Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 δ2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf)

Смирнов, Сергей Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 δ2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf)
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 δ2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf)"

На правах рукописи

Смирнов Сергей Васильевич

/ I

Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hii-482) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf).

Специальность: 03.00.03- Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003 г.

Работа выполнена в ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов".

Научный руководитель:

Кандидат химических наук Л. Р. Птицын

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Н. Н. Соколов

Кандидат биологических наук М. А. Эльдаров

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится « 003 года в 14 часов на заседании

Диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов": 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов".

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат биологических наук / В. И. Щербакова

2оо?-Д

(¿4zt

Актуальность проблемы. Цитокины - это родовое название специализированных растворимых белков и пептидов, которые, действуя как гуморальные иммуномодуляторы на отдельные клетки или ткани, принимают участие в регуляции таких важных биологических процессов как гемопоэз, иммунный ответ, тканеспецифическая клеточная пролиферация, апоптоз. В настоящее время, во многих научно-исследовательских центрах мира проводятся интенсивные работы по изучению возможности использования цитокинов для диагностики и лечения различного рода патологий иммунной системы [Егорова и др., 1998; Martino et al., 2000], вирусных инфекций [Tovey et al., 1999; Журкин и др., 2000; Carreno et. al., 2000; Pien et al., 2000; Тимченко и др., 2001] a также в комплексной терапии широкого спектра онкологических заболеваний [Tagawa 2000; Bukowski 2001; Straten et al., 2001]. Объектами подобных исследований являются, в частности, делеционная форма интерлейкина-4 человека - hIL-452 [Arinobu et al, 1999; Glare et al., 2001; Sea et al., 2001] a также - нейротрофин глиального происхождения человека GDNF [Lapchak et al., 1997, Espejo et al., 2001; Zurn et al., 2001].

Изучение экспрессии гена интерлейкина-4 человека (hil-4) показало, что в Т-лимфоцитах периферической крови человека и тимоцитах вместе с мРНК hil-4 экспрессируется и ее делеционный вариант, у которого в процессе специфического (альтернативного) сплайсинга происходит элиминация участка нуклеотидной последовательности, соответствующей экзону 2, а участки, соответствующие экзонам 1,3 и 4, образуют непрерывную рамку считывания для природной делеционной изоформы интерлейкина-4 - hIL-452 [Sorg et al., 1993]. Эксперименты in vitro с рекомбинантным hIL-482 показали, что этот белок является природным антагонистом hIL-4. В частности, hIL4-82 ингибирует как костимулирующее действие hIL-4 на активированные Т-лимфоциты периферической крови человека, так и активацию hIL-4 синтеза IgE и экспрессию CD23 в В-лимфоцитах [Ataxnas et al., 1996; Arinobu et al., 1999]. В моноцитах hIL-452, напротив, блокирует ингибирующее действие hlL-4 на LPS-индуцируемый синтез циклооксигеназы-2 и последующую секрецию простагландина Е2 [Arinobu et al., 1999]. Результаты исследований позволяют говорить о значительном терапевтическом потенциале hIL-452 как природного антагониста интерлейкина-4.

Другой представитель семейства цитокинов - GDNF-(Glial Cell Derived Neurotrophic Factor), был впервые очищен и исследован в 1993 году. Оказалось, что данный белок способствует выживанию эмбриональных допаминергических нейронов среднего мозга, дегенерирующих при болезни Паркинсона. [Lin et al., 1993], и является ростовым фактором для спинномозговых моторных нейронов [Henderson et al., 1994]. Было показано, что GDNF способствует регенерации сенсорных аксонов при травмах позвоночника [Ramer et al., 2000], участвует в процессах сперматогенеза [Meng et al 2000] и морфогенеза почек [Pichel et al., 1996]. GDNF обладает большим терапевтическим потенциалом и может быть использован для лечения многих нейропатологий, включая болезнь_____Пяргттоопа; -"> боковой

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I

БИБЛИОТЕКА J СПе 09

амиотрофический склероз и др. [Lin et al., 1993; Lin et al., 1994, Hunot et al., 1996; Bohn 1999; Ozawa et al., 2000].

Одной из основных проблем, возникающих при разработке лекарственных препаратов или диагностических систем на основе цитокинов и подобных им белков, является невозможность выделения этих биомолекул из их природных источников в количествах, достаточных для организации масштабного фармакологического производства. В этой связи, чрезвычайно актуальной становится задача разработки способов получения биологически-активных рекомбинантных аналогов природных белков, в частности, путем оптимизации гетерологичной экспрессии соответствующих генов в бактериальных клетках Escherichia coli.

Цели и задачи работы. Целью представляемой работы было создание на основе клеток E.coli высокоэффективных штаммов-продуцентов рекомбинантных hIL-452 и GDNF. В процессе работы решались следующие задачи:

1. Конструирование синтетических генов, соответствующих процессированным формам белков hIL-452 и GDNF, с оптимизированной для трансляции в клетках Е. coli нуклеотидной последовательностью.

2. Конструирование плазмидных векторов, обеспечивающих эффективную экспрессию в клетках E.coli рекомбинантных генов hil-482 и gdnf.

3. Разработка лабораторной процедуры ренатурации рекомбинантного hIL-452.

4. Исследование биологической активности препарата рекомбинантного hIL-452.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в клетках Escherichia coli осуществлена высокоэффективная экспрессия генов hil-452, а также gdnf и сконструированы штаммы-продуценты соответствующих рекомбинантных цитокинов. Для достижения максимальной продукции целевых белков учитывался целый ряд факторов, влияющих на эффективность процессов транскрипции и трансляции гетерологичных генов в Е. coli. В частности, проведен комплексный анализ первичной и потенциальной вторичной структур нативной мРНК gdnf, на основании которого разработана схема конструирования трансляционных модулей, состоящих из искусственного участка связывания рибосом (RBS) и синтетического рекомбинантного гена gdnf с оптимизированным для трансляции в Е. coli кодоновым составом. При выборе основных параметров экспрессионных векторов (копийность и стабильность репликона, «сила» и «строгость» регуляции промотора, эффективность RBS) были учтены как токсичное действие обоих гетерологичных бежов на бактериальные клетки, так и влияние относительной скорости клеточного биосинтеза целевых белков на процесс формирования структуры образуемых ими телец включения.

Исходя из особенностей формирования третичной структуры делеционной формы интерлейкина-4, разработана лабораторная методика его ренатурации и очистки из нерастворимой клеточной фракции «телец включения». Исследована биологическая активность рекомбинантного hlL-452. Показано, что in vitro ренатурированный hIL-4ä2 ингибирует костимулирующее действие hIL-4 на активированные тимоциты периферической крови человека и установлено, что данный эффект усиливается в присутствии циклоспорина А. Данные по биологической активности ренатурированного hIL-4<52 согласуются с результатами, полученными в аналогичных экспериментах с белком, продуцируемым в растворимой форме в клетках Pichia pastoris [Atamas et al., 1996].

Штамм-продуцент hIL-452 и препарат белка переданы в Институт инженерной иммунологии, а также в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН для дальнейших структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4.

Штамм-продуцент рекомбинантного GDNF передан в лабораторию НПЦ «Фосфосорб», для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов

Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и Методов, Результатов и Обсуждения, Заключения, Выводов и Списка литературы; иллюстрирована 5 таблицами и 20 рисунками. Библиография содержит 200 наименований.

Апробация работы. Результаты работы представлены на 2-м симпозиуме ICS (International Cytokine Society) и ISICR (International Society for Cytokine and Interferon Research) (Иерусалим, 1998), конференции «Научная сессия МИФИ-98» (Москва, 1998) а также, на 6-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использованы бактериальные штаммы Escherichia coli: TGI, BL21(DE3) [Маниатис и др., 1987]. Культивирование бактерий проводили в LB-среде и на агаризованных средах (1.5% агара). Для обеспечения селективного роста плазмидо-содержащих клеток в среду добавляли ампициллин (100 мкг/мл.)

При генно-инженерном конструировании были использованы плазмиды pUCTIL-4, pBTIL-4 [Птицын и др., 1995, 1998] а также коммерческие вектора рЕТ22Ь(+) и pET15b(+) (Novagene, США).

Генно-инженерные манипуляции, электрофорез олигонуклеотидов, ДНК и белков в ПААГ, трансформацию бактерий плазмидной ДНК проводили по стандартным методикам [Laemmli et al., 1970; Маниатис и др., 1987] или

согласно рекомендациям фирм-производителей ферментов (Pharmacia, Швеция; Fermentas, Литва).

Олигонуклеотиды для химико-ферментативного синтеза гена gdnf и праймеры для ПЦР были синтезированы в ЗАО "Syntol", Москва. ПЦР осуществляли в соответствии с рекомендациями (Promega, США). г

Нуклеотидную последовательность рекомбинантных ДНК определяли по методу Сэнгера [Sanger et al., 1975,1977].

Концентрацию суммарных клеточных белков определяли по методу Бредфорда с использованием реактива фирмы Bio-Rad [Bradford et al., 1976]. Количественное определение содержания в клетке целевых белков проводили путем сканирования прокрашенного в растворе Coomassie-blue R-250 электрофорезного геля на денситометре CSD-200 (Beckman, США).

Биологическая активность рекомбинантного hIL-452 тестировалась по его влиянию на пролиферацию активированных конканавалином А (СопА) тимоцитов человека. [Птицын и др., 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение штаммов Escherichia coli — продуцентов делеционной формы интерлейкина-4 человека IL4-52.

Для достижения эффективной экспрессии гетерологичного гена, при условии стабильности плазмидного штамма-продуцента в процессе его ферментации и хранения, необходима комплексная (взаимосогласованная) оптимизация структуры и параметров трех основных компонентов любой экспрессионной системы - кДНК целевого гена, экспрессионной плазмиды и штамма-реципиента. Ранее в нашей лаборатории были сконструированы ряд штаммов-продуцентов hIL-4 [Кулагина и др., 1990; Птицын и др., 1995]. Одна из наиболее эффективных экспрессионных плазмид - pUCTIL-4, была получена путем клонирования в составе вектора pUC18 синтетического гена hil-4, фланкированного эффективным участком связывания рибосом гена q>10 фага Т7 (RBS¡д) и терминатором транскрипции оперона ггпВ из E.coli (Тгма)-Эта плазмида и была использована в качестве экспрессионного вектора для клонирования делеционного варианта гена интерлейкина-4-М-462 (Рис. 1, 2). Фрагменты, соответствующие последовательностям экзона 1 и экзонов 3 и 4, были амплифицированы с использованием pUCTIL-4 и четырех олигонуклеотидных праймеров: стандартного обратного праймера М13(Р1),

олигонуклеотида Р2 (5')TTTCTGTTCAGTCAGAGAG, комплементарного 3'- t

концевой последовательности экзона 1; олигонуклеотида РЗ (5')AACACTACCGAGAAAGAAAC, соответствующего 5'-концевой последовательности экзона 3; и олигонуклеотида Р4 (5')AATCTTCTCTCATCCGCC, комплементарного участку последовательности терминатора TrRNA. В результате лигирования этих фрагментов с последующим

гидролизом лигазной смеси рестриктазами ВатЖ и Hindill был получен

Рис. 1 Конструирование pUCTIL-4d2

рекомбинантный ген hil-482. На завершающем этапе конструирования экспрессионной плазмиды pUCHL-4d2 ВатЖ- HindSl фрагмент hil-431 был субклонирован в составе вектора pUCTIL-4/ ВатЖ- ШпсИИ.

Рекомбинантный штамм TGl[pUCTIL-4d2] в условиях дерепрессии промотора Piaciivs продуцировал hIL-452 в виде телец включения с выходом до 20% от суммарного клеточного белка (Рис. 4, дорожки 2, 3). Однако, уже через 2 ч после индукции биосинтеза гетерологичного белка рост культуры существенно замедлялся, а через 3-4 ч наблюдался ее заметный лизис, что свидетельствовало о токсичности гетерологичного hIL-452 для клеток Е. coli. Тем не менее, удельное содержание целевого белка в очищенном препарате телец включения составляло 45-55%, а базальный уровень экспрессии в среднем не превышал 2% (Рис.4, дорожка 4). Полученный штамм был достаточно стабилен в разных условиях культивирования и хранения, что положительно характеризует его с «технологической» точки зрения (Таблица

1). Единственным недостатком данного штамма-продуцента являлась относительно невысокая удельная продукция ЫЬ-452.

