Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное исследование АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное исследование АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи

РАСУЛОВА ФАТИМА СУЛЕЙМАНОВНА

Структурно-функциональное исследование АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в лаборатории химии протеолитических ферментов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю. А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

старший научный сотрудник, кандидат химических наук Т.В.Ротанова

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук С.Н.Кочетков, ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук Т.А.Валуева

Ведущая организация:

Российская Медицинская Академия последипломного образования

Защита диссертации состоится 1998 г. в /^часов на заседании на

диссертационного совета К 002.96.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических 1иуквИнсппуге биохимшшм.А.Н.Баха РАН по адресу: 117071 Москва, Лешшский проспект, 33, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Л ешшский проспект, 33, корпус 1).

У

Автореферат разослан "_ 7 « _1998 г.

Ученый секретарь диссерттцюнного совета доктор биологических наук

М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Внутриклеточная деградация белков является строго контролируемым процессом. В цитозоле, ядре и митохондриях эукариотических клеток и в цитоплазме бактериальных клеток этот процесс осуществляется, главным образом, мультимерными АТР-зависимыми протеиназами. Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТР. Это свойство АТР-зависимых протеиназ выделяет их в особую группу среди протеолитических ферментов. В клетках Escherichia coli к настоящему времени обнаружены четыре АТР-зависимые протеиназы: Lon, ClpAP, HslVU и FtsH. Первые два фермента - сериновые протеиназы; каталитически активным остатком HslVU-протеиназы является треонин, a FtsH-протеиназа охарактеризована как Zn-зависимая металлопротеиназа. ClpAP и HslVU представляют собой гетероолигомеры и состоят из протеолитических (ClpP и HslV) и регуляторных АТР-азных (ClpA и HsIU) субъединиц. В Lon- и FtsH-протеиназах протеолитический и АТР-азный центры локализованы в одной полипепгидной цепи, и эти ферменты функционируют как гомоолигомеры.

Первой описанной энергозависимой протеиназой явилась Lon-протеиназа из Ecoli. К настоящему времени стало ясно, что ферменты субсемейства Lon-протеиназ присутствуют в клетках самых различных организмов от прокариот до эукариот. В E.coli Lon-протеиназа осуществляет селективную деградацию ряда короткоживущих регуляторных белков, а также освобождает клетки от дефектных, поврежденных и мутантных белков.

Lon-протеиназа отличается от классических сериновых протеиназ следующими характерными особенностями: (1) протеолиз сопровождается гидролизом АТР; (2) фермент проявляет высокую селективность по отношению к белкам-мишеням при отсутствии выраженной первичной специфичности; (3) фермент функционирует как гомотетрамер; (4) субъединица Lon-протеиназы состоит из трех функциональных доменов - N-концевого, АТР-азного (центральный домен) и протеолитического (С-концевой домен).

Несмотря на существенные успехи в исследовании энзиматических свойств Lon-протеиназы и других АТР-зависимых протеиназ, природа селективности и механизм сопряжения АТР-азной и протеслитической активностей у этих ферментов не выяснены. В связи с этим представляется актуальным изучение роли отдельных фрагментов молекулы фермента в его функционировании и в сопряжении АТР-азной и

протеолитической активностей. В настоящей работе такое исследование проведено на примере Lon-протеиназы из Escherichia coli.

Цели и задачи исследования. Формирование единой полипептидной цепью субъединицы Lon-протеиназы наряду с протеолитическим двух других доменов (N-концевого и АТР-азного) позволяет предполагать, что либо определенные элементы структуры последних доменов участвуют в формировании протеолитического центра, либо эти домены осуществляют регуляцию активности уже полностью сформированного протеолитического активного центра фермента. Выбор между этими двумя возможностями можно осуществить путем получения изолированного протеолитического домена и исследования его энзиматической активности. Таким образом, основной задачей работы явилось получение ответа на вопрос, функционирует ли как протеиназа изолированный протеолитический домен АТР-зависимой Lon-протеиназы E.coli. Кроме того, весьма актуальным и важным представлялось выявление роли N-концевого домена в активности фермента.

Решение поставленных задач включало этапы установления границ функциональных доменов в субъединице Lon-протеиназы, получение модифицированных форм фермента, содержащих АТР-азный и протеолитический домены или только индивидуальный протеолитический домен (с учетом выявленных границ доменов), и исследование ферментативной активности полученных препаратов.

Научная новизна и практическая значимость. В данной работе было проведено сопоставление аминокислотных последовательностей Lon-протеиназ из эволюционно удаленных источников, на основании которого были установлены границы N-концевого, АТР-азного и С-концевого протеолитического функциональных доменов в субъединицах ферментов.

Методами генной инженерии получены модифицированные формы Lon-протеиназы, включающие 1) фрагмент, содержащий АТР-азный и протеолитический домены, 2) протеолитический домен, 3) мутантную форму протеолитического домена, содержащую замену каталитически активного остатка Ser679Ala, 4) Lon-протеиназу, содержащую тромбин-чувствительный линкер между АТР-азным и протеолитическим доменами.

