Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование LON Гена Escherichia coli и продуктов его экспрессии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование LON Гена Escherichia coli и продуктов его экспрессии"

I о пд

: б лпр ш

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи УДК 577.152.4

ЧИСТЯКОВА Людмила Геннадьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ LON ГЕНА Escherichia coli И ПРОДУКТОВ ЕГО ЭКСПРЕССИИ

03.00.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН и Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения МЗ России

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Антонов В. К.

доктор биологических наук Киселев В. И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. И. Матвиенко

доктор химических наук С. Н. Кочетков

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН

Защита диссертации состоится 20 мая 1993 г. в часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д 074.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦМДЛ

Автореферат разослан « /<? » 1993 г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета кандидат биологических наук

В. В. Отраднова

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Одной из важнейших проблем при экспрессии в клетках E.coli физиологически важных белков и пептидов является преодоление их эффективного внутриклеточного протеолиза. Известно, что более 90% белковой деградации требует метаболитической энергии (Maurizi M.R, 1992). Ключевую роль в этом процессе играет АТР-зависимая La-протенназа, кодируемая геном Ion. Она входит в регулон белков теплового шока и наряду со способностью распознавать и направленно деградировать "ненормальные" для клеток E.coli белкн участвует в осуществлении ряда физиологически важных функций: регуляции клеточного деления, продукции капсульных полисахаридов и формировании устойчивости к ультрафиолетовому облучению и его аналогам.

La-протеиназа принадлежит к уникальному классу сериновых протеиназ, требующему для проявления своей протеолитической активности энергии АТР. Причем, АТР-азная активность этого фермента не проявляется в отсутствии белкового субстрата, а ингибирование АТР-азной активности вызывает пропорциональное уменьшение гидролиза белка. Однако, несмотря на значительное число публикаций по исследованию La-протеиназы (Gottesman S. 1989, Goldberg A et al. 1992, Maurizi M.R. 1992), точный механизм функционирования этого фермента и его субстратная специфичность до настоящего времени не известны. Не установлено также, какие структурные и химические особенности белков делают их "распознаваемыми" для La-протеиназы и какую роль в этом процессе играет АТР. Детальное изучение Ьа-протеиназы в значительной степени тормозится невозможностью получения активного препарата фермента из клеток E.coli дикого типа вследствие низкого содержания и высокой лабильности белка.

Регуляция экспрессии Ion гена и уровень La-протеиназы в клетке подвержены жесткому контролю и кратковременно индуцируются при тепловом шоке и накоплении в клетке дефектных денатурированных и чужеродных белков. Экспрессия в клетках E.coli клонированных белков приводит к активации синтеза La-протеинззы и возрастанию их протеолиза. Прямое внесение мутаций в Ion ген приводит вместе со снижением протеолиза к значительному снижению жизнеспособности клеток.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ Клонирование Ion гена E.coli, получение суперпродукции и выделение активной АТР-зависимой Ьа-протеиназы для последующего изучения биохимических свойств фермента и его субстратной специфичности, а также изучение возможности регуляции внутриклеточного

уровня La-протеиназы для создания технологичных штаммов E.coli с пониженным протеолизом рекомбинантных белков.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

В настоящей работе клонирован ген Ion, кодирующий АТР-зависимую La-протеиназу н исследована его экспрессия в клетках E.coli в различных векторных системах. Показано, что увеличение внутриклеточного содержания La-протеиназы более 1,3% то общего белка токсично для клеток, приводит к резкому возрастанию неэнергозависимого протеолиза нормальных белков и автолизу клеток. Получен на основе E.coli АВ 1899 pBRIon стабильный термоиндуцибельный штамм-продуцент La-протеиназы. Предложенный в работе простой метод выделения позволяет получить высокоочищенный препарат Ьа-протеиназы, пригодный для биохимических и структурных исследований.

Впервые показана возможность коррекции внутриклеточного протеолиза дефектных и чужеродных белков в клетках E.coli с помощью индуцибельного синтеза антисмысловых РНК к гену Ion. Установлено, что наибольший ингибируюший эффект достигается, когда в. качестве знгисмысловой последовательности использовалась 5'-концевая нетранслируемая и структурная часть Ion гена. Причем существенным для формирования стабильного РНК:РНК дуплекса in vivo является доступность для взаимодействия участка антисмысловой РНК, комплементарного S-D последовательности Ion гена. Применение разработанного подхода для экспрессии рекомбинантных белков позволило получить 2-4-х кратное увеличение синтеза ряда целевых белков (у-интерферона человека, fusion-белка на основе у-интерферона и антигенной детерминанты вируса гепатита С, протеиназы ЗС вируса полиомиелита и N-концевого Fc-связывающего домена белка A S.aureus). При этом наибольшее увеличение выхода наблюдалось при термоиндуинбельном синтезе рекомбинантных белков .. накапливающихся в цитоплазматической фракции клетки в растворимом состоянии. Отсутствие отрицательных ростовых характеристик (замедленный рост, выраженная ослизненность и дефекты деления) у полученных в процессе' работы штаммов позволяют надеятся на эффективное использование их в биотехнологии.

Впервые при исследовании консерватизма системы энергозависимого протеолиза было показано наличие гомологичного гена и АТР -зависимой протеиназы в клетках P.putida.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включая рисунков и таблиц. Работа состоит

из введения, обзора литературы, экспериментальной части , полученных результатов и их обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы ( источников).

ДПРОВАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации были доложены на 14 Интернациональном Биохимическом Конгрессе (Прага, 1988г.), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии"( Пущнно, 1988), на 20-ой Конференции ФЕ6С (Будапешт, 1990), на Всесоюзном симпозиуме "Химия белков" (Тбилиси.1990) и Интернациональном Симпозиуме по ферментам в органическом синтезе (Дели, 1992).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. КЛОНИРОВАНИЕ LON ГЕНА ESCHERICHIA COLI K-I2

Для клонирования lon-геиа, кодирующего АТР-зависимую La-протеиназу, нами был использован принцип комплементации мутации.