ВатН1<152) Xbal (304)

HmdM(G92)

ER-1

PlacUVS О/ас

RBS10

SD ATG

Структура экспрессионного модуля ER-1 плазмиды pUCTIL-4d2.

-35 ПРОМОТОР Pi..

оператор

tttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatt

BamHl

tcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtacccggggatc

Xbal

cttcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttocctctagaaaat

SD Met hil-4d2 aattttgtttaactttaagaaggagataattogoatg_^

Рис.2 Структура экспрессионной плазмиды pUCTIL-4d2

В условиях высокой токсичности целевого белка для клеток штамма-продуцента, дальнейшее увеличение его продукции, например, за счет усиления промотора или сайта связывания рибосом, должно обязательно сопровождаться адекватными мерами по усилению контроля базального уровня экспрессии гетерологичного белка. Для реализации этой стратегии Xbal-HindlU фрагмент плазмиды pUCTIL-4d2 был клонирован в составе вектора pETlL-4/Xbal-Hindlll [Птицын и др., 1995] и вектора рЕТ22Ь(+)Ш>а1-ЯгисЯП (Novagen, USA). В результате были получены экспрессионные плазмиды pBTIL-4d2 и pETIL-4d2 (Рис. 3). В обоих случаях, промотор Pfauvs был заменен на более сильный (примерно в 8 раз) Р^с (pBTIL-4d2 ) или промотор Р-л ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 (pETIL-4d2). Регуляция транскрипции была усилена введением тандема операторов Olac (pBTIL-4d2 ) на фоне снижения копийности плазмиды (репликон pBR322) и генотипа lacf штамма TG1 или введением оператора О¡^ непосредственно за промотором Р77 (pETIL-4d2) на фоне

Xbal (4083) -.

rB»mHl(1)

Hindill (174)

Xbll (562)

Hlndllt (4295>

hll-442

pETIL-4d2 5728 bp lacl J

Структура экспрессионного модуля ER-2 плазмиды pBTIL-4d2.

-35 P,.e промотор_-10 оператор _

ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaa

_оператор _

cagaattgtgagcggataacaattcatgcttcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaac

Xbal SD Met hll-4d2 ggtttccctctagaaaataattttgtttaactttaagaaggagataattcgcatg-к

Структура экспрессионного модуля ER-3 плазмиды pETIL-4d2.

Т7 промотор t оператор Oi^_ Xbal

ttaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgttta

SD Met hil-4d2 actttaagaaggagataattcgcatg-►

Рис.3 Структура якспрессипнных плязмид pBTIL-4d2 и pETIL-4d2.

увеличения дозы гена lacl , входящего в состав вектора рЕТ22Ь(+), и Р^ -зависимой транскрипции гена ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 в штамме BL21DE(3). Максимальная продукция hIL-452 для штаммов TGl[pBTIL-4d2] и BL21(DE3)[pETIL-4d2] составляла около 30% от общего клеточного белка и достигалась через 2 ч с момента начала индукции (Рис. 4). Таким образом, в обоих случаях удалось поднять продукцию целевого белка в полтора раза при сокращении времени индукции. Однако, базальный уровень экспрессии hIL-452 в штамме TGl[pBTIL-4d2] в среднем в 2-3 раза превышал его величину в штамме TGl[pUCTIL-4d2], что приводило к резкому снижению стабильности штамма при хранении и культивировании (Таблица 1).

Возможно, это связано с неоптимизированной структурой тандема операторов OiÜC (центры двух операторных участков разделяют 15 п.н.), что не позволяет

усилить репрессию промотора Р^ адекватно его «силе» на фоне эффективного

ЗОкДа

67кДа 43 кДа

14 кДа

20кДа

1 23 4567 89 10

Рис. 4. Электрофореграммы препаратов суммарных белков штаммов-продуцентов hIL-452 и соответствующих им препаратов частично очищенных телец включения.

Дорожки: 1-маркер молекулярных весов; 2,5,8 - неиндуцированные штаммы TGI [pUCTIL-4d2], BL21DE(3)[ pETIL-4d2], TGI [pBTIL-4d2] соответственно; 3,6,9 - индукция в течение 3 часов; 4,7,10 - тельца включения, частично очищенные неионным детергентом (TRITON Х-100) в присутствии 0.5М мочевины. Пунктирной рамкой выделены белковые зоны, соответствующие базальной продукции hIL-482.

RBS, даже несмотря на снижение копийности векторной плазмиды и генотип lacF штамма TGI.

Напротив, штамм BL21DE(3)[pETIL-4d2] отличался небольшой фоновой экспрессией hIL-452 (1-2%), был стабилен и имел наилучшие ростовые показатели. Благодаря особенности экспрессионных систем на основе ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 практически полностью переключать трансляционный аппарат клетки на синтез целевого белка, тельца включения, образующиеся в процессе ферментации штамма BL21DE(3)[pETIL-4d2], характеризовались наибольшим удельным содержанием hIL-452 (60-70%), что существенно упрощало процесс ренатурации и очистки рекомбинантного цитокина. Последнее обстоятельство и определило выбор штамма BL21DE(3)[pETIL-4d2] в качестве продуцента рекомбинантного hIL-452.

Таблица 1. Уровень накопления рекомбинантного ЫЬ-482 в зависимости от условий хранения и выращивания клеток штамма-продуцента.

Условия хранения и выращивания

Штамм

бактерий.

Выход целевого продукта в % от клеточного белка.

[плазмида] 1 2 3 4 5 -IPTG +IPTG

+ 2> - - + tjyfe; Ш' • -"M-'-I

£ coli TQ1 + - - + + 1-2 20

[pUCTIL-4d2] + + LB - + 1-2 20

+ + M9 - + 1-2 20

+ - - - + Л-2Я ймйн* ЯВ^ l*

Е. coli TGI + - - + + 1-2 10

[pBTIL-4d2] + + LB - + 1-2 10

+ + M9 - + 4-6 30

& coli + - - - + jg8g ; '"Mjjjt

B121(DE3) + - - + + 1-2 30

[pETIL-4d2] " + + LB - + 1-2 30

Условия хранения и культивирования:

1- для работы использовались полученные на день эксперимента плазмидные трансформанты на агаризованной LB-среде с ампициллином (100 мкг/мл)

2- клетки-трансформанты инокулировали в жидкую LB-среду, выращивали до OD555=l, добавляли глицерин (25% v/w), замораживали и хранили при температуре -70°С в течении 1-2 месяцев

3- трансформанты или замороженные клетки пересевали на агаризованную минимальную (М9) или богатую (LB) среды с ампициллином (100 мкг/мл)

4- клоны с агаризованной среды использовали для приготовления «ночной» культуры на LB-среде с ампициллином (100 мкг/мл)

5- культуру клеток выращивали на LB-среде с ампициллином (100 мкг/мл) до OD555=l, при температуре 37°С, после чего проводилась индукция синтеза целевого белка добавлением IPTG до конечной концентрации 0.5 мМ

+ - Условие выполняется, - Условие не выполняется.

2. Ренатурация и очистка рекомбинантного hIL-4§2.

Во многом, успех в осуществлении выбранной схемы ренатурации полипептида из «телец включения» зависит от учета особенностей формирования третичной структуры белка. hIL-4 принадлежит к группе цитокинов с характерной «up-up-down-down» топологией четырех структурообразующих а-спиралей, соединенных протяженными неструктурированными участками [Powers et al, 1992]. Третичная структура hIL-4 стабилизирована тремя дисульфидными мостами, сформированными следующими парами цистеиновых остатков: Cys3-Cysl27, Cys24-Cys-65, и Cys46-Cys99 (Рис. 5). При этом, свободные остатки Cys в молекуле белка отсутствуют. Участок межспиральной Н1-Н2 петли, делегированный у hIL-482

1 10 Н1 20

нкДрт^ЬОЕПКТ^зьтеоктьДТЕЬД

30 40 Н2 50_

ДИИДыТ'1[ЁКЕТ^ДкААТУЪКдЕ¥ЗН 1

60 70 НЗ 80_

нЕКРТ1фсд1|Щ?ь-нкнкоьтгкЕЬР | 90 110 Н4

120 130

¡ктн5Ет}<|зз

А В

Рис.5. Структурная организация делеционного варианта ЫЬ-482. А- Первичная структура процессированной формы ЫЬ-4. Прямоугольниками указаны структурообразующие а-спирали. Серым цветом выделен участок аминокислотной последовательности отсутствующий в структуре ЫЬ-452. В- Схематическая модель структурной организации ЫЬ-4. Прямоугольниками указаны дасульфидные связи между цистеиновыми остатками. Пунктиром указано расположение делегированных в ЫЬ-452 аминокислотных остатков.

содержит цистеиновый остаток (С24 в структуре ЫЬ-4), поэтому в молекуле ЫЬ-452 один из оставшихся цистеинов должен оставаться неспаренным. В настоящее время существуют две модели структурной организации делеционной формы интерлейкина-4. Согласно «консервативной модели» общая топология структурообразующих а-спиралей остается неизменной, при этом неспаренным остается аминокислотный остаток СуБб5. Согласно «БИр»-модели в результате делеции пептида, кодируемого вторым экзоном, в структуре ЫЬ-452 происходит пространственная переориентация одной из четырех формирующих структуру белка а-спиралей (Н1, рис. 5), что приводит к образованию новой дисульфидной связи СузЗ-СуБбб, этом Суэ127 остается неспаренным [2ау'уа1оу й а!., 1997]. Хотя рентгеноструктурный анализ ЫЬ-452 до сих пор не сделан, полученные недавно косвенные данные о структурной организации этого бежа [УаБШеу е1 а11., 2003], свидетельствуют в пользу «консервативной модели». ♦

Таким образом, особенность процесса ренатурации и очистки ЫЬ-452 определялась главным образом двумя обстоятельствами: наличием в структуре телец включения определенного количества нерегулярных межмолекулярных ковалентных связей между остатками цистеина и необходимостью обеспечить в процессе формирования третичной структуры ЫЬ-452 корректное образование двух Б-Б мостов с одновременным блокированием процесса агрегации (мультимеризации) частично или полностью ренатурированных

форм белка, «катализатором» которого может служить остающийся неспаренным цистеиновый остаток. В такой ситуации, определяющее значение имеют следующие факторы: 1) - степень гомогенности препарата телец включения, 2) - подбор оптимальных значений концентрации белка на разных этапах его ренатурации, 3) - оптимизированный по времени процесса ренатурации градиент редокс-потенциала белкового раствора, 4) - правильный выбор типа хроматографического процесса ренатурированного белка и условий его проведения.

Характеристики эффективности основных этапов разработанного нами лабораторного метода ренатурации и очистки рекомбинантного hIL-452 представлены в таблице 2. Для получения максимально гомогенного по составу препарата телец включения, разрушение клеток проводили в присутствии неионного детергента TRITON Х-100, а последующие промывки осадка фракции нерастворимых белков проводили в присутствии ЗМ мочевины. Восстанавливающие реагенты (ДТТ, меркаптоэтанол) на этом этапе не вводились из-за возможности потерь, связанных с частичным растворением телец включения. Подобная методика позволяет получить препараты телец включения с удельным содержанием целевого бежа до 80-90%.

Таблица 2. Ренатурации и очистка рекомбинантного hIL-4d2.