Показано, что изолированный протеолитический домен практически не проявляет протеолитической активности, но обладает активностью по отношению к

пептидному субстрату - мелиттину, что позволяет рассматривать изолированный протеолитический домен как пептидазу.

Установлено, что укороченная форма Lon-протеиназы, не содержащая N-концевого домена, практически полностью утрачивает и АТР-зависимую протеолитическую и АТР-азную активности, на основании чего сделано заключение, что структура N-концевого домена имеет важное значение для проявления Lon-протеиназой обоих видов ферментативной активности.

Высказано предположение об участии N-концевого домена в олигомеризации Lon-протеиназы, в результате которой формируются АТР-азный центр, белок-связывающий участок протеолитического центра и система сопряжения протеолиза и гидролиза АТР.

Полученные данные в совокупности с результатами параллельных исследований, проводимых в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ, открывают новые перспективы для дальнейшего исследования механизма функционирования Lon-протеиназы и, в частности, природы сопряжения АТР-азной и протеолитической активностей фермента.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на аницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка используемой литературы, включакмцего/^^аботы.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований докладывались на Международной конференции памяти академика А.АБаева (Москва, 1996), IV Симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 1997), П Съезде Биохимического общества Российской Академии Наук (Москва, 1997), 17 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Сан Франциско,

1997), 16 Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург,

1998), Международной конференции Biocatalysis-98 (Пущино на Оке, 1998).

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

/. Установление границ функциональных доменов в субъединицах АТР-зависилшх Lon-протеиназ

К настоящему времени аналоги гена ¡on, кодирующего Lon-протеиназу в клетках E.coli, обнаружены как у прокариот, так и у эукариот; выведены аминокислотные последовательности соответствующих ферментов. Таким образом, выявлено новое подсемейство сериновых протенназ. Сопоставление первичных последовательностей Lon-прсггеиназ из эволюционно отдаленных источников позволило получить подтверждение выдвинутого ранее в нашей лаборатории предположения о том, что субъединицы ферментов состоят их трех последовательно расположенных функциональных доменов (рис. 1а):

- центральный домен обладает АТР-азной активностью (A-домен) и содержит характерные для ряда нуклеотидтриггерных белков фрагменты последовательности (мотивы Уолкера), участвующие в связывании нуклеотида и иона MgJ> , - мотив A (GXXXXGKT/S) и мотив В (ZZZZD, Z - гидрофобная аминокислота);

- С-концевой домен - протеолитический (Р-домен); идентифицированный ранее в нашей лаборатории для фермента из E.coli каталитически активный остаток серина-679 локализован в строго консервативном для всех Lon-протеиназ фрагменте последовательности PKDGPS*AG, который не обнаруживается в структурах ни одной из сериновых протеиназ других подсемейств. В целом, первичная структура Р-домена не имеет гомологов ни среди протеолкгических ферментов, ни среди белков;

- функция N-концевого домена (N-домен) к началу настоящей работы не была выяснена.

Размеры Lon-прсггеиназ различны - от 775 до 1116 аминокислотных остатков (табл.1). Наличие междоменных вставок в структурах ферментов эукариот (рис. 1а) позволяет уточнить границы доменов (табл.1): размеры АТР-азного домена (459-471 а.о.) мало различаются у ферментов из разных источников; то же относится к протеолитическому домену (206-239 а.о.). Размеры N-концевых доменов значительно варьируют (96-288 а.о ). Высокая

гомология последовательностей наблюдается в АТР-азном и протеолитическом доменах; в М-концевом домене подобие невелико.

В!

ОХХХХОКГ (тоИГА)

оррдуакг'

I

ч'нъ (товГВ)

I а I п4"

ем

шШ

1

(а)

РКООРЯ-АО 8"»

4 (б)

Рис. 1. Схема строения АТР-зависимых Ьоп-протеиназ из различных источников (а) и Ьоп-протеиназы ЕсоИ (б). N. А. Р - соответственно Ы-конисвой, АТР-азный и протеолитический домены. N-A и А-Р - вставочные полипегттидные фрагменты. Показана локализация консервативных фрагментов (мотивов А и В Уолкера и фрагмента, включающего каталитически активный остаток серина).

Таким образом, сравнительный анализ аминокислотных последовательностей АТР-зависимых Ьоп-протеиназ из эволюционно отдаленных источников позволил установить границы функциональных доменов в субъединицах ферментов (строение Ьоп-протеиназы из Е.соН схематически показано на рис. 1 б: М-домен - остатки NN 1-107, А-домен -остатки NN 108-566, Р-домен - остатки NN 567-784). В ходе анализа было обнаружено, что ^концевой домен является наиболее вариабельным (как по размеру, так и по структуре) фрагментом Ьоп-протеиназ; поэтому естественно повысилась актуальность вопроса о роли этого домена в проявлении ферментом энзиматической активности.

