Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека

Рафиева, Лола Маратовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека"

Па правах рукописи

РАФИЕВА Лола Маратовна

ФОЛДИНГ РЕКОМБИНАНТНЫХ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ЧЕЛОВЕКА

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата химических наук

«1111111113

003482728

Москва - 2009

Работа выполнена в лаборатории белковой инженерии Отдела молекулярно-генетических основ биотехнологии и белковой инженерии Учреждения Российской академии паук Института молекулярной генетики РАН.

I Гаучный руководитель: член-корреспондент РА11,

профессор, доктор химических паук Костров Сергей Викторович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Готтих Марина Борисовна

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский

институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится «30» ноября 2009 г. в 15 ч па заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии топкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 119571, Москва, проспект Вернадского, 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.

Автореферат разослан 4хЬ 009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук ^Се^д Лютик Алла Игоревна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования: Пейротрофииы - семейство факторов роста, играющих важную роль в регуляции развития и функционирования центральной и периферической нервной системы. На сегодняшний день для человека описано четыре представителя данного семейства - фактор роста нервов NGF, иейротрофический фактор головного мозга BDNF, а также нейротрофичсскис факторы NT-3 и NT-4/5. При этом наиболее значимыми для развития нервной системы являются первые три нейротрофичсских фактора, что делает их важными объектами различных биомедиципских исследований.

Нсйротрофины синтезируются в клетках в виде предшественников -препроисйротрофшюв, имеющих в своем составе сигнальный пептид, N-концевую пропоследовательность и, собственно, зрелую часть, которая, как полагали долгое время, и обладает всеми биологическими свойствами, описанными для данных факторов роста. Роль пропептида не установлена и активно исследуется во многих лабораториях. Есть основания полагать, что про-часть нейротрофипов может служить внутримолекулярным шапероном и определять фолдинг молекулы пейротрофипа.

Недавно было показано, что клетками секретируготся не только зрелые, нроцсссированиые, нсйротрофины, но и их предшественники - пронейротрофипы. При этом происйротрофины, как было показано, обладают биологической активностью. Известно, что в некоторых случаях проформы исйротрофшюв могут запускать механизм клеточной смерти. Таким образом, пронейротрофипы и зрелые белки способны оказывать противоположные эффекты на клетки, а процеесинг, в таком случае, может служить своего рода механизмом регуляции функциональной активности нейротрофичсских факторов.

Имеющаяся на данный момент совокупность данных свидетельствует о том, что изучение предшественников нейротрофипов необходимо для понимания механизмов функционирования нервной системы человека в норме и при патологии и является важным направлением в современных биологических науках.

Цели исследования: Целью данной работы являлось изучение вовлеченности пропоследователышстей в формирование биологически активных молекул нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.

Научная нопизиа: Впервые проведено комплексное сравнительное исследование фолдинга нейротрофичсских факторов человека с использованием предшественников нейротрофипов NGF и BDNF, их индивидуальных зрелых форм и пропоследоватслыюстей. При этом в данной работе впервые осуществлен фолдинг зрелого NGF в присутствии несвязанного ковалептной связью природног о пропептида (фолдинг в системе in Irans). Показано, что природный пропептид способен существенно повышать эффективность

образования биологически активного NGF, причем наличие ковапептной связи между зрелым белком и пропептидом не является необходимым. Таким образом, в данной работе получены доказательства про-зависимого фолдинга нейротрофииа NGF. Впервые осуществлен фолдипг нейротрофииа NGF в присутствии не связанной ковалентной связью чужеродной пропоследователыюсти (пропептида BDNF) и показано, что пропептид BDNF способен направлять фолдипг зрелого NGF. Впервые показапо, что пропептид BDNF не оказывает существенного влияния на образование биологически активного нейротрофииа BDNF и, по-видимому, фолдипг данного нейротрофииа не является про-зависимым. Показапо, что индивидуальные пропоследователыюсти пейротрофипов NGF и BDNF в растворе образуют стабильную димерную форму. Также показано отсутствие дифференцирующего и пролиферативного действия пропептидов па культуры клеток феохромоцитомы крысы РС12 и эритролейкемии человека TF-1.

Практическая значимость: Получение новых данных о механизмах фолдинга нейротрофических факторов открывает большие перспективы в конструировании пейротрофипов с модифицированными свойствами, в том числе на базе одной аминокислотной последовательности. Это может помочь в исследовании взаимодействия нейротрофических факторов с тирозинкиназными рецепторами (ТгкЛ, ТгкВ и ТгкС), рецептором р75 и сортилином. Препаративное получение очищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF (предшественников, индивидуальных зрелых пейротрофипов и индивидуальных пропептидов), отработанное в данной работе, позволит использовать данные белки при разработке и создании тест-систем для детектирования пропейротрофинов, пейротрофипов и, вероятно, пропептидов в различных биологических жидкостях (крови, спинномозговой жидкости и т.д.), что может быть широко использовано в диагностике и исследовании целого ряда нейродегеперативпых заболеваний. Положения, выносимые на защиту:

• Конструирование рекомбипаптных продуцентов различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей.

• Получение высокоочищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.

• Разработка системы анализа эффективности фолдинга различных форм пейротрофипов.

• Анализ биологической активности полученных нейротрофических факторов.

• Исследование наличия шапероноподобной функции пропептидов при фолдинге пейротрофипов NGF и BDNF.

• Исследование влияния пропсптида па биологическую активность сформировавшегося зрелого нейротрофина NGF.

• Исследование собственной биологической активности индивидуальных пропептидов. Публикации и апробация работы: По результатам диссертационной работы опубликована одна статья в рецензируемом научном журнале. Результаты исследования были доложены на VI симпозиуме «Химия протсолитичсских ферментов» (Москва, 2007), III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), 11 и 12 Пущипских школах-конференциях молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), IV и V международных междисциплинарных конгрессах «Нсйронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008, 2009), IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), а также па семинаре Лаборатории белковой инженерии ИМГ РАН и па заседании кафедры Биотехнологии и бионапотехпологии Московской государственной академии топкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, посвященного функциональным особенностям псйротрофичсских факторов, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (225 ссылок). Диссертация изложена па 162 страницах и содержит 59 рисунков, 20 таблиц.

Выполнение работы проводилось в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки но приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (2009), профаммы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (2009) и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№№ грантов 06-04-48678-а, 06-04-48690-а, 09-04-00734-а, 09-04-00870-а).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Конструирование рекомбипаптпых продуцентов нейротрофинов человека

1.1. Клонирование генов нейротрофинов NGFu BDNF человека Первым этапом работы явилось клонирование генов нейротрофических факторов NGF и BDNF. В качестве вектора была выбрана плазмида pUC19.

Проанализировав имеющиеся в базе данных «Gene Bank» NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov] пуклеотидные последовательности генов NGF и BDNF человека, нами были подобраны праймеры для получения ПЦР-амплификатов, кодирующих полноразмерные предшественники этих нейротрофинов (Таб. 1).

Таб. 1. Последовательности олигонуклеотидных приймеров, использованных в работе.

Обозначение праймера Нукпеотидная 5'->3' последовательность праймера

NGF-52 TGCAGTCCAAGGGGCTGG

NGF-99 CGTCCGGACCCAATAACAGT

NGF-920 GCCCAGGAGAGTGTAGAAGG

NGF-923 GCCCAGGAGAGTGTAGAAGG

F1 ATACAGGCGGAACCACACTC

R1 TGCTCCTGTGAGTCCTGITG

I1I1NI-S1 rrrCGGGGAGTGG'lTGGG

BIÍNF-76 TGGGGGATrcn'GAC'I CG

UDNF-1067 AC I'G ГП'СССП'С'1 GG'l'CAT

F2 TAGTGAGTGGGTAACGGCGG

R2 CTATCCTrATGAATCGCCAGC

NGF-r2 'nTrAC¡ATC_r7T/ÍGTGATGC;TGATGGTGATGGGCrC1TCICACAGC

NGF-I3 GGCATACATATGGAACCACACTCAGAGAG

NGF-H ATCACACATATGCATCACCATCACCATCACGAACCACA CTCAGAGAG

NGF-r5 AAAAGAATI C7T/(CCGC'['I GCTCCTGI'GAG

NGF-Гб AGGAGCCATATGTCATCATCCCATCCCATCTI'C

UI)NF-r2 ATA'I'AAGAATI Cr7MATGGTGATGGTGATGGTG I CTrCCCC'l'rrrAATGG ICAAIG

BDNF-13 AAAAAACA l'A'l GfiCCCCCATGAAAGAAGCAAACATC

BDNF-M GTTATI'CATATGCATCACCATCACCATCACGCCCCCATGAAAGAAGC

BI)NF-rS GGCAGGGAATI'C77XGCGCCGGACCCTCATGG

ltDNF-Гб AAAAAACATATGCACTCTGACCCTGCCCG

M13/pUC direct ATACAGGCGGAACCACACTC

M 13/pUC reverse TGCTCCTGTGAGTCCTGITG

pET23-l TAATACGACTCACTATAGG

PET23-2 GGCGACTCGITATTGATCO

* Жирным шрифтом выделены области, кодирующие шестигистидиповые последовательности, подчеркиванием - сайты, расщепляемые соответствующими рестриктазами (('ата к! - сайт Ше1, ОААТТС -сай г АСЛТСТ - сайт #£/11), курсивом отмечены стоп-кодоны.

Для получения амплификата, кодирующего полпоразмерпый предшественник нейротрофина человека NGF, использовали праймеры NGF-52, №СР-99, ЖН'-920 и NGF-923, для получения фрагмента, кодирующего нейротрофический фактор В0№, - BDNF-51, BDNF-76 и ВОМЧ()67 (Таб. 1).