Процедура Концентр. Gn-HCI Редокс-потенциал Концентр, белка (мг/мл) Объем (мл) Выход %

1 .Пиготовление препарата телец включения ЫЬ-482. - - 36 мг 100

2. Растворение препарата телец включения ЫЬ-452 в денатурирующем буфере. 6М 2 мМ GSH 0,2 мМ GSSG 1,7 20 94

3. Ренатурация-стадия I. Снижение концентрации Сп-НС1 медленным разбавлением. Градиент 6М-1М 2 мМ GSH 0,2 мМ GSSG 0.1 220 61

4.Ренатурация -стадия II. Снижение концентрации Сп-НС1 с одновременной сменой буфера с помощью диализа. Градиент 1М-0.02М 0,1 мМ 2-МЕ 0,06 220 40

5. Хроматография на БР-ЗерЬаёех С-25. - 0,1 мМ 2-МЕ 1 7,5 21

Обозначения:

Gn-HCI- гуанвдин-гидрохлорид; GSH- глутатион B0ccraH0MeHHbiñ;GSSG- глутатион окисленный; 2-МЕ - 2-меркаптоэтанол

Осадок, содержащий тельца включения, растворяли в 100 мМ Трис-буфере рН 8.0 в присутствии 6 М гуанидингидрохлорида (Сгп-НС1) и глутатионовой редокс-системы. При этом, концентрация растворенного денатурированного белка составляла 1,5-2 мг/мл. Процесс ренатурации состоял из двух этапов. На первом, исходный раствор медленно разбавляли буфером, содержащим 0.5 М (Зп-НС1 в присутствии глутатионовой редокс-системы при рН 8.0 до конечной концентрации 0гп-НС1 равной 1 М. Выход растворимого белка при этом, составил порядка 65%. На втором этапе проводили дальнейшее снижение концентрации (Зп-НС1: сначала до концентрации 0,4 М диализом белкового раствора против 10 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7.4, содержащим 0.2 М Сгп-НС1 и 0.1 мМ 2-меркаптоэтанола, а затем, до конечной концентрации 0.02 М диализом против того же буфера, но без Оп-НС1. Общий выход процесса ренатурации в данных условиях составил 41%.

Для дополнительной очистки препарата ренатурированного белка была использована ионообменная хроматография ЫЬ-452 на катионообменнике вР-8ерЬас1ех С-25 с использованием «Ьа1сЬ»-метода нанесения образца. Чистота полученного препарата по результатам сканирования электрофореграмм фракций элюата, содержащих ЫЬ-452, составляла не менее 90% (рис. 6).

Рис.6. Ренатурации рекомбинантного hIL-482

Дорожки 1 и 5- маркеры молекулярных масс; 2-препарат hIL-4 (3 мкг.); 3,4 - препарат hIL-482, 0.5 и 1.5 мкг.

3. Определение биологической активности препарата рекомбинантного hIL-452.

Как известно, hIL-4 - мощный костимулятор пролиферации Т-лимфоцитов (Mitchell et al., 1989). Напротив, рекомбинантный hIL-482, полученный в результате экспрессии в клетках дрожжей Pichia pastoris, при 20200 кратном избытке оказывал ингибирующее действие на пролиферацию Т-лимфоцитов, активированных hIL-4 вне зависимости от того, какая из форм препарата - гликозилированный или негликозилированный hIL-452, использовались в данных экспериментах (Atamas et al., 1996). Механизм антагонистического действия hIL-452 до сих пор неизвестен. Возможно, это прямая конкуренция между hIL-4 и его делеционным вариантом за связывание

с общими рецепторами или другими клеточными детерминантами (Atamas et al., 1996). Так или иначе, hIL-452 представляет собой уникальный пример регуляции биологической активности цитокина посредством генерации белка-антагониста в виде собственной изоформы.

Биологическая активность выделенного препарата hIL-452 была протестирована с использованием клеток тимоцитов человека, стимулированных конканавалином А (СопА). Тимоциты человека получали при оперативном вмешательстве для лечения пороков сердца детей 3-5 лет. Ткань тимуса гомогенизировали и освобождали от эритроцитов и нежизнеспособных тимоцитов центрифугированием в градиенте плотности. Клетки в концентрации 106/мл культивировали в течение 72 часов в СОг-инкубаторе. Для стимуляции пролиферации тимоцитов в культуральную среду добавляли конканавалин А (СопА) до концентрации 0.8 мкг/мл, определенные дозы hIL-4, hIL-452 или их комбинации, после чего продолжали инкубацию в течение 72 часов. Уровень пролиферации клеток определяли по включению [3Н]тимидина в процессе их культивирования. Пролиферацию тимоцитов определяли в трех повторах, рассчитывая среднее значение и стандартное отклонение. Процент ингибирования оценивали по формуле: 100*[1 -(распад/мин для культур с hIL-4 и hIL-452)/( распад/мин для культур с hIL-4)]. Как видно из данных, представленных на рисунке 7, препарат hIL-452 ингибировал hIL-4-стимулированную пролиферацию тимоцитов и данный эффект усиливался с увеличением концентрации hIL-452. При замене в культуральной среде hIL-452 на альбумин эффект ингибирования практически отсутствовал. Интересной особенностью ингибирующего действия hIL-452 является эффект насыщения. Пятикратное увеличение дозы hIL-452 (от 100 нг/мл до 500 нг/мл) приводит не более чем к 1,25 кратному увеличению эффекта ингибирования пролиферативной активности hIL-4 для всех использованных его концентраций (5 нг/мл - 20 нг/мл).

Циклоспорин A (CsA) также является ингибитором пролиферации стимулированных тимоцитов. Механизм действия циклоспорина связан с избирательным и обратимым изменением функции лимфоцитов путем подавления образования и секреции цитокинов и их связывания со специфическими рецепторами. Как видно из рисунка 8, характер зависимости «доза-эффект» для CsA и hIL-452 практически одинаков, а одновременное присутствие в культуральной среде обоих белков усиливает ингибирующие действие друг друга, что позволяет косвенно судить о наличии прямого взаимодействия рекомбинантного hIL-452 с рецепторами hIL-4.

Подводя итог, можно сказать, что препарат негликозилированного рекомбинантного hIL-452, полученный путем экспрессии соответствующего гена в клетках Escherichia coli, обладает ингибирующим действием на hIL-4-зависимую стимуляцию пролиферативной активности тимоцитов, то есть, биологически активен.

10 имп/мин

Эффект ингибирования, %

5 10 15 20 25 ЬИ-4, нг/мл

10 15 20 25 Ы1.-4, нг/мл

Рис. 7. Влияние рекомбинантного ЫЬ-482 на ЫЬ-4- костимулированную пролиферацию тимоцитов: А - эффект ингибирования в присутствии ЫЬ-482. Дозы ЫЬ-482(нг/мл): 0 [1], 100 [2], 500 [3]. Б - Процент ингибирования оценивали по формуле: 100*[1-(распад/мин для культур с ЫЬ-4 и Ь1Ь-482)/( распад/мин для культур с ЫЬ-4)] при концентрации ЫЬ-482(нг/мл): 500 [1], 100 [2] или в присутствии 500 нг/мл альбумина [3].

10 имп/мин

Рис. 8. Ингибировапие ЫЬ-4-костимулярованной пролиферации тимоцитов рекомбинантным ЫЬ-482 и/или циклоспорином А (С«А).

Концентрации СопА, СвА, и ЫЬ-452 одинаковы для каждого эксперимента и составляют 0.8 мкг/мл, 100 нг/мл и 200 нг/мл, соответственно. 1 - инкубация тимоцитов в присутствии ЫЬ-4 и ЫЬ-482; 2 - в присутствии ЫЬ-4 и СэА; 3 - в присутствии ЫЬ-4, МЬ-482; 4 - в присутствии ЫЬ-4, ЫЬ-452 и СяА.

10 15 20 ИИ-4, нг/мл

4. Конструирование синтетического гена нейротрофина глиального происхождения человека - gdnf.

Одной из главных проблем возникающих в процессе оптимизации экспрессии гетерологичных генов в Е. coli является присутствие в структуре эукариотической мРНК так называемых «редких» кодонов, соответствующих, как правило, слабо представленным в общеклеточном пуле Е. coli молекулам тРНК (Gouy et al., 1982;Ikemura 1985; Kane 1988; Brinkman et al., 1989; Gutman et al., 1989, Chen et al., 1994). Вопрос об актуальности этой проблемы для случая гетерологичной экспрессии GDNF был впервые поставлен в работе (Liew et al., 1997). Было показано, что максимум продукции целевого бежа в клетках Е. coli, достигаемый при экспрессии природной кДНК gdnf в системе рЕТ под контролем Т7-промотора и RBS гена çlO не превышает 3% от общего клеточного белка, несмотря на интенсивное накопление соответствующей мРНК. Вариации генотипа штамма-продуцента и условий его культивирования не приводили к увеличению продукции GDNF. С другой стороны, экспрессия природного gdnf в виде слитого гена с 5'- проксимальными участками генов, кодирующих N-концевые фрагменты тиоредоксина (105 аминокислот) и глутатион S-трансферазы (220 амнокислот), позволяла добиться существенно большей продукции слитых белков Trx-GDNF и GST- GDNF (соответственно 17% и 13% от общего клеточного бежа). Анализ природной последовательности кДНК, соответствующей зрелому белку GDNF обнаружил присутствие в ней большого числа редких кодонов. Так, из 16 аргининовых кодонов, присутствующих в структуре мРНК gdnf, 8 триплетов AGA, 4-AGG и 4-CGG. При этом 9 из них локализованы в пределах первых 40 N-концевых аминокислот, 4 из которых образуют два тандемных кластера AGA1'AGA12 и CGG31AGA32 (Рис. 9). Из сопоставления представленных фактов следует, что, возможно, именно первичная структура мРНК gdnf (в первую очередь, область первых 100-120 нуклеотидов) является негативным фактором, влияющим на эффективность процесса трансляции. Поэтому работу по созданию штамма-продуцента было решено начать с получения синтетического гена gdnf с оптимизированным для трансляции в Е. coli кодоновым составом.

Первичная структура кДНК gdnf была модифицирована следующим образом. В пределах первых 120 нуклеотидов кодирующей части кДНК gdnf были заменены все триплеты, относительная частота использования которых в Е. coli (р) в 2 и более раз меньше этого параметра для наиболее встречающегося синонимичного кодона. Так, все аргининовые кодоны AGA (р=0,05), AGG (р=0,03) и CGG (р=0,1) были заменены на триплеты CGT (р=0,38) или CGC (р=0,38). Пролиновый ССА (р=0,2) и глутаминовый САА (р=0,34) кодоны были заменены на CCG (р=0,51) и CAG (р=0,66).В остальной части кДНК gdnf была произведена модификация всех указанных выше аргининовых кодонов и замена изолейцинового триплета АТА (р=0,09) на синонимичный кодон АТС (р=0,4) (Рис. 9).

Хорошо известно, что вторичная структура транскрибируемой мРНК в области локализации стартового кодона и участка связывания рибосом

1 11 21 31 41 51

EcoRI Ndel

MSPDKQMAVL P R R E R Синтет. gdnf ttctcatatgtcaocggataaacaqatqgcagttcttccacgtcqtqaac

Природ, gdnf tca^pfcataaa^BataacaqtqcttoctWMBBBp

61 71 81 91 101 111

KRQAAAAN PBNSRSKGRRGQ Синтет. gdnf qtaaco^caggctgcagoagotaacccagaaaactctegtggtaaaqqtcgtcqcgqtc Природ, gdnf ^...Д..».^^——ДД||--- и1 I )MF—

121 131 141 151 161 171

RGKNRGCVLTAIHLHVTDLG Синтет. gdnf aacgfcggtaaaaaccgtqqttqcqtactqactqcaatccacatgaaagttactgatctqq

Природ, gdnf

181 191 201 211 221 231

GYETKEELIFRYCSGSCDA Синтет. gdnf gtctgggttacgaaaccaaagaaqaactqattt.tccqttactqctctgqttcttqcqatq

_ ccqtta

Природ, gdnf gtctgggctatgaaaccac^gaggatctgatttttgjtactgcagcggctcttgcgatg

241 251 261 271 281 291

AETTYDKILKNLSRNRRLV8 Синтет. gdnf caqctgaaactacctacqacaaaatcctgaaaaacctgtctcgtaaccgtcgcctggttt Природ, gdnf cagctgagacaacgtacgacaaaf^tgaaaaacttatcc^gaal^HMHctggtga

301 311 321 331 341 351

DKVGQACCRPIAFDDDLSFL Синтет. gdnf ctgataaagttggtcaqqcatqttqcocrtccaatcqcattcgacqatqacctqtcGttce

_:cgtce

Природ, gdnf gtgacaaagtagggcaggcatgttgcjjjlJcccatcgcctttgatgatgacctgtGgtttt

361 371 381 391 401 411

DDNLVYHILRKHSAKRCGCI Синтет. gdnf tgqatgacaacctcqtttaccatattctgcgcaaacattccgctaaacgctgtggctgta

Природ, gdnf tagatgataacctggtttaccatattctaBPaagcattccgctaaaBBtgtggatgta

420 HindllI stop

Синтет. gdnf tctaagct Природ, gdnf tctqa

Рис. 9 Первичная структура природной и «оптимизированной» кДНК gdnf.