Таблица I. Сравнение Lon-протеиназ из различных источников '

Источник Число аминокислотных остатков

N-домен N-A А-доиен А-Р Р-доыен Всего

Escherichia coli 107 459 - 218 784

Erwima amvlovora 107 459 - 218 784

Bacillus brevis 106 460 - 213 779

Bacillus subtihs 105 460 - 211) 775

Mvxococcus xanthus У 119 459 - 239 817

Mvxococcus xanthus D 130 461 - 237 828

Borrelia burgdorferi 138 464 - 206 808

Xivcobacterium smegmatis 96 466 - 217 779

Mycoplasma genitalium 130 459 - 256 795

Haemophilus influenzae 105 46t - 237 803

Caulobacter crescent us 101 461 - 237 799

Azospirillum brasiliense 112 461 - 237 810

Saccharomvces cerevisiae 288 85 471 53 219 1116

Homo sapiens 201 45 466 - 225 937

Гомология <20% 50% 53%

См. также рис. I.

2. Получение Lon-npomeunaju и ее модифицированных форм

2.1. Клонирование ¿оп-протеиназы и ее модифицированных форм в плазмидном векторе pGEX-KG

Для получения Lon-протеиназы и ее модифицированных форм был использован плазмидный вектор pGEX-KG (рис.2), который позволяет получать гибридные белки, состоящие из глутатион-8-трансферазы (GST, белок-носитель) и целевого белка, соединенных линкером Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly (//), который гидролизуется тромбином по связи Arg-Gly.

Для решения задач исследования необходимо было иметь в распоряжении гибридные белки (рис. 3), в структуру которых в качестве целевых белков были бы включены: (а) полноразмерная Lon-протеиназа (остатки NN 1-784, NAP), (б) фрагмент фермента, состоящий из АТР-азного и протеолитического доменов (остатки NN 108-784, АР), (в) фрагмент,

Sxal IBamHIl

EcoRI

Ptac

вставка

Smal

Smal

BamHI

Smal

EcoRI 2300 п.о. (а)

EcoRI 2000 п.о. (б)

EcoRI 650 п.о. («)

EcoRI 2400 п.о. (г)

Рис.2. Экспрессионный вектор pGEX-KG, использованный для клонирования Lon-протеиназы и ее модифицированных форм, (см.рис.3).

Молекулярная масса, кДа

f

Рис.3. Строение гибридных белков, использованных для получения Lon-протеиназы (а), двухдоменного фрагмента Lon-протеиназы АР (б), протеолитического домена (в), Lon-протеиназы с тромбин-чувствительным линкером между АТР-азным и протеолитическим доменами (г). GST -глутатион-Б-трансфераза, tl - тромбин-чувствительный линкер.

образующий протеолитический домен (остатки NN 567-784, Р), и (г) модифицированная [.оп-протеиназа с тромбин-чувствительным линкером между АТР-азным и протеолитическим доменами ^А-//-Р) (такая конструкция была создана с целью одновременного получения как индивидуального протеолитического домена, так и фрагмента Ьоп-протеиназы, содержащего Ы-концевой и АТР-азный домены).

Фрагменты ДНК, кодирующие полноразмерную Ьоп-протеиназу и ее модифицированные формы, получали полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием в качестве матрицы ранее сконструированного экспрессионного вектора рВЯ3271оп.

Для амплификации были использованы олигонуклеотндные праймеры [VI, структура которых приведена в табл. 2. Праймеры 1-Ш - прямые, частично комплементарные участкам цепи ДНК, кодирующим ^концевые аминокислотные последовательности целевых белков. Праймер VI - обратный, частично комплементарный участку кодирующей цепи гена 1ип. содержащему стол-кодоны (выделены курсивом). Праймеры содержали последовательности

Таблица 2 Структура олигонуклсотидных праймеров. использованных при

клонировании Ьоп-протеиназы и се модифицированных форм.

Ц^юьис Гни крюм- Сайг

Ьслки Структура праймера мера*" У" чип Л) И» р«г4."грн*ти

ЫАР 5' ААА ААС ССС ССА АТО ААТ ССТ ОАО СОТ ТСТ ОАА С (I) Л Ита!

5 • АА ААА САА ТТС ТСА СИ ПТ ТС1С АОТ С АС ААС С (VI) л ЕсоШ

АР 5' ААА ААС ССС ССА САА САС ТТТ ТСТ ОСО ААС ОСО О <Щ л 5та1

5' АА ААА САА ТТС ТСА СТА ПТ ТСС АОТ САС ААС С (VI) л ЕсоШ

Р 5' АА ААА ССА ТСС САТ АТС ОАА АТГ ААС ООС САТ ААС (Ш) л ВатИI

5' АА ААА САА ТТС ТСА СТА ТТТ ТСС АОТ САС ААС С (VI) л ЕсоШ

5' ООТ СТО СТА ССО ССТ ОСА ТСС САТ АТС ОАА АТТ ААС ООС (IV) ¡1

5" С АСО СОО ГАС САО АСС АСС АСС АСС ПТ ТАА ТОА СП' (V) 12

5' ААА ААС ССС ССА АТО ААТ ССТ ОАО СОТ ТСТ ОАА С (I) л 5/ии/

5' АА ААА САА ТТС ТСА (Т. 1 ТТТ ТСС АО Г САС ААС С (VI) р- ЕсоШ

* Выделены сайты узнавания рестриктаз: курсивом обозначены Бюр-колоны

** Праймеры типа / - фланкирующие, / - специфические инсерционные: нндексы "I" и "2" относятся к прямым и обратным праймерам. соответственно

сайтов узнавания рестриктачами Smal, ИатН! и F.atHI, использованных при клонировании в экспрессионном векторе pGEX-KG.

Для введения в структуру Lon-протеиназы тромбин-чувствительного линкера между АТР-азным и протеолитическим доменам» (при получении NA-(/-Р) использовали метод SOЕ (sequence overlapping extention) ПЦР-мугагенеза (рис.4). При этом использовали четыре синтетических праймера (табл. 2), два из которых - фланкирующие (праймеры I и VI) (А и D на схеме), и два -специфические (IV, V) (В и С на схеме), в структуру которых была заложена нуклеотидная последовательность, кодирующая тромбин-чувствительный линкер (X на схеме). В двух независимых ПЦР амплифицировали два частично перекрывающихся фрагмента АВ и CD, содержащих фрагмент X в области перекрывания, используя экспрессионный вектор pBR3271on в качестве матрицы. Фрагменты АВ и CD выделяли из агарозного геля, смешивали в эквимолярных количествах и использовали как матрицу при проведении второго этапа ПЦР с применением фланкирующих праймеров А и D.

Амплифицированные фрагменты размерами -2300, -2000, -650 и -2400 п о выделяли из 1% агарозного геля; в случае фрагмента размером -650 п о последовательно обрабатывали рестриктазами RcimHI и EcoRI. остальные фрагменты подвергали обработке эндонуклеазами рестрикции Smal и EcoRI и

А С

-► Х- ► BeoRt

SmM

ПЦР. А + П

-« X , -*-

в о

ПНР. с * г>

-Х-* I

X гп

V

-

~х-

| AB*Ct>

i ПЦР, A t- D

-х-

-х--

Рис.4. Схема введения тромбин-чувствительного линкера в структуру гена Ion методом SOE ПЦР-мутагенеза.

лигировали в исходную векторную плазмиду pGEX-KG. Скрининг клонов, несущих соответствующие плазмндные конструкции, проводили с помощью рестриктного анализа В результате клонирования полученных фрагментов ДНК в используемом плазмидном векторе были получены рекомбинантные плазмнды pGEX-NAP, pGEX-AP, pGEX-P и pGEX-NA-//-P.

2.2 Экспрессии рекомбинантных генов. Выделение и очистки Lon-протеинаш и ее модифицированных форм.

Экспрессию соответствующих генов проводили в клетках E.coli штамма МН I. Индукцию tac промотора (Рш)осуществляли добавлением изопропил-P-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Клетки осаждали центрифугированием. Накопление рекомбинантных белков контролировали электрофорезом лизатов клеток (рис. 5). Выход рекомбинантных белков составил около 30% суммарного белка клетки

кДа 4а 46

кДа la 16 2а 26 За 36

А Б

Рис.5. Электрофорез в 10%- (панель А) и 15%-ПААГ (панель Б) в присутствии ЗОБ лиитов клеток К.со/1 МН-1. трансформированных плазмидами рСЕХ-ЫАР (1), рСЕХ-ЫА-(/-Р (2); рСЕХ-АР(З) и рйЕХ-Р (4) а) до индукции, б) через 3 часа после индукции ИГПТ. Стрелками показано положение целевых белков. Слева указаны стандарты молекулярных масс (кДа).

I.я

Выделение гибридных белков проводили из биомассы клеток, полученных из 200 - 1000 мл культуры. Суспензию клеток подвергали действию ультразвука с последующим центрифугированием. Для очистки белков из полученного бесклеточного экстракта использовали один из двух вариантов методики: 1) последовательная хроматография на фосфоцеллюлозе Р-11 и на DEAE-ToyoPearl (стандартная методика выделения Lon-протеиназы) или 2) аффинная хроматография на глутатион-агарозе, связывающей только GST-содержащие белки. Чистота полученных препаратов гибридных белков в обоих вариантах составляла около 90 % (по данным гель-электрофореза).

2.2.1. Выделение Lon-протеиназы и ее модифицированных форм по стандартной методике.

Контрольный препарат Lon-протеиназы получали с помощью сконструированного в нашей лаборатории плазмидного вектора pBR327lon, несущего полноразмерный ген Ion под контролем собственного термоиндуцибельного промотора. Трансформированные вектором pBR327lon клетки E.coli АВ 1899 выращивали в колбах при пониженной температуре (30° С) до достижения значения огггического поглощения Абоо 0.8-1.0. Затем в течение 2 часов проводили индукцию экспрессии гена Ion повышением температуры культивирования до 42°С (в условиях активации собственного промотора гена). Применение такой схемы позволяло получать 3-4 г сырых клеток из 1 литра культуральной жидкости.

Биосинтез Lon-протеиназы контролировали электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии SDS (рис.6) Появление белковой полосы с молекулярной массой 87 кДа после индукции свидетельствовало об экспрессии гена Ion.

Осажденные клетки разрушали с помощью ультразвука, и полученную суспензию центрифугировали для удаления обломков клеточных стенок Бесклеточный экстракт подвергали хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-П, уравновешенной 0.05 М К-фосфатным буфером (рН 6.8-7 0), при этом более 90%

1 2 3 4 > кДа

Рис.6. Электрофорез в 12% ПААГ в присутствии SDS препаратов Lon-протеииазы на различных стадиях выделения: лизаты клеток E.culi ABIX94/pBR327lon до индукции (I), после термоиндукции (2). бесклеточный экстракт (3); препарат Lon-протсннаэы после хроматографии на фосфоцеллюлозе P-II (4); препарат Lon-протенназы после хроматографии на DEAE-Toyopearl (5).

белков экстракта не сорбировалось на смоле. Элюцию белков осуществляли 0 4 М К-фосфатным буфером, содержащим 10% глицерин. На профиле элюиии наблюдали один белковый пик, в котором содержалась протеолитическая активность, обнаруживаемая только в присутствии АТР (рис.7А) Чистота препарата Ьоп-протеиназы в элюированных фракциях составила около 70% (рис 6, (4)). Относительно высокая степень очистки фермента на этой стадии объясняется тем, что по отношению к Ьоп-протеиназе фосфоцеллюлоза выступает не только как ионообменный, но и как аффинный сорбент, '«то позволяет отделиться от значительного количества балластных белков.

Фракции, содержащие Ьоп-протеиназу, объединял», диализовали против буфера А (20мМ Трис-HCl, рН 7.5; 10% глицерин, 1 мМ днтиотреит) и подвергали хроматографии на сорбенте DEAE-ToyoPearl (рис.7Б) Элюцию связавшихся белков проводили линейным градиентом концентрации хлорида натрия (0-0.5 N1) в буфере А. Степень чистоты полученного на этой стадии препарата фермента достигала 90-95 % (рис.6, (5)); выход Lon-протепназы составил 1-1.5 мг/г клеток.

Аналогичной очистке подвергали препараты гибридных белков GST-NAP и GST-АР. Выход до 5-7 мг белка/г клеток.

Б

Амо |N«cq,M

фркщ

Рис.7. Последовательная хроматография бесклеточного экстракта E.coli на фосфоцеллюлозе Р-11 (А) и на DEAE-Toyopearl (Б). Фракции, содержащие Lon-протеиназу, заштрихованы.

2.2.2. Выделение гибридных форм Ьоп-протеиназы с использованием аффинной хроматографии на глутатион-агарозе.

Бесклеточный экстракт, содержащий гибридный белок, наносили на колонку с глутатион-агарозой, уравновешенной 50 мМ трис-НС1-буфером (pH 7.3) с 10% глицерина (буфер В). Колонку промывали от несвязавшихся фракций тем же буфером. Элюцию белка осуществляли буфером В, содержащим 5 мМ восстановленный глутатион. Выход гибридного белка составлял до 10 мг на 1 г клеток Е. coli, что превышает выход Ьоп-протеиназы в случае использования экспрессионной конструкции pBR3271on.

Для получения целевых белков гибридные формы Ьоп-протеиназы подвергали гидролизу тромбином.

2.2.3. Гидролиз гибридных белков тромбином.

Гидролиз гибридных белков GST-(/-NAP и GST-//-AP тромбином по связи -Arg-Gly- в тромбин-чувствительном линкере приводит к образованию целевых белков - Ьоп-протеиназы и ее двухдоменного фрагмента (NAP и АР, соответственно), содержащих на N-конце дополнительный тетрапептид Gly-Ser-Pro-Gly от тромбин-чувствительного линкера. Гидролизом гибридного белка GST-i/-P тромбином получен протеолитический домен (Р) Ьоп-протеиназы, содержащий на N-конце дипегтгид Gly-Ser от тромбин-чувствительного линкера. Строение полученных белков подтверждено N-концевым аминокислотным секвенированием (15 а.о.).

В случае гибридного белка GST-//-NA-//-P гидролиз по двум специфическим тромбиновым линкерам проходил с различной эффективностью. Гидролиз первого линкера, соединяющего GST с целевым белком, осуществлялся с такой же эффективностью, как и в случае гидролиза гибридных белков GST-//-NAP, GST-//-AP и GST-i/-P. Что касается введенного в молекулу Ьоп-протеиназы линкера между АТР-азным и протеолитическим доменами, то он не гидролизовался тромбином в обычных условиях, вероятно, вследствие того, что этот линкер оказывался замаскированным при фолдинге белковой

молекулы и поэтому недоступным для действия фермента. Таким образом, для получения ожидаемых целевых продуктов - КА и Р - из С5Т-//^А-(/-Р необходимо провести поиск условий, позволяющих осуществить гидролиз второго тромбинового линкера. Работа в этом направлении продолжается.