Наработку амплификатов, кодирующих препронейротрофины N01'' и В0№, проводили в два этапа. На первом этапе для получения амплификатов в качестве матрицы использовали кДНК, полученную с мРНК из мозжечка человека (была любезно предоставлена

С.Л. Лимборской (ИМГ РАН)), и одну из пар подобранных нами праймсров -NGF-52 и NGF-923 (дня получения гена рскомбилангного NGF) и BDNF-51 и UDNF-1067 (для получения гена рекомбипантного BDNF). Продукты реакции амплификации анализировали электрофоретически, после чего фрагменты нужной длины экстрагировали из геля и использовали в качестве матрицы на следующем этапе ПЦР. При этом для получения амплификата, включающего ген NGF, использовали праймеры NGF-99 и NGF-920, для амплификата, содержащего ген BDNF, - BDNF-76 и BDNF-1067. После электрофоретического анализа продуктов ПЦР целевые фрагменты экстрагировали из геля и клонировали в вектор pUC19, линеаризованный по сайту распознавания рестриктазы Hirtel]I. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки штамма Е. coli XL-1 с последующим их высевом на селективную питательную среду, содержащую ампицилин, X-gal и ИПТГ. Первичный отбор клонов проводили по неспособности клеток расщеплять X-gal. Отобранные таким образом клоны анализировали трехстадийным ПЦР-апализом. При этом для анализа наличия в составе плазмиды pUC19 вставки, кодирующей ген NGF, использовали праймеры M13/pUC direct и M13/pUC reverse (1)*, NGF-99 и NGF-920 (2), Fl и R1 (3). Для ПЦР-апализа вставки, кодирующей ген BDNF, использовали праймеры BDNF-76 и BDNF-1067 (1), F2 и R2 (2), BDNF-f6 и BDNF-1067 (3) (Таб. 1). Результаты каждой стадии ПЦР-анализа клонированных фрагментов анализировали электрофоретически. Из отобранных после трех аналитических реакций амплификации клопов были выделены плазмиды, нуклеотидную последовательность клонированных фрагментов в которых подтверждали секвснированием.

В результате проведенной работы нами были клонированы гены прспропейротрофипов человека NGF и BDNF. Полученные плазмиды были названы pUC NGF и pUC BDNF, соответственно.

1.2. Конструирование рекомбинантных штаммов-продуцентов различных вариантов нейротрофипов NGF и BDNF человека

Для последующих экспериментов по установлению роли пропослсдователыюстей нейротрофипов NGF и BDNF в фолдинге этих молекул нам необходимо было получить следующие варианты исследуемых нейротрофичсских факторов: предшественники, имеющие в своем составе пропеитид, а также индивидуальные про- и зрелые части.

Для экспрессии целевых белков нами была использована система Е. coli BL-21(DE3-X). В качестве вектора, в который в дальнейшем было осуществлено клонирование ДНК-фрагментов, кодирующих различные варианты нейротрофипов, была использована экспрсссионпая плазмида рЕТ-23с. Для упрощения дальнейшей процедуры очистки было

Н скобках после нары праймсров указывается стадия 11ЦР-анализа.

-7-

решено ввести в состав всех белков шестигистидиновую метку (H¡S6-Tag), что позволило бы нам в дальнейшем использовать метод аффинной хроматографии на металлкоординированном (№) сорбенте. Введение H¡S6-Tag осуществляли методом ПЦР, используя праймеры, включающие последовательности, кодирующие шесть остатков гистидина. Для удобства последующего клонирования все полученные в дальнейшем методом ПЦР фрагменты были ограничены сайтами распознавания эндонуклеаз рестрикции (Таб. 1,Рис. 1).

Первым этапом работы стало получение амплификатов, кодирующих различные области нейротрофических факторов NGF и В1)М' (Таб. 2, Рис. 1). В качестве матрицы были использоваиы полученные нами ранее плазмиды риСЖИ'' и р1_1С_В[)№.

Таб. 2. Обозначения ДНК-фрагментов, кодирующих различные варианты нейротрофинов NGF и 8DNF человека и полученных в результате ПЦР с подобранных праймеров.

Название ДНК-фрагмента, полученного в результате ПЦР с плазмиды рЮС ^вР или РиС ВОР*Т Размер ДНК-фрагмента, П. П. Белок, кодируемый ДНК-фрагментом

714 Иролсйротрофил NGF, несущий 1Пз6-Та§ на карбокси-копцс молекулы

402 Зрелая часть несущая И18б-Та8 на карбокси-копцс молекулы

ОМСГр 357 Иро-часгь ЫСИ, несущая па амипо-коцце молекулы

732 Пропсйротрофип ВРЫР, несущий Ilis6-Tag на карбокси-копцс молекулы

375 Зрелая часть ВОЫР, несущая 1113б-Тад на карбокси-копцс молекулы

D_BDNFp 402 Про-часть ПОМ!", несущая Шз6-Тай на амино-коице молекулы

Все полученные продукты амплификации были обработаны соответствующими эпдопуклеазами рестрикции (Ше1 и Ду/П - ДНК-фрагменты 0_рЫС17 и ОМОРт, Ше\ и ЕсоЯI - ДНК-фрагмепты I) ЫОГр, I) рШЭЫГ, ПВПЫГт и ОВПМ'р) (Рис. 1) и клонированы в плазмиду рЕТ-23с. При этом фрагменты О_рЫ0Р и 0>ЮРт клонировали в вектор рЕТ-23с по сайтам ЛУс'1 и ВатН\, все остальные ДНК-фрагмепты клонировали по сайтам ШсЛ и ЕсоИI. Далее лигазные смеси обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Ват\ II и полученными рестриктными смесями трансформировали клетки Е.соЦХ Ь-1 с последующим высевом их на твердую питательную среду в присутствии ампицилина.

Наличие целевых генов в составе рекомбинантных плазмид определяли двухстадийным ПЦР-апализом, используя на первой стадии праймеры рЕТ23-1 и рЕТ23-2. Отобранные после первой стадии клопы анализировали с применением праймеров, использованных для получения соответствующих амплификатов (Таб. 1, Рис. 1). Нуклеотидная последовательность всех клонированных фрагментов была подтверждена секвенированием.

А.

риокзр

риС_ВОЛР

в.

1 ПЦР |с пр>1ысро« ♦ О-й ' ПЦР ПЦР с вр(1шро> I с пр*1мсро1 Г4-г5 г К-й ' ПЦР с праДмсро! О -г2 ' ПЦР ПЦР с прайшрю 1 с примере» Г4-г5 ♦ (6-й '■ 2 * *

,Мг\ Есо\и.

I РМСТ | погост ^Ц §|]иПй1гт> I

|Послсдатхиость, всщфующи сагшыш! пси 1 яд

□

Поииюмпшюсп, пи^ипи про&еппд

I—I Посдсдоитсхиосгъ, ' кодхрующи |рслую часть

ОПосаедоитииосте, вуифующи

Рис. 1. А. Схема получения амплификатов, кодирующих различные варианты нейротрофинов А'СГ (I.) и ВПУР (2.) человека. г2, г5, В, f4 И Г6 - праймеры, приведенные в Таб. 1. Стрелками указаны соответствующие сайты рестрикции.

В. Электрофоретический анализ ПЦР-фраглттов, кодирующих различные варианты нейротрофического фактора ВОИР. 1 - продукт ПЦР, полученный с праймеров 1ШЫК-(3 и В[ЖР-г2, 2 - маркер длин фрагментов 100-1000 п.н. 3 - продукт ПЦР, полученный с праймеров ЕШОТ-Г4 и £ШОТ-г5, 4 - продукт ПЦР, полученный с праймеров ВОЫР-Г6 и ВО№-г2.

Таким образом, на основе вектора рЕТ-23с нами были получены конструкции, обеспечивающие синтез различных форм нейротрофинов NGF и BDNF человека с шестью остатками гистидина на одном из концов. Их обозначения представлены в Таб. 3. Все полученные плазмиды были введены в штамм Е. coli BL-21, что позволило осуществить экспрессию исследуемых белков в клетках кишечной палочки.

Таб. 3. Сконструированные рекомбинантные векторы, определяющие биосинтез различных вариантов нейротрофинов NGF и ПОЫГ человека.

Название вектора Белок, экспрессия которого определяется данным вектором

pETpNGF Пронейротрофин ЫСИ, несущий Н15б-Та£ на карбокси-конце молекулы

pETNGFm Зрелая часть N0?, несущая ШБ6-Та£ на карбокси-конце молекулы

pETNGFp Про-часть ЫвР, несущая HiS()-Tag на амино-конце молекулы

pETpBDNF Пронейротрофин ВОЫР, несущий His6-Tag на карбокси-конце молекулы

pETBDNFm Зрелая часть ЕШЫР, несущая Шз6-Та§ на карбокси-конце молекулы

pETBDNFp Про-часть несущая Швб-Та£ на амино-конце молекулы

2. Получение различных вариантов нейротрофинов NGF и BDNF человека

2.1. Биосинтез целевых белков в клетках Е. coli BL-21 Культуры клеток, несущие плазмиды pETpNGF, pETNGFm, pETNGFp, pETpBDNF, pETBDNFm, pETBDNFp, растили в жидкой питательной среде до OD600 = 0,4 - 0,8. Далее индуцировали экспрессию целевых белков добавлением к клеточной культуре ИПТГ и анализировали динамику клеточного роста, а также уровень накопления рекомбинантных нейротрофических факторов в клетках штамма-продуцента (Рис. 2). На различных стадиях роста культур отбирали аликвоты клеточной суспензии для определения уровня накопления целевых белков. Наличие нейротрофических факторов в клетках определяли методом SDS-электрофореза.