При трансформации !оп-мутантов рекомбинантными плазмидами, несущими функциональноактивный Ion -ген, клетки должны терять характерные признаки мутации и обладать повышенным уровнем внутриклеточного протеолиза.

Согласно литературным данным { Zehnbauer В.A. et al., 19801 Ion-ген расположен на 11 минуте генетической карты E.coli и локализован на фрагменте ДНК около 3 т.п.о. между сайтами узнавания рестриктаз EcoRI и Sphl. Поэтому для получения обогащенного банка генов ДНК E.coli подвергали гидролизу рестриктазамн EcoRI и Sphl и фракционировали в градиенте плотности сахарозы. Фрагменты с молекулярными весами 2,5^1 т.п.о. лигировалн с соответствующим рестриктом плазмиды pBR327. Полученные рекомбинэнтные плазмиды амплифицировали в клетках E.coli Н8101, так как коэффициент трансформации 1оп-мутантов не превышал 103104 колоний на 1 мкг ДНК pBR327. Амплифицированными рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E.coli АВ1899, несущие точечную мутацию в С-концевой области Ion -гена. Первичный отбор клонов проводили по увеличению устойчивости к нитрофурантоину( Ion-мутанты не растут на LBA с концентрацией нитрофурантоина более 2 мкг/мл, в то время как дикие клетки E.coli К12 могут выдерживать концентрацию нитрофурантоина » среде до 6 мкг,/мл.) и отсутствию ослизненности на минеральной среде М9. Отобранные в результате первичного скрининга 23 клона прогерялн с помощью дот-гибридизации с олигонуклеотидным зондом 5'-

ДНК Е.соИ К-12

ЕсоИ/БрЫ

Фракционирование в градиенте плотности сахарозы( 20-40%)

I

Фрагменты ДНК Е.соН 2,5-4 т.п.о.

Рис.1 Схима клонирования 1оп гена Е.соИ К-12.

EmRl Hpal KnMHpoI В*Ш Safl Hpal SPh¡

i1 V J t * * * *

♦ t f f t

BstHl R¡tl Hpnl BamHI BstVI

Рис.2.Рестриктная карта Ion гена E.coli K-12. Положение сайтов узнавания рестриктаз указано стрелками. Маштаб карты приведен в тысячах нуклеотидных пар.

CTGAACGCATTG-AAATCCCCGTATTGCC , соответствующим 5'-концевой области гена.

Положительный сигнал при гибридизации давали 7 клонов, содержащие плазмиды с клонированным EcoRI-Sphl фрагментом геномной ДНК 2,7 т.п.о.,

Рестриктная карта клонов почти полностью совпадала с опубликованной, однако в нашем случае появились новые Sphl и Kpnl сайты.

Трансформация отобранными плазмидами 1оп-мутантов VL901 (lonl 1) и SG20050( Д1оп) приводила к исчезновению характерных признаков Ion мутации.

При определении нуклеотидной последовательности плазмиды с Ion геном было установлено, что клонированный ген не содержит терминирующего кодона и терминация трансляции происходит после Sphl сайта на участке векторной ДНК. Плазмида, содержащая С-концевые 7 аминокислот и терминирующий трансляцию кодон за сайтом узнавания рестриктазы Sphl была любезно предоставлена Америком А.Ю.

Интересно отметить, что отсутствие' С-концевых аминокислот не приводило к потере АТР-зависимой протеолитической актив..ости La-протенназы, необходимой для осуществления ею своих внутриклеточных функций.

2.ЭКСПРЕССИЯ LON-ГЕНА E.COLI В РАЗЛИЧНЫХ ВЕКТОРНЫХ

СИСТЕМАХ И ВЫДЕЛЕНИЕ АТР-ЗАВИСИМОЙ La-ПРОТЕИНАЗЫ.

Для изучения экспрессии Ion-гена в клетках E.coli плазмидами pBRIon, содержащей полноразмерный Ion ген с собственными регуляторными элементами, и pBRIonm, содержащей укороченный Ion ген,

трансформировали клетки E.coli АВ1899. Электрофоретический анализ ли-

í 2 3 4

;■ p»4J "

ЬО 60 30 120 ВРЕМЯ, мин. Рис.4 Внутриклеточная деградация '^С-пуромицин-содержащих пептидов в клетках E.coli АВ1899 pBR327 (1), АВ1157 PBR327 (2), АВ18Э9 pBRten (3), AB1899 pBRlonm(4)

t ST*4*

lis »*•» — Kil _

^ «ж» »aia

Рис.3. SDS-электрофорез в 7% поли-акриламидном геле лизатов клеток E.coli ABI899 pBR327(2), АВ1899 pBRlonm (3) и АВ1899 pBRlon (4). Положение белковых полос, соответствующих La-протеинэзе и продукту модифицированного гена Lam показано стрелками. Линия 1- маркеры молекулярных масс.

затов клеток с pBRlon в 7% SDS-полиакриламидном геле показал появление при термоиндукции в течение 1 часа при 42°С белковой полосы с молекулярной массой около 87 кД., что соответствует молекулярной массе Ьа-протеиназы.{Рис.З(4))

Уровень экспрессии, определенный при сканировании геля на приближался к 0,7% от клеточного белка. В клетках с pBR!onm при термоиндукции наблюдалось появление белковой полосы с чуть большим молекулярным весом, так как при терминации трансляции открытой рамки !оп гена на векторной ДНК к С-концу La-протеиназы присоединялись аминокислот (Рис.З(З)). Причем уровень экспрессии модифицированного белка был значительно ииже, чем полноразмерного.

Для выявления специфической протеолитической активности в клетках E.coli ABI8899 pBRlon и pBRJonm использовался тест на внутриклеточную

активность Ьа-протеиназы, определяемую по скорости деградации '^С-пурамиидковых пептидов. Антибиотик пуромицин структурно близок к концевому фрагменту аминоацил-т-РНК. При проникновении в клетки он вызывает обрыв синтеза белковой цепи и приводит при совместном впедении импульсной метки к образованию радиактивномеченных дефектных полипептидов, являющихся субстратами для La-протеиназы. В клетках АВ1899, содержащих плазмиды pBRion и pBRlonm , процент деградации таких белков возрастал более, чем в 3 раза по сравнению с контролем ÍAB1S99 pBR327) и в 1,5 рала по сравнению с клетками дикого типа (Рис.4).