Жирным шрифтом выделены все изменения нуклеотидного состава кДНК gdnf. Серьми прямоугольниками выделены заменяемые «редкие» кодоны. Остальные замены произведены с целью оптимизации реакции отжига олигонуклеотидов в процессе сборки синтетического гена ^п/ Подчеркнуты области сопряжения олигонуклеотидов по «липким» концам. Терминирующий кодон 1§а заменен на 1аа с целью введения в структуру гена сайта рестриктазы ШпсШ. Клонирование синтетического гена велось с использованием специально введенных в структуру синтетического гена сайтов рестриктаз ЕсоШ и Ше\.

оказывает существенное влияние на эффективность процесса инициации трансляции [de Smit et al., 1990; Hartz et al 1991]. Вовлечение AUG кодона и SD-последовательности в образование стабильных шпилечных структур затрудняет доступ к этим сайтам 30S рибосомальной субъединицы и блокирует стадию инициации трансляции. Поэтому в процессе оптимизации кодонового состава, учитывалась потенциальная вторичная структура 5'-проксимальной области мРНК синтетического гена gdnf (Рис. 10). Нуклеотидные замены проводили таким образом, чтобы и AUG кодон и SD-последовательность не входили в

«Orsr

13C

AUG

Рис. 10 Потенциальная вторичная структура 5'-проксимального участка мРНК gdnf. Представлены вероятные вторичные структуры 5'-проксимального участка мРНК gdnf{первые 189 нуклеотидов, соответствующие: А) - природной последовательности gdnf, В) - синтетическому гену gdnf), транскрибируемого в составе экспрессионного модуля ER5 на плазмиде pBT-GDNF (см. рисунок 12). Для каждой структуры указаны значения свободной энергии спиральных участков (кКал/моль), локализация участка связывания рибосом (SD) и стартового кодона (AUG). Расчеты вторичной структуры РНК проводились с помощью Web-pecypca GeneBee - Molecular Biology Server (http://www.genebee.msu.ru/genebee.htlm).

состав протяженных спиральных участков потенциальной вторичной структуры мРНК-транскрипта gdnf.

Конструирование синтетического гена gdnf было выполнено по следующей схеме (рис. 11). 16 химически синтезированных олигонуклеотидов с «оптимизированой» первичной структурой, образующие 8 коплементарных пар с «липкими» концами, кинировали с помощью Т4-полинуклеотидкиназы. Полученную смесь "отжигали" и лигировали в присутствии ДНК-лигазы фага Т4. Для оптимизации температуры отжига «липких» концов олигонуклеотидов и предотвращения процесса их неспецифического перекрестного отжига, в структуру кДНК gdnf были введены дополнительные нуклеотидные замены (Рис. 9). Полученные фрагменты ДНК расщепляли рестриктазами Hindlïl, ЕсоШ и препаративно разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Полученный EcóBl-Hind фрагмент, содержащий синтетический ген gdnf клонировали по соответствующим сайтам в составе вектора pUC18. Правильность структуры рекомбинантного gdnf на полученной плазмиде pUC 18- gdnf подтверждалась секвенированием соответствующего участка ДНК методом Сэнгера с использованием 7-deaza-dGTP. Из 10 случайно выбранных плазмид, 9 содержали ген gdnf с правильной первичной структурой.

Олигонуклеотид Структура (J'->3)'

G1 AATTCTCATATGTCACCGGATAAACAGATGGCAGTTCTTCCACGTC

G2 GTGAACGTAACCGTCAGGCTGCAGCAGCTAACCCAGAAAACTCTCGTGGTAA

G3 AGGTCGTCGCGGTCAACGTGGTAAAAACCGTGGTTGCGTACTGACTGCAATC

G4 CACCTGAACGTTACTGATCTGGGTCTGGGTTACGAAACCAAAGAAGAACTGA

G5 TTTTCCGTTACTGCTCTGGTTCTTGCGATGCAGCTGAAACTACCTACGACAAAAT

G6 CCTGAAAAACCTGTCTCGTAACCGTCGCCTGGTTTCTGATAAAGTTGGTCAG

G7 GCATGTTGCCGTCCAATCGCATTCGACGATGACCTGTCCTTCCTGGATGACAAC

G8 CTCGTTTACCATATTCTGCGCAAACATTCCGCTAAACGCTGTGGCTGTATCTA

Gil AGCTTAGATACAGCCACAGCGTTTAGCGGAATGTTTGCGCAGAATA

G12 TGGTAAACGAGGTTGTCATCCAGGAAGGACAGGTCATCGTCGAATGCGATTG

G13 GACGGCAACATGCCTGACCAACTTTATCAGAAACCAGGCGACGGTTACGAGAC

G14 AGGTTTTTCAGGATITTGTCGTAGGTAGTTTCAGCTGCATCGCAAGAACCAGAG

G15 CAGTAACGGAAAATCAGTTCTTCTTTGGTTTCGTAACCCAGACCCAGATCAGT

G16 AACGTTCAGGTGGATTGCAGTCAGTACGCAACCACGGTTTTTACCACGTTGA

G17 CCGCGACGACCTTTACCACGAGAGTTTTCTGGGTTAGCTGCTGCAGCCTGACG

G18 GTTACGTTCACGACGTGGAAGAACTGCCATCTGTTTATCCGGTGACATATGAG

Gl G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8

G18 G17 G16 G15 G14 G13 G12 G11 Рис. 11 Схема конструирования синтетического гена gdnf.

Олигонуклеотиды G1-G8 и Gl 1- G18 кинировапи с помощью Т4-полинуклеотидкиназы, смесь "отжигали" и лигировали в присутствии ДНК- лигазы фага Т4. Полученные фрагменты ДНК расщепляли рестриктазами EcoRl и Hindñl, после чего проводили разделение продуктов реакции в 1,5% агарозном геле. Жирным шрифтом выделены все комплементарные «липкие» концы.

5. Получение рекомбинантных штаммов Escherichia coli- продуцентов рекомбинантного нейротрофина глиального происхождения человека GDNF.

Синтетический ген gdnf, в составе Ndel-Hindlll фрагмента плазмиды pUC 18- gdnf был лигирован с Xbal-Ndel фрагментом плазмиды рЕТ-22Ь(+), содержащим 3'-проксимальную часть RBSjo- Лигазную смесь обрабатывали рестриктазами Xbal и Hindlll, после чего субклонировали Xbal - Hincffil фрагмент, содержащий синтетический ген gdnf с подстыкованным к нему RBSio в составе вектора pBTIL-4/ Xbal-Hindlll. Структура полученной плазмиды pBT-GDNF представлена на рисунке 12.

Эффективную экспрессию целевого гена должен был обеспечить промотор Рас, регулируемый тандемом операторов Otac, а трансляцию - полная последовательность RBS гена 10 фага Т7, который содержит дополнительный участок связывания с 16S рРНК (е-последовательность). Максимальная продукция рекомбинантного GDNF в клетках TGI [pBT-GDNF] составляла 17% от общего клеточного белка, что прямо подтверждало гипотезу о негативном

влиянии первичной структуры кДНК природного гена gdnf на эффективность его гетерологичной экспрессии в Е. coli. Существенным недостатком полученного штамма был высокий базальный уровень продукции целевого белка (11-15%, Рис. 12) что, учитывая токсичность GDNF для клеток Е. coli [Suter-Crazzolara et al., 1995], могло являться причиной нестабильности плазмидного штамма-продуцента при его культивировании и хранении

Структура экспрессионного модуля ER-5 плазмиды pBT-GDNF.

-35 Р.., промотор_ilO_оператор Qt„_

ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacag

оператор Oi„_

aattgtgagcggataacaattcatgcttcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttc

Xbal SD _ Met gdnf

cctctagaaaataattttgtttaactttaagaaggagatatcatatg »

Рис.12. Структура экспрсссионной плазмиды pBT-GDNF и электрофореграммы препаратов суммарных белков плазмидного штамма-прдуцента GDNFTGl[pBT-GDNF]. Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов; 2 - неиндуцированный штамм TGI [pBT-GDNF]; 3 - индукция 0,5 мМ TPTG в течении 3 часли.

(Таблица 3). Для снижения фоновой продукции GDNF, в структуру плазмиды pBT-GDNF был введен ген репрессора лактозного оперона lacl. С этой целью, BamHl-Pvul фрагмент плазмиды pBT-GDNF, содержащий ген gdnf под контролем экспрессионного модуля ER-5 (Рис. 12) и 5'-проксимальную часть гена Ыа, клонировали в составе вектора рЕТ15Ь/ BamHl-Pvul (Рис.13).

Продукция GDNF в штамме TGI [pBT-lacI-GDNF] была стабильна и составляла в среднем 40%. При этом, одновременно произошло и увеличение

базальной продукции GDNF, которая составила 20% (Рис.14). Таким образом, было показано, что, во-первых, увеличение дозы гена lacl стабилизирует плазмиду, а во-вторых, "экспрессионный потенциал" модуля ER-5 существенно больше, чем исходные 17%, но для полной его реализации необходимо дальнейшее снижение фоновой продукции целевого белка. Поэтому, на следующем этапе была сконструирована плазмида placI-GDNF (Рис.13), отличающаяся от pBT-GDNF более низкой копийностью репликона. С этой целью, Sphl-Nrul фрагмент плазмиды рЕТ15Ь, содержащий ген lacl был клонирован в составе вектора рВТ-lacI-GDNF/ Sphl-Nrul.

Благодаря снижению копийности, базальный уровень экспрессии

Рис.13. Конструирование экспрессионных плазмид pBT-lacI-GDNF, olacI-GDNF и olacIO-GDNF.

рекомбинантного СО№ в штамме ТС1[р1ас1-ОВ№] уменьшился в два раза и

67 Ша—► 43 Ша—►

30 kDa—► 20 kDa—►

14 Ша—►

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 14. Электрофореграммы препаратов суммарных белков штаммов-продуцентов СБМ?.

Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов; 2,4,6 - неиндуцированные штаммы ТС1[р!ас1(3-ОООТ], ТС1[р1ас1-00№] и Т01[рВТ-1асЮВЫР], соответственно; 3,5,7 - штаммы, индуцированные 0,5 мМ ПТв я в течении 3 часов.

составил 9%, при этом максимальная продукция целевого белка составила 44% (Рис.14).

Таблица 3. Уровень накопления рекомбинантного СОКЕ в зависимости от условий хранения и выращивания клеток штамма-продуцеита.

Штамм Условия хранения и выращивания бактерий.1 Выход целевого продукта в % от клеточного белка.

1 2 3 4 5 -IPTG +IPTG

+ - - - +

Е. coli TGI [pBT-GDNF] - + - - + + 5 8

+ + М9 - + 11 17

Е coli TGI + - - - +

[pBT-lacI- + - - + + 15 30

GDNF] + + М9 - + 20 40

+ - - - + ■ - *

E. coli TGI [placI-GDNF] - + - - + + 9 40

+ + М9 - + 9 44

E coli TGI + - - - + шжШ Ш t '' Шеаг'т-..,, «i-„ - ЛЯ '

[placlQ-GDNF] " + - - + + 2 44

+ + М9 - + 2 44

Все обозначения полностью аналогичны Таблице 1.

Естественным продолжением выбранной стратегии было клонирование в составе экспрессионной плазмиды pBT-lacI-GDNF аллеля lacl4, усиливающего примерно на порядок экспрессию репрессора Lacl. С этой целью, Sphl-Apäl фрагмент, содержащий ген lacT1, был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК F-фактора из штамма E.coli TG1, и клонирован в составе вектора placI-GDNF/ Sphl-Apäl (Рис. 13). Продукция целевого белка в штамме TGl[placIQ-GDNF] осталась такой же, как и для TG1 [placI-GDNF] - 44%, однако, фоновая продукция упала до 1-3% (Рис. 14). Такой базальный уровень экспрессии рекомбинантного белка уже не оказывал практически никакого влияния на стабильность штамма при его хранении, поэтому дальнейшее снижение его уровня не проводилось (Таблица 3).

Таким образом, было показано, что для обеспечения эффективной продукции рекомбинантного GDNF в клетках Escherichia coli необходимо и достаточно оптимизировать кодоновый состав и обеспечить строго регулируемую экспрессию соответствующего гена.