2.3. Стабильность ¿оп-протеиназы и ее моОифицированных форм.

При длительном хранении Ьоп-протеиназы и ее модифицированных форм наблюдаются процессы автолиза, причем скорость накопления продуктов зависит от характера модификации фермента и условий его хранения. Следует подчеркнуть, что при -20°С в 0.4 М К-фосфатном буфере, рН 7.0, содержащем 40 % глицерин, Ьоп-протеиназа и ее модифицированные формы способны сохранять как АТР-зависимую протеолитическую, так и АТР-азную активности в течение нескольких месяцев. В то же время концентрирование гибридного фермента С5Т-//-ЫАР ультрафильтрацией на мембране Аяпсоп ХМ-300 в 0 I М К-фосфатном буфере, рН 7 0, содержащем 10 % глицерин (буфер С), при 4"С приводит к интенсивному автолизу (подтверждено гель-электрофорезом) Подобные результаты получены при концентрировании Р-домена.

Препарат ОБТ-гАР при хранении в буфере С при 4"С автолизуется с образованием двух фрагментов с молекулярными массами 25 и 23 кДа (рис 8). Ы-концевым аминокислотным секвенированием (12 а.о.) было показано, что один из этих фрагментов (фрагмент I) представляет глутатион-Б-трансферазу, несущую на С-конце тромбиновый линкер и последовательность аминокислот 567-583 1лэп-протеиназы (из Р-домена), а другой (фрагмент II) последовательность 584-784 фермента. Таким образом, при автолизе расщеплению подвергается связь А1^583-РЬе584 (по нумерации Ьоп-протеиназы) в молекуле ОЯТ-(/-Р, в связи с чем можно констатировать, что Р-домен [-оп-протеиназы в этих условиях проявляет трипсиноподобную специфичность. Дальнейшее хранение образца приводит к полному исчезновению фрагмента (И), причем, фрагмент (I) при этом сохраняется (рис. 8). Длительное хранение очищенного препарата Р-домена в описанных условиях также приводит к его автолизу.

к.Ь /23

24 24

.'¡'/т.' ■<,■><?/! /

'¡>f'H.'.4i'< Ш : JJ

Рис. 8. Электрофорез в 15 %-иом ПААГ в присутствии SDS препаратов GST-P при хранении их в течение 1 суток (1), 1 недели (2) и 1 месяца (3).

3. Ферментативная активность Ьоп-протеиназы и ее модифицированных форм

3.1. Активность форм 1,<т-протешипы, содержащих А П'-ашыи домин.

Получение сравнительных данных по АТР-зависимой протеолитической и АТР-азной активности нативной Lon-протеиназы и ее модифицированных форм позволило ответить на вопросы, поставленные в задаче исследования. При этом гибридные белки, содержащие GST, также рассматривались как модифицированные формы Lon-протеиназы: GST-//-NAP - как фермент с удлиненным N-концевым доменом, a GST-//-AP - как Lon-протеиназа с полностью замененным N-концевым доменом.

Сопоставление активности нативного фермента и его укороченного варианта (АР) в индивидуальном состоянии и в составе гибридных белков представлено в табл. 3. Видно, что удлинение N-концевой части Lon-протеиназы на 4 (NAP) и на 226 аминокислотных остатков (GST-//-NAP) практически не влияет на энзиматические характеристики фермента: обе модификации полностью сохраняют АТР-зависимую протеолитическую активность, кинетические константы, характеризующие АТР-азную активность модифицированных форм фермента, практически не отличаются от констант для нативного фермента. Следует отметить, что добавление казеина приводит к стимуляции гидролиза АТР обеими модифицированными формами фермента

более чем в 2 раза, что также согласуется с результатами, полученными для нативной Lon-протеиназы.

С другой стороны, несмотря на то, что N-концевой домен является наиболее вариабельной частью молекул Lon-протенназ (см. раздел I), замена этого домена в молекуле Lon-протеиназы E.coli на GST (GST-//-AP) более чем на порядок снижает и АТР-зависимую протеолитическую и АТР-азную активность. Укороченная форма Ьоп-протеиназы (двухдоменный фрагмент, АР) практически полностью утрачивает оба вида активности.

Приведенные данные позволяют заключить, что структура N-концевого

Таблица 3. Ферментативная активность Ьоп-протеиназы из Escherichia coli и ее модифицированных форм*

Форма (|юрмента Молекулярная масса, кДа АТР-ивиси.мая протеолитическая активность. % АТР-азнця активность

мин мМ к.-« //.•„,. (мМ ч мин)'

Нативный 87.3 100 19 0 20 95

GST-tl-NAP 113.0 100 22 0.23 96

NAP 87.7 100 20 0.21 95

GST-il-AP 101.0 5 3 0 36 X

АР 74.7 1 <5

Кинетические параметры определены с точностью К) % для к^ и 25 % для Кт.

домена имеет важное значение для проявления Ьоп-протеиназой обоих видов ферментативной активности.

Интересно отметить, что параметры снижения активности двухдоменного фрагмента Ьоп-протеиназы (АР) хорошо коррелируют с полученными в нашей лаборатории данными о снижении активности Ьоп-протеиназы, происходящем при нарушенин олигомерной структуры фермента, например, в растворах с повышенной ионной силой. В связи с этим можно высказать предположение, что Ы-концевой домен Ьоп-протеиназы ответствен за олигомеризацию фермента. К сожалению, прямого подтверждения этому предположению в эксперименте по гель-фильтрации АР получить не удалось вследствие нестабильности этой модифицированной формы Ьоп-протеиназы. Возможно также, что более высокая активность гибридного белка ОБТ-гЛАР по сравнению

с активностью АР, обусловлена способностью GST-//-AP к образованию олнгомерных структур.

3.2. Активность протеолитического домена Lon-протеиназы.

Активность изолированного Р-домена Lon-протеиназы исследовали в сравнении с активностью нативного фермента и гибридного белка GST-//-P с использованием белкового (казеин) или олигопептидного (мелитгин) субстратов. Мелитгин - природный 26-членный пептид (GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRLRQQ-NH2) предложен недавно для сравнительного исследования специфичности протеиназ.

Протеолитический домен Lon-протеиназы весьма слабо гидролизует белковый субстрат (эффективность гидролиза казеина Р-доменом составляет менее 1% от эффективности гидролиза этого субстрата нативной Lon-протенназой) (табл. 4). Несколько выше скорость гидролиза казеина гибридным белком GST-//-P. Таким образом, удаление N-концевого и АТР-азного доменов из молекулы Lon-протеиназы приводит к тому, что изолированный протеолитический домен практически утрачивает способность нативного фермента гидролизовать белковый субстрат. В то же время Р-домен способен гидролизовать мелиттин почти так же эффективно, как нативный фермент гидролизует этот олигопептид в отсутствие АТР (АТР-независимая активность) (табл. 4). Можно отметить, что в присутствии АТР скорость гидролиза мелиттина Lon-протеиназой возрастает в 3-4 раза. Каталитические свойства гибридного белка GST-//-P мало отличаются от свойств Р-домена. Полученные данные свидетельствуют о том, что изолированный Р-домен в значительной мере сохраняет активность нативного фермента при гидролизе пептидного субстрата в отсутствие АТР. Расщепление молекулы мелиттина как Р-доменом, так и Lon-протеиназой происходит по нескольким связям. Однако неожиданным оказалось, что сайты преимущественного расщепления олигопептида нативным ферментом и Р-доменом различны: под действием Р-домена гидролизу, в основном, подвергается связь Thr10—Thr", а под действием нативной Lon-протеиназы - связь Val8 —Leu9 (показано N-концевым аминокислотным секвенированием). То есть Lon-протеиназа и ее Р-домен проявляют различную специфичность при гидролизе мелиттина.

Таблица 4. Активность протеолитического домена Ьоп протеиназы в индивидуальном состоянии и в составе нативного фермента или гибридного белка.

Протеолитическая Пептидазная

активность активность

□репарат (субстрат - казеин) (субстрат -

фермента мелиттин)

% гидролиза мкмоль/ч х мкмоль фермента

Р <1 <0.05 5.0

05Т-Г/-Р <5 <0.25 10.1

Ьоп (+АТР) 100 5 33.8

1.оп (-АТР) 0 0 9.1

Сравнение активности Р-домена и классической сериновой протеиназы -химотрипсина в экспериментах по гидролизу неспецифического сложноэфирного субстрата - »-нитрофенилового эфира триметилуксусной кислоты показало, что активный центр Р-домена функционирует на 2 порядка менее эффективно, чем активный центр химотрипсина.

Заключение

Представленные результаты позволяют дать ответ на основной вопрос исследования: "Функционирует ли как протеиназа изолированный протеолитический домен АТР-зависимой Ьоп-протеиназы ЕсоИТ'.

Можно констатировать, что Р-домен содержит сформированный каталитический аппарат активного центра и способен гидролизовать пептидный субстрат с эффективностью, сходной с эффективностью, проявляемой нативным ферментом. С другой стороны, Р-домен, в отличие от нативной Ьоп-протеиназы, не активен при гидролизе белкового субстрата, хотя и способен к автолизу (по-видимому, Р-домен правильнее называть не протеолигическим, а пептидгидролазным доменом). И только в составе нативной молекулы фермента Р-домен приобретает способность гидролизовать белковый субстрат. Таким образом, роль Ы- и А-доменов состоит, по нашему мнению, в формировании такой структуры Ьоп-протеиназы (включая этап олигомеризации), которая

способна к узнаванию и селективному связыванию специфического субстрата-мишени фермента (первичный сайт связывания субстрата должен быть локализован в ИА-фрагменте молекулы).

Изолированный Р-домен - это сравнительно низкоэффективная сериновая пептидгидролаза с мол. массой около 24 кДа. Первичная структура Р-домена не имеет гомологии среди сериновых гидролаз. Полученная в работе характеристика Р-домена позволила перейти к постановке следующей задачи в его изучении - рентгеноструктурному исследованию этого уникального объекта в изолированном состоянии и в составе нативного фермента. В настоящее время нами проводятся эксперименты по кристаллизации Р-домена, нативной Ьоп-протеиназы и их мутантов по каталитически активному остатку серина, несущих замену 5ег679А1а.

ВЫВОДЫ

1. На основе сравнительного анализа Ьоп-протеиназ из эволюционно отдаленных источников установлены границы функциональных доменов - N1-концевого (>1), АТР-азного (А) и протеолитического (Р) - в субъединицах ферментов.

2. С учетом установленных границ получены следующие модифицированные формы Ьоп-протеиназы Е.соН: а) фрагмент, включающий АТР-азный и протеолитический домены (АР), б) фрагмент, образующий протеолитический домен (Р), в) фрагмент, образующий протеолитический домен и несущий мутацию по каталитически активному остатку серина (Р-5ег679А1а), г) 1-оп-прсггеиназа, содержащая тромбин-чувствительный линкер между АТР-азным и протеолитическим доменами (ЫА-11-Р). Использованы гибридные конструкции целевых белков с глутатион-Б-трансферазой (белок-носитель).

3. Показано, что изолированный С-концевой домен Ьоп-протеиназы (Р-домен) практически не проявляет протеолитической активности, но обладает пептидазной активностью, то есть формирование каталитического участка протеолитического центра 1~оп-протеиназы происходит без участия [М-концевого и АТР-азного доменов фермента. Пептидазная специфичность Р-домена отличается от специфичности нативной Ьоп-протеиназы.

4. Установлено, что укороченная Lon-протеиназа, состоящая из АТР-азного и протеолитического доменов (AP-фрагмент), практически не обладает ни АТР-азной, ни протеолитической активностью. Это свидетельствует о необходимости N-концевого домена для проявления ферментом обоих видов активности.

5. Высказано предположение об участии N-концевого домена в олигомеризации Lon-протеиназы, в результате которой формируются белок-связывающий участок протеолитического центра и система сопряжения протеолиза и гидролиза АТР.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Расулова Ф.С., Дергоусова Н.И., Гинодман Л.М., Ротанова T.B. АТР-регулируемый протеолиз. Клонирование и экспрессия доменов Lon-протеиназы E.coli. Международная конференция памяти акад. АА.Баева, Москва, 1996. Тезисы стендовых сообщений, с.98.

2. Расулова Ф.С., Дергоусова Н.И., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Исследование роли N-концевого домена в функционировании Lon-протеиназы E.coli. IV Симпозиум по химии протеолитических ферментов, Москва, 1997. Тезисы стендовых сообщений и докладов, с.66.

3. Расулова Ф.С., Дергоусова Н.И., Ротанова Т.В. Получение и исследование фрагмента Lon-протеиназы Kcoli, включающего АТР-азный и протеолитический домены фермента. П Съезд биохимического общества Российской Академии» Наук, Москва, 1997. Тезисы стендовых сообщений, ч.1, с.58.

4. Starkova N.N., Melnikov Е.Е., Rasulova F.S., Ginodman L.M., Rotanova T.V. Escherichia coli protease Lon: Role of domains in enzyme functioning. 17 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, 1997. FASEB J.,vol. 11, p.A861.

5. Расулова Ф.С., Дергоусова Н.И., Мельников Э.Э., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Получение и исследование модифицированных в области N-концевого домена форм АТР-зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli. Биоорган.химия, 1998. Т.24, № 5, с.370-375.

6. Rasulova F.S., Dergousova N.I., Starkova N.N., Melnikov E.E., Rumsh L.D., Ginodman L.M., Rotanova T.V. The isolated proteolytic domain of the Escherichia coli ATP-dependent protease Lon exhibits the peptidase activity, FEBS Lett., 1998. Vol. 432, pp. 179-181.

7. Мельников Э.Э., Цирульников К.Б., Расулова Ф.С., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl - Новый субстрат для исследования функционирования АТР-зависимой Ьоп-протеиназы Escherichia coli и ее модифицированных форм. Биоорган.химия, 1998. Т.24, №8, с.638-640.

8. Starkova N.N., Melnikov Е.Е., Rasulova F.S., Tsirulnikov K.B., Ginodman L.M., Rotanova T.V. Interactions between proteolytic and ATPase domains in Escherichia coli protease Lon. International conference Biocatalysis-98, Puschino on the Oka, 1998. Abstracts, p.4.

9. Мельников Э.Э., Расулова Ф.С., Старкова H.H., Цирульников К.Б., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Сопряжение АТР-азной и протеолитической активностей у мутантных и укороченных форм Lon-протеиназы E.coli. XVI Менделеевский съезд по обшей и прикладной химии, посвященный 250-летию отечественной химической науки, Санкт-Петербург, 1998. Рефераты докладов и сообщений №4, с. 101.