- Рис. 2. Электрофоретическии анализ накопления

|В ^ M 2 пропептида неиротрофина NGF в клетках

^^Я^^Н Е. coli BL-21. - стандарты молекулярных масс

^К^ ——* 'ЖЦЦ^Ё ШШ АЕ (кДа), 2 - внутриклеточные белки штамма до

^К: ЯВ ЯШ индукции, 3 - 7 - накопление целевого белка после

; индукции через 1, 2, 3, 4 и 5 час, соответственно.

Полоса, соответствующая целевому белку, указана Щ^ШШШ^ стрелкой.

Далее клетки Е. coli BL-21 дезинтегрировали ультразвуком, после чего анализировали содержание целевых белков в получаемых клеточных фракциях электрофоретически. Показано, что все проформы и зрелые части нейротрофинов по результатам электрофореза накапливались в нерастворимой фракции, по-видимому, в телах включения, тогда как пропоследовательности содержались большей частью в растворимой фракции - 80 - 90% (пропептид NGF) и 65 - 75% (пропептид BDNF) (Рис. 3, 1 ). Из нерастворимой фракции белки экстрагировали раствором 8 M мочевины. Как видно из представленной электрофореграммы

" Оптическая плотность клеточной суспензии при длине волны 600 нм.

- 10-

(Рис. 3, 2), белок переходил в раствор практически полностью. Таким способом с достаточно высоким выходом были получены следующие белки: проформы пейротрофипов N0? и ВОЫГ и зрелые части данных факторов роста, а также нропептид содержащийся в

нерастворимой фракции. Для получения про-части N01' была использована растворимая фракция, из которой данный белок количественно переводился для дальнейшей работы диализом в буфер, содержащий 8 М мочевины. Аналогичным образом из растворимой фракции получали в денатурированной форме и пропептид ВГ)Ы1\

66—» -.....- - - .....а ? г--1 , 66

45 шшж I 45

36 ^^ : :r _w|m|| ^ ZZ Z Щ ! * 36

«»>»«» 24

20 #мчЬ 4_ 20

] 4 -Tf:mi

4 5 6 7 1 2 3 4 5

Рис. 3. /, Распределение различных форм нейротрофического фактора NGF между клеточными фракциями штамма-продуцента Е. coli IiL-21. 1 - стандарты молекулярных масс (кДа), 2, 4, 6 - растворимая фракция штаммов, несущих плазмиду pETpNGF, pETNGFm и pETNGFp, соответственно; 3, 5, 7 — нерастворимая фракция штаммов, несущих плазмиду pETpNGF, pETNGFm и pETNGFp, соответственно.

2. Экстракция проформ пейротрофипов из нерастворимой клеточной фракции. 1 - стандарты молекулярных масс (кДа), 2-3 - предшественник NGF, 4-5 - предшественник BDNF до и после экстракции раствором мочевины, соответственно. Полосы, соответствующие целевым белкам, указаны стрелкой.

Таким образом, нами была осуществлена эффективная экспрессия различных форм

пейротрофипов NGF и BDNF человека (Таб. 4). Определена локализация целевых белков в

клеточных фракциях штамма-продуцента. Показано, что предшественники и зрелые части

данных пейротрофипов накапливаются в нерастворимой фракции, тогда как про-части

локализованы большей частью в растворимой.

Таб. 4. Продукция целевых белков. Приведен средний выход с 1 л культуры штамма-продуцента Е. coli BL-21. В каждом случае оценивалось количество белка, перешедшего в раствор 8 М мочевины.

Щтттк

ттттщ,

тттт-

ШШШк 1 2

Белок Продукция белка, мг/л клеточной культуры

Предшественник NGF (proNGF) 90-115

Зрелая часть NGF (NGFmal) 12-20

Пропептид NGF (NGFpro) 100- 125

Предшественник BDNF (proBI)NF) 120- 150

Зрелая часть BDNF (BDNFmat) 35-40

Пропептид BDNF (BDNFpro) 120-140

2.2. Получение высокоочищенпых препаратов различных вариантов пейротрофипов N01'' и В1)ЫГ человека

Далее необходимо было получить все целевые белки в высокоочищенном состоянии.

Наличие в составе каждого варианта нейротрофинов дополнительной шсстигистидиновой

последовательности (на Ы-концах про-частей и на С-концах предшественников и зрелых

пейротрофипов) позволило нам использовать металло-хелат аффинную хроматографию

(МХАХ) па №-НТК (никель-нитрилотриуксусиая кислота) агарозе. Десорбцию целевого

белка проводили повышением кислотности элюирующего буфера. В качестве примера на Рис. 4 приведены данные по очистке предшественника нейротрофина BDNF. Фракции, получаемые после элюции буфером рП 4,5, объединяли и использовали в экспериментах по фолдингу.

^Рис. 4. Электрофоретический анализ фракций, полученных

36после очистки предшественника BDNF с помощью МХАХ.

28_ 1 стандарты молекулярных масс (кДа); 2 — несвязавшийся

с сорбентом белок; элюция (элюируемые с Ni-ИТК-агарозы фракции): 3 - рН 8; 4-5 - рП 6,3; 6-7 - рП5,9; 8-9 -14 РП4,5.

Таким образом, применение МХАХ позволило получить нам все целевые белки -проформы пейротрофииов NGF и BDNF, их зрелые и про-части - в высокоочищенном состоянии со степенью чистоты 90-95% (по данным анализа электрофореграмм). Выход целевого белка при использовании данного метода очистки составил примерно 40%.

3. Фолдинг рекомбинантных иейротрофических факторов NGF и BDNF человека

Фолдипг белков, содержащих цистиновые связи, in vitro является методически сложной задачей и требует тщательного подбора условий. При разработке условий фолдинга полученных нами рекомбипаптпых иейротрофических факторов мы учитывали общие рекомендации по ренатурации различных белков, а также имеющиеся литературные данные по фолдингу нейротрофинов [Suenaga M. et al, 1998; Rattcnholl Л. et al, 2001 ; Rattenholl A. et al, 20011. При этом мы варьировали различные параметры, разрабатывая методику достаточно простого и эффективно!« получения иейротрофических факторов NGF и BDNF. Используя proBDNF и proNGF, нами были подобраны условия сворачивания, включая такие параметры, как способ перевода белка в буфер для фолдинга (медленное непрерывное разбавление), конечная концентрация белка в растворе (1,5 мкМ) и окислительно-восстановительная пара (5 мМ GSH/0,5 мМ GSSG в случае вариантов NGF и 5 мМ Cys/1 мМ Cys-Cys в случае вариантов BDNF). Влияние таких условий, как температура и состав буфера, было изучено ранее [Rattenholl Л. et al, 2001; Rattcnholl Л. et al, 2001].

Мы провели ряд экспериментов по фолдингу проформы NGF, индивидуального зрелого NGF и индивидуального пропептида NGF. Все белки сворачивали при одинаковых условиях, используя один и тот же буфер для фолдинга.

Для выявления участия пропоследовательности в формировании корректной пространственной структуры нейротрофина NGF нами были поставлены эксперименты по сворачиванию зрелого NGF в присутствии не связанного ковалентной связью пропептида. Фолдинг зрелой части NGF проводили при молярном соотношении природный пропептид:зрелая часть — 1.1 и 12:1. Также было осуществлено сворачивание зрелой части NGF при добавлении 12-кратного молярного избытка пропептида нейротрофина BDNF. На

- 12-

данном этапе в качестве контроля фолдинга in trans ставился эксперимент по сворачиванию зрелого NGF в присутствии 12-кратного молярного избытка BSA.

Помимо фолдинга различных форм нейротрофического фактора NGF нами было осуществлено сворачивание проформы, зрелой части и пропептида нейротрофина BDNF. Эффективность сворачивания всех целевых белков оценивалась нами по нескольким параметрам: оценивалось количество остававшегося в растворе белка после удаления денатурирующего агента; проводился анализ олигомерной организации и оценивалось количество образуемых димерных форм нейротрофических факторов; анализировалась биологическая активность получаемых белков.

3.1. Оценка растворимости нейротрофических факторов при сворачивании На первом этапе определялось количество остававшегося в растворе белка после удаления денатурирующего агента (Таб. 5).

На данном этапе разные варианты нейротрофического фактора NGF оставались в растворе с разной степенью эффективности. Наименьший выход растворимого белка наблюдали при сворачивании индивидуального зрелого NGF. При эквимолярном соотношении зрелого NGF и природного пропептида растворимость зрелой формы также была невысокой. При фолдинге proNGF или же при фолдинге зрелого NGF в присутствии избыточного количества не связанной ковалентно про-части растворимость нейротрофина резко возрастала. Тут следует отметить, что добавление той или иной пропоследовательности (пропептида NGF или пропептида BDNF) к зрелой части NGF существенно не изменяло результата фолдинга. При использовании избыточного количества не связанного ковалентно пропептида, как природного, так и гетерологичного, растворимость зрелого NGF была наибольшей и достигала 80% от взятого в эксперимент белка. При сворачивании зрелого NGF в присутствии BSA количество растворимого NGF было сопоставимо с тем, что получали при фолдинге зрелого NGF без пропоследовательности.

Интересно отметить, что индивидуально свернутый BDNF и proBDNF во всех поставленных экспериментах при удалении денатурирующего агента оставались в растворе с близкой эффективностью.