Таким образом, замена 7 С-концевых аминокислот La-иротешшц не приводила к заметному изменению протеолитической активности фермента, но существенно влияла на стабильность белка как внутри клетки, так и в процессе выделения.

Так как собственный промотор Ьа-протеиназы относится к числу "слабых" термоиндуцибельных промоторов, продукция Ьа-протеиназы в клетках Е.соН дикого типа не превышает 0,01% от общего клеточного белка и не детектируется в SDS-электрофорезе с помощью окрашивания Кумасси. Поэтому замена собственного "слабого" промотора на более эффектияно работающий в клетках E.coli должна, как мы предполагали, привести к усилению экспрессии La-протеиназы. С этой целью нами была предпринята попытка клонирования Ion-гена под контроль сильного индуцибельного lac-промотора в плазмидный вектор pUC18 (Рис.5).

На первом этапе клонирования EcoRI-BamHI фрагмент плазмиды pBRion, содержащий 1оп-промогор, S-D последовательность и N-концевую структурную часть Ion-гена, был перенесен в плазмиду pUC18 по соответствующим сайгам. Затем полученная плазмида pUCNlonl гидролизовалась рестриктазои PstI и дотировалась с соответствующим С-концевым фрагментом Ion гена. В разультате полноразмерный Ion ген оказывался в плазмидном векторе pUC18 под контролем двух промоторов !ас и Ion, имеющих одинаковое направление транскрипции.

Плазмида pUC!on2 содержала полный 1оп ген E.coli с собственным участком связывания рибосомы под контролем только lac промотора и создавалась на основе вектора pUC181, имевшего стоп кодон в рамке трансляции LacZ полипептида перед рестриктазным полилинкером, предохранявший от получения гибридных белков в случае клонирования с сохранением открытой рамки LacZ и альтернативной трансляции протяженных пептидов в случае посадки рибосомы на S-D последовательность lacZ гена.

Eco Bl

Hind 111

Pat I

Bst NI Bam HI

Hind III

Bst N1 ~Bam HI

'\Psi I vHind III

Pst I Hind HI

pVCloni pUClon2

Рис.5 Схема конструирования плазмид, экспрессируюших Ion-ген E.coli под контролем 1эс-промоторз.

Электрофоретический анализ клонов AB1899, содержащих плазмнды pUClonl и pUClon2 небольшое увеличение продукции La-протеиназы при индукции IPTG: в 1,2 раза в случае pUClonl и в 1,3 раза в случае pUCIon2.

Так как прямое определение АТР-зависимой протеолитической активности в лизатах полученных штаммов-продуцентов было невозможно из-за экранирующего действия других внутриклеточных протеиназ, было проведено обогащение лизатов, содержащих La-протемназу, хроматографией на фосфоцеллюлозе PU. La-протеиназа, как ДНК-связывающий белок, взаимодействовала полуаффинно с сорбентом, в то время как остальные протеиназы оставались в несвязавшейся фракции. Результаты оп(>еделения АТР-зависимой протеолитической активности по специфическому субстрату. '^С-ацетил-казеину в обогащенных таким образом лизатах показали, что наибольшая удельная активность на мг клеточного белка определялась в клетках E.coli АВ1899 с плазмидами pBRlon и pUClonl. Значительно более низкие значения удельной активности наблюдались в клетках AB1899 с pUClon2, несмотря на высокий уровень экспрессии, определяемый электрофоретически. Это может объясняться как частичным формированием при сверхсинтезе с lac промотора неактивной конформации La-белка, так и снижением жизнеспособности клеток, в которых идет наработка больших количеств протеиназы.

Таблица 2. АТР-зависимый протеолиз в обогащенных на фосфоцеллюлозе Р-11 лизатах клеток E.coli, содержащих плазмиды с клонированным Ion геном.__

Штаммы E.coli % гидролиза ^С-Ас-казеина час мг белка Коэффициент ускорения протеолиза

-ATP +АТР

AB 1899pBR 327(lon-) 1,78 1,31 • 0,71

AB 1157pBR 327(lon+) 1,87 4,30 2,28

AB 1899 pBRlon 6,33 39,80 6.29

AB 1899 pBRlon m 5,66 23,70 4,19

AB 1899 pUClonl 5,71 37,12 6,49

AB 1899 pUCIon2 18,9 27,1 1,43

В пользу последнего предположения говорит тот факт, что клетки АВ1899 р1ГС!оп2 при индукции синтеза La-протеиназы свыше 20 минут подвергались автолизу, в них наблюдалось резкое увеличение протеолнтической активности, не зависящей от АТР.

Надо отметить, что все штаммы E.coli АВ1899, содержащие плазмиды с клонированным Ion геном, имели значительно сниженную скорость роста. При инкубации в течение суток при 37°С на чашках с минеральным агаром часть колоний возвращалась к мутантному фенотипу, причем, количество таких "ревертантоа" в случае pUCIon2 было максимальным и достигало 27,6%. Анализ плазмид из этих клонов показал, что происходят структурные изменения кодирующей Ion ген области ( делеции фрагментовДНК). В одном из клонов было обнаружено встраивание в промоторно-операторную область Ion-гена инсерционного элемента IS 186, открытого при анализе структуры белков теплового шока форели. [ Chong Р. el al., 1985 ].

% гидролиза НС -Ас-казеина

1 2 3

i— Lo

4 6 t 10

№ фракции Рис.6 Хроматография лизатов клеток E.coli ABl 899 pBRIon на фосфоцеллюлозе (*•-*■)- Оптическая плотность при Ä280> (♦-•)- Протеолитическая активность по '^С-Ас-казеину в присутствии АТР, (о—О)- Протеолитическая активность без АТР, (•■■•)- ЛТР-азная активность в присутствии субстрата. (о*"О)- АТР-азная актнииость.

