ИБХ РАН к.х.н. Котовой С.А. и Симоновой-Емельяновой Л.И.

Таблица 4. Результаты измерений энзиматических свойств мутантных форм Ьоп-протеазы E.coli. Протеолитическая активность выражена в мкг | '^С]-ацетил-альфа-казеина в 1 час на 1 мкг фермента. АТФазная активность выражена в нмоль превращенного АТФ в 1 час на 1 мкг фермента.

Форма фермента Протеолитическая активность ЛТФазиая активность

- АТФ + ЛТФ

нативная форма о 1 70 750

Lon-S 368 - А. о 125 670

Lon-S 637 - А о 150 690

Lon-S 379 - А о О 1 100

Lon-S 690 - А о 165 690

Из. полученных результатов следует, что остаток серина в положении 679 входит в протеолитический активный центр фермента, и его замена на аланин полностью ингибирует протеолитическую активность фермента. При этом АТФазная активность мутантной формы фермента не только не

уменьшилась, но и возрасла приблизительно в полтора раза. В то же время замена любого другого из консервирующихся во всех первичных структурах остатков серина - в положениях 368, 637 и 690 - не оказывает заметного влияния на активность Ьоп-протсазы, т.е. указанные остатки не являются каталитически важными.

7. Определение количественных параметров предложенной модели механизма функционирования Ьоп-протеазы на основании экспериментальных данных

Изложенные в предыдущих разделах данные позволяют уточнить модель взаимодействия доменов Ьоп-протсазы и получить некоторые количественные характеристики функционирования фермента.

Из наших данных, изложенных в разделах 5 и 6 следует, что гидролиз АТФ и связанные с этим изменения протеолитического комплекса необходимы для повышения эффективности гидролиза пептидной связи. Как следует из данных, приведенных в таблице 3, блокирование регуляторной системы активации протеолиза уменьшает скорость гидролиза полипептидов в 4-5 раз. В то же время инактивация протеолитической активности не уменьшает скорость гидролиза АТФ, что говорит об отсутствии влияния протеолитического домена на АТФазный.

Повышецие уровня гидролиза АТФ при инактивации протеолиза может быть объяснено следующим образом: Связывание субстрата Ьоп-протеазой определяется сродством расположенного в центральном домене регуляторного белок-связывающего центра. При этом не каждый раз реализуется такое расположение субстрата в протеолитическом центре, при котором возможно расщепление пептидной связи. Таким образом существует два возможных состояния комплекса (субстрат: протеолитический домен) -(1) при котором не происходит расщепления пептидной связи, и (2) при котором субстрат эффективно гидролизуется. Причем во втором состоянии комплекс существует примерно в два раза дольше, что обуславливает

полуторное увеличение скорости гидролиза АТФ при невозможности реализации второго состояния.

По литературным данным известно, что в белках субстратах Ьоп-протеаза расщепляет в среднем каждую четвертую пептидную связь, гидро-лизуя при этом две молекулы АТФ. Таким образом, при гидролизе каждой молекулы АТФ полипептидная цепь субстрата сдвигается на два аминокислотных остатка. Это соответствует расстоянию 6-8 ангстрем, что характерно для конформационных изменений в протеазах.

Исходя из наших экспериментальных данных можно сформулировать дополнительные, количественные, положения к модели функционирования фермента:

А) Расщепление белкового субстрата происходит при каждом втором "цикле" работы фермента. Время "цикла", при котором протеолиз не происходит, ориентировочно в два раза меньше "цикла" с расщеплением пептидной связи. Это следует из увеличения в 1,5 раза эффективности гидролиза АТФ в мутантной форме Ьоп-протеазы, не способной расщеплять пептидные связи (Ьоп Б 679-А).

Б) Конформационные изменения, происходящие при гидролизе одной молекулы АТФ, обеспечивают продвижение белка-субстрата вдоль активного центра на два аминокислотных остатка, что соответствует расстоянию в 6-8 ангстрем, хорактерному для конформационных изменений в бековых молекулах.

Такая схема взаимодействия белок-связывающих центров, попеременно изменяющих сродство к субстрату, позволяет объяснить способность Ьоп-протеазы длительное время удерживать связанные белковые субстраты и "продвигать" их вдоль активного центра. Предложенная детализация модели функционирования фермента не претендует на полноту, но тем не менее хорошо объясняет имеющиеся экспериментальные данные. Точное определение механизма действия АТФ-зависимой Ьоп-протеазы может быть установлено лишь в дальнейших экспериментах.