ВЫВОДЫ

1. Получены синтетические гены делеционной формы интерлейкина-4 человека (hil-462) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf) с оптимизированным для трансляции в клетках Е. coli кодоновым составом.

2. Осуществлено конструирование экспрессионных векторов, способных обеспечить высокоэффективную и строго регулируемую экспрессию генов hil-452 и gdnf, на основе которых созданы штаммы-продуценты делеционной формы интерлейкина-4 человека (hIL-4¿2) и нейротрофина глиального происхождения (GDNF).

3. Разработана лабораторная методика ренатурации и очистки из телец включения рекомбинантного hIL-4<52.

4. Исследована биологическая активность делеционной формы интерлейкина-4. Показано, что in vivo рекомбинантный hIL-4<52 ингибирует костимулирующее действие hIL-4 на активированные тимоциты периферической крови человека. Установлено, что данный эффект усиливается в присутствии циклоспорина А.

5. Штамм-продуцент hIL-452 и препарат белка переданы в Институт инженерной иммунологии, для структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4. Препарат белка hlL-452 передан в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН, для изучения роли этого цитокина в тканеспецифической регуляции иммунных реакций и на разных этапах онтогенетического развития. Штамм-продуцент рекомбинантного GDNF передан в лабораторию НПЦ «Фосфосорб», для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Птицын JI. Р., Смирнов С. В., Альтман И. Б., Самсонова Н. Н., Ходякова А. В., Василенко Р. Н. «Продукция рекомбинантного hIL-452 -природной изоформы интерлейкина-4 человека в клетках Escherichia соН». // Биоорг. химия, т.25, №8, с. 623-629, (1999)

2. Птицын JI. Р., Альтман И. Б., Смирнов С. В., Уваров В. Ю., Ляшенко А. А. « Получение рекомбинантного нейротрофина глиального происхождения на базе штамма-продуцента Е. соН» IIVI Российский Национальный Конгресс « Человек и лекарство». Тез. докл., с. 462. Москва, (1999).

3. Ptitsyn L. R., Altman I. В., Smirnov S. V., Uvarov V. Yu., Lyashenko A. A., Markin S. S. « Design and analysis of the E. coli produced strains of the recombinant glial-cell-line-derived neurotrophic factor (GDNF)». // Eur. Cytokine Network, v.9, №3, p. 480, (1998)

4. Самсонова H. H., Альтман И. Б., Маппсо С. В., Смирнов С. В., Птицын JI. Р. «Конструирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих делеционный белок интерлейкина-4 человека». // Научная сессия МИФИ-98, Сборник научных трудов, часть 8, с. 76-78, Москва, (1998).

5.Альтман И. Б., Птицын JI. Р., Смирнов С. В., Калужский В. Е., Машко С. В. «Создание штамма-продуцента рекомбинантного у-интерферона быка, пригодного для эффективного биотехнологического производства». // Биотехнология, №11-12, с. 3-13, (1997)

Принято к исполнению 02/09/2003 Исполнено 03/09/2003

Заказ №351 Тираж: 100 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.iu

gooJ-Д Ш 16 4 7 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнов, Сергей Васильевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Оптимизация экспрессии гетерологичных генов в клетках Escherichia coli.

1.1 Основные компоненты экспрессионных векторов. Проблема стабилизация дозы рекомбинантного гена.

1.2 Регуляция транскрипции.

1.2.1. Промоторы.

1.2.1.1. lac-промотор и его производные.

1.2.1.2. рЕТ-векторы.

1.2.1.3. Другие индуцируемые промоторы.

1.2.2. Строго регулируемые экспрессионные системы.

1.2.3. Терминаторы транскрипции.

1.3 Регуляция трансляции.

1.3.1. Инициация трансляции мРНК.

1.3.2. Энхансеры трансляции мРНК.

1.3.3. Стабильность мРНК.

1.3.4. Элонгация трансляции.

1.3.5. Точность трансляции.

1.3.6. Терминация трансляции.

2. Структурно-функциональные аспекты гетерологичной экспрессии белков в клетках

Escherichia coli.

2.1. Цитоплазматическая продукция рекомбинантных белков.

2.1.1. Формирование дисульфидных связей в цитоплазме Е. coli.

2.1.2 Процессинг N-концевого метионинового остатка.

2.2. Молекулярные шапероны.

2.3. Секреция рекомбинантных белков.

2.3.1 Периплазматическая продукция рекомбинантных белков.

2.3.2 Экстраклеточная секреция рекомбинантных белков.

2.5. "Слитые" белки.

2.6. Деградация белков.

2.7. Рефолдинг белков-продкутов гетерологичного синтеза.

2.7.1. Выделение, очистка и солюбилизация телец включения.

2.7.2. Ренатурация белка

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды.

Эксперименты с ДНК.

Конструирование рекомбинантного гена Ы1-482.

Конструирование синтетического гена gdnf.

Выделение и очистка белков.

Приготовление препарата телец включения ЫЬ-452.

Ренатурация и очистка ЫЬ-452.

Ренатурация и очистка ЫЬ-4.

Определение биологической активности Ы^452.

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение штаммов Escherichia coli - продуцентов делеционной формы интерлейкина-4 человека - hIL4-52.

1.1 Конструирование рекомбинантного гена hil-452 и его экспрессия в составе плазмиды pUCTIL-4d2.

1.2 Экспрессия гена Ы1-452 в составе рекомбинантных плазмид рВТ1Ь-4(12 и рЕТ1Ь-4с12.

2. Ренатурация и очистка рекомбинантного 111Ь-452.

3. Определение биологической активности препарата рекомбинантного ЫЬ-452.

4. Получение штаммов Escherichia coli— продуцентов нейротрофина глиального происхождения.

4.1 Конструирование синтетического гена нейротрофина глиального происхождения человека - gdnf

4.2 Экспрессия синтетического гена gdnf в составе рекомбинантной плазмиды pBT-GDNF.

4.3 Экспрессия синтетического гена gdnf в составе рекомбинантных плазмид pBT-lacI-GDNF, placl-GDNF и placIQ-GDNF.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 δ2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf)"

Актуальность проблемы

Цитокины - это родовое название специализированных растворимых белков и пептидов, которые, действуя как гуморальные иммуномодуляторы на отдельные клетки или ткани, принимают участие в регуляции таких важных биологических процессов как гемопоэз, иммунный ответ, тканеспецифическая клеточная пролиферация, апоптоз. В настоящее время во многих научно-исследовательских центрах мира проводятся интенсивные работы по изучению возможности использования цитокинов для диагностики и лечения различного рода патологий иммунной системы [Егорова и др., 1998; Martino et al., 2000], вирусных инфекций [Tovey et al., 1999; Carreno et. al., 2000; Тимченко и др., 2001], а также в комплексной терапии широкого спектра онкологических заболеваний [Tagawa 2000; Bukowski 2001]. Объектами подобных исследований являются, в частности, делеционная форма интерлейкина-4 человека - hIL-482 [Arinobu et al, 1999; Glare et al., 2001; Sea et al., 2001] и нейротрофин глиального происхождения человека GDNF [Lapchak et al, 1997; Espejo et al., 2001; Zurn et al., 2001].

Изучение экспрессии гена интерлейкина-4 человека (hil-4) показало, что в Т-лимфоцитах периферической крови человека и тимоцитах вместе с мРНК hil-4 экспрессируется и ее делеционный вариант, у которого в процессе специфического (альтернативного) сплайсинга происходит элиминация участка нуклеотидной последовательности, соответствующей экзону 2, а участки, соответствующие экзонам 1, 3 и 4, образуют непрерывную рамку считывания для природной делеционной изоформы интерлейкина-4 - hIL-452 [Sorg et al., 1993]. Эксперименты in vitro с рекомбинантным hIL-452 показали, что этот белок является природным антагонистом hIL-4. В частности, ML4-52 ингибирует как костимулирующее действие hIL-4 на активированные Т-лимфоциты периферической крови человека, так и активацию hIL-4 синтеза IgE и экспрессию CD23 в В-лимфоцитах [Atamas et al., 1996; Arinobu et al., 1999]. В моноцитах hlL-482, напротив, блокирует ингибирующее действие hIL-4 на LPS-индуцируемый синтез циклооксигеназы-2 и последующую секрецию простагландина Е2 [Arinobu et al., 1999]. Результаты исследований позволяют говорить о значительном терапевтическом потенциале hIL-482 как природного антагониста интерлейкина-4.

Цели и задачи работы

Целью представляемой работы было создание на основе клеток E.coli высокоэффективных штаммов-продуцентов рекомбинантных hIL-482 и GDNF. В процессе работы решались следующие задачи:

1. Конструирование синтетических генов, соответствующих процессированным формам белков hIL-452 и GDNF, с оптимизированными для трансляции в клетках Е. coli нуклеотидными последовательностями.

3. Разработка лабораторной процедуры ренатурации рекомбинантного hIL-482.

4. Исследование биологической активности препарата рекомбинантного hIL-482.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые в клетках Escherichia coli осуществлена высокоэффективная экспрессия генов hil-452 и gdnf, а также - сконструированы штаммы-продуценты соответствующих рекомбинантных цитокинов. Для достижения максимальной продукции целевых белков учитывался целый ряд факторов, влияющих на эффективность процессов транскрипции и трансляции гетерологичных генов в Е. coli. В частности, проведен комплексный анализ первичной и потенциальной вторичной структур нативной мРНК gdnf, на основании которого разработана схема конструирования трансляционных модулей, состоящих из искусственного участка связывания рибосом (RBS) и синтетического рекомбинантного гена gdnf с оптимизированным для трансляции в Е. coli кодоновым составом. При выборе основных параметров экспрессионных векторов (копийность и стабильность репликона, «сила» и «строгость» регуляции промотора, эффективность RBS) были учтены как токсичное действие обоих гетерологичных белков на бактериальные клетки, так и влияние относительной скорости клеточного биосинтеза целевых белков на процесс формирования структуры образуемых ими телец включения.

Исходя из особенностей формирования третичной структуры делеционной формы интерлейкина-4, разработана лабораторная методика его ренатурации и очистки из нерастворимой клеточной фракции «телец включения». Исследована биологическая активность рекомбинантного hIL-452. Показано, что ренатурированный in vitro hIL-4<52 ингибирует костимулирующее действие hIL-4 на активированные тимоциты человека и установлено, что данный эффект усиливается в присутствии циклоспорина А. Данные по биологической активности ренатурированного hIL-452 согласуются с результатами, полученными в аналогичных экспериментах с белком, продуцируемым в растворимой форме в клетках РгсМарайШНБ [А1атаз е1 а!., 1996].

Штамм-продуцент ЫЬ-482 и препарат белка переданы в Институт инженерной иммунологии, а также в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН для дальнейших структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4.

Штамм-продуцент рекомбинантного вБЫР передан в лабораторию НПЦ «Фосфосорб», для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Среди многочисленных доступных на сегодняшний день про- и эукариотических систем экспрессии рекомбинантных белков кишечная палочка Escherichia coli (Е. coli) остается одним из наиболее востребованных биологических объектов в фармацевтической биотехнологии. Высокая плотность культуры продуцирующих клеток и их быстрый рост на относительно недорогих субстратах позволяют во многих случаях добиться существенного снижения себестоимости конечного продукта, даже с учетом необходимости соблюдения строгих стандартов качества, предъявляемых к фармакологическим препаратам [Swartz 2001]. Как правило, почти любая работа по гетерологичному синтезу белка начинается с попытки экспрессировать соответствующий рекомбинантный ген в клетках Е. coli. Альтернативные системы экспрессии используются, только если для биологической активности белка необходима сложная посттрансляционная модификация или при наличии непреодолимых проблем связанных с его фолдингом или ренатурацией [Makrides, 1996; Машко, 1998; Jonasson et al 2002]. Кроме «технологического» аспекта, при выборе бактериальной системы экспрессии решающую роль играет детальное знание молекулярной биологии Е. coli и развитая генная инженерия этого микроорганизма.