Рис.7 Электрофорез в 7% БОБ-РЛАО лнзата клеток Е.соН АВ1899 рВИоп (1), Белковая фракция, несвя-завшаяся с фосфоцеллю-лозой (2), Фракция эллю-ата с максимальной АТР-зависимой протеолнтической активностью (3).

i 2

6? —

43 —

Рис.9 Электрофорез в 7% SDS-PAAG выделенной La-протеиназы (l), маркуры молекулярных масс(2).

Градиент NaCl- 0 - 0,5М.

Трансформация клеток E.coli дикого типа (ABI 157) плазмкдой pBRlon также вызывала гибель клеток при выращивании в жидкой среде LB. Вероятно, суперпродукция La-протеиназы токсична для клеток E.coli и приводит к автолизу клеток.

Для выделения активного фермента нами использооался штамм E.coü ABl 899 с плазмидой pBRlon как достаточно стабильный и обладающий высоким уровнем La-протеинэзы. Клетки выращивали в питательной среде LB при 30°С до ОП=0,8-1,0, для индукции синтеза Ьа-пратеинязы подвергали тепловому шоку при 42°С в течение 1 часа, разрушали ультразвуком, центрифугированием при 45 000g в течение 40 мин. освобождались от обломков клеток и мембран и подвергали хроматографии на фосфоцеллюлозе Pll(Watman). АТР-зависимая протеолитическая активность обнаруживалась во фракциях, эллюировавшихся со смолы прн концентрации фосфатного буфера до 0,ЗМ. (Рис.6) В результате этой стадии удавалось значительно освободиться от баластных белков и достичь примерно 85% чистоты фермента по электрофоретическому анализу (Рис.7).

19 щмчпмя 20 ftpшля*

Рис,8 Хроматография на ДЕАЕ-сефацеле обогащенной на фосфоцеллюлозе фракции La-протеинззы. (Л—л)- Оптическая плотность А280- (•-•)- Протеолитическая активность в присутствии ЗмМ АТР, (о-0 )-Протеолитическая активность без АТР.

Второй стадией очистки была ионообменная хроматография на DEAE-сефацеле (Pharmacia). АТР-зависимая протеолитическая активность совпадала с узким белковым пиком при концентрации NaCl в градиенте от 0,25 до 0,3 М.( Рис.8) Полученный препарат фермента был практически гомогенен по SDS-электрофорезу и использовался для изучения бнохимнчемких свойств Ьа-протеиназы и получения поли- и моноклональных антител.(Рис.Э)

3. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ LON-ГЕНА E.COLI С ПОМОЩЬЮ АНТИСМЫСЛОВЫХ РНК

Для изучения возможности коррекции протеолитических- процессов клетках E.coli с помощью антисмысловых РНК к Ion -гену была сконструирована на основе pUC!9 серия плазмид, содержащих различные участки Ion-гена ( как регуляторные, так и структурные) в обратной ориентации под контролем индуцибельного 1ас-промотора.

В литературе нет единого мнения, какие участки гена могут использоваться в качестве матрицы для синтеза антисмысловых м-РНК с выраженной ингибирующей активностью. Для ß-галактозидазы E.coli удалось на 90% снизить ее внутриклеточную активность с помощью анти-м-РНК к основной структурной части гена lacZ.[Ellison M.J.et al 19851 При ингибировании синтеза ряда белков в клетках E.coli использовались antisense RNA к 5"- нетранслируемой области и регуляторным участкам генов ( S-D последовательность, стартовый кодон трансляции) [Такауаша K.M. et al 1990]. Поэтому в качестве одного нэ фрагментов при конструировании плазмиды с антисмысловой м-РНК, pUC19AL-l, был выбран участок ДНК Ion гена, длиной 350 пар нуклеотидов, расположенный между участками узнавания рестриктаз Нра I и Hind III. Этот фрагмент содержит промоторную область, участок связывания с рибосомой и начало структурной части гена. Hpal-llindlll-фрашент Ion -гена клонирован по сайтам рестриктаз Smal и Hind III в плазмнду pUC!9 в обратной ориентации относительно 1ае-промотора. Схема клонирования изображена на Рис. 10.

Однако, наличие !оп-промотора и расположенная в его области большая "шпилька", возможно, могли повлиять на транскрипцию полученной химерной м-РНК. Поэтому при конструировании плазмиды pUC19AL-2 мы использоилли BstNI- HindlH фрагмент Ion -гена, содержащий только S-D последовательность и б'-концевую структурную часть гена. Структура полученных плазмид подтверждалась секвснированием по

ton gene (2770 bp)

рио.10Сгема создания плазмид, направлящи* скнтея антисмысловыг комплементарных panличным участкчм Ion-гена Е. соТ;

ж

с о

и А

О ■ А О-С С- О О- С

и ВСАООАтГОСАВАОАОСШЗШ1СПТ7АОШГОАА1ПГОССОССА_ С5-В

а) Антисмысловая РНК -2

А

С О О А

О -А

О- С С • О ' О-С

О ОСАООАОТОСАОАОАОСДСПСаСООАООТГОААОттеСОССАОО

V

сио оси

А в

о с

САСА ОСА О-С и-А А- О

о ■ с А-0

с

О-А А-0 А-0 О-А

С

о

0-А

в А

О А А V

О-А С- О

и-А е- о с-о

о- с

в- с

А-0 0-0 О-С

о

О-С с-в

С- в С-0

О-С О-С

и ОСАвОАООСАОАОАОСПЕПЕПСтиО АООСА-

оБ-С

б) Антисмысловая РНК -21$

А

А А

О-А А-0

о-е

ОС А- С

ее о-е

А о о-с

А А О-С

С-0 О-С

О - А А-0

0-А А-0

А-О А-0

О С О А

С-0 О-А О-С 0-А А-О

АСА • ОООООАОООААС - О ССАС

О-А О-С

о-с о-е

о-А о-е

А-О А-О

с-0 о о

О А ои о с

АОАООАААААОи ОООООТ-

в) Аяти-1оп-РНК-1

Рис. II Вторичная структура антисмысловых РНК, рассчитанная по программе "БЕСБТИиС"