22

ВЫВОДЫ

1. Проведен полный системный компьютерный анализ первичных структур Lon протеаз, выделенных из различных источников и установлены участки аминокислотных последовательностей, обладающие максимальной степенью гомологии, что говорит об их функциональной важности.

2. Построена модель вторичной структуры Ьоп-протеазы и определены

t

границы функциональных доменов с достоверностью 80%.

3. Построено филогенитическое дерево семейства Ьоп-протеаз на основании анализа гомологий структур ферментов, дающее наглядное представление о путях эволюции АТФ-зависимых протеаз. Предложена классификация семейства АТФ-зависимых Ьоп-протеаз, выделяющая три эволюционно и функционально различных группы ферментов.

4. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получена мутантная форма Ьоп-протеазы E.coli Lon-K362-Q, с заменой остатка лизина в положении 362 на глутамин. Показано, что этот остаток лизина входит в АТФазный активный центр фермента и участвует в процессе гидролиза АТФ Ьоп-протеазой.

5. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получены четыре различные мутантные формы Ьоп-протеазы E.colf. Lon-S368-A, Lon-S637-A, Lon-S679-A и Lon-S690-A, с заменами остатка серина в положениях 368, 637, 679 и 690 на аланин. Показано, что среди консервирующихся в первичных структурах Ьоп-протеаз аминокислотных остатков серина, только остаток в положении 679 является необходимым для проявления протео-литической активности фермента, а остатки в положениях 368, 637 и 690 не принимают участие в процессе гидролиза.

6. Экспериментально показано, что центральный, содержащий АТФазный центр домен фермента является активирующим регулятором протео-литической активности Ьоп-протеазы. При отсутствии активирующего эффекта протеолитическая активность уменьшается в 4-5 раз по сравнению

с нативным ферментом. В то же время инактивация протеолитической активности не уменьшает скорость гидролиза АТФ, что говорит об отсутствии влияния протеолитического домена на АТФазный.

7. Установлено, что центральный домен фермента является активатором протеолитической активности С-концевого домена, увеличивающим эффективность эффективность гидролиза белковых субстратов в 4-5 раз.

8. Предложена модель домен-доменных и домен-субстратных взаимодействий в АТФ-зависимой Ьоп-протеазе.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Основные результаты диссетационной работы изложены в следующих

статьях и докладах:

1. Amerik A.Yu., Lykov I.P.. Gorbalenya A.E., Kotova S.A., Rotanova T.V., Antonov V.K. Investigation of the E.coli ATP-dependent La-protease by site directed mutagenesis. II Russian-Israel Symposium on Peptides and Proteins, 1992, Moscow, Russia. Abstracts, p. 28.

2. Ротанова T.B., Котова C.A., Америк А.Ю., Лыков И.П.. Гинодман, Л.М., Антонов В.К., АТР-зависимая протеиназа La из Esherichia coli., Ill Симпозиум "Химия протеолитических ферментов", 1993, Москва, Россия, Тезисы докладов и стендовых сообщений., стр. 10.

3. Америк А.Ю., Петухова Г.П., Лыков И.П.. ГригоренкоВ.Г., Горбаленя А.Е., Структурное исследование АТФ-зависимой протеиназы мозга человека-., III Симпозиум "Химия протеолитических ферментов", 1993, Москва, Россия, Тезисы докладов и стендовых сообщений., стр. 11.

4. Amerik A.,Yu., Petukhova, G.P., Grigorenko, V.G., Lykov. I.P.. Yarovoi, S.Y., Lipkin,V.M., Gorbalenya,A.E., Cloning and sequence analysis of cDNA for a human homolog of eubacterial ATP-dependent Lon proteases, FEBS Letters, 1994, v.340(l-2), p.25-28.

5. Ротанова T.B., Котова C.A., Америк А.Ю., Лыков И.П.Т Гинодман Л.М., Антонов В.К. АТР-Зависимая протеиназа La из Esherichia coli., 1994 г., Биоорганическая химия, том 20(2), стр. 114-125

6. Амернк А.Ю.. Лыков И.П.. Ротанова Т.В.. Когова СЛ..—Гинодман Л.М.,-

"Модификация АТФ-зависимой протеазы методом направленного мутагенеза". I Всероссийская отчетно-плановая конференция по направлению "Генная Инженерия", 1994, Москва,. Тезисы докладов, стр.62