Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследования структуры фибритина бактериофага Т4 и роли карбоксиконцевого домена в фолдинге белка

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследования структуры фибритина бактериофага Т4 и роли карбоксиконцевого домена в фолдинге белка"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛ ЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ИМЕНИ Д. И. ИВАНОВСКОГО

РГ6 од

•1 м ! 1 ' ! J ---5

На правах рукописи УДК 577.112+578.311.1

ШНЕЙДЕР МИХАИЛ МАРКОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ФИБРИТМА БАКТЕРИОФАГА Т4 И РОЛИ КАРБОКСИКОНЦЕВОГО ДОМЕНА В ФОЛДИНГЕ БЕЛКА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Месянжинов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Е.Н. Добров

доктор химических наук, профессор В.А. Шибнев

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. А.И.Энгелыардга РАН

Защита с^тоится " 1997 г.

в- 42й0 час. на заседании Специализированного Совета Д. 001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН { 123095, Москва, ул. Гамалеи, 16)

Автореферат разослан__¿¿сц

1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы, Ген wac (whiskers antigen control) бактериофага T4 кодирует фибрмтин, который является удобной моделью для изучения фолдинга и сборки а-спирапьных белков типа coiled-coil (Месянжинов, 1997).

Фибритин формирует комплекс "воротиичек-бакенбарды" (Coombs, Eserling, 1977; Николаева и соавт., 1987), который необходим для сборки и присоединения длинных хвостовых фибрилл к частице фага (Terzaghi et а!., 1979; Wood, Conley, 1979) и участвует в регуляции адсорбции вируса на бактериальных клетках (Conley, Wood, 1975). Нуклеотидная последовательность гена wac фага Т4, кодирующего белок, состоящий из 487 аминокислотных остатков, впервые определена 8 лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского А .Г. Прилиповым и др. (Prilipov et а).. 1988). При анализе аминокислотной последовательности фибритина (Soboiev, Wesyanzhinov, 1991) была выявлена периодичность распределения гидрофобных остатков, характерная для суперспиральных белков. Однако, а-спиральный coiled-coil разделен на 12 сегментов участками, лишенными гептадной периодичности и сходными с петлями глобулярных белшз. Б.П. Ефимов и соавторы (Efimov et al., 1994) доказали, что фибритин - гример длиной 53 нм с параллельной укладкой цепей, N-концевой домен молекулы фибритина, состоящий из 47 аминокислотных остатков, отвечает за связыеание с частицей бактериофага и, очевидно, участвует в формировании "воротничка", в то время, как С-концееой домен, состоящий из 29 аминокислотных остатков, находится на дистапьном конце молекулы.

Цель и залами работы. В работе изучены механизмы фолдинга и тримеризации фибритина м уточнена его структурная организация.

Экспериментальная часть работы посвящена решению следующих задач;

1). Определению нуклеотидной последовательности генов wac, кодирующих фибритины бактериофагов Т2, 0x2 и КЗ, родственных Т4.

2). Созданию делеционных мутантов фибритина бактериофага Т4, пригодных для кристаллизации и последующего ренттеноструктурного анализа.

3). Поиску участков з последовательности фибритина, функции которых связаны с инициацией фолдинга и тримеризации.

4). Получению мутантов фибритина с аминокислотными заменами в области его С-конца, нарушающими фолдинг белка.

Впервые определены нуклеотидные последовательности генов wac фагов Т2, 0x2, КЗ. Создана серия плазмидных векторов для экспрессии делеционных мутантов фибритина различной длины. Получены в препаративных количествах делецмонные мутанты - белки Fbr-M и Fbr-E имеющие небольшой размер - 90 и 120 аминокислотных остатков в полипептидной цепи и массу мономера 3,2 кДа и 12,2 кДа, соответственно, пригодные для рэнггеноструктурного анализа и определения пространственной структуры белка. Доказано, что последовательность С-концевого домена фибритина отиечает за инициацию его тримеризации. Установлена роль ароматических остатков С-концзвого домена в сборке белка в тример. Получены точечные мутанты фибритина с аминокислотными заменами в С-концевом домене.

1. Нуклеотидные последовательности генов wac и аминокислотные последовательности кодируемых фибритинов бактериофагов Т4, Т2, 0x2 и КЗ имеот высокую степень гомологии.

2. Получена серия далециинных вариантов фибритина фага Т4. пригодных для кристаллографических исследований.

3. Доказзна ¡.-оль С концевого демена фибритина а инициации тримеризации ere молекулы

Диссертация состоит /э зьеденил, обзора научной литературы по теме диссертационной работа, методической части, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссор!ационной ¡тобогы оставляет 1 ¡0 страну машинописного текста. Диссертации содержит ¡6 рисунков и 4 таблицы.

Материалы диссертации были долохенл па X Evergresn international Т4 Meet то (Олимпия, США, ¡993), XI Evergreen htemaüona! Т4 Meeting (Олимпия. США, 1996). Meeting oi Internationa! Research Scholars from the Baltics. Centra: Europe, and the Former Soviet Union (Прага. 19961, 2-го Биохимического Сьезда (Москва, 13S7).

üyüßiitaukiA

Материалы доссер1£щич изложат.-« п 3 научных о га гья* и в 3 ирисах конференций. Нуклеотидные последовательное ги ДНК гена wac бактериофагов Г2. Ох? i-, К? депонированы в EM8L GENEBANK.

МАТЕРИАЛЫ il ¡ИСТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штамма бактерий к бактериофагов. Штймм Escherichia coli Ве/1 исппльзсезли дни выращива-мя бактериофагов Для получения ллазмидной ДНК использовали iUt&mm £ coli JM10S.

В работе бы пи и< пользованы бактериофаг^,, зыделенные ьанее другими исследователями (в -„кобка* указано! время и ^есто выделения): Т2 (31.Louis США, 1925); Ï4 (Brooklyn. США, ! 944); 0/2 {Oxford, Великобритания. 1962); КЗ (StoekKxiii, Швеция. 1945).

Консггруцраван^а ..ддааш&РЬЬ .векторов проводили по стандартным методикам (Sambrook si al.. 1989) Клонирование гена wac бактериофагов Т2. 0x2, КЗ и его фрагмя-ггоб, псигу^нны/ поладиеразной цепной реакцией, производили ь сектора p3M-3z. pGM-5zf+, f>GM-~zt-*- ¡Рготеда.США). Зк.спрессионные ппзгмиДс.1 йылп созданы на основе захторов pTZ-'9R (Pharmacia, Швеция). рЕГГ-li'h iNovagene, США,, ссдзржащих промотор фага Т7.

□йД^ОаЗШЯ.- цадш1-.£йашаа» Амплификацию фрагментов ДНК производили ¡методом полммеразной цепнэй реакции (ПЦР) с использованием звто.'лзтическаго амплифихгтора Techne Programmable Deblock PHCT (Techie LTD, Великобритания). Проводили 20-25 циклов амплификации Для амплификации использовали Taq-полиадеразу (Promega, США).

клонированных в

плазмидах под промотором фага Т7, проводили в штамме E.coli BL21(DE3) (Studier et al., 1990), в хромосоме которого содержится ген РНК-полимеразы фага Т7 под контролем индуцируемого ИПТГ промотора Lac UV5.

ДНК проводили по методу терминирующего ингибирования {Sanger. 1977). Для выполнения сиквенсных реакций использовали набор Т7 Seqencing Kit (Pharmacia LKB, Швеция). Элэктрофоретическое разделение цепей ДНК, получаемых в полимеразной реакции проводили на приборе "Macrophor" ("Pharmacia". Швеция).

2ш£21ЕиФ-Ойеа белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили по методу Laemmly (Laemmly, 1970) и в системе с трицмиовым буфеоом (Schagger , von Jagoww, 1987).

I. .Опрааелеыий_лоследйаашцгй.аоБ!!_ЛЖ_генов \уас Т-чотных

На начальном этапе данной работы нами были определены нуклеотидные последовательности генов \я/ас у нескольких Т-четных бактериофагов. По нуклеотидным последовательностям нами были рассчитаны аминокислотные последовательности соответствующих фибритинов и проведено сравнение нуклеотидкых и аминокислотных последовательностей, принадлежащих различным фагам.

Для изучения были выбраны бактериофаги, существенно различающиеся по времени и по месту их выделения и, следовательно, дающие достаточно полное представление о вариабильности аминокислотной последовательности фибритина, возникшей в процессе эволюции внутри группы Т-четных бактериофагов.

Для получения участков генома, содержащих ген ьvac нами использован метод амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции.

В качестве матрицы использовали геномную ДНК соответствующих бактериофагов. Последовательности праймероз были выбраны в областях, фланкирующих ген иве в геноме бактериофага Т4, В качестве 5'-концевого праймера использовали 22-членный олигонуклеотид

5: -С7ТС0ТАС£СЗТА/->АС0АСГге-3\ комплиментарный 3'-концевой последовательности гена 12 бактериофага Т4. В качестве З'-кснцевого праймера использовали 25-члекный олигонуклеотид

5;-СССаССТТСССвТАССАТОТТАТСС-3'. комплиментарный 5'-концевой последовательности гена 13 бактериофага Т4. В последовательности праймеров были введены точечные замены (в последовательностях праймеров подчеркнуты), приводящие к возникновению новых сайтов рестрикции Крп1. После амплификации новые сайты рестрикции оказывались в концевых областях наработанного фрагмента ДНК и были использованы для его клонирования в вектора.

нуклеотидной последовательности

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1.1.

1.2. Секвенирование гена шс бактериофагов Т2. Ох2 и КЗ.

Для полунения рекомбинаитных плазмид, содержащих фрагменты величиной 300-600 пар оснований, пригодных для секзенирования, произведено су б клонирование фрагментов ДНК, содержащих ген гас. Для определения нуклеотидной последовательности гена мае каждого из бактериофагов был получен необходимый набор ююнов.

Нуклеотидная последовательность ДНК генов шс фагов Т2, Ох2 и КЗ определена в обеих цепях ДНК. Для каждого из бактериофагов проводили секвенированме не менее двух образцов каждого из клонов гена мае с последующим сравнением нуклеотидных последовательностей с целью поиска возможных ошибок, возникших в процессе амплификации.

В последовательностях секвенированкых генов и/эс фагов 12, 0x2 и КЗ не обнаружено вставок или делеций, отличающих и/ от нуклеотидной последовательности гена !узс фага Т4. Длина всех генов №зс одинакова и равна 1461 парам нуклеотмдов, кодирующих 487 аминокислотных остатка. По нуклеотидным последовательностям нами установлены аминокислотные последовательности соответствующих фибритинов (результаты показаны на рисунках 1 и 21 Результаты сравнения нуклеотидных и аминокислотных последовательностей фмбрмтннов бактериофагов Т4, Т2. Ох2 и КЗ обобщены в таблицах 1 и 2.

Рис. 1. Нуклеютидние последовательности генов 1мэс бактериофагов Т2, 0x2 и КЗ, представленные в сравнении с нуклеотидной последовательностью гена шас бактериофага Т4 (РгШроу е? &!., 1988). Показана предсказанная аминокислотная последовательность фибригина бактериофага Т4 в однобуквенном коде. Различия в аминокислотной последовательности фибритинов бактериофагов Т4, Т2, Ох2 и КЗ показаны в скобках.

т4 ди аса йат атт оха сто аа" оас иа сса ттс стт оас озс сст сст

т2 ..................................- --- ---------

0x2 --- ...............................-..........

кз — --......-.....................................

16

АЕ$<23ЙХ£«1КЯвЕЕ132 г4 есд еда вое с?.о лее сес атт гсс таз атт ада аас аос вял оаа ата

Т2 ......... .......................................-

0x2 ...........- ...............-.....................

КЗ --- .................. -..........................

ь с а с 7 с г г Б е г г к и Н Р

74 ттл са*. ост о АСА см чат ЗОА ао? вгл сос ТСА хта аат лач сст

т2

0x2

КЗ

т v 8 v ь к н v е v ь п к Н I 6

т4 КСС С4ТТ тет зта ста лоа лат егт 6АА отх стт бат ааа аас атт («за

т2

0x2

кз

ILKTSbKTANSDIKTI ВО T4 ATA CTT АЛА АСА ТСТ ТТЛ GAA АСС G CA ААТ AGT GAT ATT AAA АСА АТТ

Т2 .................- —............................

0x2 ---— -.............. -.................-........

КЗ -----С---------------Т-- --G......-..............

ÍS)

QGXÏ,EVSSBIEALAQI9S Т4 CAG ÖGC АТС ТТА GAT STA ТСТ GGT GAT ATT GAA GCT TTG GCC CAA ATA

Т2 ...--.............. -........ --- -— ...............

0x2 .................................................

ЕЗ

Gl KKKD I SDI»£TÏ»TSE 112 Т4 GGT АТС ААТ АДА AAG GAT АТТ ТСТ ЕДС СГС AAA ACQ СТА АСС AGT GAA

Т2 .....- -..........................................

0x2 --- --- ---•......-.............. --- --- --- --- --- --КЗ А............................Т •...............

<s>

н Ï S I и H G 1 И » T V D S I L

T4 CAC АСА GAA ATA ТТА ДАТ GOA ACT ААТ ААТ ACG GTT GAC AGT ATT CTT

T! ÍP> <S) (S)

0x2 <P¡ (S) (H)

КЗ

(S)

ADÎO??KASAKSVYRT 144

Т4 GCC GAT ATT GGT CCA ÏTT AAC GCC GAG GCC AAC TCT GTA ГАС AGA ACG

(S)

<S)

IRSBbLWIKKELOQYT T4 АТС AGA ААТ GAT ТТА CTG TGG ATA AAG COT GAA CTT GCA CAA TAC ACT

T2 -..................-..........................e-A

Iä)

0x2 .................. --- -........ --- --- -........ G-A

(A)

КЗ ................-..........- --- ..............X --A

iso

GQDIMGÎ-PVVGK® S S G 17S T4 GGT CAA GAT ATT ÄAT GGT CTT CCÏ CTT GTA GGA ЛАТ CCT AGT AGT GGA T2 .......................................-.........

0x2 --- --- --- --- ...........-..............- --- --- --кз --c ...........................-...........с -ca --<T)

HXERZIHHTDVirSCG T4 ATS AAS CAT CGC ATT ATT Ш AAT ACT GAT GTC ÄTC ACT TCG CAG GGA 12 --- -— ------------ --------- --- -С- --T --- --A ------

(A)

0x2 .................. --- -.......- -C- --I-----A ------

(Ai

КЗ .........................-.........—- --А......

XEbSBbSrKFXKSDVG 208

T4 ATA CGT TCA AGC GAA TTA OSA АСА AAA TTT ATI GAA TCT GAT GTA &ÜI

T2 ..........--.....................................

0x2 .....- --- --- —............................

КЗ .....-................-................-........

Sl,T3:EVGNtSEEiGPK224 T4 TCI TT G ACC ATT GAA GTT GOT ЛАТ CTT CGT GAA GAG CTT GGA CCG AAA

И ... ... ..X.................................-.....

0x2 --------T.......................................

КЗ --- - -A --T ... ........- --- --- --C..............T ---

FfSFS'QKVYSRLNEXE 240 Г4 CCA CCA TCA TTT TCA CAG AAC GTT TAT AGT CGT TTÄ AAT CAA ATT GAC

T2 ..............— --A -— ...........-.............

0x2 --- ---.....- --A.................-......-.....

КЗ ---- --G--------- ~-A---A-C........................

(I)

T К Q T ï V E S D Г 3 A I К T S 256 T4 ACT AAA CAG АСА АСА GTT GAG TCT GAC ATT AST GCT ATT AAG ACC TCA

T2 ...............T-- A..........................-

<P)

0x2 --- -.......- --- T-- --A....... --- --- -.....- .........

(F)

КЗ ............................-.........- --- —- —-

IGYSGHKfillTSVHTH 272 T4 ATA GGA TAT CCA GGA ЛАТ AAT TCG ATT АТС ACS AGT GTT AAT АСА AA.C

T2

0x2

Г.З

T 0 lí г A S I К L S г. a e s g в

Tí, ACT GAT AAT ATT GCA TCT ATÏ AAT TTA SAG СТА AAT CAA AGT GGA GGT

та

0x2

КЗ

I2CQRLTVIKTSXGSBD T4 ATT AAA CAG CGT TTA ACC GTT ATT GAA ACT TCC ATT G3T TCA GAT GAT

T2 ------------------------ -*----- -T---------------

0x2 .....- ..............-...........T ...............

КЗ .................................T..............-

304

IPSSIKG0IKDÜTTSI320

Т4 ATT ССТ ТС« AGT ATT AAA GST CAA АТС AAA GAT ДАТ АСА ACT ТСА АТС

Т2 ........- --.........С............---......-Т- ---

(Ы

0x2 --- -.......- --- --- --С.....- --- --------- --- -Т----

(X.)

кз ....................с.............■ -- ............

BSbSGXVOBUTSSSLS 336 Т4 GAA ТСТ СТА ААТ G3A АТС GTC 6GT GAA ААС ACT ТСА ТСТ GGC ТТА AGA

TÍ .........-..........- — — ...........- --Т......

0x2 -......-- --- --- -...................- --- --Т --- --КЗ --- G......-.......................... --- --Т -..- --(А)

AHVSWL1ÍQIVGTDS S6 352 Т4 GCG ААТ GTT ТСА TCCÎ ТТЛ ААС CAA ATT GIT GGA ACT GAT ТСТ AGS GGT

T2 .....................A....................-.....

(K)

0x2 .....- .......--- --- A-- -.........................

(K)

кз -..... ...........................................

GQPSPSaSbLNRVSTI 36S T4 G CA СЛА С CT ТСТ ССТ ССТ GGG ТСТ СТТ ТТЛ ААС С CA GTT ТСТ АСА АТТ

Т2 --- ............Т--.................................

(S)

0x2 ...............Т.................................

(S)

кз ......— — .................- •-- -.........- ---

STSVSObHHDVQNbgV 384 Т4 GAA ACT ТСТ GTT ТСА GGC CTG ААТ ААС GSX GTT CAA ААС СТА CAA GTA

Т2 ................-к -.......- --- --- -..............

0x2 --- --- --- --- -•■- -• К --- ........................

КЗ --- -........... - А........- --- --------- --- ---- ----

SIGITMSAQZKGQVVAI. 400

Т4 GAG ATT GGT ААТ ААС AGO GCA GSA ATT AAA GSG CAA GTT GTA GCG ТТА

ТЗ -■-......-.....Т --- --- .........- ...........-

0x2 ..............Т.....-..............-.....- --- --КЗ ........-......... А-- --- -..........- --- ........-

(Т)

MTliVHSTHSHGSTVES 416 TS ААТ ACT ТТА СТА, ААТ GSA ACT ААТ ССД ААС GOT ТСА ACT GTT CAA SAG

T2 -...........-..........................А --С-----А

КЗ ........................................А --С.....А

0x2 --- -......................--Т -.................А

RGLÏHSIKAHETHIAS 432 Т4 CGC GGA ТТА АСС ААТ ТСА ATA AAA GCT ААС CAA ACT ААС ATT GCA ТСА

Т2 .....-................. -.......- --С —..........

0x2 .....-............— - -..........- —С............

КЗ --Т --- --- --- -..............-— —С........- ---

УТЙВ\'ИТАКвИ183Ь0 448 Т4 аГЕ АСА САА САА ОТв ААТ АСА «ГГ АЛА ООС ААТ АТА ТСТ ТСТ ТТЛ САА

тг .......-- --- --- --- --- --- --г ............—___

0x2 ..............................Т...................

КЗ -.......-...........в...........................

СВУОлЬОЕАеухРЕАР 464 т4 сот ахт отт саа ост сте см. зла исс сззт тат атт сст (зал ос* сса

Т2 А-с -в------- --- .........-.......-......--с---

(3)

охз а-с -а- — --- -•■- — — —......— --- — — --з —

(Я) (В!

кз --с.....- .......... —------- --- --- --- ------------

КО&ЗАУУККОв&ПУЬХ. 14 айл й\т йоо саа ОС" тас. ОТТ сот ааь 8аг &зс ода тсз ста тгв сп'

х2 -—........-.......... --- --- --с......-...........

0x2 ......-........--- ......- --с..................

кз ........................ --- --с ....................

480

БТРЬБРАг т4 тсг асс ТГГ ил тса сса ССА тай

т2 .................. --- ---

0x2 -................- --кз .......-............. ---

487

1464

Таблица 1. Данные сравнения количества вариабельных нуклеогидных позиций в последовательностях генов шс бактериофагов 74, 72, 0x2 и КЗ. 8 скобках указан процент гомологии между соответствуюи^ими

Т2 0x2 КЗ

Т4 44 (97,0%) 44 (96,4%) 40 (97.3%)

Т2 - 0 (100%) 46 (96,9%)

0x2 46 (96,9%)

Таблица 2. Данные сравнения

количества вариабельных

аминокислотных позиций в последовательностях генов мае бактериофагов Т4, Т2, Ох2 и КЗ. В скобках указан процент гомологии между

Т2 Ох2 КЗ

Т4 12 (57,5%) 12 (97,5%) 7 (9а,6%)

Т2 - 0 (100%) 17 (98,5%)

0x2 - - 17 (96,5%)

$шериоФагмв-14, Т2, Qz2m.&L

Сравнение аминокислотных последовательностей фибритинов бактериофагов Т4, Т2, Ох2 и КЗ показало их гомологию в пределах 98-100%. Последовательности фибритинов фагоа Т2 и 0x2 полностью идентичны. Такая высокая степень гомологии характерна и для других структурных белков Т-четных бактериофагов (Марусич, 19S3). Все обнаруженные аминокислотные замзны лежат в области, имеющей, как предполагалось согласно модели (Soboiev, Mesyanzhinov, 1991; Соболев, 1993; Efimov et al., 1994), структуру ct-спирального coüed-coil и носят достаточно консервативный характер. Полностью отсутствуют замены в гептадных позициях "а". Замена треонина 120, находящегося, согласно модели, в гепгадной позиции "d", на пролин в последовательностях фибритиноз бактериофагов Ох2 и Т2, не должна приводить к нарушению структуры а-спирали, поскольку предшествующим аминокислотным остатком з полипептидной цепи является глицин. Замена пролина 35В на серии, в позиции, терминирующей 10-й а-спиральный периодический участок, в последовательностях фибритиноз бактериофагов 0x2 и КЗ так же является консервативной.

В последовательностях N-концезого и С-концевого доменов фибритина не содержится аминокислотных замен. Высокую консервативность данных участков пэлипег.тидной цепи можно объяснить строгой зависимостью между аминокислотной последовательностью, структурой, которую она определяет, и функциями данных доменов белка.

Электронно-микроскопические исследования (Coombs, Eiserling, 1977) выявили отсутствие комплекса '"воротничок-бакенбарды" в составе частиц бактериофага Т2. Однако, наши данные свидетельствуют о том, что в составе генома этого фага имеется нормальный ген v.'ac, который способен продуцировать фибрит^н. Фибритин фага Т2 не имеет отличий в аминокислотной последовательности М-концевого домена, образующего воротничок, от фибритина фага Т4, Возможное объяснение того, что комплекс "воротничок - бакенбарды" нз виден в составе частиц бактериофага Т2, состоит в гом, что балки, образующие коннектор, к которому присоединяются молекулы фибритина, имеют мутации. Эти мутации могут ослаблять связь между комплексом воротничка и коннектором, в результате чего комплекс воротничка может быть легко утрачен частицей фага.

Кристаллизация фибриллярных белков для рентгенострукгурного анализа часто невозможна вследствие их больших размеров и плохой растворимости. Кристаллы полноразмерного фибритина также не удалось получить {С.Стрелков, личное сообщение). Мы предприняли конструирование деяеционных мутантов, которые включали бы небольшие сегменты а-спирального со(!сч1-соП и С-концевой домен, инициирующий фолдинг и тримеризацию фибритина (Ей'тоу, 1994), Предполагалось, что делеционные варианты фибритина, имеющие небольшие размеры, существенно облегчат получение кристаялез белка.

1 ТС1У1,КПЬРР'УОЙ?РАЕС05ЕХ5ЯГК НОЕКХЬОАПТОУОЗЕСЗМЫНРЭТб'/З 47

Ъ с <1 е т э а £ с <2 е { Я а

51 V ь к к V СУРСШ

56 Е V г. в к и X 263 5 I I Т Ё V

63 в т и к т 5 Ь <1) ' 269 N Т N Т о к Т (6)

70 В э т А N 3 0 I 276 - А 5 I Я ь Е X.

77 К т 1 0 с I ь №ЗЙС

ШЗСЛЭ1Е 288 I к 0 И Ь (7)

г 233 Т V X Е т Б X

А1А01О

97 л К к к э I 308 X К о 0, X

1СЗ в В ь к т ь Т <2 > 313 К г> А э N Г X (8)

110 в Е н т Е I Г

.117 N 2 т N к3 т V 320 В X. N о - V

124 И с. I Ь л п X Б 334 I. Я А N еЕнтззь V (9!

СРРНА НА 5 к

иЗУУКТ 333 н I. н 0 I V

144 X й н п Ь (3) СТОЗБОС э

143 ъ К X К к г. сзсгтаАсов 359 о Г. ь N Е ОРвРГ С V

ХНЗЬР'ЛГ 355 8 х Е Т Й V (10)

т 372 о I* н N А V

СТР88 й 379 0 и ь 0 V Е X

176 к к н к I т

л СКМЭА с

181 1 N N т п V I (4а) 392 I к й О V (31)

гае т $ с I и ъ ЭНЬСТКР ХЕЗПТС 397 V д ь к Т Ь V НОТКРКС;; ТУЕЕКНа

207 Б I. т I Е V (!Ь) 418 ь т К В X

214 а N I. г* Е Е ь 423 к А к Е т К X

СРКРР 430 А 8 V Т 0 Е V (12)

зк.чок 437 N Т А К с N X

231 I V У с к ь 444 Й 8 X С ^ и О В V

236 к Б I к Б т к 0 451 <2 А ь 0 в Л

243

250

(5)

457 СПРЕАРЯОООАУУЯКПСБ^-Ы.&ТРЬЗРА 4Е6

Рис.2. Гешадная схема соНеё-соН части фибртина (Sobo¡ev eí а/., 1995). Выделены гидрофобные остатки в позициях "а" и *гГ. Аминокислотные замены в последовательностях фибритинов других бактериофагов показаны справа над своими позициями.

При создании плазмид были использованы расположенные в последовательности гена wac сайты узнавания рестриктаз Hind И, Sna I, EcoR V и Pst I. Кроме того, были генерированы дополнительные сайты рестрикции. Исходной плазмидой для работы послужила pZW52 (Efimov et а!., 1994).

Нами получены следующие плазмиды для экспрессии делециоиных вариантов фибритина.

р252 Плазмида кодирует фибритин wac-SM, в котором удалены 129 аминокислотные остатков, расположенных вблизи N-конца (от Asn 13 до Val 141, включительно).

pSFjfi Плазмида кодирует фибритин wac-SR, в котором делетирозано 19 аминокислотных сстатксз (от Туг 143 до Тге 161, включительно), в последовательности фибритина появились аминокислотные замены: Giy 162 заменен на Asp, Gin 163 на Pro.

ВШУ Плазмида кодирует фибритин wac-HR, s котором делетированы 149 аминокислотных ociar«оз (от Vai 13 до 161, включительно), в последовательности фибритина появились аминокислотные замены: Gly 162 заменен на Asp, Gin 163 на Pro.

pZW3it Плазмида pZW931 кодирует фибритин wac-931 с делецией 35 аминокислотных остатков (от Asp 124 до Тге 161, включительно).

Другой набор делеционных вариантов фибритина был получен с использованием единой схемы, включающей подимеразную цепную реакцию. Структура этих делециоиных вариантов состоит из участков tx-спирального coited-coil и С-концевсго домена фибритина. Схема этих делециоиных вариантов фибритина представлена на рисунке 3. При выполнении

реакций амплификации в качества З'-концевого праймера во всех случаях использовали один и тот же слигонуклеотид, последовательность которого комплиментарна началу гена 13, следующего за геном wac в геноме бактериофага: 5'-AATTGGATCCCCTAAACGTCT-31. 3 последовательности данного праймера создан сайт рестрикции BamH i (подчеркнут). В качестве 5'-концевого праймера в каждой из реакций амплификации использовали свой собственный праймер. Каждый из праймеров был комплиментарен участку последовательности гена wac на различном удалении от 3'-конца гена. Последовательности праймеров представлены в таблице 3. В последовательности каждого из 5'-концевых праймеров был создан сайт узнавания рестриктазы Neo 1. При этом кодон мзтионика ATG, входящий в последовательность сайта Neo I ( CCfilßG ) расположен таким образом, что он является инициирующим кодоном соответствующего делеционного варианта фибритина. Продукт амплификации встраивали в вектор рЕТ-19Ь по сайтам рестрикции Neo I и BamH I. В соответствии с такой схемой создано семь конструкций, кодирующих делеционные варианты фибритина различной величины. Данные о этих конструкциях и кодируемых ими белках обобщены в таблице 3. При создании плазмидной конструкции pFbr М в

последовательность 5'-кснцевого праймера внесен ряд дополнительных нуклеотидных замен относительно последовательности гена wac, для того чтобы создать в составе coiled-coil домена белка дополнительные противоположно заряженные аминокислотные пары в гептадных позициях "о"

и "д" (Агд 417 на Зег, 5ег 422 на 1_уз, Азп 426 на 1яи, Абп 429 на Аэр, Тге 434 на Агд).

wac (486)

\ivac-SM (357)

wac-SR (467)

ЕЗС

угас-НВ (337)

тжшвжшвшфжтяжгввп

\vao-931 (451)

вгЕташгггзшЕЕЗзг

РЬг-А (351)

ГЫ-В (276)

Иэг-С (232)

РЬг-О (168)

РЬг-£ (120)

И22

Яэг-М (75)

ГЪг-¥ (58)

Рис.3. Схематическое изображение делеционных мутантов фибритина (делегированные участки последовательности выделены белым цветом). В скобках указано количество аминокислот в составе белка.

ч.2.

Экспрессию белка в /слетках Е.соН БЬ21 (РЕЗ) индуцировали добавлением ИПТГ до концентрации 1тМ. Клетки лизироваяи замораживанием/оттаиванием и подвергали центрифугированию при 12000 об/мин. Фракции супернатанга, содержащего растворимые белки, и осадка, содержащего нерастворимые белки и агрегаты, анализировали электрофорезом в ПААГ с ДСН. Элеетрофоретичэская подвижность

Таблица 3. Плазмидные конструкции кодирующие делеционные

Название Последова- Название Количество Молекулярная

плазмидной тельность белка аминокислот в масса

конструкции. 5'-концевого составе мономера

олигонуклео- мономера белка.

тида* белка,...................

pFbr А 5'-GTCCATTTA Fbr-A ..........351 .......... ..........."44,5

ACGQCA1Q2C

САА-3'

pFfcr В S'-GGTTCTTT Fbr-B ............276................. 35,0

gaccalggaa

GTT-3'

pFbiC S'-GCTATTAAG Fbr-C....... 232 29,4

accái55tagg

ATA-3'

pFbr Б" 5!-GAMCTT£¿ Fbr-D 138 ......23,8.....

élGSGTTCAGA

T-3'___________________________

pFbr Е 5' -cgagtttc" Fbr-e" .............120.................. 13.3

TACCAIGSAAA 1

ст:з;..........................

pFbr М 5'-CCAAACGG Fbr-M .......... 75.............. ................9,5..................

TTC.CAiaSTTG

AA.GAGAGCGG

ATTAACCAATA

AAATAAAAGCT

atcgaaactga

TATTGCATCAG

TTAGACAA-3'

pFbr г 5'- Fbr-F 58 7,4

GAAACTACC

AISSCATCAGT

t-3'

*Нуклеотидные позиции, в которых при синтезе олигонуклеогида произведены замены для получения рестрям¡ионного сайта Neo I и стартового кодона ATG, подчеркнуты.

рекомбинангных белков соответствует ожидаемой, согласно внесенным в ген wac изменениям.

Большинство созданных фибритиксв экспрессируются в клетках Eco//на уровне 10-20% от общего клеточного белка (рис. 4). При этом обнаружена корреляция между размерами белков и уровнем их экспрессии. Так, для самых коротких делеционных мутантов фибритина Fbr-M и Fbr-F уровень экспрессии заметно снижается.Белки wac-SR, wac-HR, wac-931, Fbr-Б, Fbr-D, Fbr-E, Fbr-M и Fbr-F обнаружены в супернатанте, белки wac-S и Fbr-A были нерастворимы. Белок Fbr-C обладает ограниченней растворимостью -примерно равные количества белка обнаружены во фракциях растворимых и

не растворимых белков. Сравнение данных о элехтрофоретической подвижности фибритина е денатурирующих и неденатурирующих условиях (Ефимов, 1993), показывает, что белок, обладающий растворимостью при экспрессии в клетках E.coli всегда является тримером, а, следовательно, фолдинг и тримеризация такого варианта фибритина проходят нормально.

Белок реоекрусов о1, относящийся к классу адгезинов, по своей морфологии сходен с фибритином: протяженный тройной а-спиральный coiled-coil заканчивается глобулярным С-концевым доменом. Установлено, что процесс фолдинга и олигомеризации этого белка состоит из нескольких стадий (Leone et ai„ 1992). Первоначально, взаимодействие С-концевых последовательностей приводит к объединению мономеров с образованием глобулярного домена, после чего происходит формирование тройного а-спирального coiled-coil. Однако, при этом coiied-coü домен остается чувствительным к действию протеаз, то есть является, по выражению авторов, "незрелым". Вблизи N-конца белка имеется еще один участок, наличие которого необходимо для завершения фолдинга. После объединения цепей в пределах этого N-концевого участка завершается формирование сс-сгшрал шого coüed-coii и белок становится нечувствительным к действию протеаз.

б.

Рис.4. Экспрессия рекамбинантных вариантов фибритина, показанных на рис. 3 о клетках В.соП В121(0ЕЗ) и анализ их растворимости. Белки растворимой ("р"} и нерастворимой ("о") фракций клеточных лиэатов разделялись в ? 2% ПААГсДСН (а. ) ив 10% трииут - ПААГ с ДСН ( б. ).

Сходство начальной стадии фолдинга и тримеризации фибритина и белка о1 приводит к предположению, что эти процессы протекают аналогично и на дальнейших стадиях. Мы проверили, насколько внутренние области фибритина значимы для завершения фолцинга и тримеризации белка. Для этого была создана серия делеционных мутантов фибритина, лишенных N-концевой последовательности и протяженных участков coiled-coií. Наименьший из созданных делеционных мутантов rbr-F. состоящий из 58 аминокислот, включает в себя С-концевой домен и один, двенадцатый, сегмент a-спирального coiled-coií. При экспрессии данных делеционных конструкций в клетках Е. coli BL.21ÍDE3), согласно данным э л е ктр о фо р етичес ко г о анализа, большинство из белков, в тем числе и белок Fbr-F, обнаружено в растворимой форме. Это свидетельствует, что фолдикг и тримеризации данных белков in viva проходит с той же эффективностью, что и для нагмвного фибритина. Данные электрофоретического анализа показывают, что значительные количества белков Fbr-A, Fbr-C, vvac-SM обнаружены во фракции не растворимых белков. Это свидетельствует об их повышенной, по сравнению с другими делеционными мутантами, склонности ассоциировать друг с другом с образованием агрегатов. Следует отметить, что аминокислотная последовательность данных делеционных конструкций имеет одну общую особенность: N-концезая последовательность натирного фибритиня и последовательность, образующая ас-спиральный coiled-coi!, делегированы таким образом, что вблизи вновь образовавшегося N-конца оказались крупные i идрафобчые ароматические аминокислотные остатки (Туг 142 и Тгр 151 у Fbr-A и vvac-SM, Туг 259 у Fbr-C), ранее спрятанные внутри участков coiled-coi!. Можно предположить, что крупные (идрофобные боковые группы этих остатков, не ограниченные протяженным coi'ed-coü с обеих сторон, дестабилизируют cciled-ccil делеционных мутантов на N-кокце, что приводит к возникновению неспецифических взаимодействий и агрегации.

Для делеционных мутантов, которые, согласно данным электрофоретического анализа, присутствуют при экспрессии в клетках Е. coli в растворимом виде, можно сделать вывод, что их фолдинг и тримеризация протекает без нарушений. Нормальное протекание фолдинга и олигомеризации не нарушало даже удаление 88% аминокислотной последовательности фибритина в случае Fbr-F. По-видимому, взаимодействие каких-либо участков N-концевой последовательности, так же, как и последовательности a-спиральной части фибритина, не является непременным условием эффективного прохождения фолдинга и тримеризации белка. Для эффективного фолдинга и олигомеризации белка, очевидно, необходимо наличие только С-концевого домена, обеспечивающего взаимодействие мономеров на начальной стадии процесса. Это также означает, что тримеризация фибритина носит посттрансляционный характер и начинается после окончания синтеза полипептидной цепи.

П.з. Сшзв&Згешшъ.

Мы предположили, что для кристаллизации наиболее подходящими окажутся белки Fbr-E и Fbr-M, имеющие высокий уровень экспрессии. Высокая степень очистки достигается с помощью осаждения сульфатом аммония. При концентрации сульфата аммония 40-45% осаждается

значительная часть фибри.тина. Оставшиеся примеси удаляются двукратной хроматографией на гидроксилапатите в 10 птМ фосфате натрия, рН 7,5. Фибритин элюируется в свободном объеме, в то время, как большинство примесных белкоз сорбируется на ГАП при такой концентрации фосфата (Голицына и соавт., 1983). Из 1,5 л культуры было получено 45 мг белка. Согласно данной методике нами были получены высокоочищенные белки FЬг-Е и Fbr-M.

Препараты белков Fbr-E и Fbr-M были использованы для кристаллизации в нашей лаборатории (S.Stre'kov et. at.,1996) и их рентгеноструктуркый анализ был завершен С. Стрелковым и Y. Тао в лаборатории М. Rossmann {Purdue University, USA).

дедеш&

Ранее б нашей лаборатории установлено (Ефимов, 1993; Efimov et а!., 1994), что функции С-концевого домена фибритивэ связаны с фалдингом и олигомеризацией балка и, следовательно, изучение прохождения этих процессов следует начинать с исследования структуры С-концевого домена белка. Можно предположить, что объединение С-концевых участков трех мономеров с образованием соответствующей структуры определяет последующую сборку протяженкой а-спирапьной coi!ed-coii части белка.

Для поиска участков аминокислотной послвдозательности и отдельных аминокислотных остатков, ключевых для организации структуры С-концевого домена, еыбрань! способы, заключающиеся в создании коротких делеций участков этой последовательности и замене отдельных аминокислотных остатков при помощи сайт-направленного мутагенеза. Оценка эффективности прохождения фолдинга и олигомеризации мутанжых вариантов фибритина при экспрессии в клетках E.coli дает возможность судить о том, насколько существенно нахождение конкретных аминокислот в определенных позициях С-конца и о их роли в организации С-концевсго домена. Эти данные необходимы при построении структурной модели С-концевого домена, поскольку дают возможность выбрать среди вариантов структуры наиболее вероятный (Соболев, 1993), В качестве объектов исследования мы выбрали ключевые для предполагаемой структуры С-концевого домена остатки Тгр 477, Asp 474 и Gly 475

Все работы по введению нуклеатидных замен (сайт-направленному мутагенезу) в последовательность гена wac выполнены с использованием плазмиды pZVY52.

Ниже дано описание глазмид, созданных для экспрессии мутантных форм фибритина.

¡1.1.. Отсашолаазмид,

1). Плазмиды для экспрессии фиброина с заменами аминокислотного остатка Тгр 477.

Для получения плазмид pZ1-Leu, pZ4-Ser, pZ12-Ter использовали 21-членный олигонуклеотид имеющий две вариабельные позиции

5'• GATQGCGAA7NiN2GTATTGCTT-3', где N,- А,С,Т; N2- A,C,G.

Таким образом, при сайт-направленном мутагенезе был осуществлен параллельный отбор нескольких вариантов аминокислотных замен в одной и той же позиции.

Сайт-напрарленный мутагенез выполнен с помощью полимеразной цепной реакции. В качестве матрицы была использована последовательность гена Wae с предварительно внесенной в одну из цепей ДНК нуклеотидной заменой, что было выполнено по методу, изложенному в руководстве (Promega, 1991). Амппифицированный фрагмент обрабатывали эндонуклеазами и клонировали в вектор pZW52, из которого предварительно удалили соответствующий фрагмент гена юс.

Отбоо мутантных клонов проводили секвенированием З'-концевой части гена WBc на одно цепочечных формах гглазмид с использованием 18- членного праймера S'-GAAGCTCCAAGAGATGGG-З', комплиментарного

последовательности гена wac в С-концевой области, непосредственно перед позицией мутагенеза.

Таким образом, на первом этапе мутагенеза остатка Тгр 477 были получены следующие плазмиды, экспрэссирующие мутантные формы продукта гена (ПГ) was.

pZl-JxfU! В плазмеде кодон Тгр 477 T6G заменен на кодом Leu TTG. В клетках E.coíi BL21 (DE3) плазмида экспрессирует мутантную форму ПГиас -белок wac-Leu 477, в котором Тгр 477 заменен на Leu.

pSir&ttE 8 данной шдамиде кодон Тгр 477 заменен на кодон Ser TCG. Экспрессирует мутантную форму П Г iva с - белок wac-Ser 477, в котором Тгр 477 заменен на Ser.

pZ12-Tcr При создании этой плазмиды кодон Тгр 477 превращен в стоп-кодон TAG, Экспрессирует делеционный мутант' ПГадс - wac¿10, лишенный 10 последних, аминокислотных остатков. Терминирование синтеза полипептидной цепи происходит после Glu 476.

Метод сайт-направленного мутагенеза, описанный выше, использовали в дальнейшем для получения других мутантных вариантов фибритина.

иети vao- то-

Иной шс. ласАЫ UmáZL Sat4Zc р о ророро р о

Рис.6. Экспрессия вариантов фибритина, полученных при помощи сайт-направленного мутагенеза, в клетках Е.соИ 31.21(ОЕЗ) и анализ их растворимости. Белки растворимой ("р°) и нерастворимой ("о") фракций клеточных лиэатоа разделялись в 10%ПААГ сДСН.

pMW-ЗОЗ Плазмида получена из плазмиды pZ12-Ter с

использованием 19-членного олигонуклеотида с одной вариабельной позицией 5'-GATGGCGAATNCGTATTGC-3', где N-A,T. При сайт-

направленном мутагенезе терминирующий arnber-кодон TAG в позиции 477 заменен на кодон Туг TAC. Плазмида продуцирует мутантную форму фибритина wac-Tyr 477.

pMW 31? Плазмида получена сайт-направленным мутагенезом из плазмиды pZ2-Leu с использованием того же олигонуклеотида, который был использован при конструировании плазмиды pMW 303. При мутагенезе кодон Leu TTG в позиции 477 заменен на кодон Phe TTC. Плазмида продуцирует мутантную форму фибритина wac-Phe 477.

2). Плазмиды для экспрессии фибритина с заменами аминокислотного остатка Asp 474.

Для получения вариантов ПГлзс, имеющих аминокислотные замены Asp

474, выполнен сайт-направленный мутагенез. При мутагенезе использован 17-членный олигокуклеотид с одной вариабельной нуклеотиднсй позицией, имеющий последовательность 5'-CGTAAAGNTGGCGAATG-3', где N- G,T,C.

Получены следующие плазмиды:

PMW104 Плазмида получена сайт-направленным мутагенезом плазмиды pZW52. При мутагенезе кодон Asp 474 GAT заменен кодоном Gly GGT. При экспрессии образуется мутантный фибритин wac-Gly 474.

pMW116.4 Плазмида получена сайт-направленным мутагенезом плазмиды pZW52. При мутагенезе, кодон Asp 474 GAT заменен кодоном Val GTT. При экспрессии образуется мутантный фибритин wac-Val 474.

рМШ13 Плазмида получена сайт-направленным мутагенезом плазмиды pZW52. При мутагенезе кодон Asp 474 GAT заменен кодоном Ala GCT. При зкспрессии образуется мутантный фибритин wac-Aia 474.

3). Плазмиды для экспрессии фибритина с заменами аминокислотного остатка Qíy 475.

Для создания вариантов ПГwac, имеющих аминокислотные замены Gly

475, выполнен сайт-направленный мутагенез. При мутагенезе использован 17-членный олигонуклеотид с одной вариабельной нуклеотидной позицией, имеющий последовательность5'-TAAAGATGNCGAATGGG-3', где N- А,Т.

Получены следующие плазмиды:

ЙЙЖ2Й2 Плазмида получена сайт-направленным мутагенезом плазмиды pZW52. При мутагенезе кодон Gly 475 GGC заменен кодоном Val GTC. При зкспрессии образуется мутантный фибритин wac-Val 475.

р MW 207 Плазмида получена сайт-направленным мутагенезом плазмиды pZW52. При мутагенезе кодон Gly 475 GGC заменен кодоном Asp GAC. При экспрессии образуется мутантный фибритин wac-Asp 475.

Клетки Е.соН BL21(DE3) трансформировали описанными выше плазмидами и экспрессию индуцировали добавлением ИПТГ до концентрации 1тМ. Анализ яизатов индуцированных клеток проводили электрофорезом в ПААГ с ДСН. Клеточные лизаты для электрофореза обрабатывали согласно методике, описанной в разделе II.2. Во всех случаях уровень экспрессии фибритина составляет около 20% от общего клеточного

í

белка Элекгрофоретическая подвижность рекомбинантных белков соответствует ожидаемой, согласно внесенным в ген wac изменениям (рис.б).

Белки wac-Tyr 47"?. wac-Pne 477, wac-Gly 474, wac-Val 47-1, wac-Ala 474, vvac-Val 475. wac.-Asp 475. и vvac-Arg 4S6 продуцирую гея в растворимой форма. Белки vvüe-Le.J 477. vvac-Ser 477, vvacAIÜ обнаружены в клетках £ со// в нерастворимой Форме

!!! 3. ЗлtXK£i&i№.

Используя лдичыь п:.; растворимое ш мутантныл варган гов фибригика. мы ппиш-'м к выводу. что структурная мидель С-концопого помина фибритииа. предложенная я нашей лаборатории Б.Н. Соболевым (Соболев,1992;, яиляятся наиболее вероятной. Согласно зтой модели С-концевой домен белка предстанлчзт собой объединение трех ß-листов. лринздпех>ш9'? соответственно, трем мономерам, в структуру гипи пропеллера. То, что гидрофобные язаимодкйстуия играют определяемую роль а орган*. 13гшш ладной стр/г.туры, подп.,?рхаается дачными о растворимости муэнтиых вариантов фибритина с заменами остатка Tip 477 на Leu и Sor ;что приэодит к нарушению тримвр^зааии). г. одной стороны, и на Туг и Phe (что не еызыаае; нарушения олигс/ариздции), с другой

Результаты ре-нтгвиоструктурного анализа делеционных вариантов фибритина фага Т4, завершенного С. Стрелковы,.1. а лаборатории М. Rossmanri ¡ Purriue Univernty, USA ), подтвердили справедливость модели, согласно которой фибритин является тримерным и-спиральным белком, в котором субъединицы уложень' з параллельный caikxi-coi!. Протяженная cci!ed-cc¡l часть разделена петлями на сстыенгы Спиральные сегменты с обеих сторон ограничены остатками глицина, одновременно, выполняющим роль шарнира по отношению к петлям, имеющим жесткую структуру. Согласно данным рентгеноструютурнсо анализа, в основе структуры С-конценого домена лежат гидрофобные взаимодействия между тремя цепями мономоров. Таким образом,

гидрофобные взаи.модойстния в интерфейсе продолжаются после терминирования а-спиралей

ззаимодейсгвием между Туг 459 и lio 460. С-юнеи молекулы фибритина является ß-структурным Основными структурными элементами С-концевого домена мономера являются дпа антипараллельных ß-тяжа, образованные аминокислотными

L

3

Ч,

- ' - .

7 ■Ц

6. J*>>-

, s . . „ ■í'í''

JVÍK^OÜ)

Рис.7 Структурна* схема С-концееого домена фибонгина (Тао Y. ot al. 1997). э. ß-листы в составе С-хонцавого демона (показаны стрзльае/м!

6 схематическая диаграмма расположений ß-листов-

Водородныв с&язи показаны точками

остатками: Ala 469 - Lys 473, первый, и Giu 476 - Leu 480 , второй.

Взаимодействия между Тгр 477 и Arg 472 в составе одной цепи и между остатками соседних цепей формируют кольцо гидрофобных взаимодействий. Замена остатка триптофана на остатки Leu и Ser в результате сайт-направленного мутагенеза приводит к тому, что кольцо гидрофобных взаимодействий не формируется; при этом нарушается нормальный фолдинг фибритина. Становится очевидным, почему замена остатка триптофана на ароматические остатки треонина и фенилаланина не имеет драматических последствий для фолдинга и олигомеризации - гидрофобные взаимодействия при этом должны сохраняться.

Гидрофобные взаимодействия осуществляются и между Leu 430 и Phe 483, как в одной цепи, так и между остатками соседних цепей.

Мы предполагали, что замены двух аминокислотных остатков, лежащих в основе ß-позорота между двумя ß-тяжами - Asp 474 на Va! и Gly 475 на Asp и Val, соответственно, приведут к нарушению структуры ß-поворота, что должно отразиться на тримеризации белка и, следовательно, на его растворимости при экспрессии в клетках E.cali. Однако, существенных изменений растворимости мутантных вариантов белка, по сравнении с растворимостью нативного фибритина, обнаружено не было. По-видимому, такие изменения в составе С-.концевого домена приводят к изменению степени олигомеризации белка. Не исключено, что мутантные фмбритины накапливаются в клетках в мономерной форме.

Выводы.

1. Определены последовательности ДНК генов шс бактериофагов Т2, 0x2 и КЗ, кодирующих фибритин - фибриллярный белок со структурой а-спирального соПесРсоИ. Сравнение аминокислотных последовательностей фибритинов показало их высокую консервативность, количество вариабельных аминокислотных позиций составляет только 3,7%. Замены в области соМес)-со(1 отсутствуют а гептадной позиции "а", а замены в гептадной позиции "сТ носят консервативный характер. Полностью отсутствуют замены е М- и С-концевом доменах фибритина.

2. Создана серия плазмидных векторов для экспрессии мутантов фибритина, имеющих делоции аминокислотной последовательности Ы-концевогс домена и протяженной соНес!-со|1 части: РЬг-А (содержащий 351 аминокислотный остаток в цепи мономера), РЬг-В {276 аминокислотных остатков), РЬг-С (232 аминокислотный остаток), РЬг-О (188 аминокислотных остатков), РЬг-Е (120 аминокислотных остатков), РЬг-М (75 аминокислотных остатков), РЬг-Р (58 аминокислотных остатков).

3. Изучение тримеризации делециснных мутантов фибритина и вариантов белка, полученных при помощи сайт-направленного мутагенеза, при экспрессии в клетках Е.соН показало, что последовательность белка содержит один участок, ответственный за инициацию тримеризации - С-концевой домен, который является фолдоном.

4. Делеционные варианты фибритин Е и М использованы для кристаллизации. Получены кристаллы, пригодные для рентгеноструюгурного анализа, что позволило лаборатории завершить определение пространственной структуры белка.

5. Установлено, что ароматические остатки в последовательности фолдона триптофан 477 и тирозин 485 являются критичными дпя эффективной сборки фибритина в тример при экспрессии в клетке.

6. С помощью сайт-направленного мутагенеза получены точечные мутанты фибритина с заменами триптофана 477 нэ тирозин, фенилаланин, серии и лейцин, аспарагииовой кислоты 474 на глицин, валин и аланин, а также глицина 475 на аспарагин и валин.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Sabolev B.N , Shneider М.М., Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V.Adhesiri and fibritin of bacteriophage T4 tail us how fibrous protein fc!ds and assembles. // In Evolutionary Biochemistry ant! Related Areas of Physicochemical Biology, 18ЭБ, Moscow.

2. Kuíter E., Gachechiiadze K., Pogiazov A., Marusich E., Shneider M., Aronsson P., Mapti'i A., Porter D., Mesyanzhinov V.V. Evolution of T4-re!ated phages. // Virus Genes, 1995, V.11, Р.2Б5-2Э7.

3. Strelkov S.V., Tao Y., Rossmar, M.G., Kurochkina L..P., Shneider M.M., Mesyanzhinov V.V. Preliminary crystallographic studies of bacteriophage T4 fibritin confirm a trimeric coi!ed-coil structure. //Virology, 19S6, V.219, P.190-194.

4. Nepluev I.V.. Efimov V.P., Soboiev B.N., Zurabishvili TG., Shneider M M., Sadykova G.K., Seiivanov N.A.. Mesyanzhinov V.V. Structural study of T4 fibrous proteins, // Abstracts от X International Evergreen T4 Meeting, Olympia, Washington, 1993.

5. Mesyanzhinov V.V.. Tao Y., Strelkov S.V., Shneider M.M., Rossman M.G. Structure, folding, and assembly of bacteriophage T4 fibritin.// 1995 Meeting of internatiolna! Research Scholars from the Baltics. Centra! Europe, and the Former Soviet Union , 1996, Prague.

6. Shneider M.M, londet Y.Y., Mesyaramnov V.V. The carboxy-terrninaS domain directs correct assembly of T4 phage fibritin in vivo. // Abstracts of X! Internationa! Evergreen T4 Meeting, Olympia, Washington, 19S6.

7. Ю.Я. Лсндер, M.M. Шнейдер, В.В. Месянжинов С-концевой домен фибритина бактериофага Т4 отвечает за тримеризацию и обеспечивает устойчивость к додецилсульфату натрия. // Тезисы 2-го Биохимического съезда, Москва, 1997.

S.Shneider М.М., Mesyanzhinov V.V. Bacteriophage Г2 fibritin (wac) gene complete cds. //EMBL accesión no. L43611, 19S5.

9. Shneider M.M., Mesyanzhinov V.V. Bacteriophage 0x2 fibritin (wac) gene complete cds. // EMBL accesión no. L43612, 1995.

10. Shneider M.M,, Mesyanzhinov V.V. Bacteriophage КЗ fibritin (wac) gene complete cds. // EMBL accesión no. L43613, 1995.