Белок' Растворимость белка, %

NGFmat 35-40%

proNGF (фолдинг в системе in eis) 50-60%

NGFpro 90- 100%

NGFmat:NGFpro (фолдинг в системе in trans) - соотношение 1:1 40 - 45%

NGFmat :NGFpro (фолдинг в системе in trans) - соотношение 1:12 70 - 80%

NGFmat:BDNFpro (фолдинг в системе in trans) - соотношение 1:12 75 - 80%

NGFmat:BSA (контроль фолдинга в системе in trans) - соотношение 1:12 35-40%

BDNFmat 60 - 80%

proBDNF 60 - 80%

BDNFpro 90- 100%

Далее для всех полученных растворимых вариантов NGF была оценена биологическая активность.

3.2. Оценка биологической активности растворимых форм NGF

Оценка биологической активности нейротрофических факторов проводились при участии в.н.с. МосНИИ медицинской экологии, к.х.н. Г.А. Посыпановой.

Для анализа биологической активности различных форм нейротрофического фактора NGF использовали клетки феохромоцитомы крысы линии PC 12 и клетки эритролейкемии человека линии TF-1.

Клетки PC 12 экспрессируют специфичный для NGF рецептор TrkA, универсальный для всех нейротрофинов и пронейротрофинов рецептор р75 и сортилин, рецептор пронейротрофинов. Данная клеточная линия является удобной модельной системой для оценки дифференцирующего действия NGF. Под действием этого нейротрофина клетки способны дифференцироваться в нейрональноподобные.

Клетки эритролейкемии линии TF-1 являются строго фактор-зависимыми клетками. Именно это их свойство, а также то, что они экспрессируют исключительно TrkA-рецептор, сделало данную линию широко используемой при оценке пролиферативного действия NGF.

Нами было оценено пролиферативное (Рис. 5, 1) и дифференцирующее (Рис. 5,2, Рис. 6) действие следующих вариантов NGF: индивидуально свернутого зрелого NGF; зрелого NGF, свернутого в присутствии различных количеств природного пропептида; зрелого NGF, свернутого в присутствии избыточного количества пропептида BDNF; зрелого NGF, свернутого в присутствии BSA; индивидуально свернутой проформы NGF; индивидуально свернутых пропептидов NGF и BDNF. В качестве контролей использовали буфер и BSA в аналогичном буфере, которые, как было показано, никаким детектируемым действием на используемые линии клеток не обладают.

'Начальная концентрация нейротрофического фактора в растворе во всех экспериментах составляла 30 мкМ. Фолдинг осуществляли при 20-кратном разведении.

-NGFmat — proNGF — NGFmat/BSA (1:12)

—NGFmat/NGFpro (1:12) — NGFpro--NGFmat/NGFpro (1:1) -NGFmat/BDNFpro (1:12)

Рис. 5. I. Пролиферативное действие различных вариантов NGF на клетки TF-1. 2. Дифференцирующее действие различных вариантов NGF на клетки PCI2.

Контроль

(без факторов) NGFmat NGFmat/BSA (1:12) BSA NGFmat

•^Л'/i - ¿г Л* V Ч. " * • • -

.У. » rr ,v$4. v

I * * * J ' * *"*Î2S нг/мл A *Î25h>mjÎ* «•^МЬщ-'мл « , I * *0 нг/мл f . % * . ' • (8,7 нМ) • » * '» "* (8,7 нМ)-« « (30 иМ) . . (17,3 нМ)

NGFmat/NGFpro (1:12) NGFmat/NGFpro (1:1) proNGF NGFpro NGFmat/BDNFpro (1:11)

^ 1 125Л1Г/МЛ » J . US нг/мл , ^50 нг/мл 28Ш> иг/мл * * *"25(Г|Лмл

*> _(8/>н(3) * (5,7 нМ) Г* *(9JhM* (35« 1*1). »V -,(1*3"*)

Рис. 6. Дифференцирующее действие различных вариантов ЫОР' на клетки РС12.

Для оценки влияния нейротрофичееких факторов на клеточные культуры были введены параметры С250 - при оценке пролиферативного действия исследуемого белка - и С50 -при оценке дифференцирующего действия (С250 - концентрация целевого белка, при которой достигалось увеличение первоначального количества клеток в 2,5 раза; С50 — концентрация белка, при которой 50% клеток подвергалось дифференцировке) (Таб. 6).

Таб. 6. Оценка биологической активности нейротрофичееких факторов.

Белок С2 sib " W Cso. nM

NGFmat 13,7±1,2 21,8±1,3

proNGF 35,5±5,2 9,1±1,2

NGFmat/NGFpro (1:1) 5,7±0,7 11,5±2

NGFmat/NGFpro (1:12) 3,6±0,7 8,5±1,2

NGFmat/BSA (1:12) 17,2±3,9 20,6±0,9

NGFpro или BDNFpro - -

NGFmat/BDNFpro (1:12) 8,7±1,4 8,1±0,7

Здесь и далее, при оценке пролиферативного действия нейротрофинов на клетки линии ТР-] за 100% взято первоначальное количество живых клеток.

Как видно из приведенных данных, дифференцирующее действие растворимого индивидуально свернутого зрелого NGF было сравнительно невысоким (Рис. 5,2, Таб. 6). С$о такого NGF составляло 21,8 нМ (Таб. 6). В то же время, активность proNGF и NGF, полученных при фолдинге in eis и in trans (1:12), возрастала примерно в 2,5 раза* (Таб.6). Следует отметить, что фолдинг NGF in trans (1:1), осуществленный при эквимолярном соотношении зрелой части и природного пропептида, также позволил получить более активный белок, чем при индивидуальном сворачивании зрелой части NGF -дифференцирующее действие увеличивалось примерно в 2 раза (Таб. 6). В то же время активность NGF, свернутого в присутствии BSA, существенно не отличалась от активности зрелой формы этого нейротрофина, сворачивание которого проводили без участия пропептида.

Пролиферативное действие индивидуально свернутого NGF и NGF, свернутого в системах in trans (1:1) и (1:12), изменялось подобным образом, как и их дифференцирующее действие (Рис. 5,1, Таб.6). Пролиферативная активность зрелого NGF при фолдинге его in trans (1:12) возрастала примерно в 4 раза (Таб.6). В то же время пролиферативное действие проформы оказалась невысоким (Рис. 5, 1, Таб.6). Вероятно, это может быть связано с тем, что данная линия клеток экспрессирует только тирозинкиназный рецептор TrkA, с которым пронейротрофин, как известно, эффективно взаимодействовать не может.

Таким образом, анализ биологической активности индивидуально свернутого NGF, а также NGF, свернутого в системах in eis и in trans (Рис. 5, Таб. 6), показал, что присутствие природного пропептида при фолдинге зрелого нейротрофина приводит не только, как отмечалось выше, к увеличению растворимости нейротрофического фактора (Таб. 5), но и к возрастанию его биологической активности. Следовательно, присутствие пропептида при фолдинге нейротрофина NGF значительно увеличивает эффективность данного процесса. При этом наличие ковалентной связи не является определяющим и необходимым условием.

Нами была оценена биологическая активность зрелого NGF, свернутого в присутствии гетерологичной пропоследовательности (Рис. 5, Таб. 6). В этом случае растворимость зрелого белка при удалении денатурирующего агента также заметно увеличивалась (Таб. 5). Как видно из приведенных данных, дифференцирующее и пролиферативное действие NGF, свернутого в присутствии экзогенного пропептида BDNF, также возрастает по сравнению с NGF, свернутым индивидуально (Рис. 5, Таб. 6). Параметр С50, отражающий дифференцирующее влияние, уменьшился примерное в 3 раза, а С250, позволяющий оценить пролиферативное действие, - в 1,5 раза.

* Здесь и далее, при сравнении биологической активности растворимых форм нейротрофического фактора N(¡1' оценивалось изменение параметров С50 (в случае дифференцирующего действия) и С250 (в случае пролиферативного действия).

Таким образом, нами показапо, что чужеродная последовательность также способна эффективно направлять фолдинг зрелой части нейротрофина NGF.

Пропсптиды нейротрофинов NGF и BDNF ни в одном из экспериментов не оказали ни дифференцирующего, ни пролиферативного действия на клетки (Рис. 5).

3.3. Анализ олигомерной организации нейротрофических факторов Функционально активной формой нейротрофинов являются гомодимеры. В связи с этим, следующим этапом оценки эффективности фолдинга стал анализ олигомерной организации всех белков методом гель-проникающей хроматографии (Рис. 7-9, Таб. 7).

Таб. 7. Оценка эффективности фолдинга различных вариантов нейротрофинов методом гель-проникающей хроматографии.

Белок % димерпой формы

NGFmat 3 - 8%

proNGF (фолдинг в системе in eis) 30-50%

NGFpro 85-100%

NGFmat:NGFpro (фолдинг в системе in trans)- соотношение 1:1 И.О.'

NGFmat:NGFpro (фолдинг в системе in trans) — соотношение 1:12 и.о.

NGFmat: BDNFpro (фолдинг в сист еме in trans) - соотношение 1:12 и.о.

NGFmatrBSA (кон фоль фолдинга в системе in trans) — соотношение 1:12 4 - 5%

BDNFmat 20-25%

proBDNF 20-25%

BDNFpro 85-100%

"Г '" I

О 2 4 6 8 10 12

Обьсм, мл

0,06-

0,04-

0,00

Рис. 7. Хроматографический анализ олигомерной организации

предшественника Л'671' (1) и индивидуально свернутого зрелого N(¡1'' (2)У Пик «1» соответствует а1рсгат|п,1м формам, молекулярная масса которых более 75 кДа. Ник «2» -димериым формам (в случае ргоЖ!Н -52 кДа, в случае ШИта! - 29 кДа). 11равое плечо у пика «2» на Рис. 7,1 соответствует частично

нроцессированпой форме

предшественника.

