Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инженерия гомотримерных фибриллярных белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мирошников, Константин Анатольевич, Москва

/#

А

ЮССИИСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А Н. БАХА

на правах рукописи

МИРОШНИКОВ КОНСТАНТИН АНАТОЛЬЕВИЧ

ИНЖЕНЕРИЯ ГОМОТРИМЕРНЫХ ФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

Диссертация на соискание ученой степени Кандидата биологических наук 03.00.03 - молекулярная биология 03.00.04 - биохимия

' Научный руководитель:

л

I доктор биологических наук,

I;

профессор МЕСЯНЖИНОВ В .В.

МОСКВА-1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений 6

Глава I. Введение 7

1.1. Актуальность проблемы 7

1.2. Цели и задачи исследования 8

1.3. Научная новизна и практическая ценность 9

1.4. Основные положения, выносимые на защиту 9

1.5. Апробация работы 10

I.7. Объем и структура работы 10 Глава П. Обзор литературы

II. 1. Фибриллярные адгезины бактериофага Т4. 11

II. 1.1. Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ) 11

II. 1.1.1. Функциональная роль 11 II. 1.1.2. Характеристика белкового комплекса длинных хвостовых

фибрилл 12 II. 1.1.3. Структурная характеристика белков длинных хвостовых

фибрилл 14

II. 1.2. Короткие хвостовые фибриллы (КХФ) 19

II. 1.2.1. Функциональная роль 19

II. 1.2.2. Молекулярная организация 20

II. 1.3. Фибритин бактериофага Т4 23

II. 2. Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT): модель для изучения фолдинга

белка и стабилизации структуры 26

II. 3. Бета-спиральные белки 29

II.3.1. Общие сведения о |3-спиральных белках 31

11.3.2. Свойства ß-спиральной структуры 34

11.3.3. Факторы стабилизации ß-спиральной структуры 40

11.3.4. Петли и спирали как минорные элементы ß-спиральных белков. Роль этих участков в функциональной активности белка 46

11.3.5. Предполагаемые белки с ß-спиральной структурой

и их функции 48 Глава Ш. Материалы и методы

III. 1 Бактериальные штаммы 53

111.2 Среды для выращивания бактерий 53

111.3 Векторы для клонирования. Плазмиды 54 III. 4 Ферменты 59 III. 5 Полимеразная цепная реакция 59 III.6 Выделение и очистка ДНК 62

111.6.1. Очистка амплифицированных фрагментов 62

111.6.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК 62

111.6.3. Очистка линеаризованной плазмидной ДНК 62 III. 7 Приготовление компетентных клеток Е. coli 63 III. 8 Трансформация компетентных клеток E.coli

плазмидной ДНК 63 III. 9 Селекция клонов, содержащих рекомбинантные

Плазмиды 64

III. 10 Экспрессия клонированных генов в Е. coli 64 III. 11 Проверка экспресии в клетках и растворимости

синтезированных белков 65

III. 12 Выделение и очистка белков 65

III. 12.1. Выделение растворимых белков 65

III. 12.2. Очистка белков на основе фибритина ES 66

III. 12.3. Очистка белков на основе фибритина ТВ 1 67 Ш.12.4.0чистка рекомбинантных белков gpl2N2 и

gpl2N3. 67 III. 12.5. Очистка растворимого рекомбинантного

белка gpl2N4. 68

III. 12.6. Выделение и рефолдинг белка gpl2Nl 69

III. 12.7. Очистка белка gpl2FN 69 III. 12.8. Выделение белков gpAd-FA, gpAd-FB, gpAd-FC70

III. 12.9. Выделение и очистка белка CAT-FbrE 71

III. 13. Определение концентрации белка 72

III. 14. Определение олигомерности белка 72

III. 15. Ограниченный протеолиз 72

III. 16. Спектроскопия кругового дихроизма (КД) 73

III. 17. Электронная микроскопия 73 Глава IV. Результаты исследования и их обсуждение

IV. 1. Клонирование и экспрессия фрагментов генов 12 и 37 бактериофага Т4

74

ГУ.2. Выделение, очистка и исследование растворимых делеционных мутантов gpl2M-gpl2N4 76

IV.3. Конструирование химерных белков, содержащих фрагменты gpl2, gp34 и gp37 бактериофага Т4 в качестве С-концевого продолжения фибритина 81

ГУ.3.1. Выделение, очистка и свойства химер на основе фибритина Е с переходным сайтом НрМ (серия конструкций р\¥Е8) 83

IV.3.2. Выделение, очистка и свойства химер на основе фибритина В1 с переходным участком, включающим участок атаки протеиназами и сайт ВатШ (серия конструкций pWTBl) 87

IV.3.3. Свойства химер на основе полноразмерного фибритина J с переходным сайтом ВатШ. (серия конструкций pWJ) 89

IV.3.4. Выделение, очистка и свойства химер на основе фолдона фибритина (фибритина Y) с переходным сайтом ВатШ (серия конструкций pWY) 90

IV.4. Конструирование и исследование химерных белков, содержащих фрагменты gpl2 и gp37 бактериофага Т4 и белка хвостового шипа аденовируса в качестве N-концевого продолжения фолдона фибритина 92

IV. 5. Конструирование и исследование химерного белка, содержащего глобулярный и фибриллярный домены, CAT-FbrE 97

V. Выводы 99

VI. Список литературы 100

VII. Приложения 110

VII. 1. Последовательности праймеров, использованных для ПЦР-амплификации 110

VII.2. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности фибритина бактериофага Т4 с указанием положений праймеров 111

VII. 3. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности gpl2 бактериофага Т4 с указанием положений праймеров 112

VII.4. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности gp34 бактериофага Т4 с указанием положений праймеров 114

VII. 5 Нуклеотидная и аминокислотная последовательности gp37 бактериофага Т4 с указанием положений праймеров 116

VII. 6. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности хвостового шипа аденовируса типа V с указанием положений праймеров 118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. аминокислотный остаток

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДХФ длинные хвостовые фибриллы

КД круговой дихроизм

КХФ короткие хвостовые фибриллы

нт, по нуклеотид, пара оснований

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТЕМЕД - N',N',N',N' - тетраметилэтилендиамин

тетрауксусная кислота

Трис Трис (гидроксиметил) аминометан

Ad аденовирус

АР щелочная протеиназа

CAT хлорамфеникол-ацетилтрансфераза

СоА кофермент А

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

EGT А этиленгликоль бис-(2-аминоэтиловый эфир)-1М, N, N', N' -

Fbr фибритин

HCl соляная кислота

IPTG изопропил-1 -тио—ß-D-галактопиранозид

PAG, PAGE полиакриламидный гель, электрофорез в полиакриламидном геле

Pel В. s. пектатлиаза Bacillus subtilis

PelC и PelE пектатлиазы С и Е Erwinia chrysanthemi

RG-аза рамногалактоуроназа

SDS додецилсульфат натрия

Глава I ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

Фибриллярные белки, выполняющие разнообразные биологические функции, являются одними из наиболее интересных и важных объектов современной молекулярной биологии. Так, вирусные белки фибриллярной природы играют первостепенную роль в процессе инфицирования. Узнавание специфических рецепторов на поверхности клетки-хозяина и адсорбция вируса на мембране происходит именно при помощи фибриллярных адгезинов. Поэтому исследование функциональных участков этих белков, определение их структуры и механизма взаимодействия с рецепторами представляют интерес для разработки способов борьбы с вирусными инфекциями.

Фибриллярные белки также являются удобной моделью для исследования процессов упорядоченной укладки (фолдинга) и олигомеризации белка. Недостаточность сведений о механизмах фолдинга существенно сдерживает дизайн белковых молекул de novo в биотехнологии и белковой инженерии [4]. Известно, что процесс пространственной укладки белка регулируется белками-помощниками (шаперонами) [42], которые стабилизируют частично собранные интермедиаты. При создании рекомбинантных биологически активных белков экспрессия генов в гетерологичных системах часто приводит к аберрантной укладке полипептидов и образованию неспецифических агрегатов, называемых «телами включения 67].

Удобными объектами исследования являются фибриллярные гомотримерные адгезины бактериофага Т4, продукты генов 12, 34 и 37. Другой фибриллярный тримерный белок фага Т4, фибритин (белок воротничковых нитей), детально исследован в нашей лаборатории [35, 88, 89], и его структура решена рентгеновскими методами [92, 95]. Выяснено, что карбоксиконцевой домен фибритина, или фолдон в

нашем определении, отвечает за правильный фолдинг и олигомеризацию белка. Это свойство является полезным при конструировании химерных белков, в которых фолдон фибритина направляет правильную упаковку и олигомеризацию другого белка в обход шаперонного пути.

1.2. Цель и задачи исследования.

Проведенное исследование - установочная часть в белково-инженерном направлении лаборатории молекулярной биоинженерии. Цель работы - получение в растворимой форме рекомбинантных вирусных адгезинов и их первичное физико-химическое исследование. Первой задачей было конструирование делеционных мутантов белков. Второй - создание химерных белковых конструкций, состоящих из фрагментов фибритина различной длины, содержащих фолдон, и фрагментов вирусных адгезинов - gp 12, gp34 и gp37 бактериофага Т4 или хвостового шипа аденовируса типа V. При этом мы варьировали положение домена, направляющего фолдинг, относительно полипептидной цепи химерного белка.

В настоящей диссертации поставлены следующие задачи:

1. Конструирование экспрессионных векторов, несущих гены делеционных мутантов адгезинов, а также гибридных генов фибритин+адгезин.

2. Экспрессия полученных искусственных генов в системе E.coli, проверка растворимости продуцируемых белков, рефолдинг белков, образующих тела включения.

3. Разработка методов выделения и очистки растворимых делеционных мутантов и химерных белков.

4. Первичное исследование физико-химических параметров полученных белков - числа субъединиц, присутствия структурных элементов по КД-спектру, биологической активности.

5. При возможности - изучение структуры белка с помощью электронной микроскопии и подбор условий для кристаллизации белка.

1.3. Научная новизна и практическая ценность

В настоящем исследовании впервые разработана и экспериментально подтверждена стратегия использования ранее известного зародышевого ядра (фолдона) фибритина для управления сворачиванием и олигомеризацией другого тримерного фибриллярного белка в обход шаперонного пути. В ходе исследования сконструирован ряд векторов, несущих фрагменты гена фибритина. Эти вектора могут служить универсальными матрицами для клонирования различных генов с целью получения химерных белков, в том числе, возможно, и для конструирования белков со встроенными антигенными детерминантами различных вирусов.

Впервые получены химерные белки, имеющие фибриллярную тримерную организацию, а также ряд делеционных мутантов ёр12 бактериофага Т4. Разработаны методы выделения и очистки этих белков. Перевод фрагментов ряда адгезинов в растворимую форму и изучение свойств этих белков позволили получить ряд новых сведений об их структуре и функциях.

1.4. Основные положения, выносимые на защиту

1. Клонирование серии фрагментов генов 12 и 37 бактериофага Т4.

2. Конструирование векторов, экспрессируюгцих гибридные гены, состоящие из фрагмента гена м>ас и фрагментов генов 12, 34, 37 бактериофага Т4 и гена хвостового шипа аденовируса тип V.

3. Разработка методов препаративного выделения и очистки полученных делеционных мутантов и химерных белков.

4. Анализ структурированности полученных растворимых белков методами КД-спектроскопии, ограниченного протеолиза и электронной микроскопии.

1.5. Апробация работы

Материалы диссертации изложены в 2 опубликованных статьях. Результаты исследований были доложены на 4-х конференциях в виде стендовых докладов и в виде пленарного сообщения на IV чтениях памяти Ю.А. Овчинникова (1998). Тезисы исследований, вошедших в диссертацию, удостоены поощрительного гранта Конкурса-экспертизы 1997г. научных проектов молодых ученых РАН по фундаментальным и прикладным исследованиям (постановление президиума РАН №272 от 13.07.98)

1.6. Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора научной литературы, в котором обобщены сведения о белках-объектах исследования, описания методической части, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем работы составляет Мб страниц машинописного текста, иллюстрированного 9 таблицами и 37 рисунками. Список литературы включает 112 наименований.

Глава П

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

П.1. Фибриллярные адгезины бактериофага Т4. П.1.1. Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ)

II. 1.1.1 .Функциональная роль

Адсорбция бактериофага Т4 на поверхность бактерии Е. coli начинается с поиска специфических рецепторов клеточной стенки бактерии, который осуществляется длинными хвостовыми фибриллами [85]. Мутанты бактериофага, в которых отсутствуют длинные фибриллы, неинфекционны [104]: хотя присоединение таких мутантов к бактерии и наблюдается, оно не сопровождается сокращением хвостового отростка и вводом фаговой ДНК в [105]. Известно, что для необратимого связывания фага с клеточной стенкой требуется присоединение всех длинных и коротких фибрилл [86], однако точное количество рецепторов, необходимое для этого, не определено. При взаимодействии с рецепторами трех длинных хвостовых фибрилл из шести связывание фага с клеткой является обратимым [27].

Процесс прикрепления бактериофага Т4 к клетке Е. coli осуществляется за счет взаимодействия дистального (удаленного от базальной пластинки) окончания длинных хвостовых фибрилл с липополисахаридами рецепторов клетки [16]. Непосредственной группой взаимодействия является терминальная а-(1-4)-глюкоза в глюкозо-гептозном участке липополисахаридного рецептора [29]. Адсорбция фага с помощью длинных фибрилл непосредственно сопряжена с механизмом запуска структурной перестройки базальной пластинки, в результате которой происходит сокращение чехла и ввод ДНК в клетку [27, 28]. Считается [28], что длинные хвостовые фибриллы передают сигнал (вероятно, через медиатор - белок gp9) о наличии соответствующих рецепторов, после чего начинается конформационная перестройка базальной пластинки. Возможно,

длинные хвостовые фибриллы определяют позицию, необходимую для ориентации базальной пластинки параллельно рецепторному участку клетки. Последующее прикрепление к клеточной стенке с помощью коротких фибрилл завершает перестройку базальной пластинки [44].

II. 1.1.2. Характеристика белкового комплекса длинных хвостовых фибрилл

Препарат длинных хвостовых фибрилл был впервые выделен в 1959 г. в результате разрушения фага [20]. В дальнейшем были разработаны методики получения длинных хвостовых фибрилл и в неденатурирующих условиях [1, 10]. Согласно результатам электронной микроскопии длинные хвостовые фибриллы имеют размеры 150 х 4.5 нм с утолщением в середине, которое разделяет их на две части по отношению к базальной пластинке фага - проксимальную (прилежащую к базальной пластинке) и дистальную (удаленную) [103]. Дистальная и проксимальная половинки фибрилл соединены под углом около 156°. Соединены они жестко, но нековалентно. С базальной пластинкой длинные фибриллы связаны подвижно, что позволяет им перемещаться относительно частицы фага. После высвобождения из инфицированной клетки, или находясь в среде с низкой ионной силой, длинные хвостовые фибриллы взаимодействуют своими дистальными половинками с воротничковыми нитями бактериофага, принимая, таким образом, поднятое положение [103].

Гены, контролирующие синтез и сборку длинных хвостовых фибрилл, были открыты и изучены при использовании различных амбер-мутантов бактериофага Т4 [34]. В формировании фибрилл участвуют шесть генов, из которых четыре кодируют структурные белки - gp 34, gp35, gp36 и gp37, а два белка - gp 38 и gp57 - участвуют в сборке, не включаясь в конечную структуру. Впоследствии был определена

нуклеотидная последовательность генов и аминокислотный состав этих структурных белков [1, 33, 70].

t

Стехиометрия белкового комплекса длинных хвостовых фибрилл в течение длительного времени была темой для дебатов. Данные, полученные при исследовании белков расчетными методами [31], анализом нуклеотидной последовательности генов [103], количественным SDS-электрофорезом с использованием красителей [54] и радиоактивных меток [51], ультрацентрифугированием [100] и сканирующей электронной микроскопией (STEM) [21], существенно различались. Долгое время считалось, что стехиометрическое соотношение структурных белков длинных хвостовых фибрилл gp35:gp34:gp36:gp37 = 1:2:2:2 [1, 100]. По мере накопления сведений о структурной организации других фибриллярных белков вирусной природы -адгезинов колифага Т7 [61], фага Р22 [90], аденовируса тип V [91], а также коротких хвостовых фибрилл бактериофага Т4 [62], все из которых являются тримерами, и совершенствования экспериментальных методик, была выдвинута гипотеза [21], что для длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 также характерна тримерная организация, структурных белков, т.е. стехиометрическое соотношение белков gp 35: gp 34: gp 36: gp37= 1:3:3:3.

Как показывают экспериментальные данные, проксимальная часть длинных хвостовых фибрилл являются гомоолигомером gp34. Дистальная же часть сформирована продуктами трех генов - 35,36и37 (рис.1) [31, 103]. Сборка дистальной половинки начинается с тримеризации gp 37, в результате чего образуется предшественник фибриллы длиной около 65 нм [103]. На следующем этапе присоединяются три копии gp36 с удлинением предшественника на 17 нм [103]. Формирование длинных хвостовых фибрилл завершается присоединением одной копии gp35, выполняющего роль соединителя двух половинок фибрилл (рис.1).

Таблица 1. Молекулярные массы белков длинных хвостовых фибрилл [21, 28, 31, 1031_

Белок Молекулярная масса, кДа Молярное соотношение

БР34 120 - 160 2.63+0.14

ЕР 37 100-130 2.8 + 0.2

БрЗб 24-27 3.12+0.15

8Р 35 31-40 1