модифицированному методу Максама-Гилберта. Плазмида из одного из клонов, pUC!9Al-21S содержала вставку из 38 нуклеотидов в районе BstNI сайта

В качестве одного из претендентов на кнгибирующее действие была предпринята попытка создать плазмиды, направляющие синтез micRNA к центральной кодирующей части Ion -гена. Фрагмент Hpal-Hpaí длиной 1,1т.п.о., содержащий консервативную область и АТР-связывающий участок, клонировали в pUC19 по сайту узнавания рестриктазы Smal. Однако, а результате скрининга клонов E.coli HB10I, трансформированных рекомбинантными плазмидами, обнаруживались клоны, содержащие плазмиды со вставкой Hpal-Hpaí Ion-гена только в прямой ориентации относительно 1ас-промотора. Попытка переклонировать Pstl-Hpàl -фрагмент по соответствующим сайтам в pUC19 также не дала положительных результатов. Возможно, плазмиды с такой структурой оказываются неустойчивыми или экспрессия антисмысловой м-РНК к основной структурной части Ion-гена подавляет рост клеток E.coli.

Да я получения анти-м-РНК транскрипта на З'-концевую область Ion -гена HpaI-Sphl-фрзгмент гена переклонировали в pUCI9 и получили плазмиду pUC10AL-4.

При конструировании всех плазмид, направлявших синтез антисмысловых РНК, учитывалась необходимость отсутствия протяженной открытой рамки считывания с 1ас-промотора, чтобы предотвратить нх трансляцию.

В качестве теста для проверки ингибирующей активности полученных плазмид использовали определение внутриклеточной „ктивмости La-протеиназы по скорости деградации '^С-пуромицшювых пептидов.

Клетки E.coli ABU57 трансформировали плазмидами pUCi9-AL-l, pUCl9At.-2, pUC19AL-2!S, pUC19AL-4. В качестве положительного контроля использовались эти же клетки АВ1157 с векторной плазмидой pUCl9, а отрицательным контролем служил штамм E.coli АВ1899 (изогеннын АВП57, но несущий точечную мутацию в Ion-гене, lonlOO) с pUC19. Наибольшее снижение скорости протеолиза •''С-пуромициновых пептидов ( почти до уровня lon-мутэнта) наблюдалось при транскрипции анти-м-РНК с плазмиды pUC19AL-l. Менее выраженный эффект ( 50-60% ингибиропания) наблюдался в клетках, содержащих pUCl9AL-2. Причем, этот эффект полиостью исчезал в случае pUC19AL-2IS. когда транскрибирующаяся с 1ас-промотора анти-м-РНК содержала вставку.

ьЯ g»

s

et

CS

a.

u о CI «a s

QJ

к

a

U

iS 30 1S

ВРЕМЯ, мин.

Рис.1J Скорость деградации '^С-пуромициновых пептидов в клетках E.coÜ AB1899 pUC19 (1), АВ1157 pUC19 (2), ABl 157 pUC19AL-l (3), ABl 157 pUC19AL-2 (4), ABl 157 pUC19AL-4 (5), ABl 157 pUCAL-2IS (6).

В клетках ABU57 с pUC19AL-4 снижения протеолизй по сравнению с контролем не наблюдалось. По-видимому, анти-1оп-м-РНК к З'-концевой области Ion-гена не препятствует синтезу Ьа-протеиназы в клетке.( Рис. U.)

Для объяснения различий в эффективности действия анти-1оп-м-РНК был произведен рассчет предполагаемой вторичной структуры по программе "SECSTRUC", основанной на энергетических рассчетах M.Gouy по стабильности вторичной структуры РНК в физиологических условиях (концентрация соли, рН и температура).(Рис. 12.). Согласно этим рассчетам, последовательность, комплементарная S-D-области не вовлечена в образование стабильных "шпилек" в РНК, транскрибируемых с плазмид pUC19AL-l и pUCl9AL-2 и может взаимодействовать с м-РНК Ion гена. Включение нуклеотидного фрагмента . приводит к изменению вторичной структуры антисмысловой РНК, нарабатывающейся с плазмиды pUC19AL-2IS. Рядом с комплементарной S-D областью появляется выраженная "шпилька". Вероятно, такая структурная перестройка существенно снижает эффективность формирования РНК:РНК -дуплекса, что и проявляется при исчезновении влияния на внутриклеточную активность Ьа-протеиназы.

Согласно данным Перссона и др I Persson С. et al., 1988], полученным с использованием точечного мутагенеза, на первой стадии образования РНК:РНК дуплекса в клетке при арест-трансляции происходит

взаимодействие комлементарных участков РНК, расположенных в петлеобразных структурах на вершинах жестких "шпилек". Выраженное ингнбирующее действие, проявляемое ани-1оп-мРНК, транскрибируемой с плазмиды pUC19AL-l может объясняться наличием в комплементарной промотору области ряда жестких "шпилек". Экспонированные в лупах этих шпилек" последовательности взаимодействуют с комплементарными участками м-РНК, расположенными на аналогичных "шпильках" и, вероятно, инициируют процесс образования РНК:РНК-дуплекса.

С другой стороны, различия в эффективности ингибирующего действия антисмысловых м-РНК, транскрибируемых с pUC19AL-1 и pUC19AL-2 , могут быть связаны с различной стабильностью их в клетке. Расположенная на 3'-конце pUC19AL-l РНК G-C-богатая шпилька, завершающаяся поли11-последовательностью может служить р-зависимым терминатором транскрипции и предохранять РНК от действия внутриклеточных нуклеаз.

Дальнейшее исследование протеолиза '''С-пуромициновых пептидов в клетках ABl 157 с pUC19AL-l показало, что анти-м-РНК-1 оказывает влияние только на энергозависимый, ингибируемый KCN иротеолиз дефектных пептидов и не влияет на иротеолиз нормальных белков в клетке.

Для определения внутриклеточного уровня Li-протенназы провели определение АТР-зависнмой протсолитическон активности по специфическому субстрату ИС -ацетил-казеину в лизатах клеток E.coli. обогащенных1 на фосфоиеллюлозе Р-11.Данные, приведенные в таблице ¡1. показывают, что в клетках, транскрибирующих при индукции IPTG антисмысловую РНК с плазмиды pUC19AL-l существенно снижается внутриклеточный уровень La-протеиназы.

Таблица il. Ингнбирование АТР-зявисиМого протеолиза с помощью антисмысловых РНК к lar; гену в лизатах клеток Е.coli,обогащенных на фосфоцеллюлозе Р11.

Штаммы E.coli АТР-зависимый протеолиз % гидролиза ^С-казеийа час. х мг.белка Протеолиз в относительных %

АЯ1899 pUC19 1.80 2 S

ABl 157 dUC19 6,37 100

ABl 157 pUC19AL-l 2.71 •12

Чтобы определить универсальность действии антисмысловой м-РНК к гену Ion два других наиболее широко используемых в рекомбинантной технологии штамма E.coli НВ101 и МН1 трансформировали pUC19AL-l. В обоих штаммах происходило снижение внутриклеточного протеолиза '^С-пуромициновых пептидов на 55 и 40 % соответственно при индукции анти-lon-M-PHK-1. ( Табл. 3.)

Существенным недостатком 1оп-мутантов, препятствующим их широкому использованию в биотехнологии, являются замедленный рост, сильная ослизнеиность, филаментированне клеток и высокая чувствительность к ультрафиолету. Однако, в штаммах E.coü, превращенных в Ion -мутанты с помощью pUC19AL-l таких фенотипических изменений не наблюдалось.

Таблица Ш. Эффект индуцибельного синтеза антисмысловой РНК к гену Ion на внутриклеточный протеолиз дефектных белков в различных штаммах E.coli

Штаммы E.coli Гидролиз 1.4С-пуромициновых пептидов в относительных % за 60 мин. при 37°С

+ ImMKCN

МН1 püC19 100 61,8

МН1 pUCl9AL-l 66,7 63,5

НВ101 pUC 19 100 42,2

HBIOI pUC19AL-l 45,6 43,8

Кривая роста клеток АВ1157 pl)C19AL-l практически совпадала с кривой роста контрольных клеток АВ1157 pUC19 с нормальным протеолизом, тогда как Ion-мутант АВ1899 pUC19 имел значительно сниженную скорость роста. При инкубации чашек с колониями клеток АВ1157pUC19AL-l на минеральной среде ослизнення колоний не происходило в отличие от мутантных по Ion-гену клеток. При микроскопическом исследовании мазков этих клеток длинные неделящиеся клетки-фила менты также не обнаруживались. Очевидно, остаточный внутриклеточный уровень La-протсиназы (на 10-20% выше, чем в Ion-мутантах) достаточен для осуществления этим ферментом своих внутриклеточных функций: регуляции

л

синтеза капсульных полисахаридов и расщепления suIA-белка. препятствующего делению клеток.

Таким образом, введение плазмиды, кодирующей антисмысловую последовательность к 5'-концевому фрагменту 1оп-гена( включая 5'-нетранслирусмую область, S-D последовательность и начало структурной части гена) позволяет существенно снизить внутриклеточный протеолнз дефектных белков в различных штаммах E.coíi, не приводя при этом к появлению отрицательных ростовых характеристик 1оп-мутантов.

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИСМЫСЛОВОЙ КОРРЕКЦИИ ПРОТЕОЛИЗА ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ E.COLI.

Физиологически активные белки и пептиды, экспрессируемые в клетках E.coli, подвергаются быстрой протеолитической деградации, что является серьёзным препятствием на пути создания их суперпродуцентов н разработки технологий получения малодоступных полипептидов.

Показано, что внутриклеточное содержание ряда нелепых белков (фибробластнын интерферон человека, соматотропнн и интерлейкин-2) повышается в 2-3 раза при экспрессии п !оп-мутантах|Маипг! M.R. 1988 ).

Чтобы изучить возможность увеличения синтеза рекомбинантных белков в штаммах, где наработка La-протеиназы подавлена аитисмысловой РНК к гену Ion, была создана на основе вектора pACYC184 с р!5А репликоном плазмнда. транскрибирующая антисмысловую РНК (Рис.13). Репликон р15А является совместимым с ColE реплнкотм, на основе которого построено большинство используемых • п биотехнологии экспрессиопных плазмид и позволяет совместно существовать в клетках E.coli плазмиде pACYCl84 с рскомбинаитными векторами, кодирующими целевые белки.

Трансформация клеток E.coli НВ101 плазмидон pACYCIÜlAL-l также приводила к снижению почти в два раза при индукции 1PTG деградации ''^С-

пуромициновых полипептидов по сравнению с контрольными клетками.

В качестве целевых белков были выбраны у-ннтерферон человека, гибридный белок, полученный на основе N-концсиого фрагмента у-интерферона человека и антигенной детерминанты вируса гепатита С. протсиназа ЗС вируса полиомиелита и N-кониевой Ес-свнл.вающий домен белка A Staphylococcus aureus. Причем первые два белка экспрессировалиеь под контролем trp промотора н образовывали в клетках E.coli "тела

Hind III

pACYC AL-i

Рис.13 Создание плазмиды, направляющей синтез антисмысловой РНК к гену Ion на основе вектора PACYC184 с р15А репликоном.

включения", протеиназа ЗС находилась под контролем термоиндуцибельного Р[ промотора и накапливалась в цитоплазматической фракции клетки, a N-

концевой фрагмент белка А содержал секреторную последовательность и накапливался в периплазме. Кроме того, такой выбор оъектов позволял охватить все наиболее часто используемые формы экспрессии физиологически активных белков:

1.Изолированная экспрессия полноразмерных белков (у-интерферон человека)

2.Экспрессия целевых полинептидов в составе гибридов с белками носителями (антигенная детерминанта вируса гепатита С, протеиназа ЗС вируса полиомиелита)

3. Наработка функционально-важных фрагментов .целевых белков с помощью изолированной экспрессии ( N-концевой Fc-связывающий домен стафилококкового белка А)

Для определения влияния антисмысловой регуляции уровня La-протенназы на синтез рекомбинантных белков, клетки E.coli НВ101 совместно трансформировали плазмидой pACYC184AL-l и плазмидами, содержащими целевые б елки и выращивали в среде LB с ампициллином и хлорамфениколом до ОП=1,0 Затем синтез целевых белков и антисмысловой РНК к гену Ion индуцировали с помощью соответствующих

J

а ъо

I

И

г а

i*

2

S

Рис.14 Синтез рекомбинантных белков а) у-иитерфсрона человека, б) химерного белка на основе у-интерферона и антигенной детерминанты вируса гепатита С, вЪротеиназы ЗС вируса полиомиелита, г) N-концевого Кс-связываюшего домена белка A S riureus п клетках E.coli АВ1157(1оп+) (I), АВ1899 (ion ) (2), AHI 157 с pACYCAL-I, синтезирующей antisense RNA к гену !оп

агентов. Процент выхода рекомбииантных белков определяли при сканировании клеточных белков, разделенных SDS-электрофорезом и окрашенных Кумасси на лазерном денситометре.

Как видно на рис 14, снижение с помощью antisense RNA внутриклеточной концентрации La-протеиназы приводит к значительному (в 1,5-4 раза) увеличению выхода всех рекомбииантных' белков, причем максимальный эффект в 4,1 раза наблюдался при термоиндуцибельной экспрессии протеиназы ЗС вируса полиомиелита.

5. ОБНАРУЖЕНИЕ АТР-ЗАВИСИМОЙ ПРОТЕИНАЗЫ, ГОМОЛОГИЧНОЙ La-ПРОТЕИНАЗЕ E.COL1 В КЛЕТКАХ PSEUDOMONAS PUTIDA.

Хотя традиционным объектом биотехнологии, используемым для производства биологически активных препаратов является Escherichia coti, в последние годы возрос интерес к поиску новых бактерий-хозяев, обладающих лучшими технологическими характеристиками. В этом отношении наибольший интерес вызывают бактерии рода Pseudomonas (P.putida), способные усваивать самые различные субстраты (вподь до нефтепродуктов) и широко используемые для биологической очистки сточных вод и экологической реабилитации загрязненых нефтью территорий.

Обнаруженная Сакагучн с соавт. (Sakaguchi et al 1992 ] способность РНК-полимеразы I P.putida более эффективно, чем фермент бактерии-хозяина, связываться с промоторной областью некоторых широко используемых при экспрессии в E.coli генов (LacZ) позволяет получить в' этом микроорганизме сверхпродукцию белков с регуляторных элементов E.coli.

Однако, при синтезе гетерологичных белков в P.putida также возникают проблемы, связанные с их прогеолитической деградацией. В связи с этим представляли интерес эксперименты, направленные на поиск в геноме P.putida генов, ответственных за протеолиз, в частности гомолога Ion гена E.coli.

Дот-гибридизация ДНК P.putida PAW340 с 32P-EcoRl-Sphl фрагментом, содержащим всю структурную часть гена Ion, выявила слабый положительный сигнал в отличие от контрольной ДНК спермы лосося, что позволяет надеяться на наличие в P.putida достаточно структурно близкого гомологичного гена.

Í. г. 3. 4. 5. 6: 7. g.

7. S.

-25W

em

С»::,»

"а-:- ^ -¡5-

Рис15. Блот-гнбридизация ДНК P.putida, гидролнзованной рестриктазами: 2) Kpnl; 3) Sal I; 4) Нра I; 5) BamHI; 6) Pst I; 7) Hindi« с а) 32р-мечсный фрагментом Hpal-Hpal (750 п.о.) Ion гена (5'-концевая область гена), б) 32р.меченым фрагментом PslI-Hpal ( I 300 п.о.), центральной структурной частью Ion гена. I) ДНК спермы лосося, гидролизованная рестриктазой HindIII, 8) Hindlll- рестрнкт ДНК E.coli К12.

Блот-гнбридизация ДНК P.putida PAW340, подвергнутой гидролизу рестриктазами Kpnl, HindIII. Sali, Hpal, BamHI. PslI с двумя 32P-фрагмснтамн Ion гена E.coli подтвердила это предположение. Причем было установлено, выраженная гомология между генами проявляется как в 6-концеоой облясти ( при гибридизация с 5'-концевым Hpal-Hpal фрагментом Ion гена (Рис.15, а), так н в центральной структурной области < зонд 32р. Pstl-Hpal фрагмент Ion гена. Рис. 15, б). З'-Концевой Hpal-SphI фрагмент Ion гена, использованный в качестве зонда, не дапал положительного сиг нала при тех же условиях гибридизации.

Более подробный анализ результатов блот-гибридизацин позволяет дать частичную структурную характеристику гомологичного гена:

1. Наличие двух полос гибридизации с Hpal-Hpal зондом в Kpnl и Pstl рестрнктах ДНК P.putida говорит о наличии сайтов узнавания этих рестриктаз в 5'-концевой области гомолога Ion гена. Согласно рестриктной карте ion гена E.coli учаг.ткн узнамнич рестриктаз Kpnl и Pstl располагаются в центральной структурной части гена.

2. В области Ion гена P.putida, гомологичной центральной структурной части Ion гена и АТР-связывающему участку, обнаружен сайт рестрикции Sali.

3. Отсутствие полос гибридизации при гидролизе Hpal ДНК P.putida может говорить о наличии в структуре гомологичного гена нескольких сайтов узнавания для этой рестриктазы, что приводит к образованию низкомолекулярных фрагментов, не детектируемых на приведенном электрофорезе.

4. Сайт узна'&ания рестриктазы Hindlll, расположенный в N-концевой структурной части Ion гена E.coli, отсутствует в данном положении в

Таким образом, предполагаемая рестриктная карта гомолога Ion гена из P.putida существенно отличается от структурной карты Ion гена E.coli.

Подтверждением нашего предположения о существовании в клетках P.putida родственной протеиназы было обнаружение в бесклеточных экстрактах P.putida АТР-завнсимой лротеолитической активности.

Рис. 17 Электрофорез в 7% БОБ-РАЛО белковых фракций из пиков I (линия I) и 2 (линия 2) после хроматографии на

фосфоцеллюлозе. Линия 3- маркеры молекулярных масс. 4 - Имнуноблот с мо-ноклональиыми антителами к Ьа-проте-

Рис.16 Хроматография'бесклеточного экстракта P.putida на фосфоцеллюло- . зе 1 --Aggg, 2.3,- протеолнтнческая активность в отсутствии и присутствии ЗмМ АТР.4- концентрация фосфатного буфера.

иназе

В результате хроматографии лизата клеток Р.риШа на фосфоцеллюлсзе были выявлены две фракции 0 и 11 ), обладавшие АТР-зависимой протеолитической активностью по специфическому субстрату с коэффициентом ускорения протеолиза 13,5 и 15,1 соответственно (Рис.16.

При электрофорезе в 7% БОЭ-полиакриламидном геле проб из каждой фракции было обнаружено значительное обогащение в обеих полосы с молекулярным весом около 73кД.(Рис,17)

В иммуноблоте моноклональные антитела, полученные к 1л-протеиназе Е.еоН , специфически связывались только с белком с м.в. 73кД, что позволяет идентифицировать его как АТР-зависнмую протеииазу, родственную Ьа-протеиназе Е.соИ.

выводы

1. Клонирован Ion ген E.coli К-12, кодирующий АТР-зависимую La-протеиназу

2. Изучена экспрессия Ion гена в клетках E.coii в различных векторных системах, создан штамм-суперпродуцент Ьа-протеиназы и выделен гомогенный препарат фермента. Показано, что превышение внутриклеточного уровня Ьа-протеиназы свыше 1,3% от общего клеточного белка токсично для клеток E.cöli.

3. Обнаружено, что делеция 7 С-концевых аминокислот не приводит к снижению специфической протеолитической активности La-протенназы, но существенно влияет на стабильность фермента в процессе выделения.

4. Показана возможность коррекции внутриклеточного протеолиэа дефектных и чужеродных белков с помощью антисимысловой регуляции синтеза Ьа-протеиназы, не приводящая к появлению отрица тальных ростовых характеристик 1оп-мутантов.. Обнаружено, что максимальный ингибкрующий эффект (85-90%) достигался при использовании антисмысловой РНК к 5'-концевой нетранслируемой и N-концевой структурной части Ion гена.

5. Получено увеличение продукции в 1,5-4раза рекомбинантных белков ( у-интерферона человека, антигенной детерминанты вируса гепатита С, протеиназы ЗС вируса полиомиелита и N-концевого Fe-связывающего домена белка А S.aureus) в штаммах с антисмысловой регуляцией протеолиза. Показано, что максимальное увеличение выхода (в 4,1 раза) наблюдалось при термоиндуцибельной экспрессии протеиназы ЗС вируса полиомиелита, накапливающейся в цитоплазматической фракции клетки.

6. Обнаружены в клетках Pseudomonas putida АТР-зависимая протеиназа и кодирующий ее ген, гомологичный гену Ion E.coli.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПЕЧАТНЫХ РАБОТАХ:

1.Америк А.Ю.,Чистякова Л.Г., Остроумова Н.И.,Гуревич А.И., Антонов В.К.," Клонирование,экспрессия и структура функционально активного укороченного гена Ion E.coli", Бноорганическая химия ,1988,т.14 ,стр.408-4 1!

2.Amerik A. Yu., Chistjakova L.G.,Ostroumova N.f.Gurevich A.I.,Anfonov V.К.,"Cloning, expression and structure of shortened functional ly active lon-gene of E.coli " In: 14th International congress of Biochemistry, Prague ,1988,p.204

3. Чистякова Л.Г., Киселёв В.И., " Генетический контроль протеолити-ческих процессов а клетках E.coli и Ps. aeruginosa .Пути стабилизации гетерологичных белков" , Тезисы докладов на Всесоюзной конференции " Новые направления биотехнологии",Пушино, 1988,стр.99

4. Чистякова Л.Г.,Киселев В.И., Рыжова Е.В.,"Коррекция протеолитических процессов в клетках E.coli с помощью ант'исмысловых РНК генов htpR и !оп",В сборнике статей " Реаферон".Ленинград, 1988, стр. 27-29

5. Киселев В.И., Чистякова Л.Г.,Антонов В.К.," Регуляция протеолитических процессов с помощью антисмысловых РНК генов Ion и htpR в гетеро- и гомологичных системах", Бноорганическая химия, 1989, т. 15, №9, стр.1231-1235

6. Rotanova T.V.,Chistyakova L.G., Michaylov А.P., Antonov V.K.," АТР-dependent proteinase and its coding gene in Ps.pulida", In: 20 th FEBS Mitting .Budapest,!990,Abstract P-tu-456,p,198

7.Chistyakova L.G..Antonov V.K. "Regulation of intracellular proteolysis in Escherichia coli cells by antisense m RNAs of the Ion gene",Biomedical Science, 1990,v.l, p.359-365

8.Америк А.Ю., Антонов В.К., Остроумова. Н.И., Ротанова Т.В.,Чистякова Л.Г., " Клонирование, структура и экспрессия полноразмерного гена Ion Escerichia coli. .кодирующего АТФ-зависимую La-протеиназу", Бноорганическая химия , 1990,т. 16, № 7 , стр 869-880

9. Ротанова Т.В., Чистякова Л.Г.,Михайлов А.П., Игнатов К.Б., Антонов В.К.," АТФ-зависимая протеиназа и кодирующий её ген в Pseudomonas putida ".Тезисы докладов на Всесоюзном симпозиуме " Химия белков", Тбилиси, 1990, стр.46

10. Potanova T.V., Chistyakova L.G., Mikhaylov А.Р., Amerik A.Yu., Kotova S.A.,Shemborevich E.V., Antonov V.K. " ATP-dependent proteinase. Sfnicture and application" fn: International Symposium of Enzyme in Organic Synthesis. Delhi, India, 1992