Процесс ко-трансляционного формирования структуры эукариотического белка в бактериальной клетке обладает одной характерной особенностью. При сравнительно малом уровне продукции гетерологичного полипептида (0,01-0,1% от суммарного клеточного белка) соответствующий белок, как правило, растворим, при повышении уровня экспрессии обнаруживаются как растворимые, так и нерастворимые формы белка, а при дальнейшем возрастании уровня экспрессии до 5-10% или выше от суммарного клеточного белка - практически весь синтезируемый рекомбинантный белок обнаруживается в виде нерастворимых «телец включения» (inclusion body) [Стронгин 1990]. Критические значения внутриклеточной концентрации и скорости биосинтеза, равно как «технологические» и «экономические» параметры процессов ренатурации и очистки специфичны для каждого конкретного белка. Поэтому в одних случаях выгодно добиваться максимального выхода его растворимой формы (стратегия «максимального качества»), а в других - полностью переводить целевой белок в нерастворимую фракцию «телец включения» (стратегия «максимального количества»). Очевидно, что для успешной реализации каждой из этих стратегий необходимо: во-первых, уметь регулировать скорость биосинтеза рекомбинантного полипептида, а во-вторых - влиять на процессы котрансляционного формирования третичной структуры белка, посттрансляционного процессинга (в частности - протеолиза) и межкомпартментного транспорта (секреция целевого белка в периплазму или культуральную среду). Кроме того, если гетерологичный белок продуцируется в форме нерастворимых «телец включения», то для получения его растворимой функционально-активной формы необходимы стадии ренатурации и очистки.

Исходя из того, что основной целью представляемой работы была эффективная продукция цитокинов человека в клетках Е. coli, данный Обзор литературы посвящен анализу современных подходов к решению задачи оптимизации гетерологичной продукции белков в клетках Е. coli, которая, как было указано выше, имеет два четко выраженных аспекта. Первый - это комплекс задач по обеспечению эффективной экспрессии гетерологичного гена, то есть, создание экспрессионной системы с оптимальными, в рамках выбранной стратегии, скоростями транскрипции целевой кДНК и трансляции соответствующей мРНК. Второй - структурно-функциональный аспект, включает в себя задачи эффективного и целенаправленного использования бактериальных систем фолдинга и секреции белков, регуляции клеточных редокс-потенциала и профиля протеолитической активности, разработки общих подходов к проблеме ренатурации белка in vitro.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Смирнов, Сергей Васильевич

ВЫВОДЫ

1. Получены синтетические гены делеционной формы интерлейкина-4 человека (hil-482) и нейротрофина глиального происхождения (gdnj) с оптимизированным для трансляции в клетках Е. coli кодоновым составом.

2. Осуществлено конструирование экспрессионных векторов, способных обеспечить высокоэффективную и строго регулируемую экспрессию генов hil-4S2 и gdnf, на основе которых созданы штаммы-продуценты делеционной формы интерлейкина-4 человека (hIL-4<S) и нейротрофина глиального происхождения (GDNF).

3. Разработана лабораторная методика ренатурации и очистки из телец включения рекомбинантного hIL-4^2.

4. Исследована биологическая активность делеционной формы интерлейкина-4. Показано, что in рекомбинантный hIL-4<52 ингибирует костимулирующее действие hIL-4 на активированные тимоциты человека. Установлено, что данный эффект усиливается в присутствии циклоспорина А.

5. Штамм-продуцент hIL-452 и препарат белка переданы в Институт инженерной иммунологии, для структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4. Препарат белка hIL-452 передан в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН, для изучения роли этого цитокина в тканеспецифической регуляции иммунных реакций и на разных этапах онтогенетического развития. Штамм-продуцент рекомбинантного GDNF передан в лабораторию НПЦ «Фосфосорб», для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнов, Сергей Васильевич, Москва

1. Adams, J. М. (1968) On the release of the formyl group from nascent protein. J. Mol. Biol. 33: 571-589.

2. Adhya, S. and Gottesman, M. (1982) Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity. Cell 29: 939-944.

3. Allen, S.P., Polazzi, J.O., Gierse, J.K., Easton, A.M. (1992) Two novel heat shock genes encoding proteins produced in response to heterologous protein expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:6936-6941.

4. Arenas, E., Trupp, M., Akerud, P. & Ibanez, C.F. (1995) GDNF prevents degeneration and promotes the phenotype of brain noradrenergic neurons in vivo. Neuron 15:1465-1471.

5. Atamas, S.P., Choy, J., Yurovsky, V.V., White, B. (1996) An alternative splice variant of human IL-4, IL-452, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation. J. Immunol. 156:435-441.

6. Balakrishnan, R., Bolten, В., Backman, K.C. (1994) A gene cassette for adapting Escherichia coli strains as hosts for a//-Int-mediated rearrangement and PL expression vectors. Gene 138: 101-104.

7. Balbas, P., Bolivar, F. (1990) Design and construction of expression plasmid vectors in Escherichia coli. Methods Enzymol. 185: 14-37.

8. Banchereau J., Bidaud, C., Fluckiger, A., Galibert, L., Garrone, P., Malisan, F. & Pandrau, D. (1993) Effects of interleukin 4 on human В cell growth and differentiattion. Res. Immunol. 144:625-631.

9. Baneyx, F. (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10: 411-421.

10. Bardwell, J. C. A. (1994) Building bridges: disulfide bond formation in the cell. Mol. Microbiol. 14: 199-205.

11. Bechhofer, D. (1993) 59 mRNA stabilizers, p. 31-52. In J. G. Belasco and G. Brawerman (ed.), Control of messenger RNA stability. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

12. Belasco, J. G., G. Nilsson, A. von Gabain, and S. N. Cohen. (1986) The stability of£. coli gene transcripts is dependent on determinants localized to specific mRNA segments. Cell 46:245-251.

13. Ben-Bassat, A., Bauer, K., Chang, S.-Y., Myambo, K., Boosman, A., Chang, S. (1987) Processing of the initiation methionine from proteins: properties of the Escherichia coli methionine aminopeptidase and its gene structure. J. Bacteriol. 169: 751-757.

14. Bessette, P-H., Aslund, F., Beckwith, J., Georgiou, G. (1999) Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96:13703-13708.

15. Bjornsson, A., S. Mottagui-Tabar, and L. A. Isaksson. (1996) Structure of the C-terminal end of the nascent peptide influences translation termination. EMBOJ. 15: 1696-1704.

16. Blackwell, J. R. and Horgan, R. (1991) A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form. FEBS Lett. 295: 10— 12.

17. Blight, M. A., Chervaux, C., and Holland, I. B. (1994) Protein secretion pathways in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 468—474.

18. Bogosian, G., Violand, B. N., Dorward-King, E. J., Workman, W. E., Jung, P. E., and Kane, J. F. (1989) Biosynthesis and incorporation into protein of norleucine by Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264: 531-535.

19. Bohn, M. (1999) A commentary on glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). From a glial secreted molecule to gene therapy. Biochem Pharmacol. 57(2): 135-142.

20. Bowden, G. A., and Georgiou, G. 1988. The effect of sugars on b-lactamase aggregation in Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 4: 97-101.

21. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method of for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the priciple of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

22. Brinkmann, U., Mattes, R. E., and Buckel P. (1989) High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 85: 109-114.

23. Brosius, J., Erfle, M., Storella, J. Spacing of the -10 and -35 regions in the tac promoter. (1985) Effect on its in vivo activity. J Biol Chem. 260(6):3539-3544.

24. Brosius, J., Ullrich A., Raker, M.A., Gray, A., Dull, T.J.,Gutell, R.G., Noller, H.F. (1981) Construction and fine mapping of recombinant plasmids containing the rrnB ribosomal RNA operon of E.coli. Plasmid 6: 112-118.

25. Brown, W.C. and Campbell, J.L. (1993) A new cloning vector and the expression strategy for genes encoding proteins toxic to Escherichia coli. Gene. 127: 99-103.

26. Bukau, B., Horwich, A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 92: 351-366.

27. Bukowski TP, Sedberry S, Richardson B. Straten. (2001) Is human chorionic gonadotropin useful for identifying and treating nonpalpable testis? J Urol. 165(l):221-226.

28. Butler, J.S., Springer, M., Grunberg-Manago, M. (1987) AUU-to-AUG mutation in the initiator codon of the translation initiator factor IF3 abolishes translational autocontrol of its own gene (infC) in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4022-4025.

29. Carpousis, A.J., Vanzo, N.F., Raynal, L.C. (1999) mRNA degradation: a tail of poly(A) and multiprotein machines. Trends Genet. 15: 24-28.

30. Chang, J.Y. and Swartz, J.R. (1993) Single-step solubilization and folding of IGF-I aggregates from Escherichia coli. In: Protein Folding in vivo and in vitro. Cleland J.I., Ed. ACS Symposium Series 526. Washington. D.C. p. 178189.

31. Chao, Y.-P., Chiang, C.-J., Lo T.-E., Fu, H. 2000. Overproduction of D-hydantoinase and carbamoylase in a soluble form in Escherichia coli. Appl. Microbiol Biotechnol. 54: 348-353.

32. Cheah, K. C., Harrison, S., King, R., Crocker, L., Wells, J. R. E. and Robins, A. (1994) Secretion of eukaryotic growth hormones in Escherichia coli is influenced by the sequence of the mature proteins. Gene 138: 9-15.

33. Chen, C.-Y. A., Beatty, J. T., Cohen, S. N., and Belasco, J. G. (1988) An intercistronic stem-loop structure functions as an mRNA decay terminator necessary but insufficient for puf mRNA stability. Cell 52: 609-619.

34. Chen, G.-F. T., and Inouye, M. (1994). Role of the AGA/AGG codons, the rarest codons in global gene expression in Escherichia coli. Genes Dev. 8: 2641-2652.

35. Chen, G.-F. T., and Inouye, M. 1990. Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene expression: preferential usage of minor codons within the first 25 codons of the Escherichia coli genes. Nucleic Acids Res. 18: 1465-1473.

36. Chen, H.-Y., Pomeroy-Cloney, L., Bjerknes, M., Tam, J., Jay, E. (1994) The influence of adenine-rich motifs in the 3' portion of the ribosome binding site on human IFN-y gene expression in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 240: 2027.

37. Chen, L.-H., S. A. Emory, A. L. Bricker, P. Bouvet, and J. G. Belasco. (1991) Structure and function of a bacterial mRNA stabilizer: Analysis of the 59 untranslated region of ompA mRNA. J. Bacteriol. 173: 4578-4586.

38. Chen, W., Kallio, T., Bailey, J.E. (1995) Process characterization of a novel cross-regulation system for cloned protein production in Escherichia coli. Boitechnol. Prog. 11: 397-402.

39. Chopin, M-C., Chopin, A., Ronault, A., Galleron, M. (1989) Insertion and amplification of foreign genes in the Lactococcus lactis subsp. lactis chromosome. Appl.Environ. Microbiol. 55:1769-1774.

40. Clark, E. (1999) Protein refolding for industrial processes. Current Opinion in Biotechnology 12:202-207.

41. Cleland, J. I., (1993) Impact of protein folding on biotechnology. In: Protein Folding in vivo and in vitro. Cleland J.I., Ed. ACS Symposium Series 526. Washington. D.C. p. 1-18.

42. Coburb, G.A., Mackie, G.A. 1999. Degradation of mRNA in Escherichia coli: an old problem with some new twists. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 62: 55-108.

43. Coyle, J.E., Jaeger, J., Gross, M., Robinson, C.V., Radford, S.E. (1997) Structural and mechanistic consequences of polypeptide binding by GroEL. Fold. Des. 2: 93-104.

44. Crawford, R., Finbloom, D„ Ohara, J., Paul W. & Meltzer, M. (1987) B cell stimulatory factor-1 (interleukin-4) activates macrophages for increased tumoricidal activity and expression of 1 a antigens. J. Immunol. 139:135-141.

45. Dalboge, H., Dahl, H.-H. M., Pedersen, J., Hansen, J. W., Christensen, T. (1987) A novel enzymatic method for production of authentic hGH from an Escherichia coli produced hGH-precursor. Bio/Technology 5: 161-164.

46. Derman, A. I., Prinz, W. A., Belin, D., and Beckwith, J. (1993). Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. Science 262: 1744-1747.

47. Dix, D.B., and Thompson, R.C. (1989). Codon choice and gene expression: synonymous codons diffe in translation accuracy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6888-6893.

48. Donovan, W. P., and S. R. Kushner. (1986) Polynucleotide phosphorylase and ribonuclease II are required for cell viability and mRNA turnover in Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 120-124.