' I..... I 1 I ' I ' I ' I '

2 4 6 в 10 12

Объем, мп

По результатам гель-пропикающей хроматографии (Рис. 7,2) в среднем 5% индивидуально свернутого NGF, представляет собой димер, все остальное - агрегаты различного состава, молекулярная масса которых более 75 кДа. При этом при сворачивании предшественника NGF образовывалось от 30 до 50% димерпой формы (Рис.7, 1). Таким

Оценивался процент содержания формы, соответствующей по своей молекулярной массе димерпой форме соответствующего белка.

'И.О. - «не определено»; процентное содержание каждого из белков в отдельности определить не удалось.

*3дссь и далее, по оси ординат отложена оптическая плотность при длине волны 280 пм - О2цо-

образом, если сравнивать полученные па этом этапе результаты для проформы NGF и зрелой части NGF, видно, что наличие пронептида может существенно увеличивать эффективность образования димера.

Рис. 8, Хроматографический анализ олигамерной организации пронептида BDNF (1) и фолдинга NGF in Irans в присутствии избыточного

количества природного пропептида (2). пик «1» соответствует агрегатным формам, молекулярная масса которых более 75 кДа. Пики «2» и «3» соответствуют димерпым формам зрелого NGF и соответствующего пропептида (в случае BDNFpro -27 кДа, в случае NGFpro - 25 кДа). 11равос плечо у пика «2» на Рис. 8, 1 соответствует частично

нроцсссировапной форме пронептида.

Отмстим, что

индивидуальные про-части нсйротрофических факторов NGF и BDNF, по данным гель-

проникающей хроматографии (Рис. 8, 1), образовывали при сворачивании стабильные

димеры. Это говорит, па наш взгляд, о том, что в предшественнике пропептиды также могут

взаимодействовать между собой. Косвенным подтверждением этого является одна из

предполагаемых моделей предшественника [Paolctti F. et al, 2006]. На сегодняшний день в

литературе оиисапы две вероятные модели proNGF - стержневидная, в которой

пропоследовательности так же, как и зрелые части, взаимодействуют между собой, и

крабовидпая, в которой отсутствует взаимодействие между иропетттидами в составе

проформы [Paolctti F. et al, 2006]. Полученные в нашей работе данные для

пропоследователыюстей нейротрофинов NGF и BDNF согласуются со стержнсвидной

пространственной моделью proNGF.

По своей подвижности на хроматографической колонке димерная форма про-части практически совпадала с подвижностью димерной формы NGF (Рис. 8,2). Электрофорстическая подвижность этих белков также оказалась очень близкой. По этим причинам мы не смогли оценить процентное содержание димера NGF, свернутого в присутствии нековапентно связанного пропептида (Таб. 7).

Зрелый NGF, свернутый в присутствии BSA, также как и NGF, сворачиваемый индивидуально, образовывал около 5% димера (Таб. 7). Это свидетельствует в пользу того, что нсспецифичсские белки, в отличие от пропептида, на сворачивание зрелого нейротрофина NGF заметного влияния не оказывают.

Объем, мл Объем, мл

■ 111 -1 > г 'I > 11 0 2 4 I > 10 12 14

Объем, мл

Рис. 9. Хроматографический анализ олигомерной организации

предшественника ВОКГ (1) и индивидуально свернутого зрелого /ЮЛТ7 (2). Пики «1» соответствуют агрегатным формам, молекулярная масса которых более 75 кДа. Пики «2» -димерным формам (в случае ргоВОК'К -54 кДа, в случае ВБОТша! - 29 кДа). Пик «3» на Рис. 9, 1 соответствует частично процессированной форме предшественника.

О 2 4 S В 10 12 14

Объем, мл

Особо стоит отметить, что при сворачивании индивидуального зрелого BDNF без пропептида количество образуемой димерной формы было сопоставимо с количеством димера, образуемым при сворачивании проформы данного нейротрофина (Рис. 9). Эти результаты показывают, что, по крайней мере, на образование димерной формы нейротрофина BDNF наличие пропептида влияния не оказывает.

3.4. Оценка биологической активности димерных форм нейротрофических факторов NGF и proNGF

Для анализа биологической активности методом гель-проникающей хроматографии нами были получены димерные формы следующих нейротрофических факторов (Таб. 8): проформы NGF, зрелой части NGF и зрелой части BDNF. Помимо этого была проанализирована биологическая активность агрегатных форм предшественника и зрелой части NGF. Для димерной формы предшественника NGF нами были подобраны эффективные условия процессинга его in vitro (трипсинолиз) с образованием зрелого белка. Далее продукт процессинга proNGF также был использован для определения его биологической активности.

Таб. 8. Выход димерных форм нейротрофических факторов. Расчет производился на основе данных, полученных при оценке растворимости белков и их олигомерной организации (Таб. 5, Таб. 7).

Белок Выход димера, %

NGFmat 1 - 3%

proNGF (фолдинг в системе in eis) 15-30%

BDNFmat 12-20%

proBDNF 12-20%

Было определено пролиферативное действие полученных нейротрофических факторов N0? на клетки эритролсйкемии человека линии ТР-1 и дифференцирующее - на клетки феохромоцитомы крысы линии РС12 (Рис. 10- 11). В качестве контроля был использован коммерческий 2.55 NGF мыши. Его активность была проверена в рекомендуемом производителем тесте на выживаемость клеток РС12.

На данном этапе целью нашей работы являлась более точная сравнительная оценка полученных нейротрофических факторов (зрелого КСР, рп^ОР и продукта гидролиза

ргоИОР) и коммерческого нейротрофина 2.58 N0?. Для этого в данных экспериментах была рассчитана средняя эффективная концентрация ЕС50 (концентрация целевого белка, требуемая для достижения 50% от максимально возможного эффекта) (Таб. 9-10).

-2.58 ЫОГ -ЛОИ — ОТРпииж

Рис. 10. Пролиферативное (1) и дифференцирующее (2) действие димерной и агрегатной форм рекомбинантного NGF человека. ЫвР - полученный в данной работе рекомбинантный гомодимер ЫвР человека, ЫОРша1_а§§ - агрегатная форма нейротрофина ЫвИ, полученная после гель-проникающей хроматографии.

Таб. 9. Оценка биологической активности димерной формы рекомбинантного нейротрофина МОЕ.

Белок ес$в при пролиферативном действии Л67 на культуру клеток 11-1. нМ ес№ при дифференцирующем действии NGF на культуру клеток РС12, нМ

2.58 0,40±0,13 0,68±0,18

тег 0,39±0,08 0,69±0,23

—•—2.55 N0? —ргоЫОР —>—ртоНОР/грнпсян —ргоКОР.ад

Рис. 11. Пролиферативное (I) и дифференцирующее (2) действие димерной и агрегатной форм рекомбинантного ргоЛ^СГ человека. рп^-ЮР - полученный нами рекомбинантный гомодимер ргоМОР человека, ргоЫОР_а§§ - агрегатная форма нейротрофина ргоЫвР, полученная после гель-проникаюшей хроматографии.

Таб. 10. Оценка биологической активности димерной формы рекомбинантного пронейротрофина NGF.

Белок ЕСю при пролиферативном действии нейротрофтеских факторов на культуру клеток 11-1, нМ ЕС$о при дифференцирующем действии нейротрофических факторов на культуру клеток РС12, нМ

2.58 ИСК 0,38±0,11 0,15±0,02

рго\СР 8,65±2,35 0,47±0,09

pгoNGF/тpиncин 0,04*0,01 0,11 ±0,02

Анализ биологической активности димерной формы свернутого индивидуально зрелого N01- (Рис.10, Таб.9) показал, что его действие сопоставимо с действием коммерческого белка. Значение ЕС50 для КОР и 2.55 КОР во всех тестах было практически одинаковым, как при оценке пролиферативпого, так и при оценке дифференцирующего действия (Таб. 9). Это говорит в пользу того, что полученный рекомбипаптпый нейротрофип N0? корректно свернут. Агрегатная форма зрелого нейротрофина пи в одном из экспериментов не проявила никакой активности (Рис. 9).

Таким образом, наши результаты показывают, что индивидуально свернутый зрелый ЫОР способен формировать биологически активный гомодимер без участия пропептида, хотя и с чрезвычайно низкой эффективностью (выход составлял 1 - 3%) (Таб. 8).

Нами была проанализирована активность полученных димерной и агрегатной форм предшественника КвР, а также продуктов ограниченного протеолиза димерной формы ргоЫОР (Рис. 11, Таб. 10).

Дифференцирующее действие рекомбипантпого пропейротрофина КОР на клетки феохромоцитомы линии РС12 было ниже действия коммерческого нейротрофина, используемого нами в качестве контроля. ЕС50 ргоКОР в приведенном выше эксперименте (Рис. 11,2) составила 0,47 пМ, что было примерно в 3 раза выше ЕС50 2.58 ЫОР (0,15 нМ) (Таб. 10). Однако после проведенного ограниченного протеолиза пропейротрофина до зрелой формы его дифференцирующее действие увеличилось и стало сопоставимо с действием коммерческого белка - ЕС50 составила 0,11 пМ (Таб. 10).

Пролиферативное действие рекомбипантпого предшественника КОР на клеточную линию ТР-1 также было значительно ниже активности коммерческого нейротрофина - ЕС50 ргоКвР в приведенном выше эксперименте (Рис. 11,1) составила 8,65 нМ, что примерно в 23 раза больше ЕС50 2.58 N0? (0,38 11М) (Таб.10). Однако после осуществленного нами процессинга предшественника до зрелого пейрогрофипа его активность возросла и ЕС50 составила 0,04 нМ, что примерно в 10 раз выше активности коммерческого белка (Таб. 10).

Высокая пролиферативная активность нейротрофического фактора, получаемого после обработки ргоКОР трипсином, оказалась неожиданным результатом. Мы предполагаем, что в этом случае может проявляться действие не только образующегося зрелого КОР, но и коротких пептидов (1ЛР1 и ЫР2), получаемых при процессицге про-части, которые также, как и КОР, способны индуцировать фосфорилировапие ТгкА-рецептора [Оюои Е., 2007]. Однако данное предположение требует дальнейшего экспериментального подтверждения.

Таким образом, на двух различных клеточных линиях была показана высокая биологическая активность ргоКОР до и после процессинга его т уШо.

3.5. Фолдинг NGF in trans При фолдинге зрелого NGF in trans дифференцирующая активность получаемого растворимого белка была достаточно высокой и сопоставима с активностью растворимой проформы - С50 (NGFmat/NGFpro (1:12) составила 8,5 нМ, а С50 (proNGF) - 9,1 11М (Таб. 6). В то же время, индивидуально свернутый NGF, а также зрелый NGF, фолдинг которого осуществляли в присутствии BSA, обладали невысоким дифференцирующим действием на клетки РС12 - С50 равнялось 21,8 нМ и 20,6 нМ, соответственно. Мы показали, что пи пронептиды, ни агрегатные формы NGF и proNGF в условиях эксперимента не обладают собственной биологической активностью. Активность проявляли только димерные формы NGF и proNGF. Таким образом, можно предположить, что в смеси белков NGFmat/NGFpro (1:12), получаемой при фолдипгс in trans, активностью также обладает только димерная форма зрелого NGF. В таком случае, хотя мы и не смогли разделить пропептид и зрелый NGF после фолдинга in trans, мы полагаем, что добавление пропептида при сворачивании зрелого NGF in trans увеличивает процентное содержание димерной формы зрелого белка за счет возможного взаимодействия этих молекул во время фолдинга.

При фолдинге NGF in trans в присутствии пропептида BDNF, как отмечалось выше, С50 (дифференцирующее действие на PC 12) составила 8,1 нМ, С250 (пролиферативное действие па TF-1) - 8,7 нМ (Таб. 6). В то же время, С50 NGF, полученного при фолдипгс in trans в присутствии природного пропептида, равнялось 8,5 нМ, а С250 - 3,6 нМ (Таб. 6). Как видно из приведенных данных, дифференцирующее действие NGF, свернутого в присутствии экзогенного пропептида (как природного, так и гстсрологичного) увеличивалось примерно в равное количество раз (по сравнению с активностью индивидуально свернутого NGF, С50 которого равнялось 21,8 нМ). В то же время, пролиферативное действие NGF, полученного в присутствии пропоследоватслыюсти BDNF, было примерно в 2,5 раза ниже, чем действие NGF, свернутого при добавлении собственного пропептида. На настоящий момент нельзя с точностью сказать, с чем связана меньшая пролиферативпая активность нейротрофина, получаемого при фолдипгс in trans NGFmat/BDNFpro(l:12). Одним из предположений является то, что при про-зависимом фолдинге NGF за счет действия иного шаперона (BDNFpro) может образовываться альтернативная конформация. Однако данная версия требует экспериментальных подтверждений.

З.б. Влияние пропептида на биологическую активность сформировавшегося NGF Было исследовано влияния природного пропептида на биологическую активность уже сформировавшегося, активного зрелого NGF. Для этого свернутый пропептид нейротрофина NGF добавляли в 10-кратном молярном избытке к свернутому ранее растворимому зрелому NGF (в составе данного препарата присутствовали как агрегатные формы, так и димерная форма), полученной нами димерной форме NGF, а также к коммерческому 2.5S NGF. Далее

-22-

смесь NGF и пропептида инкубировали, варьируя температуру и время инкубации (1 ч/22"С, 1 ч/4"С, 30 мин/37"С), после чего добавляли к клеткам TF-1. Ни в одном из вариантов изменений активности зрелого нейротрофина замечено не было. Таким образом, индивидуальный пропептид не оказывает влияния па пролиферативное действие зрелого белка на культуру клеток TF-1, а все биологические эффекты, наблюдаемые при фолдинге NGF in trans, связаны с действием зрелого NGF.

3.7. Биологическая активность димерной формы BDNF Анализ биологической активности полученной после гель-проникающей хроматографии димерной формы нейротрофина BDNF оценивали в тестах па выживаемость на двух типах клеток: клетках глиобластомы человека линии U373MG и клетках гепатоцеллюлярпой карциномы человека линии IlepG2 (Рис. 12). Для этих линий клеток ранее было показано, что они экспрессируют как полноразмериые изоформы специфичного для BDNF рецептора TrkB, так и изоформы этого рецептора с усеченным внутриклеточным тирозинкиназным доменом (пейротрофин с таким рецептором связывается, но фосфорилирование вну триклеточного домена пе происходит) [Wadhwa S. et al, 2003; XiaoZY. et al, 2006]. В качестве контроля был использован коммерческий BDNF человека в максимальной концентрации 50 нг/мл. Однако в данной концентрации этот белок не оказал никакого влияния па выживаемость клеток линий U373MG и HepG2. В то же время рекомбинантный зрелый пейротрофин BDNF в концентрации 500 нг/mji заметно стимулировал выживаемость клеток этих линий (Рис. 12).

о4*

О 1!»

га

CQ >40

3 <»

Рис. 12. Влияние рекомбинантного зрелого ВОМР па выэ/сиваемость клеток глиобластомы человека линии 11373МО (серые столбцы) и клеток гепатоцеллюлярпой карциномы человека линии ПерС2 (черные столбцы).

Концентрация, нг/мл

Таким образом, можно констатировать, что зрелый ВОКР, полученный при фолдинге в отсутствие пропептида, обладает заметной биологической активностью, хотя оценить ее уровень в сравнении с природным белком пока пе удалось.

4. Заключение

Несмотря на то, что псйротрофическис факторы N01', ВОЫГ и Ш"-3 исследуются ие первый год, о биологических функциях нропослсдователыюстсй нейротрофипов извсстио недостаточно. В частности, оставался открытым вопрос об участии иропситидов псйротрофичсских факторов в процессе образования биологически активной пространственной структуры зрелых молекул. Наша работа была направлена на исследование роли пропоследоватслыюстсй псйротрофичсских факторов КОР и 1ШЫГ в фолдипгс этих белков. Для этого было необходимо получить препаративные количества различных форм псйротрофичсских факторов N01'' и В1ЖР человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей, и изучить процесс их созревания.

Нами сконструированы продуценты различных форм псйротрофичсских факторов КОР и ВОЫР человека. Была разработана эффективная система очистки рекомбинаптпых белков, подобраны условия ренатурации предшественников и зрелых форм нейротрофипов N01'' и ВОЫР. Разработана система анализа эффективности фолдипга различных форм нейротрофипов, ключевой стадией которой являлась оценка биологической активности полученных псйротрофичсских факторов. С использованием этой системы было показано, что рсиатурированпые рекомбипаптпые нейротрофипы в условиях эксперимента обладают профилем биологической активности, характерным для факторов роста, полученных из природных источников. Изучение биологической активности различных форм нейротрофипов, полученных нами, позволило оценить степень участия их пропоследоватслыюстсй в формировании биологически активной структуры факторов КОР и ВЭЫР. Было показано, что фолдипг пейротрофического фактора КОР протекает по про-зависимому механизму, тогда как на образование биологически активного нейротрофина ВОКР пропептид, по-видимому, влияния не оказывает. Анализ полученных экспериментальных данных позволяет заключить, что, несмотря на общее сходство всех нейротрофипов, молекулярные механизмы функционирования пропоследователыюстей ЫСР и ВОЫЬ" различны.

В то же время остается открытым вопрос о возможности введения структурных изменений в молекулу зрелого нейротрофина при взаимодействии с различными вариантами пропептида. Наши данные, полученные при сворачивании нейротрофина N01'' в присутствии природной и гстсрологичпой пропоследовательпости, позволяют предполагать наличие конформационных изомеров КОР. Дальнейшие исследования, в том числе и структурные, позволят подтвердить или опровергнуть вероятность образования различных конформеров псйротрофичсских факторов па базе одной аминокислотной последовательности.

выводы

1. Зрелые пейротрофины NGF и BDNF еиоеобиы формировать биологически активные формы без участия пропоследовательностей. При этом фолдинг нейротрофина BDNF протекает значительно эффективнее.

2. При фолдинге нейротрофического фактора NGF в системах in cis и in trans пропептид повышает эффективность образования биологически активной формы белка, причем наличие ковалентной связи между зрелым нейротрофином и пропоследователыюстыо не является необходимым. Таким образом, фолдинг нейротрофина NGF протекает по про-зависимому механизму.

3. Пропептид BDNF не оказывает существенного влияния на процесс формирования биологически активной формы данного нейротрофина (BDNF). Следовательно, фолдинг нейротрофина BDNF не является про-зависимым. Таким образом, молекулярные механизмы функционирования пропоследовательностей нейротрофических факторов NGF и BDNF различны.

4. Пропептид BDNF способен направлять фолдинг зрелой части NGF и существенно повышать эффективность образования биологически активного белка.

5. Индивидуальный пропептид в растворе имеет стабильную димерпую форму, и это свидетельствует в пользу того, что в предшественнике (proNGF) пропоследователыюсти, по-видимому, взаимодействуют между собой.

6. Индивидуальные пропоследователыюсти NGF и BDNF не обладают собственной дифференцирующей либо пролиферативпой активностью в рамках использованных экспериментальных моделей.

7. В условиях эксперимента пропептид NGF не влияет на биологическую активность уже сформировавшегося зрелого нейротрофина.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. СафипаД.Р., РафисваЛ.М., Коваль A.B., Шкурипа Е.Е., Дмифисва В.Г., Раевская U.M., Гасапов Е.В., Дсмидюк И.В., Костров C.B. Олигомсрная организация рскомбипаптпых пейротрофипов человека, экспрсссированных в клетках Escherichia coli. I ! Виоорганичсская химия, 2008, т. 34, № 3, с. 327-332.

2. СафипаД.Р., РафисваЛ.М., Коваль A.B., Дмитриева В.Г., Раевская U.M., ГасановЕ.В., ДсмидюкИ.В., Костров C.B. Пронсссинг предшественников пейротрофипов человека, как механизм, определяющий их функциональную активность. II VI симпозиум «Химия протеолитичсских ферментов». Москва, 2007, с. 131.

3. СафипаД.Р., РафисваЛ.М., Коваль A.B., ГасановЕ.В., Дмитриева В .Г., Раевская U.M., Дсмидюк И.В., Косфов C.B. 11сйро'фофины как ключевые рс!уляторы развития гомсостаза нервной системы человека. II 111 российский симпозиум «Белки и пептиды». Пущипо, 2007, с. 88.

4. РафисваЛ.М., ШкуринаЕ.Е., СафипаД.Р., Раевская U.M. Получение рскомбипаптпых пейротрофипов человека. //1111ущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущипо, 2007, с. 108.

5. СафипаД.Р., РафисваЛ.М., Коваль A.B., Шкурина Е.Е., Ефремова Л.В., ШрамС.И., Посыпапова Г.А., Пиислис В.Г., Костров C.B. Функциональная организация и биологические свойства рскомбипаптпых пронейротрофипов человека.//IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008, с. 347.

6. РафисваЛ.М., Шкурина Е.Е., СафипаД.Р., Коваль A.B., Ефремова Л.В., ШрамС.И., Посыпапова P.A., Костров C.B. Роль пропослсдоватслыюстсй в модуляции биологической активности пейротрофипов человека. // IV Международный междисциплинарный конгресс «11сйронаука для медицины и психологии». Судак, Украина, 2008, с. 238.

7. Сафипа Д.Р., Коваль A.B., Рафисва Л.М., Шкурина Е.Е., Сурин A.M., Пинелис В.Г., Костров C.B. Исследование биологической активности предшественника нейротрофина NT-3 человека в системе глутаматной эксайтотоксичности. // IV Международный междисциплинарный конгресс «Псйропаука для медицины и психологии». Судак, Крым, Украина, 2008, с.263.

8. РафиеваЛ.М., Ефремова Л.В, Шкурина Е.Е., СафипаД.Р., ШрамС.И., Костров C.B. Исследование влияния нропослсдоватслыюсти на биологические свойства и фолдипг пейро'фофинов человека. И Конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». Санкт-Петербург, 2008, с. 112-113.

9. Шкурила Е.Е., РафисваЛ.М., СафилаД.Р., Коваль A.B., Ефремова Л.В., ШрамС.И., Посыпапова Г.А., Костров C.B. Получение биологически активного рекомбинантного предшественника нейротрофина NGF человека.//12 Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». 11ущипо, 2008, с. 64.

10. СафипаД.Р., РафисваЛ.М., Коваль A.B., Шкурина Е.Е., Посыпапова ГЛ., Сурип A.M., Тухбатова Г.Р., 1 Ынслис В.Г., Костров C.B. Рскомбинантиыс псйротрофичсские факторы. // Юбилейный 11ятый Московский международный конфссс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва, 2009, с. 39-40.

11. Шкурипа Е.Е., Рафисва Л.М. Исследование влияния пропоследовательпости на биологические свойства и фолдипг пейротрофипов человека. // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». Москва, 2009, с. 36.

12. РафисваЛ.М., Шкурипа Е.Е., СафипаД.Р., ДсмидюкИ.В., Посыпапова Г.Л., КостровС.В. Роль пронептидов пейротрофипов человека NGF и BDNF в фолдинге этих белков. // V Международный междисциплинарный конгресс «Нсйроиаука для медицины и психологии». Школа-семинар «Инновационные технологии в диагностике и лечении заболеваний нервной системы» Судак, Украина, 2009, с. 188.

13. СафипаД.Р., РафисваЛ.М., Сурип A.M., Тухбатова Г.Р., Пипелис В.Г., КостровС.В. Действие нейротрофина человека NT-3 на нейроны головного мозга крыс при нарушениях внутриклеточного кальциевого гомсостаза. H V Международный междисциплинарный конфссс «Нсйронаука для медицины и психологии». Школа-ссминар «Инновационные технологии в диагностике и лечении заболеваний нервной системы» Судак, Крым, Украина, 2009, с.196.

14. РафисваЛ.М., Шкурипа Е.Е., СафипаД.Р., ДсмидюкИ.В., Посыпапова Г.А., КостровС.В. Роль пропослсдоватслыюстсй пейротрофипов человека NGF и BDNF в фолдинге этих белков. // IV российский симпозиум «Белки и пептиды». Казань, 2009, с. 115.

15. СафипаД.Р., РафисваЛ.М., Сурип A.M., Тухбатова Г.Р., Пинелис В.Г., КостровС.В. Исследование биологической активности предшественника нейротрофина NT-3 человека в системе глутаматной эксайтотоксичиости. // IV российский симпозиум «Белки и пептиды». Казань, 2009, с. 351.

Подписано в печать 23.10.2009 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Рафиева, Лола Маратовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Факторы роста нервной ткани.

1.1.1. Понятие о факторах роста.

Классификация факторов роста нервной ткани.

1.1.2. Открытие фактора роста нервов.

1.1.3. Природные источники фактора роста нервов.

1.2. Семейство нейротрофинов.

1.2.1. Экспрессия нейротрофинов в центральной и периферической нервной системе.

1.2.2. Структура генов нейротрофинов человека.

1.2.3. Внутриклеточный процессинг нейротрофинов.

Влияние продомена на эффективность процессинга.

1.2.4. Секреция нейротрофинов.

1.2.5. Структурная организация зрелых нейротрофинов.

1.2.6. Структурные особенности пронейротрофина NGF и его пропептида.

1.3. Рецепторы нейротрофических факторов.

1.3.1. Структурная организация рецепторов.

1.3.1.1. Тирозинкиназные рецепторы.

1.3.1.2. Рецептор р75.

1.3.1.3. Сортилин.

1.3.2. Структурные особенности взаимодействия нейротрофинов и их предшественников с рецепторами.

1.3.2.1. Взаимодействие нейротрофинов с тирозинкиназными рецепторами.

1.3.2.2. Взаимодействие нейротрофинов с рецептором р75.

1.3.2.3. Взаимодействие нейротрофинов с рецепторами Trk и р75.

1.3.2.4. Взаимодействие пронейротрофинов с сортилином.

1.3.3. Сигнальные каскады, запускаемые при взаимодействии нейротрофических факторов с рецепторами.

1.3.3.1. Сигнальные каскады Trk-рецепторов.

1.3.3.2. Сигнальные каскады рецептора р75.

1.3.3.3. Взаимодействие каскадов, запускаемых рецепторами Trk и р75.

1.3.3.4. Участие сортилина в сортировке и сигнализации нейротрофических факторов.

1.4. Пропоследовательности нейротрофинов.

1.4.1. Роль пропоследовательностей в фолдинге нейротрофинов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека"

Актуальность исследования

Нейротрофины - семейство факторов роста, играющих важную роль в регуляции развития и функционирования центральной и периферической нервной системы. Они влияют на пролиферацию и дифференцировку нейрональных и глиальных клеток, необходимы для поддержания жизнеспособности и функционирования нейронов, обладают нейропротекторным действием, влияют на передачу и изменение синаптического сигнала (синаптическая пластичность).

На сегодняшний день для человека описано четыре представителя данного семейства - фактор роста нервов NGF, нейротрофический фактор головного мозга BDNF, а также нейротрофические факторы NT-3 и NT-4/5. При этом наиболее значимыми для развития нервной системы являются первые три нейротрофических фактора, что делает их важными объектами различных биомедицинских исследований.

Нейротрофины синтезируются в клетках в виде предшественников — препронейротрофинов, имеющих в своем составе сигнальный пептид, N-концевую пропоследовательность и, собственно, зрелую часть, которая, как полагали долгое время, и обладает всеми свойствами, описанными для данных факторов роста. Препептид, считается, участвует в транспорте синтезированного белка из эндоплазматического ретикулума в транс-отдел аппарата Гольджи. Роль пропептида не установлена и активно исследуется во многих лабораториях. Есть основания полагать, что про-часть нейротрофинов может служить внутримолекулярным шапероном и определять фолдинг молекулы нейротрофина.

Недавно было показано, что клетками секретируются не только зрелые, процессированные, нейротрофины, но и их предшественники. При этом пронейротрофины, как было показано, обладают биологической активностью. Известно, что в некоторых случаях проформы нейротрофинов могут запускать механизм клеточной смерти. Таким образом, пронейротрофины и зрелые белки способны оказывать противоположные эффекты на клетки, а процессинг в таком случае может служить своего рода механизмом регуляции функциональной активности нейротрофических факторов.

Имеющаяся на данный момент совокупность данных свидетельствует о том, что изучение предшественников нейротрофинов необходимо для понимания механизмов функционирования нервной системы человека в норме и при патологии и является важным направлением в современных биологических науках.

Цели исследования

Целью данной работы являлось изучение вовлеченности прогтоследовательностей в формирование биологически активных молекул нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное сравнительное исследование фолдинга нейротрофических факторов человека с использованием предшественников нейротрофинов NGF и BDNF, их индивидуальных зрелых форм и пропоследовательностей. При этом в данной работе впервые осуществлен фолдинг зрелого NGF в присутствии несвязанного ковалентной связью пропептида NGF (фолдинг в системе in trans). Показано, что пропептид NGF способен существенно повышать эффективность образования биологически активного нейротрофина NGF, причем наличие ковалентной связи между зрелым белком и пропептидом не является необходимым. Таким образом, в данной работе получены доказательства про-зависимого фолдинга нейротрофина NGF. Впервые осуществлен фолдинг нейротрофина NGF в присутствии не связанной ковалентной связью чужеродной пропоследовательности (пропептида BDNF) и показано, что пропептид BDNF способен направлять фолдинг зрелого NGF. Впервые показано, что пропептид BDNF не оказывает существенного влияния на образование биологически активного нейротрофина BDNF и, по-видимому, фолдинг данного нейротрофина не является про-зависимьтм. Показано, что индивидуальные пропоследовательности нейротрофинов NGF и BDNF в растворе образуют стабильную димерную форму. Также показано отсутствие дифференцирующего и пролиферативного действия пропептидов на культуры клеток феохромоцитомы крысы PC 12 и эритролейкемии человека TF-1.

Практическая значимость

Получение новых данных о механизмах фолдинга нейротрофических факторов открывает большие перспективы в конструировании нейротрофинов с модифицированными свойствами, в том числе на базе одной аминокислотной последовательности. Это может помочь в исследовании взаимодействия нейротрофических факторов с тирозинкиназными рецепторами (TrkA, TrkB и TrkC), рецептором р75 и сортилином. Препаративное получение очищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF (предшественников, индивидуальных зрелых нейротрофинов и индивидуальных пропептидов), отработанное в данной работе, позволит 8 использовать данные белки для разработки и создания тест-систем для детектирования пронейротрофинов, нейротрофинов и, вероятно, пропептидов в различных биологических жидкостях (крови, спинномозговой жидкости и т.д.), что может быть широко использовано в диагностике и исследовании целого ряда нейродегенеративных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

Конструирование рекомбинантных продуцентов различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей.

Получение высокоочищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.

Разработка системы анализа эффективности фолдинга различных форм нейротрофинов.

Анализ биологической активности полученных нейротрофических факторов.

Исследование наличия шапероноподобной функции пропептидов при фолдинге нейротрофинов NGF и BDNF.

Исследование влияния пропептида на биологическую активность сформировавшегося зрелого нейротрофина NGF.

Исследование собственной биологической активности индивидуальных пропептидов.

Выполнение работы проводилось в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (2009), программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (2009) и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (М» грантов 06-04-48678-а, 06-04-48690-а, 09-04-00734-а, 09-04-00870-а).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рафиева, Лола Маратовна

выводы

1. Зрелые нейротрофины NGF и BDNF способны формировать биологически активные формы без участия пропоследовательностей. При этом фолдинг нейротрофина BDNF протекает значительно эффективнее.

2. При фолдинге нейротрофического фактора NGF в системах in cis и in trans пропептид повышает эффективность образования биологически активной формы белка, причем наличие ковалентной связи между зрелым нейротрофином и пропоследовательностью не является необходимым. Таким образом, фолдинг нейротрофина NGF протекает по про-зависимому механизму.

5. Индивидуальный пропептид в растворе имеет стабильную димерную форму, и это свидетельствует в пользу того, что в димерной структуре предшественника пропоследовательности, по-видимому, взаимодействуют между собой.

6. Индивидуальные пропоследовательности NGF и BDNF не обладают собственной дифференцирующей либо пролиферативной активностью в рамках использованных экспериментальных моделей.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, члену-корреспонденту РАН, доктору химических наук, профессору Кострову Сергею Викторовичу за внимание, чуткое отношение, теоретическую и практическую помощь, оказанные им в процессе выполнения данной диссертационной работы.

Автор также выражает признательность ведущему научному сотруднику Московского научно-исследовательского института медицинской экологии, кандидату химических наук Посыпановой Галине Ароновне за неоценимую помощь в выполнении экспериментальной части работы и обсуждении полученных результатов.

Автор благодарит за помощь, ценные советы и моральную поддержку всех сотрудников лаборатории белковой инженерии ИМГ РАН, особенно кандидата химических наук Демидюка Илью Валерьевича, кандидата химических наук Сафину Дину Рашидовну и кандидата химических наук Гасанова Евгения Валерьевича.

Автор также благодарит всех сотрудников ИМГ РАН за внимание и содействие, оказанное ими, особенно доктора биологических наук, профессора Лимборскую Светлану Андреевну, кандидата химических наук Шрама Станислава Ивановича и доктора биологических наук Кульбачинского Андрея Владимировича.

3.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как известно, нейротрофические факторы NGF, BDNF и NT-3 являются ключевыми регуляторами развития и функционирования нервной системы позвоночных. Несмотря на то, что данные факторы исследуются не первый год, о биологических функциях пропоследовательностей нейротрофинов известно недостаточно. В частности оставался открытым вопрос об участии пропептидов нейротрофических факторов в процессе образования биологически активной пространственной структуры зрелых молекул. Наша работа была направлена на исследование роли пропоследовательностей нейротрофических факторов NGF и BDNF в фолдинге этих белков. Для этого было необходимо получить препаративные количества различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей, и изучить процесс их созревания.

Нами сконструированы продуценты различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека. Была разработана эффективная система очистки рекомбинантных белков, подобраны условия ренатурации предшественников и зрелых форм нейротрофинов NGF и BDNF. Разработана система анализа эффективности фолдинга различных форм нейротрофинов, ключевой стадией которой являлась оценка биологической активности полученных нейротрофических факторов. С использованием этой системы было показано, что ренатурированные рекомбинантные нейротрофины в условиях эксперимента обладают профилем биологической активности, характерной для факторов роста, полученных из природных источников. Изучение биологической активности различных форм нейротрофинов, полученных нами, позволило оценить степень участия их пропоследовательностей в формировании биологически активной структуры факторов NGF и BDNF. Было показано, что фолдинг нейротрофического фактора NGF протекает по про-зависимому механизму, тогда как на образование биологически активного нейротрофина BDNF пропептид, по-видимому, влияния не оказывает. Анализ полученных экспериментальных данных позволяет заключить, что, несмотря на общее сходство всех нейротрофинов, молекулярные механизмы функционирования пропоследовательностей NGF и BDNF различны.

В то же время остается открытым вопрос о возможности введения структурных изменений в молекулу зрелого нейротрофина при взаимодействии с различными вариантами пропептида. Наши данные, полученные при сворачивании нейротрофина NGF в присутствии природной и гетерологичной пропоследовательности, позволяют предполагать наличие конформационных изомеров NGF. Дальнейшие исследования, в том числе и структурные, позволят подтвердить или опровергнуть вероятность образования различных конформеров нейротрофических факторов на базе одной аминокислотной последовательности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Рафиева, Лола Маратовна, Москва

1. ОдинакМ.М., Цыган Н.В. Факторы роста нервной ткани в центральной нервной системе. Монография. Санкт-Петербург: Наука, 2005. 157 с.

2. Wikipedia. http://ru.wikipedia.org

3. KorschingS. The neurotrophic factor concept: a reexamination. // The Journal of Neuroscience, 1993,13(7):2739-2748.

4. Levi-Montalcini R, Meyer H. HumburgerV. In vitro experiments on the effects of mouse sarcomas 180 and 37 on the spinal and sympathetic ganglia of the chick embryo. // Cancer Research, 1954,14(l):49-57.

5. Cohen S, Levi-Montalcini R, Hamburger V. A nerve growth-stimulating factor isolated from sarcomas 37 and 180. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1954, 40(10): 1014-1018.

6. BuekerED. Implantation of tumor into hide limb of the embryonic chick and developmental response of the lumbosacral nervous system. // The Anatomical Record, 1948,102:369-390.

7. Levi-Montalcini R, Hamburger V. Selective growth-stimulation effects of mouse sarcoma on the sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo. // The Journal of Experimental Zoology, 1951,116(2) :321-362.

8. Levi-Montalcini R. Effects of mouse tumor transplants on nervous system. II Annals of the New York Academy of Science, 1952, 55(2):330-343.

9. Cohen S. Purification and metabolic effects of a nerve growth-promoting protein from snake venom. // The Journal of Biological Chemistry, 1959, 234(5): 1129-1137.

10. Cohen S. Purification of a nerve-growth promoting protein from the mouse salivary gland and its neurocytotoxic antiserum. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1960, 46(3):302-311.

11. Hamburger V, Levi-Montalcini R. Proliferation, differentiation and degeneration in the spinal ganglia of the chick embryo under normal and experimental conditions. // The Journal of Experimental Zoology, 1949,111(3):457-501.

12. Cohen S, Levi-Montalcini R. A nerve growth-stimulating factor isolated from snake venom. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1956, 42(9):571-574.

13. Levi-Montalcini R, Cohen S. In vitro and in vivo effects of a nerve growth stimulating agent isolated from snake venom. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1956, 42(9):695-699.

14. Chretien M. Action of testosterone on the differentiation and secretory activity of a target organ: the submaxillary gland of the mouse. // International Review of Cytology, 1977, 50:333-396.

15. Thoenen H, BardeYA. Physiology of nerve growth factor. // Physiological Reviews, 1980, 60(4):1284-1335.

16. Caramia F, Angeletti PU, Levi-Montalcini R. Experimental analysis of the mouse submaxillary gland in relationship to its nerve growth factor content. // Endocrinology, 1962, 70:915-922.

17. Varon S, Nomura J, Shooter EM. The isolation of mouse nerve growth factor protein on a high molecular weight form. // Biochemistry, 1967, 6(7):2203-2209.18.

Информация о работе

Рафиева, Лола Маратовна
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы