Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение пути фолдинга фибритина бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Летаров, Андрей Викторович, Москва

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ

ИМЕНИ Д.И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

ЛЕТ АРОВ Андрей Викторович

ИЗУЧЕНИЕ ПУТИ ФОЛДИНГА ФИБРИТИНА БАКТЕРИОФАГА Т4

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.03 Молекулярная биология

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Месянжинов

МОСКВА 1999 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додецилсульфат натрия ИПТГ - изопропил-1 -тио-р-галактозид КДа -килодальтон п.н. - пара нуклеотидов ПААГ - полиакриламидный гель пг - продукт гена

ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль Трис - трис-гидроксиметиламинометан ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений..........................................................2

Оглавление.......................................................................3

I Введение........................................................................8

1.1 Актуальность проблемы...................................................8

1.2 Цель и задачи работы......................................................9

1.3 Научная новизна и практическая ценность работы..................10

II Обзор литературы..........................................................11

II. 1 Фолдинг белка как вторая половина генетического кода...........11

11.2 Основные закономерности фолдинга.................................13

II.2.1 Две гипотезы механизма сворачивания..........................13

11.2.1.1 Гипотеза нуклеации и роста......................................13

11.2.1.2 Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов...............................................................14

11.3 Молекулярные шапероны................................................18

11.3.1

DnaK/DnaJ......................................................................18

11.3.2 GroEL/GroES............................................................20

11.4 Фолдинг белка и сборка бактериофагов.................................12

11.4.1 Бактериофаги и молекулярные шапероны........................23

11.4.2 Фибриллярные белки бактериофагов и их сборка...............26

11.4.3 Фибриллярные белки фага Т4.......................................28

11.5 Структурные особенности coiled coil....................................32

11.5.1 Основные принципы структуры coiled coil........................32

11.5.2 Олигомерность coiled coil.............................................35

11.5.3 Ориентация цепей в структуре coiled coil.........................36

11.5.4 Нарушения периодичности...........................................36

11.6 Механизмы фолдинга и олигомеризации coiled coil..................38

11.7 Фибритин бактериофага Т4...............................................39

III. Материалы и методы.....................................................50

III. 1 Штаммы бактерий и бактериофага......................................50

III.2. Среды для выращивания бактерий.....................................50

III.3 Выращивание бактериофагов и выделение фаговой ДНК.........50

111.4. Плазмиды и белковые препараты.......................................51

111.5. Конструирование рекомбинантных плазмид.........................51

111.6. Полимеразная цепная реакция..........................................52

111.7. Приготовление компетентных клеток Е. coli

и трансформация плазмидной ДНК...........................................53

111.8. Экспрессия белков и анализ на растворимость.......................54

111.9. Электрофорез белков и иммуноблот...................................54

III. 10. Выделение и очистка белков...........................................55

III. 1.1. Определение концентрации белка....................................55

III.1.2. Ограниченный протеолиз..............................................56

III. 13. Спектроскопия кругового дихроизма................................56

III. 14 Определение нуклеотидной последовательности..................56

III. 15. Изучение криорефолдинга..............................................56

III. 16. Дифференциальная сканирующая калориметрия..................57

III. 17 Солюбилизация тел включения и рефолдинг белка in vitro............57

IV Результаты исследования...................................................58

IV. 1 Исходные предпосылки.........................................................58

IV.2 Неспособность последовательности coiled coil участка фибритина

инициировать тримеризацию и фолдинг.............................................61

IV.2.1 Получение делеционного мутанта фибритина В, лишённого С-

концевого домена.........................................................................61

IV.2.2 Свойства белка NB 1......................................................61

IV.2.2.1 Экспрессия, растворимость и очистка..............................61

IV.2.2.2 Электрофоретическая подвижность.................................62

IV.2.2.3 Чувствительность к трипсинолизу..................................62

IV.2.2.4 Неспособность восстанавливать ДСН-устойчивое олигомерное состояние.................................................................................62

TV.2.2.5 Неспособность ингибировать рефолдинг фибритина В.........64

IV.3 Доказательство роли С-концевого домена в инициации

тримеризации и фолдинга фибритина..........................................65

IV. 3.1 Получение химерного белка W31, содержащего фолдон

фибритина......................■.......................................................65

IV.3.2 Свойства белка W31.....................................................66

IV.3.2.2 Электрофоретическая подвижность.................................67

IV.3.2.3 Свойства олигомеров W31.............................................67

IV.3.2.4 Ингибирование ренатурации фибритина В..........................69

IV.4 Демонстрация посттрансляционной тримеризации in vivo

делеционных мутантов фибритина...................................................71

IV.4.1 Совместная экспрессия фибритинов В и Е.........................71

IV.5 Поиск мутаций, стабилизирующих мономерный интермедиат

фолдинга..............................................................................................73

IV.5.1. Получение и скрининг библиотеки случайных мутантов фибритина В1 по пяти аминокислотным остаткам в

последовательности С-концевого домена............................................75

IV.5.1.1 Растворимость мутантных белков с нарушенным

С-концевым доменом.....................................................................76

IV.5.1.2. Общий фенотип мутантов фибритина с нарушенным

С-концевым доменом.....................................................................77

IV.5.2 Свойства мутантов фибритина с нарушенной

тримеризацией и фолдингом............................................................78

IV.5.2.1 Нуклеотидные последовательности мутантов........................78

IV.5.2.2. Экспрессия при различных температурах.............................79

IV.5.2.3 Получение и очистка мутантных белков...............................79

IV.5.2.4 Способность образовывать микроагрегаты в растворе..............81

IV.5.2.5 Спектры кругового дихроизма мутантных белков...................83

IV.5.2.6 Неспособность восстанавливать ДСН-устойчивое

тримерное состояние....................................................................84

IV.5.2.7. Чувствительность к расщеплению трипсином...................84

IV.5.2.8 Дифференциальная сканирующая калориметрия

(ДСК) мутантных белков.............................................................85

IV.5.2.9. Неспособность мутантов с нарушенным фрлдоном ингибировать

рефолдинг интактного фибритина....................................................87

IV.5.3. Свойства точечных мутантов фибритина с

заменами остатка Тгр476 и делеционного мутанта С1...........................87

IV.6 Изучение возможности альтернативных путей фолдинга

фибритина...............................................................................89

IV.6.1 Замещение фолдона фибритина С-концевым фрагментом пг9.....89

IV.6.1.1 Создание химерного белка WB9C......................................89

IV.6.1.2 Свойства химерного белка WB9C.......................................90

IV.6.2. Получение и свойства делеционного мутанта WacXN -

полноразмерного фибритина с удалённым С-концевым доменом...............95

IV.6.2.1 Создание делеционного мутанта Wae XN..............................95

IV.6.2.2 Свойства белка Wae XN...................................................96

IV.6.3 Рефолдинг фибритина XN и свойства ренатурированного

белка..........................................................................................96

IV.6.3.1 Рефолдинг.....................................................................96

IV.6.3.2 Свойства ренатурированного белка Wae XN..........................96

V Обсуждение результатов......................................................99

V. 1 Доказательство роли С-концевого домена в инициации фолдинга фибритина................................................................................99

V.1.2 Способность С-концевого домена фибритина к автономной тримеризации..............................................................................100

IV. 2 Поспрансляционное сворачивание делеционных

мутантов in vivo и существование моно мерно го интермедиата..................102

V.3 Свойства мутантных белков с нарушенным фолдоном...................103

V.4 Возможны ли альтернативные пути фолдинга фибритина ?......108

V.4.1 Замещение фолдона фибритина С-концевым

фрагментом белка пг9...............................................................108

У.4.2 Роль 1Ч-концевого домена в фолдинге фибритина.................109

Выводы............................... ........................................112

Список литературы......... ...............................................113

Благодарности............•.......................................................126

I ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы.

Проблема формирования пространственной структуры белковой молекулы на основе её первичной структуры (фолдинг белка) - одна из наиболее активно исследуемых в современной молекулярной биологии и биохимии. Понимание закономерностей фолдинга является одной из предпосылок для успешного решения ряда биотехнологических и медицинских проблем, таких как создание рекомбинантных вакцин, эффективных противовирусных препаратов, лечение ряда наследственных заболеваний [1,2], а также дизайна белковых молекул de novo.

Структура фибритина бактериофага Т4 - белка, формирующего воротничёк и бакенбарды (воротничковые нити) вирусной частицы подробно исследована в лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. В структурном отношении фибритин представляет собой сегментированный, параллельный тройной а-спиральный coiled coil,

белок, то есть суперспираль из трёх а-спиралей.

Белки, содержащие структуру coiled coil - широко распространены в природе. К ним относятся такие функционально важные белки как миозин, тропомиозин, промежуточные филаменты, ядерные ламинины, некоторые вирусные адгезины и другие [83].

Фибритин бактериофага Т4 является удобным модельным объектом для исследования закономерностей фолдинга фибриллярных белков. Ряд его свойств, такие как растворимость, возможность получения больших количеств рекомбинантного белка в клетках Е. coli, простота очистки, возможность получения нормально собирающихся делеционных мутантов, а

также устойчивость олигомерного состояния к действию ДСН позволяют значительно методически упростить работу с данным белком.

К настоящему времени выяснено, что N-домен молекулы ответственней за присоединение белка к вирусной частице и, очевидно, участвует в формировании воротничка фага. С-концевой домен находится в дистальной части фибриллы. Установленно, что карбоксиконцевой домен играет существенную роль в фолдинге белка [125,126]. Известна рентгеновскай структура С-концевого фрагмента фибритина [129]. Однако, последовательность событий в процессе фолдинга фибритина и конкретные функции С-концевого домена к началу данной работы оставались невыяснены.

1.2 Цель и задачи работы.

Целью данной работы было выяснение пути фолдинга фибритина

бактериофага Т4 и уточнение роли С-концевого домена.

Экспериментальная часть работы посвящена решению следующих

задач:

1. Идентификации участков в последовательности фибритина В, ответственных за инициацию тримеризации и фолдинга in vitro.

2. Проверке возможности котрансляционной олигомеризации делеционных мутантов фибритина in vivo.

3. Получению мутаций, блокирующих тримеризацию и стабилизирующих мономерный интермедиат фолдинга.

4. Изучению возможности существования альтернативных путей фолдинга фибритина.

1.3 Научная новизна и практическая ценность работы.

Получены прямые данные, свидетельствующие о том, что фолдинг фибритина in vitro инициируется тримеризацией С-концевого домена (фолдона), после чего следует формирование структуры coiled coil. Показано, что С-концевой домен способен к автономной тримеризации в отсутствии последовательности coiled coil части фибритина.Это даёт возможность использовать С-концевой домен в белковой инженерии для обеспечения тримеризации химерных белков.

Продемонстрировано формирование гетеротримеров при коэкспрессии делеционных мутантов фибритина различной длины , что свидетельствует о посттрансляционной олигомеризации фибритина и о существовании in vivo мономерного интермедиата фолдинга.

Получена серия мутантов по пяти аминокислотным остаткам в последовательности С-концевого домена фибритина В. Сходный фенотип мутантов, содержащих различные аминокислотные замены позволяет предположить, что состояние полипептидной цепи мутантов соответствует мономерному интермедиату.

Показана возможность формирования нативоподобной структуры делеционным мутантом фибритина, лишённым С-концевого домена, в условиях рефолдинга in vitro.

Полученные данные важны для понимания механизмов формирования пространственой структуры фибриллярных белков.

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

II. 1 Фолдинг белка как вторая половина генетического кода

Проблема укладки полипептидной цепи в нативную пространственную структуру - одна из наиболее актуальных в современной биохимии, молекулярной биологии и медицине. Многие наследственные заболевания, такие как ретинальный пигментоз и куриная слепота, болезнь Альцгеймера, идиопатический фиброзирующий альвеолит (cystis fibrosis), синдром Ларона при мутациях в гормоне роста, синдром Марфана при мутациях в гене фибриллина, различные болезни соединительной ткани, являются следстием нарушения фолдинга соответствующих белков в клетке[1,2]. Мутации в гене р53 - супрессоре опухолевого роста также, вероятно, приводят к нарушению фолдинга [3].

Понимание механизмов фолдинга in vivo существенно также для развития биотехеологии и биоинженерии. При экспрессии различных генов в гетерологичных системах, в следствие абберантного фолдинга, генно-инженерные белки часто накапливаются в клетках в виде нерастворимых тел включения [4.] Дизайн белковых молекул de novo также ограничивается недостаточным пониманием механизмов фолдинга.

В процессе формирования нативной структуры белковой молекулы происходит отбор правильной, биологически активной конформации из огромного множества стерически возможных состояний [5]. Простой перебор этих состояний потребовал бы времени сравнимого со временем существования Вселенной, однако в клетке процесс фолдинга занимает промежутки времени, исчисляемые минутами или секундами. Эта проблема известна под названием парадокса Левинталя [2]. Предложено несколько гипотез, объясняющих способность белка быстро находить правильную конформацию, в том числе теория «иерархической

конденсации» с последовательным формированием элементов вторичной структуры белка, доменов, субдоменов и сборкой субъединиц [6,7]

После классической работы Анфинсена [8], показавшего, что денатурированная рибонуклеаза А способна к спонтанному рефолдингу in vitro, стало очевидно, что полипептидная цепь содержит полную информацию, необходимую для формирования её пространственной структуры. И, хотя не все белки удаётся ренатурировать in vitro, и скорость и условия рефолдинга в клетке не сопоставимы с условиями в эксперименте, все факторы, управляющие фолдингом в клетке (молекулярные шапероны, пептидилпролил-цис-транс-изомеразы, изомеразы дисульфидных связей, протеазы, удаляющие неправильно собранные полипептидные цепи и агрегаты, а также существующие в цитоплазме физико-химические условия) носят неспецифический характер. Конечная конформация полипептидной цепи определяется, таким образом, только её аминокислотной последовательностью.

Идентификацию стереохимического кода фолдинга то есть способа кодирования пространственных взаимодействий в первичной структуре белка часто называют второй половиной проблемы генетического кода.

В целом, как сформулировал Крейтон [9], при изучении проблемы фолдинга возникают следующие вопросы:

1. В результате каких кинетических процессов или последовательных стадий белок принимает нативную биологически активную конформацию

2. Какова физическая основа стабильности различных конформаций

белка

3. Почему аминокислотная последовательность белка определяет одну его конечную структуру, а не иную

4. Как предсказать трёхмерную структуру белка исходя из его аминокислотной последовательности.

11.2 Основные закономерности фолдинга.

II.2.1 Две гипотезы механизма сворачивания

Две основные гипотезы, о том, как могут сворачиваться белки, были сформулированы в 1972 г. Гипотеза Болдуина [10] предсказывала, что лимитирующим шагом в сворачивании белка является формирование ядра фолдинга, которое затем быстро растёт, охватывая всю молекулу. Эта гипотеза подразумевает, что сворачивание происходит по принципу «всё или ничего»: молекула скачкообразно переходит из развёрнутого в свёрнутое состояние, минуя какие-либо интермедиаты.

Птицыным [11,12], напротив, была предложена гипотеза, согласно которой процесс самоорганизации макромолекулы сопровождается формированием ряда промежуточных состояний с возрастающей степенью упорядоченности.

По современным представлениям [13] обе эти гипотезы верны для определённых классов белков.

Для ряда белков экспериментально показано существование интермедиатов фолдинга типа «расплавленная глобула» [14,15]. Однако в 1991 г. Джексон и Фершт показали, что сворачивание ингибитора химотрипсина 2 (CI2) протекает без накопления каких - либо кинетических интермедиатов.

II.2.1.1 Гипотеза нуклеации и роста

На основании результатов компьютерного моделирования Ша