49. Duvoisin, R. M., D. Belin, and H. M. Krisch. (1986) A plasmid expression vector that permits stabilization of both mRNAs and proteins encoded by the cloned genes. Gene 45: 193-201.

50. Emory, S. A., P. Bouvet, and J. G. Belasco. (1992) A 59-terminal stem-loop structure can stabilize mRNA in Escherichia coli. Genes Dev. 6: 135-148.

51. Estrem, S.T., Gaal, T., Ross, W., Gourse, R. L. (1998) Identification of an UP element consensus sequence for bacterial promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 9761-9766.

52. Etchegaray, J.P., Inouye, M. (1999) Translational enhancement by an element downstream of the initation codon in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274: 10079-10085.

53. Fahnestock, S. R., Irwin, S. L., (1997)Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47(l):23-32.

54. Figge, J., Wright, C., Collins, C. J., Roberts, T. M., and Livingston, D. M. (1988) Stringent regulation of stably integrated chloramphenicol acetyl transferase genes by E. coli lac repressor in monkey cells. Cell 52:713-718.

55. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P., (1993) Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukariotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol. Bioeng. 41: 3-13.

56. Forrer, P. and Jaussi, R. (1998) High-level expression of soluble heterologous proteins in the cytoplasm of Escherichia coli by fusion to the bacteriophage lambda head protein D. Gene 224: 45-52.

57. Frankel, S., Sohn R., Leinwand, L., (1991) The use of sarcosyl in generating soluble protein after bacterial expression. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1192-1196.

58. Friehs K, Reardon KF. (1993) Parameters influencing the productivity of recombinant E. coli cultivations. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 48:53-58.

59. Garcia, G. M., P. K. Mar, D. A. Mullin, J. R. Walker, and N. E. Prather. (1986) The E. coli dnaY gene encodes an arginine transfer RNA. Cell 45: 453-459.

60. Georgiou, G. (1996) in Protein engineering: Principles and Practice (Cleland, J. L. and Craik, C. S., eds.), pp. 101-127, Wiley-Liss, New York.

61. Georgiou, G., Valax, P. (1999) Isolation inclusion bodies from bacteria. Methods. Enzymol. 309:48-58.

62. Giladi, H., Koby, S., Gottesman, M.E., Oppenheim, A.B. (1992) Supercoiling, integration host factor, and a dualpromoter system, participate in the control of the bacteriophage X pL promoter. J. Mol. Biol. 224: 937-948.

63. Glare, E.M,. Divjak, M., Rolland, J.M., Walters, E.H. (1999) Asthmatic airway biopsy specimens are more likely to express the IL-4 alternative splice variant IL-4delta2. J Allergy Clin Immunol 104(5):978-982.

64. Glascock, C.B., Weickert, M.J. (1998) Using chromosomal lacIQX to control expression of genes on high-copy number plasmids in Escherichia coli. Gene 223: 221-231.

65. Goff, S. A. and Goldberg, A., L. (1985) Production of abnormal proteins in E. coli stimulates transcription of Ion and other heat shock genes. Cell 41:587595.

66. Gold, L. and Stormo, G.D. (1990) High-level translation initiation. Methods Enzymol. 185: 89-93.

67. Goldman, E., Rosenberg, A. H., Zubay, G., and Studier, F. W. (1995) Consecutive low-usage leucine codons block translation only when near the 5'-end of a message in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 245: 467-473.

68. Gottesman, S. (1999) Regulation of proteolysis: developmental switches. Current Opinion in Microbiology 2:142-147.

69. Grossman, T.H., Kawasaki, E.S., Punreddy, S.R., Osbune, M.S. (1998) Spontaneous cAMP-dependent derepression of gene expression in stationary phase plays a role in recombinant expression instability. Gene 209: 95-103.

70. Gutman, G. A. and Hatfield, G. W. (1989) Nonrandom utilization of codon pairs in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3699-3703.

71. Hall, M.N., Gabay, J., Debarbouille, M., Schwartz, M. (1982) A role for mRNA secondary structure in the control of translation initiation. Nature (London) 295:616-618.

72. Hancock, R.E.W. (1983) Alternations in outer membrane permeability. Annu.Rev.Microbiol. 38: 237-247.

73. Hayashi, M.N., Hayashi, M. (1985) Cloned DNA sequences that determine mRNA stability of bacteriophage <f)X174 in vivo are functional. Nucleic Acids Res. 13: 5937-5848.

74. Henderson, C.E., Philips, H.S., Pollock, R.A., Davies A.M., Armanini, M., Simmons, L., Moffet, B„ Vandlen, R.A. & Simmons, L. (1994) GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266:1062-1067.

75. Higgins, C. F„ H. C. Causton, G. S. C. Dance, and E. A. Mudd. (1993) The role of the 39 end in mRNA stability and decay, p. 13-30. In J. G. Belascoand G. Brawerman (ed.), Control of messenger RNA stability. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

76. Hirota, Y., Suzuki, H., Nishimura, Y., Yasuda, S. 1977. On the process of cellular division in Escherichia coli: a mutant of E.coli lacking a murein-lipoprotein. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74: 1417-1422.

77. Hottenrott, S., Schumann, T., Pluckthun, A., Fischer, G., Rahfeld, J.-U. (1997) The Escherichia coli SlyD is a metal ion-regulated peptidyl-prolyl cis/trans isomerase. J. Biol. Chem. 272: 15697-15701.

78. Howard, M., Farrar, J., Hilfike,r M., Johnson, B., Takatsu, K., Hamaoka, T., Paul W. E. (1982) Identification of a T cell derived B cell growth factor distinct from interleukin-2. J. Exp. Med. 155:914-923.

79. Hsiung, H. M., Cantrell, A., Luirink, J., Oudega, B., Veros, A. J., and Becker, G. W. (1989) Use of bacteriocin release protein in E. coli for excretion of human growth hormone into the culture medium. Bio/Technology 7: 267-271.

80. Hsiung, H. M., Mayne, N. G., and Becker, G. W. (1986) High-level expression, efficient secretion and folding of human growth hormone in Escherichia coli. Bio/Technology 4: 991-995.

81. Huh, K. R., Cho, E. H., Lee, S. O., Na, D. S. (1996) High level expression of human lipocortin (annexin) 1 in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 18: 163168.

82. Hwang, C., Sinskey, A. J., Lodish, H. F. (1992) Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. Science 257: 1496-1502.

83. Illera, V., Perdandones, C., Stünz, L., Mower, D. & Ashman. (1993) Apoptosis in splenic B lymphocytes:regulation by protein kinase C and IL-4. J. Immunol. 151:3521-3526.

84. Jaenicke, R., Rudolf, R. (1989) Folding protein, pp.191-223. In: T. E/ Creighton (ed.), Protein structure, a practical approach. Oxford University Press, Oxford, UK.

85. Jonasson, P., Liljeqvist, S., Nygren, P-A., Stahl, S. (2002) Genetic design for facilitated production and recovery of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem. 35:91-105.

86. Kapust, R.B. and Waugh, D.S. (1999) Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sei. 8: 1668-1674.

87. Kavanaugh, J. S., Rogers, P. H., Arnone, A. (1992) High-resolution X-ray study of deoxy recombinant human hemoglobins synthesized from b-glo-bins having mutated amino termini. Biochemistry 31: 8640-8647.

88. Kenealy, W. R., Gray, J. E., Ivanoff, L. A., Tribe, D. E., Reed, D. L., Korant, B. D. and Petteway, S. R., Jr. (1987) Solubility of proteins overexpressed in Escherichia coli. Dev. Ind. Microbiol. 28: 45-52.

89. Kern, I., and Ceglowski, P. (1995) Secretion of streptokinase fusion proteins from Escherichia coli cells through the hemolysin transporter. Gene 163: 53-57.

90. Kimmenade, A., Bond, M. W., Schumacher, J. H., Laquoi, C., Kastelein, R. A. (1988) Expression, renaturation and purification of recombinant human interleukine 4 from Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 173:109-114.

91. Kitai, K., Kudo T., Nakamura, S., Masegi, T., Ichikawa, Y., and Horikoshi, K. 1988. Extracellular production of human immunoglobulin G Fe region (hlgG-Fc) by Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28: 52-56.

92. Kleerebezem, M. and Tommassen, J. (1993) Expression of the pspA gene stimulates efficient protein export in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 7: 947-956.

93. Laemmli, V.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

94. Lanzer, M., Bujard, H. (1988) Promoters largely determine the efficiency of repressor action. Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 8973-8977.

95. Lapchak, P.A., Gash, D. M., Jiao, S., Miller, P. J., Hilt, D. (1997) Glial cell line-derived neurotrophic factor: a novel therapeutic approach to treat motor dysfunction in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 144(1 ):29-34.

96. Lee, Y., Oelkuct, M., Gentz, R. Method for pyrifying chemokines from inclusion bodies. US patent 1999 591 12327.

97. Liew, O.W., Choo A.B-H., Too, H.P. (1997) Parameters influencing the expression of mature glial-cell-line-derived neurotrophic factor in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem. 25:223-233.

98. Lin, L-F.H., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S & Collins, F. (1993) GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260:1130.

99. Makrides, S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Reviews. 60:512-538.

100. Minas, W., and Bailey, J. E. (1995) Co-overexpression ofprlF increases cell viability and enzyme yields in recombinant Escherichia coli expressing Bacillus stearothermophilus a-amylase. Biotechnol. Prog. 11: 403-411.

101. Minsky, A., Summers, R. G., and Knowles, J. R. (1986) Secretion of beta-lactamase into the periplasm of Escherichia coli: evidence for a district release step associated with a conformational change. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:4180-4184.

102. Miroux, B., Walker, J. (1996) Over-production of protein in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J.Mol.Biol. 260: 289-298.

103. Mitchell, L., Davis, L. & Lipsky, P. (1989) Promotion of human T lymphocyte proliferation by IL-4. J. Immunol. 142:1548-1557.

104. Muller, J., Oehler, S., Muller-Hill, B. (1996) Repression of lac promoter as a function of distance, phase and quality of an auxiliary lac operator. J. Mol. Biol. 257:21-29.

105. O'Connor, C.D. and Timmis, K.N., (1987) Highly repressible expression system for cloning genes that specify potentially toxic proteins. J. Bacteriol. 169: 4457-4462.

106. Olins, P. O., Rangwala, S. H. (1990) Vector for enhanced translation of foreign genes in Escherichia col\. Methods Enzymol. 185: 115-119.

107. Olins, P. O., Rangwala, S. H. (1989) A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264: 16973-16976.

108. Olsen, M.K., Rockenbach, S.K., Curry, K.A., Tomich, C.-S.C. (1989) Enhancement of heterologous polypeptide expression by alterations in the ribosome-binding site sequence. J. Biotechnol. 9: 179-190.

109. Olson, P., Zhang, Y., Olsen, D., Owens, A., Cohen, P., Nguyen, K., Ye, J-J., Bass, S., Mascarenhas, D.(1998) High-level expression of eukaryotic polypeptides from bacterial chromosomes. Protein. Expr. Purif. 14:160-166.

110. Omer, C. A., Diehl, R. E., Krai, A. M. (1995) Bacterial expression and purification of human protein prenyltransferases using epitope-tagged, translationally coupled systems. Methods Enzymol 250: 3-12.

111. Ozawa, K., Fan, D.S., Shen, Y., Muramatsu, S., Fujimoto, K., Ikeguchi, K., Ogawa, M., Urabe, M.,Kume, A., Nakano, I. (2000) Gene therapy of Parkinson's disease using adeno-associated virus (AAV) vectors. J. Neural. Transm. Suppl. 58:181 -191.

112. Pe'rez-Pe'rez, J., G. Ma'rquez, J.-L. Barbero, and J. Gutie'rrez. (1994) Increasing the efficiency of protein export in Escherichia coft. Bio/Technology 12: 178-180.

113. Peredelchuk, M. Y., Bennett, G. N. (1997) A method for construction of E. coli strains with multiple DNA insertions in the chromosome. Gene 187:231238.

114. Phadtare, S., Alsina, J., Inouye, M. (1999) Cold-shock response and cold-shock proteins. Curr. Opin. Microbiol. 2: 175-180.

115. Poole, E. S., Brown, C. M., and Tate, W. P. (1995) The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. EMBOJ. 14: 151-158.

116. Proba, K., Ge L. M., Pluckthun, A. (1995) Functional antibody single-chain fragments from the cytoplasm of Escherichia coli: influence of thioredoxin reductase (TrxB). Gene 159: 203-207.

117. Pryor, K.D. and Leiting, B. 1997. High level expression of soluble proteins in Escherichia coli using a His6-tag and maltose-binding protein double-affinity fusion system. Protein Expr. Purif10: 309-319.

118. Przybycien, T.M., Dunn, J.P., Valax, P., Georgiou, G. (1994)Secondary structure characterization of p-lactamase inclusion bodies. Protein Eng. 7:131-137.

119. Pugsley, A. P. and Schwartz, M. (1985) Export and secretion of proteins by bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32: 3-38.

120. Ramer, M.S., Priestly, J.V. & McMahon, S. B. (2000) Functional regeneration of sensory axons into the adult spinal cord. Nature 403:312-316.

121. Richardson, J.P. and Greenblatt, J. (1996) Control of RNA chain elongation and termination, p. 822-848. In F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin K.B.Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley M. Schaechter and H.E. Umbarger.

122. Ringquist, S., Shinedling, S., Barrick, D., Green L., Binkley, J., Stormo, G.D., Gold, L. (1992) Translation initiation in Escherichia coli: sequence within the ribosome-binding site. Mol.Microbiol. 6: 1219-1229.

123. Rudiger, S., Germeroth, L., Schneider-Mergener, J., Bukau, B. (1997) Substrate specificity of the DnaK chaperone determined by screening cellulose-bound peptide libraries. EMBO J. 16: 1501-1507.

124. Russell, D., R., Bennett, G. N. (1982) Construction and analysis of in vivo activity of E. coli promoter hybrids and promoter mutants that alter the -35 to -10 spacing. Gene 20(2):231-243.

125. Sachdev, D. and Chirgwin, J.M. (1998) Order of fusions between bacterial and mammalian proteins can determine solubility in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 933-937.

126. Sagava, H., Ohshima, A., Kato I. (1996) A tightly regulated expression system in Escherichia coli with SP6 RNA polymerase. Gene 168: 37-41.

127. Sambrook, J., Fritsch E., Maniatis T.// Molecular cloning. A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor, 1989.

128. Sandman, K., Grayling, R. A., Reeve, J. N. (1995). Improved N-terminal processing of recombinant proteins synthesized in Escherichia coli. Bio/Technology 13: 504-506.

129. Sanger, F.,Nicklen, S., Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 74:5463-5467.

130. Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996) Common principles of protein translocation across membranes. Science 271: 1519-1526.

131. Schauder, B., McCarthy, J. E. G. (1989) The role of bases upstream of the Shine-Dalgarno region and in the coding sequence in the control of geneexpression in Escherichia coli: translation and stability of mRNAs in vivo. Gene 78: 279-283.

132. Schein, C. H. (1991) Optimizing protein folding to the native state in bacteria. Curr. Opin. Biotechnol. 2:746.

133. Schein, C. H. (1993) Solubility and secretability. Curr. Opin. Biotechnol. 4: 456—461.

134. Schumperli, D., McKenney, K., Sobieski, D.A., Rosenberg, M. (1982) Translation coupling an intercistronic boundary of the Escherichia coli galactose operon. Cell 30: 865-871.

135. Scolnik, E., R. Tompkins, T. Caskey, and M. Nirenberg. (1968) Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 61:768-774.

136. Sharp, P. M., and Bulmer, M. (1988) Selective differences among translation termination codons. Gene 63:141-145.

137. Shine, J., and L. Dalgarno (1974) The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71: 1342-1346.

138. Siegele, D.A. and Hu, J.C. (1997) Gene expression from plasmids containing the araBAD promoter at subsaturating inducer concentrations represents mixed populations. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 94: 8168-8172.

139. Skerra, A. (1993) Bacterial expression of immunoglobulin fragments. Curr. Opin. Immunol. 5: 256-262.

140. Snyder, W. B. and Silhavy, T. J. (1992) Enhanced export of b-galactosidase fusion proteins in prlF mutants is Lon dependent. J. Bacteriol. 174:5661-5668.

141. Sorg, R.V., Enczmann, J., Sorg, U.R., Schneider E.M, Wernet, P. (1993) Identification of an alternatively spliced transcript of human interleukin-4 lacking the sequence encoded by exon 2. Exp. Hematol. 21:560-563.

142. Sprengart, M. L., Fuchs, E., Porter, A. G. (1996) The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli. EMBOJ. 15: 665-674.

143. Stanssens P., Remaut E., Fiers W. (1985) Alterations upstream from the Shine-Dalgarno region and their effect on bacteral gene expression. Gene 36: 211-223.

144. Sugimoto, S., Yokoo, Y., Hatakeyama, N., Yotsuj, A., Teshiba, S., and Hagino, H. (1991) Higher culture pH is preferable for inclusion body formation of recombinant salmon growth hormone in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 13: 385-388.

145. Summers, D. (1998) Timing, self-control and a sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability. Mol. Microbiol. 29:1137-1145.

146. Swartz, R. (2001) Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr. Opin. Biotechnol 12:195-201.

147. Tagawa A, Kashima R, Kaneda K, Nakayama M, Ono S, Shimizu N. (2000) Polymyositis successfully treated with surgical resection of colon cancer. Eur Neurol. 44(4):251-252.

148. Tate, W. P., and C. M. Brown. (1992) Translational termination: "stop" for protein synthesis or "pause" for regulation of gene expression. Biochemistry 31: 2443-2450.

149. Tessier, L.-H., Sondermeyer, P., Faure T., Dreyer, D., Benavente, A., Villeval, D., Courtney, M., Lecocq, J.-P. (1984) The influence of mRNA primary and seconary structure on human IFN-y gene expression in E.coli. Nucleic Acids Res. 12: 7663-7675.

150. Thomas, C.D., Modha, J., Razzaq, T.M., Cullis, P.M., Rivett, A.J. (1993) Controlled high-level expression of the Ion gene of Escherichia coli allows overproduction of Lon protease. Gene 136: 237-242.

151. Thomas, J.G., Ayling, A., Baneyx, F. (1997) Molecular chaperones, folding catalysis and the recovery of active recombinant proteins from E.coli: to fold or to refold. Appl. Biochem. Biotechnol. 66: 197-238.

152. Tocatlidis, K., Dhurjati, P., Millet, J., Beguin, P., Aubert, J.-P. (1991) High activity of inclusion bodies formed in Escherichia coli overproducing Clostridium thermocellum endoglucanase D. FEBSLett. 282:205-209.

153. Tolentino, G.J., Meng, S.-Y., Bennet, G.N., San, K.-Y. (1992) A pH-regulated promoter for the expression of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Letters. 14: 157-162.

154. Tsung, K., Inouye, S., Inouye, M. (1989) Factors affecting the efficiency of protein synthesis in Escherichia coli. Production of a polypeptige of more than 6000 amino acid residues. J. Biol. Chem. 264: 4428-4433.

155. TzarevaN. V., Makhno V. I., Boni I. V. (1994) Ribosome-messenger recognition in the absence of the Shine-Dalgarno interactions. FEBS Lett. 337: 189-194.

156. Varshavsky, A. (1996) The N-end rule: Functions, mysteries, uses. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93: 12142-12149.

157. Vasina, J. A., Peterson, M. S., Baneyx, F. (1998) Scale-up and optimization of the low-temperature inducible cspA promoter system. Biotechnol. Prog. 14:714-721.

158. Voskuil, M.I. and Chambliss, G.N. (1998) The -16 region of Bacillus subtilis and other gram-positive bacterial promoters. Nucl. Acids Res. 26: 3584-3590.

159. Warne, S.R., Thomas, C.M., Nugent, M.E., Tacon, W.C.A. (1986) Use of modified Escherichia coli trpR gene to obtain tight regulation of high-copy number expression vectors. Gene 46: 103-112.

160. Wier, U., Sparks, J. (1987) Purification and renaturation of recombinant human interleukine-2. Biochem. J. 245:85-91.

161. Wilhelm, O. G., Jaskunas, S. R., Vlahos, C. J., Bang, N. U. (1990) Functional properties of the recombinant kringle-2 domain of tissueplasminogen activator produced in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265:14606-14611.

162. Wilkinson, D. L. and Harrison, R. G. (1991) Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology 9: 443-448.

163. Williams, S. G., Cranenburgh, R. M., Weiss, A-M. E., Wrighton, C. J., Sheratt, D. J., Hanak, J. J. (1998) Repressor tiyration: a novel system for selection and stable maintenance of recombinant plasmids. Nucleic Acids Res. 26:2120-2124.

164. Wong, H. C., and S. Chang. March (1990) 39-Expression enhancing fragments and method. U.S. patent 4,910,141.

165. Yabuta, M., Onai-Miura, S., Ohsuye, K. (1995) Thermo-inducible expression of a recombinant fusion protein by Escherichia coli lac repressor mutants. J. Biotechnol. 39: 67-73.

166. Yamamoto, T., and F. Imamoto. (1975) Differential stability of trp messenger RNA synthesized originating at the trp promoter and pL promoter of lambda trp phage. J. Mol. Biol. 92: 289-309.

167. Yasueda, H., Nagase, K., Hosoda, A., Akiyama, Y., Yamada, K. (1990) High-level direct expression of semi-synthetic human interleukine-6 in Escherichia coli. And production of N-terminus Met-free product. Bio/Technol. 8:1036-1040.

168. Yasukawa, T., Kaneiishii, C., Maekawa, T., Fujimoto ,J., Yamamoto, T. And Ishii, S. (1995) Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem. 270: 2532825331.

169. Zav'yalov, V.P., Denesyuk, A. I., White, B., Yurovsky, V. V.,Atamas, S. P., Korpela, T. (1997) Immunol. Lett. 58:149-152.

170. Zhang, S., G. Zubay, and E. Goldman. (1991) Low usage codons in Escherichia coli, yeast, fruit fly and primates. Gene 105: 61-72.

171. Zhang, Y., Olsen, D.R., Nguyen, K.B., Olson, P.S., Rhodes, E.T., Mascarenhas, D. (1998) Expression of eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 12: 159-165.

172. Zum, A.D., Widmer, H.R., Aebischer, P. (2001) Sustained delivery of GDNF: towards a treatment for Parkinson's disease. Brain Res. Rev. 36:222229.

173. Альтман И.Б., Птицын JI.P., Смирнов C.B., Калужский B.E., Машко C.B. (1997) Создание штамма-продуцента рекомбинантного у-интерферона быка, пригодного для эффективного биотехнологического производства. Биотехнология №11-12, С. 3-13.

174. Дебабов В. Г., Жданова Н. И. И др. Штаммы Е. coli ВНИИГенетика VL 334(pYN7) и ВНИИГенетика VL. 334(pYN6) продуценты L -треонина и способ их получения: Заявка № 4191345/13 СССР. 1979.

175. Егорова В.Н., Смирнов М.Н. (1999) Новые возможности иммунотерапии с использованием Ронколейкина в рекомбинантного интерлейкина-2 человека. Terra Medica, 2:15.

176. Кулагина M. А., Скапцова Н. В., Батчикова Н. В., Куркин А. Н., Ажаев А. В. (1990) Н-фосфатный метод в синтезе структурного гена интерлейкина-4 человека. Биоорганическая химия 16(5):625-629.

177. Машко C.B., 1998. Оптимизация экспрессии чужеродных генов в клетках E.coli. Биотехнология 6:3-23.

178. Птицын Л.Р., Альтман И.Б. (1995) Рекомбинантные штаммы Escherichia coli, обеспечивающие высокий уровень экспрессии интерлейкина-3 и интерлейкина-4 человека. Новые медицинские технологии 59(1):83-85.

179. Птицын Л.Р., Смирнов C.B., Альтман И.Б., Самсонова H.H., Ходякова A.B., Василенко Р.Н. (1999) Продукция рекомбинантного hIL-452 -природной изоформы интерлейкина-4 человека, в клетках Escherichia coli. Биоорганическая химия 25(8):623-628.

180. Стронгин А. Я. (1990) Молекулярно-биологические основы структурно-функциональных особенностей белков — продуктов гетер олотичного микробного синтеза.// Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. Москва, Наука, с. 240.

Информация о работе

Смирнов, Сергей Васильевич
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.03

Диссертация

Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 δ2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы