Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли конденсинов в формировании высших уровней организации хроматина и структурно-функциональной организации ядрышка

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли конденсинов в формировании высших уровней организации хроматина и структурно-функциональной организации ядрышка"

На правах рукописи Тимирбулатова Эльмира Раисовна

УДК 576.315.42

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ КОНДЕНСИНОВ В ФОРМИРОВАНИИ ВЫСШИХ УРОВНЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМАТИНА И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ЯДРЫШКА

I

03.00.25

I

гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Института Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (директор - академик РАН В.П. Скулачев) Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель

кандидат биологических наук Игорь Игоревич Киреев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доктор биологических наук,

Глеб Иванович Кирьянов Владимир Иванович Попенко

Ведущая организация:

Институт Цитологии РАН.

Защита состоится "20 " иОл^А- _2003 г., в часов на заседании

диссертационного совета Д 501.001.52 при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Россия, Москва, Ленинские Горы, д. 1, корп. 12, Биологический факультет МГУ, ауд._ мч

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан:'

2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ___—i E.H. Калистратова

: ——^ E.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Хромосомы эукариотических клеток представляют собой сложную систему многоуровневой упаковки ДНК. Специфическая упаковка хроматина необходима для правильной сегрегации геномов в митозе и мейозе, а также для регуляции генной экспрессии в клеточном цикле. Принципы структурной организации высших уровней компактизации хроматина и молекулярные механизмы, лежащие в основе их формирования, на сегодняшний день изучены недостаточно.

В течение последних лет были описаны и частично охарактеризованы белки, которым приписывается решающая роль в специфической компактизации хроматина в митотических хромосомах. К таким белкам относят так называемые SMC белки (Structural Maintenance of Chromosomes) (Strunnikov et al., 1993; Hirano and Mitchison, 1994). Показано, что они участвуют в митотической конденсации хромосом, когезии сестринских хроматид, рекомбинационной репарации ДНК, а также в процессах, связанных с компенсацией дозы гена (Hirano et al., 1994; Saka et al., 1994; Michaelis et al., 1997; Guacci et al., 1997; Jessberger et al., 1996, Chuang et al., 1994; Chuang et al., 1996).

В экстракте яиц Xenopus laevis были идентифицированы белки ХСАР-С и ХСАР-Е, принадлежащие к семейству SMC. Вместе с дополнительными субъединицами, белками ХСАР-Н, XCAP-G и pEg7 они образуют мультикомплексы - конденсины, выполняющие важную роль в митотической конденсации хромосом (Hirano et al., 1997; Kimura and Hirano, 1997, Cubizolles et al., 1998). Были выделены два комплекса конденсинов с коэффициентами седиментации 8S и 13S (Hirano et al., 1997; Kimura and Hirano, 1997; Losada et al., 1998). О возможном участии 13S конденсинового комплекса в компактизации митотических хромосом косвенно свидетельствует тот факт, что его связывание специфическими антителами вызывает нарушение конденсации хромосом в системе in vitro, а добавление приводит к восстановлению нормальной структуры хромосом (Hirano, 1998; Cubizolles et al., 1998). В других экспериментах показано, что отдельные компоненты 13S комплекса гиперфосфорилируются cdc2 киназой в начале митоза, и, следовательно, могут играть регуляторную роль в процессе конденсации хромосом (Hirano, 1998). Функциональное значение комплекса 8S остается неясным.

В настоящее время существует несколько гипотез о механизме действия конденсинов. Одна из них связана с формированием своеобразных структурных "скрепок", которые обеспечивают митотическую конденсацию хромосом и поддерживают специфическую организацию макромолекулярных комплексов хроматина в митозе (Strunnikov et al., 1993).

Недавно представители комплекса конденсинов были обнаружены в ядрышках интерфазных клеток HeLa (Cabello et al., 2001). Кроме того, субпопуляции конденсинового комплекса человека описаны в виде мелких точек в ядрах клеток HeLa (Schmiesing et al., 2000). По предположению Cabello et al (2001) в ядрышках конденсины связаны с околоядрышковым хроматином и участвуют в перестройках рибосомной ДНК. Эта гипотеза согласуется с данными, полученными методом иммунопреципитации, по которым у Saccharomyces cerevisiae конденсины ассоциированы с рибосомальной ДНК (Freeman et al., 2000).

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы было исследовать локализацию двух субъединиц 13S конденсинового комплекса, белков ХСАР-Е и pEg7, на разных стадиях клеточного цикла, изучить характер их взаимодействия с хромосомами при искусственном изменении степени компактизации митотических хромосом, а также исследовать связь конденсинов с ядрышком в зависимости от функционального состояния последнего. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить, как меняется экспрессия белков ХСАР-Е и pEg7 в клеточном цикле.

2. Исследовать локализацию ХСАР-Е и pEg7 в митотических хромосомах в норме и при искусственном изменении структурного состояния хромосом в живой клетке.

3. Изучить локализацию белков ХСАР-Е и pEg7 в интерфазе на светооптическом и ультраструктурном уровнях.

4. Изучить локализацию белка ХСАР-Е в ядрышке при ингибировании синтеза и процессинга рРНК.

5. Исследовать связь ХСАР-Е с ядерным матриксом.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: основные результаты были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 2000), Всероссийском совещании "Клеточная биология на пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 2001), на XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2002), а также на семинарах в НИИФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ и на кафедре цитологии, гистологии, клеточной биологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научная новизна и практическое значение работы: Впервые детально проанализирована субдоменная локализация белка ХСАР-Е в ядрышке на светооптическом и улыраструкгурном уровнях. Показано, что этот белок связан с гранулярным и плотным фибриллярным компонентами ядрышка. Ассоциация ХСАР-Е с гранулярным компонентом

не зависят от уровня транскрипционной активности и процессинга рРНК. Показано, что белок ХСАР-Е связан с остаточным ядрышком в препаратах ядерного матрикса и эта связь прямо или косвенно опосредована взаимодействием с РНК. Впервые показано, что при искусственном изменении структурного состояния хромосом в живых клетках восстановление структуры хромосом происходит без участия конденсинов. Показано, что блокирование хромосом в конденсированном состоянии in vivo под действием цитостатических агентов приводит к диссоциации конденсинов без нарушения структуры хромосом. Таким образом, впервые получены экспериментальные данные, позволяющие по-новому взглянуть на функции конденсинов в клеточном цикле.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Список сокращений-. БСА - бычий сывороточный альбумин; ДНКаза дезоксирибонуклеаза I; ДРБ - 5.6-дихлоро-1р-д-рибофуранозид-бензимидазол; РНКаза-рибонуклеаза А; ФСБ - фосфатно-солевой буфер; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; DAPI - 4'6-Diamidino-2'-phenylindole; PMSF - phenilometansylphoniñorid.

1. Клеточная культура. В работе использовали клеточную культуру XL2 (Xenopus laevis). Клетки выращивали в культуральных флаконах "Falcon" (США) и на покровных стёклах в чашках Петри в среде Лейбовица L-15, "ICN" (США) с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы, "Вектор" (Россия) и антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и амфотерицин в концентрациях 100 мкг/мл, 100 мкг/мл и 25 мкг/мл соответственно) при температуре 25° С, как было описано ранее (Uzbekov et al., 1998).

2. Синхронизация клеток культуры XL2. Для синхронизации клеток линии XL2 использовался протокол, описанный ранее (Uzbekov et al., 1999) с модификациями. Состав scsx клеточных фракций контролировался мечением BrdU. ?*4итотичесхие клетки были подсчитаны прямым наблюдением в фазовоконтрастный микроскоп.

3. Электрофорез белков и иммуноблотинг. Синхронизованные клетки были соскоблены с поверхности флаконов специальным скребком "Sigma" (США) с одновременным добавлением трёхкратного лизируюшего буфера Лэммли (Laemmli, 1970). Лизаты были обработаны ультразвуком, нагреты до 90° С в течение 5 минут и стандартизованы по концентрации клеток добавлением буфера Лэммли, содержащего 1% SDS, 5% Ь-меркаптоэтанол, 125 мМ TRIS-HC1, рН 7.2, бромфеноловый синий - до синей окраски.

Количество белков в пробах определяли по методу Шаффнера и Вейсмана (1973).

Электрофорез проводили по модифицированному методу Лэммли (1970). С

нефиксированного геля белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану при помощи электропереноса. Мембраны были разрезаны для последующей раздельной окраски специфическими антителами и блокированы в 4 последовательных сменах TBST буфера (20 мМ TRIS-HC1, pH 7.6, 137 мМ NaCl, 0.1% Tween), содержащего 5% сухого обезжиренного молока в течение 1 часа при комнатной температуре. Эта и все последующие инкубации были проведены при постоянном помешивании на качалке. Далее мембраны были проинкубированы в растворе соответствующих специфических антител (моноклональные антитела против бета-тубулина, ДНК топоизомеразы Па и pEg2 и афинно очищенные поликлональные антитела против ХСАР-Е и pEg7) на TBST, содержащем 5% сухого молока при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем мембраны промывали 3 раза по 10 минут в TBST, содержащем 5% сухого молока и инкубировали в растворе соответствующих вторых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена в разведении 1:500 на буфере TBS, содержащем 1% БСА (использовались антимышиные антитела для мембран, инкубированных с первьми антителами против бета-тубулина или ДНК топоизомеразы Па и pEg2 и антикроличьи для мембран, инкубированных с первыми антителами против ХСАР-Е и pEg7). Инкубацию полос проводили в течение 2 часов, несвязавшиеся антитела отмывали тремя сменами TBS с 0.05% Tween-20 и двумя сменами TBS. Для проявления блота использовали раствор 3,3'-диаминобензидина в буфере TRIS-HC1.

4. Гипотонические воздействия. Клетки инкубировали в смеси 30% среды L-15 и 70% дистиллированной воды в течение 5, 15 и 30 минут. Затем клетки споласкивали 30 % физиологическим солевым буфером (ФСБ), фиксировали 3% параформальдегидом на 30% ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре, пермеабилизовали в растворе, содержащем 0.5% Triton XI00 на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре, и окрашивали антителами по методике, описанной далее.

5. Цитостатические воздействия. Клетки инкубировали в среде с нокодазолом или таксолом в конечных концентрациях 0.5 мкг/мл или 10 мкг/мл, соответственно. Время инкубации было 3 или 6 часов. Затем клетки отмывали ФСБ от сыворотки, фиксировали 3% параформальдегидом на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре и лизировали в растворе, содержащем 0.5% Triton XI00 на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем окрашивали антителами по методике, описанной далее.

6. Иммуноцитохимический анализ Для иммуноцитохимического выявления белков ХСАР-Е и pEg7 фиксированные и пермеабилизовашше клетки инкубировали в ФСБ,

содержащем 3% БСА в течение 30 минут при комнатной температуре для минимизации неспецифического связывания антител. Далее клетки инкубировали в ФСБ, содержащем 1% БСА и афинно очищенные поликлональные антитела против pEg7 или против ХСАР-Е (Strunnikov, 1998) в разведении 1:100 в течение 45 минут при 37°С.

В качестве маркеров различных компартментов ядрышек использовались монокпональные антитела против В23 (Bulycheva et al., 2000), человеческие аутоиммунные антитела против фибрилларина или UBF (Hernandez-Verdun). Клетки инкубировали в 1% растворе БСА па ФСБ, содержащем антитела к В23 или фибрилларину или UBF в разведении 1:100. В качестве маркера кольчатых телец использовались человеческие аутоиммунные антитела против кошгана (М. Bellini). Клетки инкубировали в растворе антител (1:100) на ФСБ, содержащем 1% BSA в течение 45 минут при температуре 37°С. Затем клетки промывали ФСБ 3 раза по 10 минут и инкубировали со вторыми антикроличьими антителами коньюгированными с TRITS, "Sigma" (США) и со вторыми античеловеческими антителами, коньюгированными с FITC, "Sigma" (США) на буфере ФСБ с 1% БСА в течение 35 минут при температуре (разведение вторых антител 1:50). Клетки промывали ФСБ 3 раза по 10 минут, окрашивали DAPI, "Sigma" (США), в конечной концентрации 1 мкг/мл, в течение 10 минут и заключали в Mowiol, "Calbiochem" (США).

Для иммунофлуоресцентного выявления BrdU после 30 минут (для определения клеток в S фазе) или 33 часов (для определения клеток в Go) инкубации в среде, содержащей 40 мМ BrdU, "Sigma" (США), клетки трижды промывали ФСБ, затем фиксировали 30 минут в 70% этаноле при комнатной температуре. Далее клетки снова промывали ФСБ и помещали для гидролиза в 4M NaCl на 20 минут. После отмывки кислоты в ФСБ клетки инкубировали в растворе моноклональных мышиных антител против BrdU, "Sigma" (США) в ФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре, далее промывали 3 раза по 10 минут ФСБ и инкубировали со вторыми, коньюгированными с Texas-Red антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем препараты заключали в Mowiol, "Calbiochem" (США).

Препараты просматривали и фотографировали на микроскопе Opton-Ш, оборудованном ПЗС-камерой АТ-200 с воздушным охлаждением, "Photometries" (США). 7. Воздействие актиномицином Д или ДРБ. Клетки инкубировали в среде, содержащей 5 мкг/мл актиномицина Д в течение 6 часов или в среде, содержащей 100 мкг/мл ДРБ в течение 6 часов. Затем клетки споласкивали ФСБ, фиксировали 3% параформальдегидом на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре, лизировапи в растворе,

содержащем 0.5% Triton XI00 на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре, и окрашивали антителами.

8. Получение нуклеоидов. Нуклеоиды получали по методу Шеваля и Полякова (2002). Клетки быстро промывали ФСБ, затем лизировали 0.5% раствором Triton Х-100 на буфере, содержащем 50 мМ TRIS-HC1 (рН 7.4), 5 мМ MgCl2,1 мМ CuS04,1 мМ PMSF в течение 10 минут. Затем клетки промывали в том же буфере, но без Triton Х-100 и обрабатывали раствором, содержащем 2М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ TRIS-HC1 (рН 7.4) в течение 6 минут. Клетки фиксировали 3% раствором параформальдегида на том же буфере и окрашивали антителами.

9. Обработка нуклеазами. Энзиматической обработке подвергались клетки, пермеабилизованные в ФСБ или в условиях получения стабилизированного ядерного матрикса по методу (Шеваль, Поляков, 2002).

Клетки, пермеабилизованные в ФСБ обрабатывали ДНКазой в концентрации 250 мг/мл на ФСБ с добавлением 5 мМ MgCfe или РНКазой в концентрации 200 мг/мл на ФСБ в течение 30 минут при температуре 37° С. Клетки фиксировали 3% параформальдегидом на ФСБ.

Нуклеоиды обрабатывали 250 мг/мл ДНКазой на буфере, содержащем 50 мМ TRIS-НС1 (рН 7.4), 5 мМ MgCl2, 1 мМ CuS04, 1 мМ PMSF в течение 30 минут или 200 мг/мл РНКазой на том же буфере при температуре 37° С. Затем обрабатывали раствором, содержащем 2М NaCL, ЮмМ ЭДТА, 20 мМ TRIS-HC1 (рН 7.4) в течение 6 минут, фиксировали 3% раствором параформальдегида на том же буфере и окрашивали антителами.

10. Электронная микроскопия. В работе использовали стандартную процедуру подготовки образцов для электронно-микроскопического исследования (Миронов и др., 1994).

Для иммуно-электронной микроскопии клетки, культивируемые на стёклах фиксировали 3% раствором параформальдегида 10 минут, лизировали 0,5% Triton Х-100 10 минут, инкубировали в фосфатном буфере, содержащем 3% BSA в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее клетки инкубировали в растворе антител против ХСАР-Е (1:50) на фосфатном буфере, содержащем 1% BSA в течение 45 минут при температуре 37°С. Клетки промывали ФСБ 3 раза по 10 минут и инкубировали со вторыми антикроличьими антителами, конъюгированными с 5 нм золотом, "Sigma" (USA) 1:50 в ФСБ, содержащем 1%BSA 12 часов. После промывки клетки фиксировали 2,5% раствором

глютарового альдегида на фосфатном буфере Зёренсена, обрабатывали боргидридом в концентрации 1 мг/мл 2 раза по 10 минут при комнатной температуре и проводили процедуру усиления лактатом серебра по Danscher et al. (1987).

Клетки промывали дистиллированной водой, обезвоживали в возрастающих концентрациях этанола и абсолютном ацетоне, и далее проводили пропитку образцов в смесях ацетона с эпоном (смесь ЭПОН 812). После пропитки клетки заключали в заливочную смесь ЭПОН 812 и проводили полимеризацию смолы в течение суток при 37° С и далее в течение двух суток при 60° С. Ультратонкие срезы 600-800 А получали с помощью ультратома LKB-III. Срезы контрастировали 2% раствором цитрата свинца (по Рсйнольдсу, 1963) и 2% водным раствором уранилацетата и фотографировали на микроскопе HU-1 IB (Hitachi, Japan).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Количество белков ХСАР-Е и pEg7 в клетке остаётся постояннным на протяжении клеточного цикла.

Чтобы ответить на вопрос о том, присутствуют ли белки, входящие в состав конденсиновых комплексов в клетке на других стадиях клеточного цикла, возрастает ли их количество при вхождении клетки в митоз и снижается ли при переходе в Gi, был проведён количественный анализ белков ХСАР-Е, pEg7 и топоизомеразы Па в синхронизованных клеточных популяциях с помощью иммуноблотинга.

В качестве стандарта использовался белок бета-тубулин, количество которого возрастает пропорционально клеточной массе и к концу интерфазы удваивается (Weisenberg, 1972). Уровни исследуемых белков в клеточном цикле были отнесены к уровню бета-тубулина в соответствующей фракции, отношение во фракции "Gi" было принято за 1.

От Gi фазы до митоза количество белка pEg2 возрастало более чем в 15 раз. Уровень топоизомеразы II был максимальным в G2 фазе (примерно в 3.5 раза выше, чем в Gi) и оставался таким во время митоза, что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными (Heck et al., 1988; Drake et al., 1989; Woessner et al., 1991). Напротив, уровень экспрессии ХСАР-Е и pEg7 медленно повышался при переходе от Gi фазы к митозу. В митозе уровень этих белков был менее чем в 2 раза выше по сравнению с Gi.

Таким образом, можно говорить о том, что уровень белков ХСАР-Е и pEg7 лишь незначительно повышается одновременно с увеличением размеров клеток.

2. Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических хромосомах.

Характер распределения антител к белку ХСАР-Е на митотических хромосомах различается в зависимости от фазы митоза. Начиная с ранней профазы, антитела к ХСАР-Е локализуются в аксиальных районах хромосом в виде дискретных блоков. На этой стадии митоза в кариоплазме видны гомогенно флуоресцирующие ядрышки, размеры которых значительно меньше интерфазных. В метафазе и анафазе интенсивность флуоресценции хромосом возрастает. На этих стадиях митоза антитела взаимодействуют только с аксиальными областями хроматид. При этом сохраняется дискретность флуоресценции, а в сестринских хроматидах выявляется симметричное расположение слабо и сильно флуоресцирующих зон. В ранней телофазе интенсивность флуоресценции хромосом резко снижается и в средней телофазе, одновременно с началом их деконденсации, белок ХСАР-Е перестаёт выявляться на хромосомах и выявляется в нуклеоплазме. Одной из особенностей распределения белка ХСАР-Е в делящихся клетках является то, что сильная флуоресценция антител наблюдается в полюсах митотического веретена. Характер локализации белка pEg7 в митотических клетках принципиально не отличается от распределения ХСАР-Е, однако в полюсах митотического веретена метка не выявляется.

3. Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках, подвергнутых гипотоническому шоку.

Одним из подходов для анализа функциональной роли конденсинов и характера их взаимодействия с хромосомами может служить индуцированное изменение компактизации митотических хромосом in vivo. Искусственное изменение структурного состояния хромосом в живых клетках вызывали инкубацией клеток в гипотонической среде. Такое воздействие является структурно обратимым, поэтому можно установить связь между присутсвием конденсинов и структурной целостностью хромосом. Обработка живых клеток 30% раствором среды L-15 в течение 5 минут приводит к увеличению диаметра хромосом и одновременно снижает интенсивность их окрашивания красителем DAPI. Таким образом, гипотоническое воздействие на живые клетки вызывает частичную деконденсацию митотических хромосом. Общая морфология хромосом в этих условиях сохраняется. Через 15 минут инкубации начинается постепенная адаптация клеток к гипотонической среде, сопровождающаяся реконденсацией хромосом; примерно через 30 минут внешний вид хромосом близок к исходному. Анализ распределения белков pEg7 и ХСАР-Е в клетках, подвергнутых гипотоническому шоку, показывает, что в фазе

деконденсации наблюдается их частичный выход в цитоплазму. В то же время, в телах деконденсированных хромосом сохраняются тонкие аксиальные структуры, состоящие из мелких флуоресцирующих гранул. Через 30 минут после начала воздействия, когда наступает фаза реконденсации, антитела к pEg7 и ХСАР-Е перестают окрашивать хромосомы и выявляются в цитоплазме .

4. Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках после воздействия цитостатиков.

В ходе митоза конденсины постоянно сохраняют ассоциацию с конденсированными хромосомами. Эта ассоциация может быть следствием их функциональной активности, а может служить способом их переноса в дочерние клетки. В связи с этим необходимо исследовать поведение копденсинов в хромосомах, пребывающих в конденсированном состоянии длительное время. Такого состояния можно достичь, обрабатывая митотические клетки цитостатиками. Для этой цели использовались нокодазол и таксол. Клетки инкубировали в среде, содержащей 0.5 мкг/мл нокодазола или 10 мкг/мл таксола, фиксировали через разные промежутки времени и окрашивали антителами к белкам ХСАР-Е и pEg7. В течение 6 часов наблюдений происходило накопление метафазных клеток, при этом хромосомы в них сохраняли компактную структуру. Важно отметить, что в данных условиях не наблюдалось реверсии митоза, то есть перехода клеток в интерфазу без расхождения хромосом. При этом, в клетках, обработанных нокодазолом, антитела к pEg7 и к ХСАР-Е перестают окрашивать хромосомы уже через 3 часа после начала воздействия. В клетках, инкубированных в среде, содержащей таксол, также наблюдается постепенный выход белхов и ХСАР-Е из митотических. Можно предположить, что отсутствие окрашивания хромосом связано с их суперкомпактизацией. Поэтому в качестве контроля использовались антитела к топоизомеразе П. В этих условиях антитела выявляют топоизомеразу П в осевых областях компактизованных хромосом, что делает данное предположение маловероятным.

5. Локализация белков ХСАР-Е, pEg7 и некоторых белков ядрышка в интерфазных клетках.

Как следует из экспериментов по анализу уровня экспрессии белков ХСАР-Е и pEg7, их количество в течение клеточного цикла остаётся постоянным. В связи с этим, возникает вопрос об их функциональной роли в интерфазе. Для ответа на этот вопрос был проведен иммуноцитохимический анализ локализации белков ХСАР-Е и pEg7 в интерфазных клетках.

В интерфазных клетках линии XL2 при окрашивании антителами к белку ХСАР-Е интенсивно флуоресцируют ядрышки и несколько (1-4) мелких глобулярных структур в кариоплазме. Слабая флуоресценция наблюдается также в кариоплазме. Двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и флуорохромом DAPI показывает, что белок ХСАР-Е не связан с околоядрышковым хроматином. Следует отметить, что локализация исследуемого белка в ядрышке не зависит от фазы клеточного цикла, поскольку окрашивание ядрышка наблюдается во всех интерфазных клетках.

Несмотря на некоторые данные о локализации субъединиц конденсинового комплекса в ядрышках (Cabello et al., 2001; Freeman et al., 2000), в настоящее время отсутствуют сведения о внутриядрышковой компаргментализации этих белков. С этой целью было использовано двойное окрашивание клеток линии XL-2 антителами к ХСАР-Е и антителами к маркерным белкам внутриядрыппсовых доменов. В ядрышках белок ХСАР-Е ко локализуется с В23. Оба белка располагаются на периферии ядрышек в виде сплошной сферы или одной - трёх полусфер, окружающих фибриллярные комплексы. С фибрилларином наблюдается лишь частичная колокализация, с белком UBF колокализации нет. Эти данные подтверждает ультраструктурный анализ распределения антител, конъюгированных с золотом: ХСАР-Е локализован в гранулярном и плотном фибриллярном компонентах ядрышка. В фибриллярных центрах ХСАР-Е не выявляется.

При сходных условиях фиксации, белок pEg7 в составе интерфазных ядрышек не выявляется. В интерфазных клетках антителами к этому белку интенсивно окрашивается кариоплазма. Однако, модификация процедуры фиксации, в частности использование метанольной фиксации и метанольной фиксации с предварительным лизисом в Triton XI00 позволяет визуализовать этот белок в составе периферичесих районов ядрышка.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что некоторые субъединицы конденсиновых комплексов входят в состав гранулярного компонента ядрышка. 6. Влияние актиномицина и ДРБ на локализацию ХСАР-Е в ядрышках интерфазных клеток.

Для того, чтобы ответить на вопрос о возможных функциях конденсинов в ядрышке, клетки подвергались воздействию актиномицина Д и ДРБ. Поскольку в гранулярном компоненте ядрышка происходят терминальные этапы процессинга и сборка прерибосомных частиц (Olson et al., 2000), ингибирование синтеза рРНК приводит к истощению пула зрелой рРНК и рибосом. Поведение конденсинов в этих условиях может отражать характер их взаимодействия с различными компонентами ядрышка.

Длительная инкубация клеток линии XL-2 с актиномицином Д приводит к сегрегации ядрышка на компартменты, содержащие гранулярный и фибриллярный компоненты. Антитела против ХСАР-Е гомогенно окрашивают лишь часть сегрегированного ядрышка. Двойное окрашивание клеток антителами и DAPI показало, что зона распределения антител в ядрышке не совпадает с зонами конденсиованного хроматина. Двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и белкам В23, фибрилларину и UBF показало, что в таких ядрышках белок ХСАР-Е колокализуется только с белком В23 и не колокализуется с UBF и фибрилларином. На ультраструкгурном уровне антитела, меченые ' коллоидным золотом выявляются в гранулярном компартменте сегрегированного ядрышка.

В фибриллярном компартменте метка отсутствует. V После инкубации клеток с ДРБ, композиция гранулярного компонента ядрышка

практически не изменяется, а крупные фибриллярные комплексы диссоциируют на несколько более мелких структур, содержащих фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент. Двойное окрашивание ядрышек антителами к ХСАР-Е и белкам В23 и фибрилларину показывает, что ХСАР-Е колокализуется с В23, но не колокализуется с фибрилларином и UBF. На ультраструктурном уровне после воздействия ДРБ антитела к ХСАР-Е декорируют в сегрегированных ядрышках зоны, соответствующие гранулярному и плотному фибриллярному компонентам. В остаточном материале фибриллярных центров метка отсутствует.

7. Иммунолокализация белков ХСАР-Е и коипина в интерфазных клетках.

Как было указано выше, помимо ядрышек, в большинстве ядер интерфазных клеток белок ХСАР-Е выявляется в составе небольших глобулярных структур в кариоплазме. Их количество варьирует от 2 до 5 на ядро, а размер от 0.2 до 1 мкм. Белок В23 колокализуется с ХСАР-Е только в крупных таких структурах и отсутствует в мелких. Известно, что * другими внутриядерными структурами, содержащими белок В23, являются так

называемые тельца Кахаля, или кольчатые тельца (Gall, 2001). В связи с этим, проводилось » окрашивание клеток XL-2 антителами к коилину - маркерному белку кольчатых телец.

Полученные данные показывают, что коилин локализуется в кариоплазме некоторых клеток в виде многочисленных мелких глобулярных фокусов. Однако в этих фокусах не наблюдается колокализации коилина с белком ХСАР-Е. Таким образом, глобулярные тельца, содержащие белок ХСАР-Е не являются эквивалентом кольчатых тел, а, скорее, представляют собой особый тип внутриядерных компонентов.

Помимо ядрышек и кариоялазматических структур, в интерфазных ядрах наблюдается слабая флуоресценция антител к ХСАР-Е в кариоплазме. На ультраструктурном уровне, после окрашивании антителами, коньюгированными с золотом, метка выявляется во всем объеме ядра в связи с ДНП-фибриллами.

Обработка клеток ДНКазой приводила к полному гидролизу ДНК, что видно по окраске DAPI. После такого воздействия антитела к ХСАР-Е гомогенно окрашивали ядрышки и цитоплазму. j

После воздействия на клетки, лизированные в ФСБ РНКазой, антитела к ХСАР-Е не выявлялись в ядрышках, однако наблюдалось сильное окрашивание цитоплазмы. ''

8. Локализация ХСАР-Е в нуклеоидах и ядерном матриксе. (

Наличие в структуре SMC белков участков, образующих при димеризации coiled-coil структуры, характерные для многих белков, способных образовывать фибриллярные >

структуры (например белки промежуточных филаментов), позволило высказать предположение о скелетной роли SMC белков в структурной организации хромосом (Stnmnikov, 2000). Нельзя исключить, что подобную функцию эти белки выполняют и в ядрышке. Для ответа на этот вопрос были проведены эксперименты по получению |

ядерного матрикса. j

Полученные в условиях стабилизации ядерного матрикса нуклеоиды имеют типичную структуру: они представлены остаточными ядрами с фибриллярно-гранулярной сетью I

ДНК-содержащего материала и окружающим их гало, содержащим ДНК (Cook and Brazell, '

1975; Lebkowski and Laemmli, 1982; Шеваль и Поляков, 2002). В этих условиях вокруг ядрышек четко выявляются зоны, интенсивно окрашенные DAPI. ,

В нуклеоидах белки ХСАР-Е и В23 колокализуются в остаточных ядрышках и глобулярных структурах в кариоплазме. Аналогично клеткам, фиксированным in situ, ¡>

метка выявляется по периферии ядрышек в виде одной - трёх полусфер или колец; кариоплазматические структуры сохраняют размер и форму, как в контроле. Совмещение ^

изображений показывает, что DAPI-положительный материал и белок ХСАР-Е не колокализуются ни в ядрышках, ни в глобулярных структурах. После экстракции 2М NaCl часть белков выходит из ядра в цитоплазму, но в большинстве клеток распределение экстрагированного из ядер ХСАР-Е не совпадает с зонами экструзированной ДНК.

В препаратах ядерного матрикса, полученных после обработки ДНКазой, ядра практически перестают окрашиваться DAPI. Антитела к ХСАР-Е и В23 окрашивают

ядрышки аналогично ядрышкам неэкстрагированных клеток, однако интенсивность флуоресценции выглядит более слабой по сравнению с "интактными" нуклеоидами. Значительная флуоресценция наблюдается в цитоплазме, что свидетельствует о выходе части ХСАР-Е и В23 из ядер в результате обработки.

Предварительная обработка РНКазой приводит к тому, что в препаратах ядерного матрикса вокруг ядрышек и кариоплазматических структур образуются зоны, интенсивно окрашивающиеся ОАР1. Окраска антителами к ХСАР-Е выявляет очень слабую, близкую к фоновой, флуоресценцию в ядрышках и сильную флуоресценцию в цитоплазме. Белок В23 практически не выявляется в составе ядрышек, но наблюдается сильная флуоресценция антител в цитоплазме. Совмещение изображений ядер, окрашенных ОАР1 и антителами к ХСАР-Е показывает, что этот белок не колокализовая с ВАР1-позитивными участками. 9. Локализация ХСАР-Е в хромосомном сюффолде.

В делящихся клетках, пермеабилизованных в условиях стабилизации хромосомного скэффолда и экстрагированных 2М №С1, окрашивание БАР1 выявляет остаточные хромосомы в виде длинных извитых нитей. В профазе и анафазе антитела к ХСАР-Е окрашивают сестринские хроматиды гомогенно, в «средней» метафазе, до начала расхождения хроматид к полюсам, отчетливо выявляется более интенсивная флуоресценция центромерных районов. Помимо хромосом, в митотических клетках, экстрагированных 2М ИаС1 антитела к ХСАР-Е окрашивают перицснтриолярные районы, окружающие разошедшиеся к полюсам центриоли.

ОБСУЖДЕНИЕ.

В работе показано, что белки - субъединицы конденсинового комплекса играют важную функциональную роль и в интерфазе и в митозе. В связи с тем, что функции на этих стадиях клеточного цикла могут быть различны, целесообразно обсудить отдельно их роль в митотических хромосомах и интерфазных клетках.

В настоящей работе изучена динамика внутриклеточной локализации белков ХСАР-Е и рЩ7 в норме и при экспериментальных воздействиях, вызывающих искусственное изменение структурного состояния митотических хромосом и ядрышка в живых клетках. В контрольных делящихся клетках линии ХЬ2 оба белка выявляются в аксиальных областях сестринских хроматид, начиная со стадии профазы до телофазы в виде близких по размеру блоков.

Высказывалась гипотеза о том , что белки ХСАР-С, ХСАР-Е и топоизомераза II являются интегральными компонентами скэффолда и обеспечивают специфическую радиально - петлевую организацию хроматина в интерфазных и митотических хромосомах, выполняя при этом роль своеобразных «скрепок» (Оаввег, 1995; Шгапо, 1998). Однако поведение ХСАР-Е и pEg7 в клетках, адаптирующихся к гипотонической среде, заставляет усомниться в том, что эта гипотеза верна. После кратковременного набухания, вызванного гипотоническим шоком, хромосомы вступают в обратимую реконденсацию, которая осуществляется без участия конденсинов: в реконденсированных хромосомах полностью !

отсутствуют белки ХСАР-Е и рЕ^7. Таким образом, первичную деконденсацию хромосом *

после гипотонического шока можно рассматривать как своего рода сигнал, индуцирующий выход конденсинов из состава хромосом. Независимо от того, какие факторы вызывают <

I

реконденсацию хромосом в условиях адаптации клеток к гипотонической среде, важно, что конденсины в этом процессе не принимают никакого участия, так как локализуются не в |

хромосомах, а в цитоплазме. К аналогичным выводам об отсутствии у конденсинов !

структурной функции приводят данные о динамике ХСАР-Е и рЕ£7 в клетках, I

блокированных на стадии метафазы нокодазолом или таксолом. Эти агенты обладают разным механизмом действия на митотическое веретено. Обработка нокодазолом приводит к деполимеризации микротрубочек, и полному разрушению митотического веретена (Ое |

ВгаЬапс1ег е1 а1., 1977). Таксол, напротив, понижает критическую концентрацию |

полимеризации тубулина, что приводит к формированию дополнительных нецентросомапьных фокусов полимеризации микротрубочек в цитоплазме митотических клеток и вызывает блок митоза вследствие нарушения обмена тубулина (Ьее й а1., 2001). I

Однако и в том и в другом случае хромосомы способны достигать нормальной степени компактизации и сохранять ее в течение нескольких часов. Как оказалось, белки ХСАР-Е и р1^7 полностью теряют связь с хромосомами, блокированными на стадии метафазы, н длительное время остающимися в конденсированном состоянии. Таким образом, результаты экспериментов с длительным воздействием нокодазола и таксола позволяют .

заключить, что белки ХСАР-Е и рЕ§7 не являются необходимыми для поддержания структурной целостности высших уровней организации хроматина, как это предполагалось ранее (Шгапо, 1998), то есть, не играют роль гипотетических белковых "скрепок". Возможно, конденсины необходимы только на начальных этапах формирования "высших" уровней компактизации ДНК в митотических хромосомах, а не для стабилизации их макромолекулярной структуры, которая достигается в результате действия других

структурных белков. Постоянное присутствие конденсинов на хромосомах в течение всего митоза может обеспечивать их пассивное перераспределение в дочерние ядра. Возможно также, что конденсины не принимают непосредственного участия в компактизации хромосом, а являются составной частью аппарата когезии. Как известно, процессы когезии и конденсации строго координированы и необходимы для достижения правильной сегрегации генетического материала в митозе (Hirano, 1998; Losada and Hirano, 2001). Недавно было получено и генетическое доказательство того, что название конденсинов не вполне отражает приписываемую им функцию в клетке: мутанты по гену DCAP-G (Drosophilá) имели нормально конденсированные хромосомы, но в них наблюдались нарушения при расхождении сестринских хроматид (Lee et al., 2001). Возможно, этот комплекс белков участвует в другой структурной перестройке, идущей параллельно конденсации хромосом - разделении сестринских хроматид.

Вопрос о функциональной роли конденсинов в интерфазе в настоящее время остаётся открытым. Полагают, что в ядрышках конденсины ассоциированы с рДНК (Cabello et al., 2001; Freeman et al., 2000). Ранее многими авторами была показана способность 13S конденсинов или отдельных SMC белков связывать ДНК in vitro (Akhmedov et al., 1998; Sutani and Yanagida, 1997; Kimura and Hirano, 1997) и взаимодействовать с конденсированными хромосомами как in vivo, так и in vitro (Hirano and Mitchison,1994; Freeman et al., 2000). Можно предположить взаимодействие ХСАР-Е с нетранскрибирующимися цистронами рДНК, которые в виде компактизованного хроматина могут плотно прилегать к ядрышку (Graf and Kobel, 1991) или, в некоторых случаях, интеркалировать в гранулярный компонент. У X laevis примерно 500 цистронов рРНК на гаплоидный набор (Wallace and Binistiel, 1966) расположены в коротком плече 12 хромосомы (Kahn, 1962) рядом с центромерой (Graf and Kobel, 1991). Таким образом, в интерфазе центромерный район 12 хромосомы находится в непосредственной близости от ядрышка, предполагается, что это важно для регуляции транскрипции рРНК. Однако, двойное окрашивание клеток флуорохромом DAPI и антителами показывает, что белок ХСАР-Е не выявляется в зонах локализации околоядрышкового хроматина. Нуклеазные обработки клеток также показывают, что в ядрышке белок ХСАР-Е по-видимому не связан с ДНК.

Для понимания роли конденсинов в ядрьппке принципиально важно знать, в каком из основных его субдоменов - гранулярном компоненте, фибриллярных центрах или в плотном фибриллярном компоненте, локализованы эти белки. Как показал

ультраструктурный анализ, а также двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и к белкам В23, фибрилларину и UBF, в ядрышках клеток Xenopus laevis белок ХСАР-Е локализуется в гранулярном компартменте. В соответствии с современными представлениями о молекулярной организации ядрышка (Shaw and Jordan, 1995), отсутствие колокализации ХСАР-Е с UBF и фибрилларином означает, что ХСАР-Е не ассоциирован с транскрибирующейся рДНК, и по-видимому, не участвует в начальных этапах процессинга рРНК. В пользу этого предположения также свидетельствуют данные о том, что подавление синтеза рРНК акгиномицином Д, блокирующим формирование новых предшественников рРНК (Puvion-Dutilleul, 1992), не приводит к удалению из "остаточного" гранулярного компонента диссоциированного ядрышка ХСАР-Е. После воздействия ДРБ, который вызывает интенсивную деградацию 32S рРНК, но лишь частично подавляет синтез 45S рРНК (Granick, 1975), ХСАР-Е остаётся в гранулярном компоненте ядрышек и в плотном фибриллярном компоненте. На этом основании можно предположить, что в гранулярном компоненте ядрышка ХСАР-Е ассоциирован с процессирующейся 45S рРНК, но не входит в состав зрелых прерибосомных частиц.

Возникает вопрос, с какими компонентами (ДНК, РНК или белками) взаимодействует ХСАР-Е в интерфазном ядре, в том числе в гранулярном и в плотном фибриллярном компонентах ядрышка. По результатам иммуно-электронного анализа, часть ХСАР-Е локализуется на фибриллах хроматина в интерфазном ядре, что соответствует ранее полученным данным (Schmiesing et al., 2000). Ранее было показано, что ДНК входит в состав гранулярного компонента ядрышка в виде небольших кластеров ДНП фибрилл (Derenzini et al., 1987; Thiry et al., 2000). Частичный выход ХСАР-Е из ядрышка после воздействия ДНКазы можно объяснить гидролизом ДНК во внутривдрышковом хроматине. В то же время, практически полное удаление метки после обработки РНКазой пермеабилизованных клеток или нуклеоидов позволяет утверждать, что ХСАР-Е в ядрышке преимущественно взаимодействует с рибосомальной РНК. Известно, что формирование прерибосомных частиц - векторный процесс, направленный от фибриллярных комплексов к периферии ядрышка, начальным этапом которого является транскрипция рРНК. Сведения о точной локализации сайтов транскрипции рРНК противоречивы: по некоторым данным экспрессия рибосомных генов осуществляется на границе между плотным фибриллярным компонентом и фибриллярным центром (Dundr, Raska, 1993; Mosgoller et al., 1998), по другим - в дискретных компартментах ПФК (Stanek et al., 2001; Koberna et al., 2002) или в ФЦ (Thiry et al., 2000; Mais, Scheer, 2001). В ПФК

начинается процессинг новообразованной рРНК, который завершается в ГК (Shaw et al., 1995; Cmarko et al., 2000). Маркерным белком ранних этапов процессинга является фибрилларин, локализованный в ПФК (Puvion-Dutilleul, Christensen, 1993). Поскольку в ядрышках клеток XL2 ХСАР-Е никогда не колокализуется с UBF, только частично колокализуется с фибрилларином, мажорным белком ПФК и полностью колокализуется с белком гранулярного компонента В23 а также на основании данных об электронно-микроскопической иммунолокализации ХСАР-Е можно высказать предположение о том, что главная функция этого белка в ядрышках - участие в процессинге рРНК.

Вопрос о конкретной функциональной роли ХСАР-Е на разных этапах биогенеза рибосом, так же, как и о механизме его действия, остается открытым, отчасти, потому, что до сих пор не существует однозначного мнения о механизме действия SMC белков. Показано, что конденсины в комплексе с топоизомеразами и АТФ 13S индуцируют положительную суперспирализацию циклической ДНК in vitro (Kimura, Hirano, 1997). Возможно, что ХСАР-Е и топоизомераза I включены в котранскрипционные модификации рибосомной ДНК, которые происходят в ФЦ и ПФК. Однако, данные о том, что ХСАР-Е является мажорным бежом ГК, отсутствует в фибриллярных центрах, и только частично колокализован с фибрилларином в ПФК, делает это предположение маловероятным.

Другая гипотеза - ХСАР-Е, в комплексе с топоизомеразой П и бежом В23, которые входят в состав ГК (Tavormina et al., 2002; Niimi et al., 2001), контролирует фоддинг рРНК в формирующихся прерибосомных частицах.

Последнее не означает, что ХСАР-Е взаимодействует непосредственно с процессирующейся рибосомной РНК, а возможно с другими компонентами ядрышка. Одним из таких компонентов являются РНП-частицы, содержащие метаболически стабильные низкомолекулярные РНК (нмРНК) U-типа (U3, U8, U14 и U22) (Maxwell and Foumier, 1995). По некоторым данным, именно нмРНК способны связывать специфические нерибосомные белки, необходимые для процессинга рРНК (Maxwell and Fournier, 1995). Некоторые из этих белков выявлены не только в ядрышках, но также в кариоплазме или в цитоплазме. В настоящей работе нерибосомный белок ХСАР-Е обнаружен, помимо ядрышек, в глобулярных структурах кариоплазмы, где он колокализуется с В23 и фибрилларином. Двойное иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и коилину показало, что глобулярные структуры в кариоплазме не являются кольчатыми тельцами. Тем не менее, функции этих структур могут быть аналогичными. Показано, что в кольчатых тельцах содержатся нмРНК и белки, необходимые для

процессинга РНК (Gall, 2000). Возможно, в глобулярных структурах, содержащих ХСАР-Е также депонируются те белки и низкомолекулярные РНК, которые необходимы для созревания и компактизации прерибосомных частиц в ядрышках. Маловероятным представляется тот факт, что эти структуры соответствуют фокусам фосфорилирования гистона НЗ, описанным Schmiesing et al (2000).

Структурным субстратом ядрышек и кариоплазматаческих структур, на котором могут быть иммобилизованы ХСАР-Е в комплексе с ДНК, рРНК или нмРНК, по-видимому, является белковый матрикс. В пользу этого можно привести следующие аргументы. Во-первых, после обработки пермеабилизованных клеток 2М NaCl значительная часть ХСАР-Е выявляется в остаточных ядрах нуклеоидов. Во-вторых, некоторое количество белка сохраняется в элементах внутриядерного остова, в остаточных ядрышках и SMS-bodies после исчерпывающей обработки ДНКазой, т.е. в условиях получения "классического" ядерного матрикса.

Изначально SMC белок Sell, гомолог белка ХСАР-Е, был идентифицирован как мажорный компонент хромосомного скэффолда (Lewis and Laemmli, 1982). Процедура получения ядерного матрикса in situ позволила выявить связь ХСАР-Е со скэффолдом митотических хромосом, в полном соответствии с данными Maeshima and Laemmli (2003). Это согласуется с гипотезой, по которой ХСАР-Е в комплексе с белками скэффолда и топоизомеразой П кооперационно участвуют в организации высших уровней компактизации хроматина (Saitoh et al., 1995). Яркая флуоресценция центромерных районов хромосом в средней метафазе, по-видимому, связана с тем, что только в этих районах хромосом сохраняется когезия сестринских хроматид и, следовательно, более высокая концентрация ХСАР-Е.

На основания вышеизложенных данных можно сделать вывод о том, белок ХСАР-Е играет важную роль не только в митозе, но и в интерфазе. В митозе, в составе конденсинового комплекса этот белок участвует в конденсации митотических хромосом и, возможно в регуляции процесса разделения сестринских хроматид. В интерфазе белок ХСАР-Е участвует в структурно-функциональной организации ядрышка.

ВЫВОДЫ:

1. Ассоциация белков ХСАР-Е и pEg7 с хромосомами не является необходимым условием для восстановления и поддержания конденсированного состояния митотических хромосом после искусственной деконденсации in vivo под действием гипотонического воздействия.

2. Искусственное поддержание митотических хромосом в конденсированном состоянии при воздействии нокодазола и таксола не сопровождается постоянной ассоциацией конденсинов с хромосомами.

3. Уровень экспрессии белков ХСАР-Е и pEg7 значительно не изменяется в течение клеточного цикла.

4. В интерфазе белки 13S конденсинового комплекса входят в состав гранулярного и плотного фибриллярного компонентов ядрышка. Ассоциация ХСАР-Е с ядрышком прямо или косвенно опосредована его взаимодействием с РНК.

5. Связь ХСАР-Е с гранулярным компонентом не зависит от уровня транскрипционной активности рибосомных генов и процессинга рРНК.

6. При экстракции хроматина in situ ХСАР-Е сохраняет ассоциацию с остаточным ядрышком. Взаимодействие ХСАР-Е с этой структурой прямо или косвенно опосредовано его взаимодействием с РНК.

7. Идентифицированы ядерные домены, содержащие ХСАР-Е и некоторые компоненты ядрышка. Данные домены не являются тельцами Кахаля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Тимирбулатова Э.Р., Грабеклис С.А., Узбеков Р.Э., Ле Геллек К., Киреев И.И. 2000. Изучение роли конденсинов в формировании высших уровней организации хромосом эукариот. // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов", Москва, выпуск 4, стр. 72-73. V 2. Грабеклис С.А., Тимирбулатова Э.Р., Узбеков Р.Э., Ле Геллек К., Гулак П.В., Киреев И.И.

2001. Исследование роли конденсинов в митотической компактизации хромосом. // Тезисы Всероссийского совещания "Клеточная биология на пороге XXI века", Санкт-Петербург, Цитология, т.43, № 4, стр. 335-336. 3. Тимирбулатова Э.Р., Грабеклис С.А., Узбеков Р.Э., Гулак П.В., Ле Геллек К., Поляков В.Ю. 2001. Исследование роли SMC белков в ядрышке. // Тезисы Всероссийского

совещания "Клеточная биология на пороге XXI века", Санкт-Петербург, Цитология, т.43, № 4, стр. 402

4. Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Грабеклис С.А., Гулак П.В., Ле Геллек К., Поляков В.Ю., Узбеков Р.Э. 2002. Внутриклеточная локализация конденсинов ХСАР-Е и pEg7 в норме и при воздействиях, вызывающих искусственное изменение структурного состояния митотических хромосом. // Цитология, т. 44, № 6, стр. 576-584.

5. Тимирбулатова Э.Р., Киреев-И.И., Гулак П.В., Поляков В.Ю., Узбеков Р.Э. 2002. Белок конденсинового комплекса ХСАР-Е связан с РНК в ядрышках клеток линии XL2. // Тезисы докладов и сообщений, представленных на XIV Всероссийский симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", Санкт-Петербург, Цитология, т. 44, №9, стр. 908.

6. Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Картавенко Т.В., Гулак П.В., Поляков В.Ю., Ле Геллек К., Узбеков Р.Э. 2003. Исследование внутриклеточной локализации белка ХСАР-Е в клетках линии XL2 (Xenopus laevis) в норме и при ингибировании транскрипции и процессинга рРПК. // Цитология, т. 45, № 6, стр. 290-297.

7. Uzbekov R., Timirbulatova Е., Watrin Е., Cubizolles F., Ogereau D., Gulak P., Legagneux V., Polyakov V.Yu., Le Guellec K., Kireev I. 2003. Nucleolar association of pEg7 and ХСАР-Е, two members of Xenopus laevis condensin complex in interphase cells. // J. Cell Sei. V. 116, p. 1667-1678.

r

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 22.09.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 80 экз. Заказ 752. Тел. 939-3890,939-3891, 928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

114925

'Y

s

л ^

î /

/г

Г

Л

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимирбулатова, Эльмира Раисовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Клеточная культура. ......

Синхронизация клеток культуры XL2....

Western blot анализ ....

Гипотонические воздействия .—.----------. цитостатические воздействия иммуноцитохимический анализ.-------.-------.-------.-------.----------------. воздействие актиномицином д.----------.-------.--------. воздействие ДРБ

Получение нуклеоидов.----------.—-------------. обработка нуклеазами..----------.—.—.—.

Электронная микроскопия-------------------------.-------------------.------------------------.—.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Уровень экспрессии белков ХСАР-Е и pEg7 остаётся постояннным на протяжении клеточного цикла

Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических хромосомах.

Локализация белков ХСАР-Е и PEG7 в клетках, подвергнутых гипотоническому

Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках в условиях блокады митоза.......

Локализация белков хсар-е, рес7 и мажорных белков ядрышка в интерфазных клетках....

Влияние актиномицина д и дрб на локализацию хсар-е в ядрышках интерфазных клеток иммунолокализация белков ХСАР-Е и коилина в интерфазных клетках..

Локализация ХСАР-Е в нуклеоидах и ядерном матриксе.. локализация ХСАР-Е в хромосомном скэффолде

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли конденсинов в формировании высших уровней организации хроматина и структурно-функциональной организации ядрышка"

Митотические хромосомы эукариотических клеток представляют собой сложную систему многоуровневой упаковки ДНК. Специфическая упаковка хроматина необходима для правильной сегрегации геномов в митозе и мейозе, а также для регуляции генной экспрессии в клеточном цикле.

Примерно десять лет назад были описаны и частично охарактеризованы различные структурные белки, которым приписывается решающая роль в специфической компактизации хроматина в составе митотических хромосом. К таким белкам относят так называемые SMC белки (Structural Maintenance of Chromosomes) (Strunnikov et al., 1993; Hirano and Mitchison, 1994). Они вовлечены в процессы митотической конденсации хромосом, когезии сестринских хроматид, рекомбинационной репарации ДНК, а также в процессы, связанные с компенсацией дозы гена (Hirano et al., 1994; Saka et al., 1994; Michaelis et al., 1997; Guacci et al., 1997; Jessberger et al., 1996, Chuang et al., 1994; Chuang et al., 1996).

В экстракте яиц Xenopus laevis были идентифицированы белки ХСАР-С и ХСАР-Е, принадлежащие семейству SMC. Вместе с дополнительными субъединицами, белками ХСАР-Н, XCAP-G и pEg7 они образуют мультикомплексы - конденсины, которые играют важную роль в митотической конденсации хромосом (Hirano et al., 1997; Kimura and Hirano, 1997, Cubizolles et al., 1998). Были выделены два конденсиновых комплекса с коэффициентами седиментации 8S и 13S (Hirano et al., 1997; Kimura and Hirano, 1997; Losada et al., 1998). 13S конденсиновый комплекс состоит из пяти белков: ХСАР-С, ХСАР-Е, ХСАР-Н, XCAP-G и XCAP-D2 (pEg7). 8S комплекс состоит из белков ХСАР-С и ХСАР-Е. О возможном участии 13S конденсинового комплекса в компактизации митотических хромосом косвенно свидетельствует тот факт, что его связывание специфическими антителами вызывает нарушение конденсации хромосом в системе in vitro, а добавление приводит к восстановлению нормальной структуры хромосом (Hirano, 1998; Cubizolles et al., 1998). Кроме того, показано, что некоторые субъединицы 13S комплекса гиперфосфорилируются cdc2 киназой в начале митоза, и, возможно играют регуляторную роль в процессе конденсации хромосом (Hirano, 1998). Функциональное значение комплекса 8S остается неясным.

В настоящее время механизм действия конденсинов неизвестен. Была предложена гипотеза о том, что эти комплексы формируют своеобразные структурные «скрепки», которые обеспечивают митотическую конденсацию хромосом и поддерживают специфическую организацию макромолекулярных комплексов хроматина в митозе (Gasser, 1995; Hirano, 1998). Другая гипотеза предполагает, что конденсины выполняют энзиматическую функцию при конденсации хроматина (Strunnikov et al., 1993).

Относительно функции конденсинов в интерфазе на данный момент известно немного. Была предложена гипотеза о том, что в интерфазе конденсины участвуют в регуляции экспрессии генов, в том числе рибосомных. С помощью метода иммунопреципитации было показано, что у Saccharomyces cerevisiae конденсины ассоциированы с рибосомальной ДНК (Freeman et al., 2000). Показано, что в интерфазе компоненты 13S конденсинового комплекса выявляются в ядрышках (Cabello et al., 2001). Однако данные о точной локализации конденсинов в интерфазных клетках и, в том числе в ядрышках, отсутствуют.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы было исследовать локализацию двух субъединиц 13S конденсинового комплекса, белков ХСАР-Е и pEg7, на разных стадиях клеточного цикла, изучить характер их взаимодействия с хромосомами при искусственном изменении степени компактизации митотических хромосом, а также исследовать связь конденсинов с ядрышком в зависимости от функционального состояния последнего. Ч

Обзор литературы

Структурные белки хромосом.

Одной из самых больших загадок современной клеточной биологии является структура эукариотической хромосомы. В полностью компактной метафазной хромосоме коэффициент линейной компактизации ДНК достигает 104 (DuPraw, Bahr, 1969), а в интерфазном ядре составляет несколько сотен (Golomb, Bahr, 1974). Столь плотная упаковка осуществляется посредством образования нескольких уровней укладки длинной молекулы ДНК. Наиболее детально исследован низший уровень компактизации ДНК — k нуклеосомная частица (McGhee, Felsenfeld, 1980; Richmond et al., 1984; Храпунов и др.,

1988), при образовании которой достигается семикратная компактизация (Griffith, 1975). Нуклеосомы упакованы в нуклеосомную фибриллу, которая под электронным микроскопом выглядит как цепочка сферических гранул или нить диаметром 10 нм (Olins, Olins, 1974; Thoma et al., 1979). Следующим уровнем компактизации хроматина является фибрилла диаметром 25-30 нм (Ris, 1975). Способ образования такой фибриллы из нуклеосомной остаётся невыясненным. Существуют различные модели организации 25 нм фибриллы хроматина - соленоидная (Finch, Klug, 1976; Thoma et al., 1979), нуклеомерная (Kiryanov et al., 1976, 1982; Subirana et al., 1981), модель спиральной укладки зигзагообразной ленты (Woodcock et al., 1984) и другие. Принципы структурной организации следующих, высших уровней компактизации хроматина и молекулярные механизмы, лежащие в основе их формирования, ещё более неопределённые. В настоящее время предложено большое количество моделей упаковки хроматина, в том числе модели сложенная фибрилла" (Gall, 1963, 1966), "иерархия спиралей" (Вак et al., 1977; Sedat, Manuelidis, 1978; Taniguchi, Takayama, 1986), "ось-радиальные петли" (Paulson, Laemmli, 1977; Earnshaw, Laemmli, 1983; Comings, Okada, 1970, 1974) и "хромомерная модель" (Okada, Comings, 1976; Зацепина и др., 1983; Тихоненко и др., 1985). Различия между моделями отражают технические трудности, связанные с изучением структуры хромосом, обусловленные высокой плотностью упаковки материала и чувствительностью к изменению условий среды.

В ранних работах было показано, что воздействуя на изолированные хромосомы 1М NaCl, можно выделить так называемые "остаточные хромосомы" (Mirsky and Ris, 1951). "Остаточные хромосомы" состоят из двух фракций. Одна из них содержит ДНК и гистоны, в состав другой фракции входят нитевидные структуры, содержащие РНК и негистоновые белки. На основании этих данных Mirsky и Ris предположили, что основой хромосом является белковый скелет. Позднее с помощью метода электронной микроскопии было показано, что изолированные митотические хромосомы состоят из аксиального и периферического компонентов (Stubblefield and Wray, 1971). Эти структуры видны на хромосомах после экстракции гистоновых и большинства негистоновых белков. Была предложена модель организации хромосом, согласно которой структурные негистоновые белки формируют фиброзный скэффолд, на котором закреплены петли хроматина (Paulson and Laemmli, 1977). В связи с тем, что хромосомный скэффолд при экстракции сохраняет внешнюю морфологию хромосомы (Adolph et al., 1977), его принято считать каркасом, своеобразной сеткой внутри митотической хромосомы. При помощи высоко-А-Т-специфического флуорохрома даномицина был получен оптический сигнал, идущий от А-Т богатых участков хромосом, ассоциированных с хромосомным скэффолдом (SARs). В результате была предложена петлевая модель, учитывающая продольную неоднородность хромосомы: структура метафазной хромосомы может быть представлена в виде хроматидной нити, от которой отходят короткие Q-петли и более длинные G-петли, при этом ДНК прикрепляется к скэффолду хромосомы через А-Т последовательности (Saitoh et al., 1994).

Большое количество последующих работ было посвящено исследованию белкового состава осей хромосом (De, 2002). Несмотря на то, что молекулярные основы взаимодействия ДНК с гистонами и другими многочисленными белками в процессе репликации и генной экспрессии успешно изучаются, роль негистоновых белков в структурной организации хромосом остаётся невыясненной. К таким белкам относят HMG (high-mobility-group) белки, топоизомеразу П и SMC (structural maintenance of chromosomes) белки.

В 1982 году в составе скэффолда изолированных метафазных хромосом были выделены два мажорных белка - Scl (Mr 170 кДа) и Sell (Mr 135 кДа) (Lewis and Laemmli, 1982). Позднее стало ясно, что один из них, белок Scl, является топоизомеразой Па (Earnshaw et al., 1985). При помощи различных методов показано, что топоизомеразаП концентрируется в осевом (аксиальном) участке хроматид и обнаруживается в меньших количествах в петлевых доменах (Earnshaw and Heck, 1985; Tavormina et al., 2002). Ряд функциональных исследований подтверждает гипотезу о том, что топоизомераза П играет существенную роль в поддержании структуры митотических хромосом как на ранних, так и на поздних стадиях митоза. Показано, что этот белок необходим для правильной конденсации хромосом у дрожжей (Uemura et al.,1987), а также для конденсации хромосом Xenopus laevis in vitro (Adachi et al.,1991; Hirano and Mitchison, 1993). Какую роль играет топоизомеразаП во время конденсации хромосом, не известно. Возможно, этот фермент необходим для устранения запутанных участков ДНК, которые препятствуют правильной конденсации хромосом. В таком случае процесс митотической конденсации хроматина можно представить как распутывание хромосом относительно друг друга, чтобы потом они смогли вести себя независимо в митозе (Holm, 1994). Существуют данные о возможном взаимодействии топоизомеразы П с SAR/MAR последовательностями, которые формируют основания топологически замкнутых петлевых доменов (Adachi et al., 1989), что в свою очередь может обеспечивать сближение различных сайтов ДНК при конденсации (Earnshaw et al.,1985; Gasser et al.,1986; Adachi et al., 1991). Представление, что этот фермент играет структурную роль в хромосоме in vivo, спорно, несмотря на результаты, полученные в экспериментальных системах. Так, совсем недавно с помощью прижизненных наблюдений за клетками, стабильно экспрессирующими химеры топоизомераза II-GFP белок было показано, что in vivo топоизомераза На распределяется по всему объему митотических хромосом, а не только в осевых районах. Вторая субъединица топоизомеразы П, топоизомераза Пр в митозе с хромосомами не ассоциируется (Christensen et al., 2002). В интерфазных клетках оба белка аккумулированы в ядрышках и свободно перемещаются между ядерными компартментами (Christensen et al., 2002).

Белок Sell, второй мажорный компонент хромосомного скэффолда, как оказалось, принадлежит семейству SMC белков (Heck, 1997; Saitoh et al., 1994). Впервые SMC белки были идентифицированы у почкующихся дрожжей. Было показано, что мутации по гену SMC1 приводят к потере стабильности минихромосом (Larionov et al., 1985).

Структура SMC белков.

Первичная структура SMC белков образована пятью отдельными доменами. Два нуклеотид-связывающих мотива, Walker А и Walker В, располагаются на высококонсервативных N-терминальном и С-терминальном доменах молекулы, соответственно. Центральный домен представлен двумя длинными спирализованными доменами, которые разделены небольшим "шарнирным" участком, (Gasser, 1995).

Участие

Связывание А ТФв образовании димеровСвязывание ДНК

I-1 I- - - -1 I-1

Голова" Шарнирный "Хвост"

Спиральный участок Спиральный \т / участок участок ототсту Qpr.m

200-450 ^^^ 200-450 аминокислот аминокислот аминокислот

100-150 100-150 аминокислот аминокислот

N-концевой глобулярный домен состоит из 100 — 150 аминокислот и обладает способностью связывать АТФ (Walker А).

СООН-концевой глобулярный участок (DA box, Walker В) состоит из 100 -150 аминокислот и обладает ДНК - связывающей активностью. Этот участок является наиболее консервативным и способен принимать конформацию "спираль-петля-спираль" ("helix-loop-helix"). (Saitoh et al., 1995).

Между глобулярными доменами располагаются два длинных а спиральных участка, каждый из 200 - 450 аминокислот. Между ними находится не спирализованный домен, включающий около 100 аминокислот.

Молекулярная масса SMC-белков составляет около 110 - 170 кДа (Strunnikov et al., 1999).

С помощью электронно-микроскопического анализа было показано, что спирализованные участки способны образовывать антипараллельные гомодимеры и гетеродимеры (Melby et al., 1998). Гидродинамические свойства SMC димера согласуются с идеей о том, что центральный домен между спирализованными участками обладает гибкостью и является своебразным шарниром (Hirano et al., 2001). Антипараллельные конфигурации приводят к тому, что NH3- и СООН- концевые домены связываются друг с другом, образуя глобулярные структуры на каждом конце SMC димера. Walker А и Walker

В мотивы способны тесно взаимодействовать друг с другом (Lowe et al., 2001) и оба мотива участвуют в связывании и гидролизе АТФ (Hirano et al., 2001).

Концевые домены способны соединяться в такой конформации, когда молекула SMC-белка изогнута в шарнирной области наподобие сложенной удочки ("folded-rod" конформация) (Melby et al., 1998).

Структура, похожая на структуру SMC-белков: трёхдоменная полипептидная цепь с высококонсервативными участками, характерна для механохимических моторных белков типа кинезинов. В связи с этим была выдвинута гипотеза о функциональном сходстве кинезинов и SMC-белков (Gasser, 1995).

Описаны три различных типа SMC гетеродимеров, выделенных из клеток разных организмов: SMC1/SMC3, SMC2/SMC4 и SMC5/SMC6 гетеродимеры. Эти гетеродимеры ассоциируют с другими не-SMC белками, образуя мультимерные комплексы, которые выполняют разные функции в клетках различных организмов. Так, комплекс, в состав которого входит гетеродимер SMC1/SMC3 необходим для когезии сестринских хроматид. Гетеродимер SMC2/SMC4 участвует в компактизации митотических хромосом, а гетеродимер SMC5/SMC6 в репарации ДНК (Hirano, 2002).

Участие SMC белков в митотической конденсации хромосом.

Каждая хромосома состоит из двух хроматид, несущих идентичный генетический материал. На протяжении митоза происходит продольное расщепление хромосом с последующим расхождением хроматид к полюсам клетки. Именно эти два события обеспечивают равномерное распределение наследственного материала между дочерними клетками. Исследования композиции митотических хромосом выявили три мажорных класса белков. Первый класс включает основные структурные компоненты интерфазного хроматина, такие как нуклеосомные гистоны и гистон HI. Второй класс включает белки, которые присутствуют и на митотических, и на интерфазных хромосомах, но обладают различной активностью на разных стадиях клеточного цикла. К таким белкам относится топоизомераза II. К третьему классу относятся SMC белки (Koshland and Strunnikov, 1996).

В 1994 году были идентифицированы два белка, ХСАР-С и ХСАР-Е (ХСАР обозначает Xenopus chromosome associated proteins) (Hitano and Mitchison, 1994). Оба эти белка являются SMC белками и принадлежат подсемействам SMC4 и SMC2, соответственно (Hirano, 1998; Jessberger et al., 1998; Strunnikov, 1998; Hirano, 1999). Конденсиновый комплекс с коэффициентом седиментации 13S был впервые выделен из экстракта яиц Xenopus laevis (Hirano et al., 1997) и затем он был идентифицирован в различных организмах (Sutani et al., 1999; Freeman et al., 2000; Schmiesing et al., 2000; Kimura et al., 2001). В состав этого комплекса входят две коровые SMC субъединицы: SMC2 (или по другой классификации САР-Е), SMC4 (САР-С) и три дополнительных белка (CAP-D2, CAP-G и САР-Н) (Hirano et al., 1997). 13S конденсиновый комплекс необходим для митотической конденсации хромосом. Также было показано, что белок XCAP-D2 (он же pEg7), необходим для этого процесса in vitro (Cubizolles et al., 1998). Подсчитано, что конденсиновые комплексы расположены с периодом 5-10 кб ДНК в хромосомах, собранных в экстракте яиц Xenopus laevis и в нативных хромосомах Schizosaccharomyces pombe (Sutani and Yanagida, 1997).

Генетические исследования мутантов различных организмов, в том числе дрожжей и насекомых показали, что мутации в генах, кодирующих белки класса SMC2, приводят к ингибированию конденсации митотических хромосом (Saka et al., 1994, Strunnikov et al., 1995; Freeman et al., 2000; Lavoie et al., 2000; Sutani et al., 1999; Bhat et al., 1996, Steffensen et al., 2001), что выражается в нарушении сегрегации хромосом в анафазе. Для таких мутантов характерно образование хромосомных мостов в анафазе. Такие изменения очень похожи на нарушения, наблюдаемые в мутантах, дефектных по топоизомеразе П, что позволило выдвинуть гипотезу об участии конденсинов в расхождении сестринских хроматид совместно с топоизомеразой П (Koshland and Strunnikov, 1996; Hirano, 2000).

Очищенные конденсиновые комплексы Xenopus laevis и человека вызывают положительную суперспирализацию кольцевых плазмид в присутствие топоизомеразы I и образование узлов в кольцевых плазмидах в присутствие топоизомеразы II (Kimura and Hirano, 1997; Kimura et al., 1999; Kimura et al., 2001). Вероятно, эти свойства конденсинов отражают процессы, происходящие при конденсации хромосом in vivo.

Работа конденсинов точно регулируется во время клеточного цикла. В клетках Schizosaccharomyces pombe cdc2-3aBHCHMoe фосфорилирование субъединиц конденсинов, определяет сборку целого комплекса в ядре в начале митоза (Sutani et al., 1999; Freeman et al., 2000). Для высших эукариот данный вопрос остаётся открытым до сих пор. Показано, что в экстракте яиц Xenopus laevis SMC-подобные субъединицы конденсинового комплекса в митозе гиперфосфорилированы, и такой комплекс взаимодействует с митотическим хроматином, но не с интерфазным (Hirano et al., 1997).

В таблице 1 показаны представители различных групп SMC белков и SMC-подобных белков, входящих в состав 13S конденсинового комплекса эукариот (Hirano, 2002):

Таблица 1. SMC и SMC-подобные белки 13S конденсинов эукариот.

3 1=г к я § и ю а 1 о <> S о «a. to к & 8» с .3 5 « с « а ■s $ &j § и оз со а cj St!

SMC2 Smc2 Cut 14 MIX-l DmSMC2 BAB 11490 XCAP-E hCAP-E

SMC4 Smc4 Cut3 F35G12.8 DmSMC4 BAB 10693 XCAP-C hCAP-C non-SMC Ycs4 Cndl ? CG1911 CAB72176 pEg7 hCAP-D2 non-SMC Ycs5/1 Cnd3 ? CGI 7054 BAB08309 XCAP-G hCAP-G non-SMC Bml Cnd2 ? Barren AAC25941 XCAP-H hCAP-H

8S комплекс у Xenopus laevis образован белками ХСАР-Е и ХСАР-С, однако его функции не изучены. Показано, что мутации этих белков приводят к дефектам конденсации хроматина (Strunnikov AV et al.,1995; Sutani T et al.,1997).

Роль SMC белков в когезии сестринских хроматид.

Показано, что SMC1/SMC3 гетеродимеры совместно с другими белками образуют высоко-консервативные комплексы, необходимые для нормальной когезии сестринских хроматид (Guacci et al.,1997; Losada et al., 1998; Losada et al., 2000). Эти комплексы были названы когезинами.

Когезины, выделенные из клеток HeLa способны связываться с двунитевой ДНК и формировать крупные ДНК-белковые аггрегаты in vitro (Losada and Hirano, 2001). Показано, что в клетках когезины связываются с определёнными сайтами в областях центромер и вдоль плечей хромосом, главным образом с А-Т последовательностями (Laloraya et al., 2000). На основании этих данных предложена модель, согласно которой когезиновые комплексы формируют своеобразные мосты между сестринскими хроматидами (Losada and Hirano, 2001).

Было показано, что у дрожжей когезины связываются с хроматином в G1 фазе клеточного цикла и поддерживают когезию в S фазе во время ДНК репликации. В митозе когезины остаются связанными с хромосомами вплоть до перехода из метафазы в анафазу (Uhlmann and Nasmyth, 1998; Guacci et al., 1997; Michaelis et al., 1997). Этот переход сопровождается активацией АРС (anaphase-promoting complex), под действием которого происходит расщепление одной из субъединиц когезинового комплекса, белка Sccl, а вслед за этим распад всего комплекса. Далее происходит разделение сестринских хроматид (Losada and Hirano, 2001).

У высших эукариот этот процесс немного сложнее. В экстракте яиц Xenopus laevis небольшое количество когезинов также связываются с хроматином в интерфазе, но большинство из них (~95%) остаются диссоциированными вплоть до вступления в митоз (Losada et al., 1998). Такое же поведение когезинов характерно для клеток Xenopus laevis, мыши и человека in vivo (Losada et al., 2000; Sumara et al., 2000; Schmiesing et al., 1998; Stusberg et al., 1999; Darwiche et al., 1999). Показано, что небольшая часть когезинов остаётся связанной с метафазными хромосомами и таким образом удерживает сестринские хроматиды вместе при вхождении в анафазу (Losada et al., 2000). Эти результаты легли в основу модели, согласно которой процесс когезии в клетках высших эукариот можно разделить на два этапа. Первый этап, который происходит во время профазы, АРС-независимый, в это время происходит фосфорилирование Scc3 субъединицы когезинового комплекса (Losada et al., 2000; Sumara et al., 2000). Второй этап, во время перехода из метафазы в анафазу, является АРС-зависимым и включает расщепление Sccl субъединицы когезинового комплекса, как это было показано для дрожжей (Waizenegger et al., 2000).

Таким образом, SMC белки формируют различные функциональные комплексы: конденсины и когезины. Существует гипотеза о том, что эти комплексы совместно участвуют в сборке метафазных хромосом и их взаимодействие обеспечивает точную координацию процессов конденсации митотических хромосом и когезии сестринских хроматид (Losada and Hirano, 2001). Согласно этой модели в каждой сестринской хроматиде конденсины связаны с петлями хроматина, а когезины локализуются в областях контактов сестринских хроматид. Высокая плотность когезинов на хромосоме определяется размерами петель хроматина. Маленькие петли затрудняют работу конденсинов, и тем самым приводят к формированию хромосомы с низким уровнем компактизации. Когда плотность когезинов уменьшается, размеры петель увеличиваются и конденсины плотно упаковывают хромосомы (Losada and Hirano, 2001).

In vitro показано взаимодействие когезинов с топоизомеразой П. В присутствии топоизомеразы II когезины вызывают сцепления между циклическими молекулами ДНК, в отличие от конденсинов, которые вызывают их суперспирализацию (Kimura et al., 1999).

Комплекс компенсации дозы гена.

Кроме участия в конденсации митотических хромосом и сегрегации, конденсины играют важную роль в процессе компенсации дозы гена у Caenorhabditis elegans (Meyer, 2000). Белки MIX-1 (принадлежат классу SMC2 белков) и DPY-27 (принадлежат классу SMC4 белков) входят в состав комплекса, который связываясь с X хромосомами нематод уменьшает уровень транскрипции в 2 раза. Возможно, что при этом SMC белки действуют с помощью тех же механизмов, что и при конденсации хромосом в митозе.

У Drosophila melanogaster топоизомеразаП и одна из субъединиц конденсинового комплекса, белок Barren/CAP-H колокализуются на определённых последовательностях ДНК, участвуя в репрессии транскрипции гомейотических генов. Белок Barren необходим для эпигенетической репрессии генов (Lupo et al., 2001). Таким образом конденсины участвуют в регуляции генной экспрессии.

Участие SMC белков в рекомбинационной репарации ДНК.

Детальный анализ показал, что в эукариотических клетках присутствуют ещё два представителя семейства SMC - белки SMC5 и SMC6 (Cobbe and Heck, 2000). Совместно с другими белками у Schizosaccharomyces pombe они формируют комплексы, необходимые для репарации повреждений ДНК, после действия ультрафиолетовых лучей или у излучения (Lehmann et al., 1995, Fousteri and Lehmann, 2000). У млекопитающих белки SMC5 и SMC6 в большом количестве экспрессируются в семенниках и ассоциированы с парой XY хромосом в поздней профазе мейоза (Taylor et al., 2001). Рекомбинационный комплекс 1 ( RC1 ), выделенный из бычьего тимуса, катализирует рекомбинационную репарацию двунитевых разрывов и делеций in vitro и содержит ДНК - полимеразу е, ДНК - лигазу III и две SMC субъединицы (Hirano, 1998). Одной из специфических реакций при рекомбинации является образование D петли путём объединения однонитевой и двунитевой молекул ДНК. Показано, что и бычий RC1 комплекс, и изолированный SMC1/SMC3 гетеродимер способны индуцировать формирование D петли в реакции, для которой необходимо наличие гомологичных последовательностей и суперспирализованность присоединённого дуплекса ДНК (Jessberger et al., 1998).

Было показано, что у Arabidopsis thaliana, мутанты по белку SMC6 гиперчувствительны к разнообразным агентам, вызывающим повреждения ДНК (Mengiste et al., 1999). Несмотря на то, что у гомозиготных растений с такими мутациями появляются дефекты в процессах гомологичной рекомбинации они, в отличие от других эукариот, вполне жизнеспособны.

Модели работы конденсинов

1) В связи с тем, что локализация конденсинов во многом совпадает с локализацией топоизомеразы И, была выдвинута гипотеза о взаимодействии этих белков друг с другом. (Gasser, 1995; Kimura et al., 1999).

Согласно этой модели, в профазе происходит связывание топоизомеразы П с ДНК. Топоизомераза П представляет собой нечто вроде скрепки, защёлкнутой вокруг ДНК (так называемая закрытая форма). С двумя молекулами топоизомеразы взаимодействует одна молекула SMC-белка, таким образом соединяя их. При изменении конформации SMC-белка, то есть при изгибе в шарнирной области, на ДНК образуются петли.

Профаза:

В метафазе существуют две формы топоизомеразы II: закрытая форма, с которой по-прежнему ассоциированы конденсины и открытая форма. Открытая форма топоизомеразы II представляет собой "раскрывшуюся скрепку", находящуюся в свободной от ДНК форме. SMC-белки в это время локализуются на тех молекулах топоизомеразы II, которые ещё взаимодействуют с хроматином, и некоторые молекулы SMC-белков присоединяются уже непосредственно к ДНК.

Метафаза:

В анафазе топонзомераза II диссоциирует в цитоплазму. Конденсины, оставаясь на хроматине, поддерживают его структуру.

Таким образом, согласно этой модели, топоизомераза П играет роль посредника между хроматином и конденсинами. Топоизомераза П взаимодействует с определёнными сайтами на ДНК, сближает их, при этом ДНК образует петли, с которыми в свою очередь взаимодействуют молекулы конденсинов. После этого топоизомераза П диссоциирует и структурная упаковка хроматина поддерживается конденсиновыми комплексами. 2) Другая модель основана на структурных сходствах SMC-белков с моторными белками кинезином и миозином. Димеры SMC-белков in vitro могут существовать в виде вытянутой нити, либо в виде изогнутых структур. Такие структуры, взаимодействуя с ДНК, могут образовывать гибкие мостики между молекулами ДНК (Hirano, 1998). В отличие от предыдущей модели, здесь посредником являются не молекулы топоизомеразы II, а какие-то другие белки, возможно, не-SMC субъединицы конденсинов. Эти модели предполагают, что степень компактизации пропорциональна количеству белка, связавшегося с ДНК:

Анафаза: Л б)

3) На основании особенностей структуры SMC-белков была выдвинута гипотеза о том, что они работают как моторные белки, которые движутся вдоль ДНК, используя энергию гидролиза АТФ ( Strunikov et al., 1993). Согласно этой модели, SMC-белки "катализируют" процесс компактизации, то есть достаточно нескольких молекул SMC-белков для того, чтобы компактизовать участок ДНК значительной длины: а) б) в) г)

Д)

4) Альтернативная гипотеза была высказана Kimura. Он предполагает, что ДНК образует витки вокруг молекул конденсинов, формируя устойчивый комплекс (Kimura,

1997). Показано, что 13S конденсины обеспечивают АТФ-зависимую положительную суперспирализацию кольцевой плазмидной ДНК в присутствии бактериальной или эукариотической топоизомеразы I (Kimura et al., 1997). В той же работе показано, что 13S конденсины имеют большее сродство к длинным участкам ДНК. Возможно, конденсины способны наматывать ДНК вокруг себя, формируя стабильный комплекс. То есть 13S сворачивают ДНК в правую (положительную) спираль, для этого используется энергия гидролиза АТФ. Торсионное напряжение сдвигает левозакрученные участки ДНК, свободные от белков, затем топоизомераза I релаксирует их.

В результате данных исследований были предложены две модели работы 13S комплекса. Первая модель описывает действие конденсинов в циклической молекуле ДНК:

138+АТФ -► О л топо II > И- Г --► релаксированная циклическая ДНК спирал изованная

ДНК

Другая модель предполагает наличие в хромосомах сайтов связывания конденсинов. Вероятно, эти сайты содержат определённые структурные мотивы, такие как АТ-богатые участки ДНК или изгибы. Так было показано, что in vivo 13S конденсины имеют высокую аффинность к синтетическим крестообразным участкам ДНК (Kimura et al., 1997).

Конденсины связываются с этими сайтами и вызывают локальную положительную суперспирализацию ДНК, используя энергию АТФ: а)

А А b) A с) A A

Такие структурные изменения приводят к компактизации хроматина. Взаимодействие молекул конденсинов могут ускорять и стабилизировать этот процесс. На сайтах связывания субъединиц конденсинов может происходить сборка мультимерных комплексов (Saka et al., 1994).

Таким образом, предложенные модели можно разделить на две группы. Первая группа включает модели, предполагающие «стехиометрическое» взаимодействие конденсинов с хроматином. Другими словами, степень компактизации хромосом зависит от плотности конденсинов, которые играют роль своеобразных скрепок, поддерживающих хромосомы в конденсированном состоянии. Вторая группа моделей предполагает «каталитическое» действие конденсинов. В этом случае конденсины активно участвуют в модификациях ДНК, а структура хромосомы поддерживается другими белками.

Конденсины в клеточном цикле.

Взаимодействие хромосом с конденсинами в системе in vitro имеет зависимость от фазы клеточного цикла. Биохимическое фракционирование белка цыплёнка Sell, гомолога ХСАР-Е, показало, что Sell в интерфазе распределён в объёме ядра, но при выделении ядер выходит из них (Saiton et al., 1994). В дрожжах SMC белки также находятся в ядрах (Strunnikov et al., 1993). Все эти результаты говорят о том, что конденсины локализуются в интерфазных ядрах, но при этом их аффинность к хроматину чрезвычайно низка. Хорошо подтверждает этот вывод тот факт, что белок Barren, гомологичный белку ХСАР-Н, ассоциируется с митотическими хромосомами, но не с интерфазным хроматином в клетках эмбрионов дрозофилы на ранних стадиях развития (Bhat et al., 1996).

Существует по крайней мере два доказательства того, что фосфорилирование отдельных белков, входящих в состав конденсинового комплекса, играет значительную роль во взаимодействии конденсинов с хроматином. Во-первых, специфическое связывание ДНК с конденсинами чувствительно к соотношению киназы/фосфатазы в экстракте яиц Xenopus laevis (Hirano et al., 1997). Во-вторых, XCAP-D2, XCAP-G и XCAP-H, три из пяти субъединиц 13S конденсинового комплекса, гиперфосфорилируются перед митозом и уровень фосфорилирования коррелирует со способностью конденсинов связываться с ДНК (Hirano et al.,1997). Было высказано предположение, что изменяет степень сродства конденсинов и хроматина, однако показано, что и митотическая, и интерфазная формы белков, когда они частично очищены, связываются с ДНК сходным образом. Эти результаты можно объяснить существованием белков-посредников типа шаперонов или хромосомных "рецепторов", которые помогают конденсинам связываться с хромосомами (Hirano et al., 1997).

Последовательность событий, которые приводят к ассоциации конденсинов с хромосомами в настоящее время не ясна. Тот факт, что фосфорилирование гистона НЗ сопряжено с началом конденсации хромосом, позволил Hirano (1999) предположить, что именно это фосфорилирование должно предшествовать связыванию конденсинов с митотическими хромосомами. Позднее было показано, что у Drosophila melanogaster фосфорилирование гистона НЗ Aurora В киназой необходимо для связывания конденсинов с хромосомами (Giet and Glover, 2001), а в человеческих клетках фракция SMC белков ассоциирована с дискретными локусами на хромосомах в интерфазе и эти фокусы колокализованы с сайтами, где располагаются фосфорилированые гистоны НЗ (Schmiesing et al., 2000). Однако, в системе in vitro фосфорилирование гистона НЗ не достаточно для связывания конденсинов с хромосомами (Kimura et al, 2001).

Недавно было показано взаимодействие белка человека XCAP-D2 с белком АКАР95 (A kinase-anchoring protein) (Steen et al., 2000), и была предложена модель, согласно которой АКАР95 в начале митоза связывается с хроматином и рекрутирует конденсиновый комплекс, вслед за чем происходит конденсация митотических хромосом (Steen et al., 2000).

SMC белки и ядрышки.

Недавно представители SMC-белков были обнаружены в ядрышках интерфазных клеток HeLa (Cabello et al., 2001). Кроме того, компоненты конденсинового комплекса человека (ЬСАР-С и hCAP-Е) распределены в виде мелких точек в интерфазных ядрах клеток HeLa, где они колокализованы с сайтами фосфорилирования гистона НЗ (Schmiesing et al., 2000). По предположению Cabello et al (2001) в ядрышках SMC-белки связаны с околоядрьппковым хроматином и участвуют в перестройках рибосомной ДНК. Эта гипотеза согласуется с данными, полученными методом иммунопреципитации, по которым в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae конденсины ассоциированы с рибосомной ДНК (Freeman et al., 2000). Возникает вопрос о роли SMC белков в ядрышках. В связи с этим, становятся интересными структура и функции ядрышка.

Из-за плотности и высокой степени светопреломления ядрышко было одной из первых внутриклеточных органелл, открытых исследователями. Впервые ядрышки были описаны Фонтана в 1781 году (Olson et al., 2002). В 1839 году Валентин предложил термин ядрышко для структуры, которое он назвал "ядром внутри ядра" (Olson et al., 2002). Долгое время функциональное значение ядрышка было непонятно. Вплоть до 50-х годов многие исследователи считали, что материал ядрышка представляет собой своего рода запас, который используется и исчезает в момент деления ядра (Ченцов, 1995). Однако ещё в 30-х годах было показано, что возникновение ядрышек топологически связано с зонами вторичных перетяжек на особых, ядрьппкообразующих хромосомах (Heitz, 1931; McClintock, 1934). Эти зоны были названы ядрышковыми организаторами, а сами ядрышки представлялись как структурное выражение хромосомной активности данных локусов. Позднее было показано, что ядрьппковые организаторы содержат гены, кодирующие 28S и 18S рибосомные РНК. Важным шагом в понимании функций ядрышка был электронно-микроскопический анализ активных рибосомальных генов (Miller and Beatty, 1969). Стало ясно, что рибосомные гены состоят из двух участков: нетранскрибируемой последовательности ДНК-спейсера и транскрипционной единицы. В состав транскрипционной единицы входят участки, соответствующие 45S РНК, которые затем процессируют на 28S, 18S и 5,8S рибосомные РНК (Miller, 1981).

Ультраструктурный анализ показал, что ядрышко состоит из трёх компонентов: гранулярного, плотного фибриллярного компонентов (Jordan, 1984), третий компонент представлен материалом фибриллярного центра (Jordan and Chapman, 1971). Предполагается, что структурной основой ядрышка являются белки ядерного матрикса.

С помощью авторадиографии на электронно-микроскопическом уровне было показано, что плотный фибриллярный компонент является местом синтеза РНК (Granboulan and Granboulan, 1965). Позднее появились данные о том, что синтез РНК происходит в фибриллярном центре (Thiry et al., 2000; Mais and Scheer, 2001) или на границе между фибриллярным центром и плотным фибриллярным компонентом (Dundr and Raska, 1993; Mosgoller et al., 1998). Таким образом, вопрос о точной локализации транскрипции рибосомальной РНК на данный момент остаётся открытым. Поздние стадии процессинга и аккумуляция пре-рибосом происходят в гранулярном компоненте.

Кроме ядрышка, в процессинге пре-рибосомной РНК участвуют особые внутриядерные структуры - кольчатые тельца или тельца Кахаля. Кольчатые тельца были впервые идентифицированы на светооптическом в 1903 году Рамоном Кахалем и получили своё название из-за своего строения на электронно-микроскопическом уровне. Было показано, что эти внутриядерные структуры вовлечены в процессинг пре-рибосомной РНК, сплайсинг пре-мРНК и другие важные внутриклеточные процессы (Gall, 2000). Показано, что кольчатые тельца могут взаимодействовать с ядрышком (Hardin et al., 1961; Ferreira and Carmo-Fonseca, 1995), более того, иногда они обнаруживаются внутри ядрышка (Malatesta et al., 1994; Ochs et al., 1994; Lyon et al., 1997). Была показана структурная связь телец Кахаля с фибриллярным компонентом (Hardin et al., 1969; Lafarga et al., 1983). Ядрышки и кольчатые тельца также объединяют некоторые общие компоненты, в частности белки фибрилларин (Reimer et al., 1987), В23, Noppl40 (Raska et al., 1991; Meier and Blobel, 1994), топоизомераза I и U3 малая ядерная РНК (Gall, 2000). Функции кольчатых телец остаются неясными. Так, существует модель, согласно которой эти органеллы являются местами сборки транскрипционных фабрик в ядре: три типа эукариотических полимераз (полимеразы I, II и III) ассоциируются с факторами процессинга и транскрипции и затем транспортируются в виде готовых комплексов к сайтам транскрипции (Gall, 2000).

Обзор данных литературы показывает, что практически все гипотезы о роли конденсиновых комплексов в конденсации митотических хромосом опираются на радиально-петлевую модель организации митотических хромосом. Все предложенные гипотезы о механизмах действия конденсинов можно разделить на две группы: «скрепочные» гипотезы и «каталитические». К сожалению, большинство из них базируется на данных, полученных в системе in vitro. Между тем большой интерес представляет исследование поведения конденсинов в условиях обратимой искусственной деконденсации in vivo. Так же важно выяснить, присутствуют ли эти комплексы при длительном поддержании хромосомы в конденсированном состоянии постоянно.

Относительно роли конденсинов в интерфазе на данный момент известно очень немного, многими авторами этот вопрос рассматривается сквозь призму представлений о механизмах работы конденсинов в митозе. Несмотря на то, что компоненты 13S конденсинового комплекса были выявлены в ядрышках, точная локализация в настоящее время не известна. В связи с этим, задачами настоящей работы было выяснить, меняется ли количество белков ХСАР-Е и pEg7 в клетке в течение клеточного цикла, или остаётся постоянным, а так же провести анализ распределения белка ХСАР-Е в ядрышке в норме и при воздействиях, вызывающих блок транскрипции и процессинга рРНК.

Поскольку было показано, что в клетке компоненты конденсинов существуют в составе трёх комплексов (XCAP-E/XCAP-C, XCAP-H/XCAP-G/pEg7 и 13S комплекс, состоящий из всех пяти субъединиц), и активностью обладает только полный 13S комплекс, для того, чтобы его идентифицировать в клетке, необходимым и достаточным является анализ белков ХСАР-Е и pEg7.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Выяснить, как меняется экспрессия белков ХСАР-Е и pEg7 в клеточном цикле.

2. Исследовать локализацию ХСАР-Е и pEg7 в митотических хромосомах в норме и при искусственном изменении структурного состояния хромосом в живой клетке.

3. Изучить локализацию белков ХСАР-Е и pEg7 в интерфазе на светооптическом и ультраструктурном уровнях.

4. Изучить локализацию белка ХСАР-Е в ядрышке при ингибировании синтеза и процессинга рРНК.

5. Исследовать связь ХСАР-Е с ядерным матриксом.

Материалы и методы.

Список сокращений: БСА - бычий сывороточный альбумин; ДНКаза -дезоксирибонуклеаза I; ДРБ - 5.6-дихлоро-1р-д-рибофуранозид-бензимидазол; РНКаза-рибонуклеаза А; ФСБ — фосфатно-солевой буфер; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; ALLN - N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal; DAPI - 4'6-Diamidino-2'-phenylindole; PMSF -pheni lometansylphoniftorid.

Клеточная культура.

В работе использовали клеточную культуру XL2 (Xenopus laevis). Клетки выращивали в культуральных флаконах "Falcon" (США) и на покровных стёклах в чашках Петри в среде Лейбовица L-15, "ICN" (США) с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы, "Вектор" (Россия) и антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и амфотерицин в концентрациях 100 мкг/мл, 100 мкг/мл и 25 мкг/мл соответственно) при температуре 25° С, как было описано ранее (Uzbekov et al., 1998).

Синхронизация клеток культуры XL2.

Для синхронизации клеток линии XL2 использовали протокол, описанный ранее (Uzbekov et al., 1999) с модификациями. После инкубации в среде без сыворотки в течение 24 часов, клетки помещали в полную среду с 2 мкг/мл афидиколина, на 30 часов. Далее клетки промывали несколькими сменами свежей полной среды культивирования. Фракции клеток с максимальным процентом клеток в S фазе и G2 фазе были получены через 2 и 10 часов после отмывки афидиколина, соответственно. Для получения фракции митотических клеток через 8 часов после отмывки афидиколина, клетки инкубировали 3 часа в полной среде с 0.5 мкг/мл нокодазола и затем 4 часа в полной среде с 0.5 мкг/мл нокодазола и 40 мкг/мл ALLN. После отмывки нокодазола и ALLN в течение 20 минут свежей средой была получена фракция митотических клеток. Фракция клеток в Gi фазе была получена через 11 часов после отмывки нокодазола и ALLN. Фракция клеток в Go фазе клеточного цикла была получена после культивирования клеток в течение 7 дней в полной среде при 4° С и затем 24 часов в среде без сыворотки при 25° С.

Состав всех клеточных фракций контролировали мечением BrdU. Процент клеток в Go фазе был определен по проценту клеток, не включивших BrdU в течение 33 часов. Процент клеток в S фазе был подсчитан на фиксированных клетках, включивших импульсную (30 минут) метку BrdU. Митотические клетки были подсчитаны прямым наблюдением в фазовоконтрастный микроскоп. Процент клеток в Gj и G2 фазах был подсчитан на основании ранее опубликованных данных (Uzbekov et al., 1999).

Western blot анализ а) Подготовка проб к электрофорезу:

Синхронизованные клетки были соскоблены с поверхности флаконов специальным скребком "Sigma" (США) с одновременным добавлением трёхкратного лизируюшего буфера Лэммли (Laemmli, 1970). Лизаты были обработаны ультразвуком, нагреты до 90° С в течение 5 минут и стандартизованы по концентрации клеток добавлением буфера Лэммли, содержащего 1% SDS, 5% Ь-меркаптоэтанол, 125 мМ TRIS-HC1, рН 7.2, бромфеноловый синий — до синей окраски. б) Определение белка:

Количество белков в пробах определяли по методу Шаффнера и Вейсмана (1973). Аликвоты препаратов (5мкл) наносили на мембранные фильтры "Сынпор" и высушивали.

Фильтры с белками промывали 5% раствором трихлоруксусной кислоты для фиксации и промывки материала. Затем фильтры переносили на 10 минут в 0.2% раствор амида чёрного. Для обесцвечивания фона их отмывали 7% раствором уксусной кислоты. Зоны с окрашенным белком вырезали и элюировали с них белок раствором 25 мМ NaOH, 5 мМ ЭДТА, 50% этанола. Элюцию проводили в течение 30 минут при температуре 37° С. Поглощение измеряли против контроля при 630 нм на спектрофотометре "Hitachi 124". Концентрацию белка определяли по калибровочной кривой. В качестве стандарта использовали БСА "Reanal". в) Электрофорез белков:

Электрофорез проводили по модифицированному методу Лэммли (1979). Плоский гель размером 20 см х 18 см х 0.1 см готовили между стеклянными пластинками. Градиентный разделяющий гель был приготовлен из 18% акриламида (соотношение акриламид : N, N' - метиленбисакриламид 30 : 0.6), содержащего 0.36 М TRIS-HC1, рН 8.9, 0.1% SDS, 30% глицерин, 1 мМ ЭДТА и 12% раствора акриламида (соотношение акриламид: N, N* - метиленбисакриламид 30 : 0.3), содержащего 0.36 М TRIS-HC1, рН 8.9, 0.1% SDS, 7.5% глицерин, 1 мМ ЭДТА. Гели полимеризовали добавлением персульфата аммония и ТЕМЕДа до 0.002 М. Растворы для градиентного геля смешивали про помощи магнитной мешалки и заливали между стеклянными пластинками. Концентрирующий гель содержал 3.5% акриламид (соотношение акриламид: N, № - метиленбисакриламид 30 : 0.6), содержащего 0.12 М TRIS-HC1, рН 6.8, 0.2% SDS, 2М мочевину, 1 мМ ЭДТА. Гель полимеризовали добавлением персульфата аммония и ТЕМЕДа до концентрации 0.004 М. Гель заливали между стёклами на разделяющий гель и сверху вставляли "гребёнку" из фторопласта для образования лунок для нанесения образцов. Пластинку с гелем устанавливали в прибор для электрофореза, в камеры заливали электродный буфер, содержащий 25 мМ TRIS, 0.2 М глицин и 0.003 М SDS. Образцы белков с помощью автоматической пипетки наносили в лунки геля в концентрации 30 мкг суммарного белка на лунку, подслаивая под электродный буфер. Электрофорез начинали при 300 V в концентрирующем геле, при вхождении в разделяющий гель напряжение уменьшали до 200 V, а затем вновь увеличивали до 300 V. В качестве маркеров использовали стандартный набор белков "Sigma". Гели окрашивали 0.1% кумасси-бриллиантовым синим в 20% изопропаноле и 10% уксусной кислоте, отмывали 7% раствором уксусной кислоты и фотографировали. г) Электроперенос:

С нефиксированного геля белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану при помощи электропереноса. На нижнюю пластину прибора помещали несколько листов фильтровальной бумаги, смоченных в 0.3 М TRIS-HC1, рН 10.4. Сверху помещали несколько листов фильтровальной бумаги, смоченных в 0.025 М TRIS-HC1, рН 10.4 и 20% метаноле. Сверху помещали нитроцеллюлозную мембрану, смоченную тем же раствором, затем гель и снова несколько листов фильтровальной бумаги, смоченных раствором, содержащим 0.025 М TRIS-HC1, рН 9.4, 0.004 М е-аминокапроновую кислоту и разделённых диализной мембраной. Перенос проводили при силе тока 0.8 мА/см2 в течение 1.5 часов. Окраску проводили 0.3% раствором понсо S, отмывку — дистиллированной водой. Далее мембраны высушивали. д) Иммуноблоттинг:

Мембраны были разрезаны для последующей раздельной окраски специфическими антителами и блокированы в 4 последовательных сменах TBST буфера (20 мМ TRIS-HC1, рН 7.6, 137 мМ NaCl, 0.1% Tween), содержащего 5% сухого обезжиренного молока в течение 1 часа при комнатной температуре. Эта и все последующие инкубации были проведены при постоянном помешивании на качалке. Далее мембраны были проинкубированы в растворе соответствующих специфических антител (моноклональные антитела против бета-тубулина, ДНК топоизомеразы На и pEg2 и афинно очищенные поликлональные антитела против ХСАР-Е и pEg7) на TBST, содержащем 5% сухого молока при комнатной температуре в течение 3 часов в разведении 1:10000. Затем мембраны промывали 3 раза по 10 минут в TBST, содержащем 5% сухого молока и инкубировали в растворе соответствующих вторых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена в разведении 1:500 на буфере TBS, содержащем 1% БСА (использовались антимышиные антитела для мембран, инкубированных с первыми антителами против бета-тубулина или ДНК топоизомеразы Па и pEg2 и антикроличьи для мембран, инкубированных с первыми антителами против ХСАР-Е и pEg7). Инкубацию полос проводили в течение 2 часов, несвязавшиеся антитела отмывали тремя сменами TBS с 0.05% Tween-20 и двумя сменами TBS. Для проявления блота использовали раствор 3,3 '-диаминобензидина в буфере TRIS-HC1 (10 мг 3,3'-диаминобензидина в 10 мл 0.1 М TRIS-HC1, рН 7.2). Непосредственно перед использованием в раствор добавляли перекись водорода (7 мкл 30% перекиси в 10 мл дистиллированной воды). Окрашивание блотов проводили в течение 5 минут. Проявление останавливали погружением блотов в дистиллированную воду.

Гипотонические воздействия

Клетки инкубировали в смеси 30% среды L-15 и 70% дистиллированной воды в течение 5 , 15 и 30 минут. Затем клетки споласкивали 30 % ФСБ, фиксировали 3% параформальдегидом на 30% ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре, лизировали в растворе, содержащем 0.5% Triton XI00 на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре и окрашивали антителами по методике, описанной далее.

Цитостатические воздействия

Клетки инкубировали в среде, содержащей нокодазол или таксол в конечных концентрациях 0.5 мкг/мл или 10 мкг/мл, соответственно в течение 3 или 6 часов. Затем клетки отмывали ФСБ от сыворотки, фиксировали 3% раствором параформальдегида на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре и лизировали в растворе, содержащем 0.5% Triton XI00 на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем окрашивали антителами по методике, описанной далее.

Иммуноцитохимический анализ

Для иммуноцитохимического анализа фиксированные и пермеабилизованные клетки инкубировали в ФСБ, содержащем 3% БСА в течение 30 минут при комнатной температуре для минимизации неспецифического связывания антител. Далее клетки инкубировали в ФСБ, содержащем 1% БСА и афинно очищенные поликлональные антитела против pEg7 или против ХСАР-Е (Strunnikov, 1998) в разведении 1:100 в течение 45 минут при 37°С.

В качестве маркеров различных компартментов ядрышек использовались антитела против В23 (Bulycheva et al., 2000), человеческие аутоиммунные антитела против фибрилларина или UBF в разведение 1:100 (Hernandez-Verdun). Клетки инкубировали в 1% растворе БСА на ФСБ, содержащем антитела к В23 или фибрилларину или UBF в разведении 1:100.

В качестве маркера кольчатых телец использовались человеческие аутоиммунные антитела против коилина (М. Bellini). Клетки инкубировали в растворе антител (1:100) на ФСБ, содержащем 1% BSA в течение 45 минут при температуре 37°С.

Затем клетки промывали ФСБ 3 раза по 10 минут и инкубировали со вторыми антикроличьими антителами коньюгированными с TRITS, "Sigma" (США) и со вторыми античеловеческими антителами, коньюгированными с FITC, "Sigma" (США) на буфере ФСБ с 1% БСА в течение 35 минут при температуре (разведение вторых антител 1:50). Клетки промывали ФСБ 3 раза по 10 минут, окрашивали DAPI, "Sigma" (США), в конечной концентрации 1 мкг/мл, в течение 10 минут и заключали в Mowiol, "Calbiochem" (США).

Для иммунофлуоресцентного выявления BrdU после 30 минут (для определения клеток в вфазе) или 33 часов (для определения клеток в Go) инкубации в среде, содержащей 40 мМ BrdU, "Sigma" (США), клетки трижды промывали ФСБ, затем фиксировали 30 минут в 70% этаноле при комнатной температуре. Далее клетки снова промывали ФСБ и помещали для гидролиза в 4М NaCl на 20 минут. После отмывки кислоты в ФСБ клетки инкубировали в растворе моноклональных мышиных антител против BrdU, "Sigma" (США) в ФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре, далее промывали 3 раза по 10 минут ФСБ и инкубировали со вторыми, коньюгированными с Texas-Red антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем препараты заключали в Mowiol, "Calbiochem" (США).

Препараты просматривали и фотографировали на микроскопе Opton-III, оборудованном ПЗС-камерой АТ-200 с воздушным охлаждением, "Photometries" (США).

Воздействие актиномицином Д

Для блока транскрипции клетки инкубировали в среде, содержащей 5 мкг/мл актиномицина Д в течение 6 часов. Затем клетки споласкивали ФСБ, фиксировали 3% раствором параформальдегида на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре, лизировали в растворе, содержащем 0.5% Triton XI00 на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре, и окрашивали антителами.

Воздействие ДРБ

Блок процессинга вызывали инкубацией клеток в среде, содержащей ДРБ в концентрации 100 мкг/мл в течение 6 часов. Затем клетки промывали ФСБ от сыворотки, фиксировали 3% параформальдегидом на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре и лизировали в растворе, содержащем 0.5% Triton XI00 на ФСБ в течение 10 минут при комнатной температуре и окрашивали антителами по вышеописанной методике.

Получение нуклеоидов.

Нуклеоиды получали по методу Шеваля, Полякова (2002). Клетки быстро промывали ФСБ, затем лизировали 0.5% раствором Triton Х-100 на буфере, содержащем 50 мМ TRIS-HC1 (рН 7.4), 5 мМ MgCl2, 1 мМ CuS04, 1 мМ PMSF в течение 10 минут. Затем клетки промывали в том же буфере, но без Triton Х-100 и обрабатывали экстрагирующим раствором, содержащим 2М NaCL, ЮмМ ЭДТА, 20 мМ TRIS-HC1 (рН 7.4) в течение 6 минут. Клетки фиксировали 3% раствором параформальдегида в экстрагирующем растворе и окрашивали антителами.

Обработка нуклеазами.

Энзиматической обработке подвергались клетки, пермеабилизованные в ФСБ или в условиях получения стабилизированного ядерного матрикса по методу Шеваля, Полякова, (2002).

Клетки, пермеабилизованные в 0.5% Triton Х-100 на ФСБ, обрабатывали ДНКазой в концентрации 250 мг/мл на ФСБ с добавлением 5 мМ MgCh или РНКазой в концентрации 200 мг/мл на ФСБ в течение 30 минут при температуре 37° С. Клетки фиксировали 3% параформальдегидом на ФСБ. Затем окрашивали антителами.

Клетки, пермеабилизованные в 0.5% растворе Triton Х-100 на буфере, содержащем 50 мМ TRIS-HC1 (рН 7.4), 5 мМ MgCl2, 1 мМ CuS04,1 мМ PMSF, обрабатывали ДНКазой в концентрации 250 мг/мл или РНКазой в концентрации 200 мкг/мл на том же буфере в течение 30 минут при температуре 37° С, экстрагировали в растворе (2М NaCL, ЮмМ ЭДТА, 20 мМ TRIS-HC1 (рН 7.4)) в течение 6 минут и фиксировали 3% раствором параформальдегида на экстрагирующем растворе. Затем окрашивали антителами.

Электронная микроскопия. а) Для ультраструктурного анализа клетки, культивируемые на покровных стёклах фиксировали смесью 4% параформальдегида и 0.2% глутарового альдегида на 0.1М буфере Зёренсена (рН = 7.2-7.4). Фиксированные клетки промывали 10 минут в двух сменах буфера Зёренсена и дофиксировали 1% раствора OSO4 в течение 2 часов. Далее клетки обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации: в 50% этаноле- две смены по 30 минут, 70% этаноле - 1 час, 80% этаноле — две смены по 30 минут, 96% этаноле - 1 час. Далее спирт заменяли ацетоном — две смены по 30 минут. Далее проводили пропитку в смесях ацетона с эпоном - ацетон : ЭПОН 812 в соотношении 3:1,

1:1, 1:3 в течение 1 часа в каждой смеси. Далее стёкла с клетками помещали в свежую заливочную смесь ЭПОН 812 в лунки тефлоновых пластинок. Полимеризацию смолы проводили сутки при 37° С и двое суток при 60° С.

После окончания полимеризации стёкла удаляли с помощью жидкого азота и просматривали заливки в фазовом контрасте. Нужные клетки отмечали при помощи металлического метчика, прикреплённого к объективу микроскопа, затачивали на эти клетки блок и резали на ультратонкие срезы 600-800 А на ультратоме Reichert-Jung ultracut "Reichert" (Германия). Срезы контрастировали 2% раствором цитрата свинца (по Рейнольдсу, 1963) и 2% водным раствором уранилацетата и фотографировали на микроскопе HU-1 IB (Hitachi, Japan). б) Для иммуно-электронной микроскопии клетки, культивируемые на стёклах фиксировали in situ, инкубировали в фосфатном буфере, содержащем 3% BSA в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее клетки инкубировали в растворе антител против ХСАР-Е (1:50) на фосфатном буфере, содержащем 1% BSA в течение 45 минут при температуре 37°С. Затем клетки промывали ФСБ 3 раза по 10 минут и инкубировали со вторыми анти-кроличьими антителами, конъюгированными с 5 нм золотом, "Sigma" (USA) 1:50 в ФСБ, содержащем 1%BSA 12 часов. Клетки промывали ФСБ 3 раза по 10 минут. Затем клетки фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида на фосфатном буфере Зёренсена. Клетки промывали дистиллированной НгО 3 раза по 5 минут, обрабатывали боргидридом в концентрации 1 мг/мл 2 раза по 10 минут при комнатной температуре и снова промывали дистиллированной НгО. Далее проводили процедуру усиления лактатом серебра. Для этого использовали следующие растворы: Отмывочный буфер: 50мМ MES, 200мМ сахарозы. Довести рН=5,8 добавлением NaOH.

Нейтральный фиксатор: 250мМ тиосульфата Na, 20мМ HEPES. Довести рН=7,4 добавлением NaOH. Stock растворы:

1) Раствор GumArabic: растворили 5г GumArabic в 10мл MilliQ в течение 3 суток.

2) Раствор NPG: растворили 10 мг NPG в 250 мкл 100% этилового спирта и добавили MilliQ до конечного объёма 5 мл.

3) Раствор лактата серебра: 36мг лактата серебра растворили перед употреблением в 5 мл milliQ (в темноте).

Процедура серебряного усиления заключалась в слежующем: смешали 5мл GumArabic с 2мл MES. Сполоснули клетки отмывочным буфером- 3 смены по 10 минут. В темноте за 3 минуты до использования добавили 1.5 мл раствора NPG к смеси GumArabic и MES, в этот конечный раствор добавили 1.5 мл лактата серебра. В полученном растворе инкубировали клетки в темноте в течение 2.5 минут. Остановили процесс нейтральным фиксатором.

Затем клетки промывали дистиллированной водой, обезвоживали в возрастающих концентрациях этанола и абсолютном ацетоне, и далее проводили пропитку образцов в смесях ацетона с эпоном (смесь ЭПОН 812). После пропитки клетки заключали в заливочную смесь ЭПОН 812 и проводили полимеризацию смолы в течение суток при 37° С и далее в течение двух суток при 60° С. Ультратонкие срезы 600-800 А получали с помощью ультратома LKB-III. Срезы контрастировали 2% раствором цитрата свинца (по Рейнольдсу, 1963) и 2% водным раствором уранилацетата и фотографировали на микроскопе HU-1 IB (Hitachi, Japan).

Результаты

Уровень экспрессии белков ХСАР-Е иpEg7 остаётся постояннным на протяжении клеточного цикла.

Основываясь на литературных данных, логично сделать предположение о том, что конденсины работают в клетке только в митозе, а именно тогда, когда происходит процесс компактизации митотических хромосом, и до начала их деконденсации. Возникает вопрос о том, присутствуют ли белки, входящие в состав конденсиновых комплексов в клетке на других стадиях клеточного цикла, возрастает ли их количество при вхождении клетки в митоз и снижается ли при переходе в Gi фазу. Чтобы ответить на этот вопрос, был проведёт количественный анализ белков ХСАР-Е, pEg7 и топоизомеразы Па в синхронизованных клеточных популяциях с помощью иммуноблоттинга.

В качестве стандарта использовался белок бета-тубулин, количество которого возрастает пропорционально клеточной массе и к концу интерфазы удваивается (Weisenberg, 1972).

Все использованные антитела, за исключением моноклональных антител против топоизомеразы Па, на иммуноблоте выявлялись в виде одиночных специфических полос: очищенные поликлональные антитела против ХСАР-Е в области 125 кДа, очищенные поликлональные антитела против pEg7 в области 150 кДа, моноклональные антитела против бета-тубулина в области 50 кДа. Моноклональные антитела против человеческой топоизомеразы Па выявлялись в виде одной мажорной полосы 180 кДа и дополнительной слабой полосы в районе 50 кДа (Рис. 1).

Синхронность клеточной популяции и фаза клеточного цикла, в которой эта популяция находилась, определялась с помощью включения BrdU и иммунофлуоресцентного анализа (Uzbekov et al., 1998; Uzbekov et al., 1999). В таблице 2

РОССИЙСКАЯ ,ГОСУДАРСТ*ШШ4* библиотека показано процентное соотношение клеток на различных стадиях клеточного цикла в синхронизованных клеточных популяциях, которые использовались для Western blot анализа:

Таблица 2. Процентное соотношение клеток на различных стадиях клеточного цикла в синхронизованных клеточных популяциях, которые использовались для Western blot анализа. клеток в Gi % клеток в S % клеток в G2 % клеток в М

Фракция "Gi" 85.6 11.9 1.9 0.7

Фракция "S" 7.7 923 0 0

Фракция "G2" 0 18.2 77.2 4.6

Фракция "M" 12.1 13.5 3.4 41.7

Так как количество бета-тубулина растёт пропорционально клеточной массе, измеряя относительное количество белка к уровню бета-тубулина определялось отклонение от пропорционального роста количества исследуемого белка в клеточном цикле (Узбеков, 2003, в печати). Уровни остальных белов в клеточном цикле были отнесены к уровню бета-тубулина в соответствующей фракции. При этом отношение во фракции "Gi" было принято за 1. На рис. 2 показаны изменения уровней белков в течение клеточного цикла. Как видно из рис.2, от Gi фазы до митоза количество белка pEg2 возрастало более чем в 15 раз. Уровень топоизомеразы II был максимальным в G2 фазе (примерно в 3.5 раза выше, чем в Gi) и оставался таким во время митоза, что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными (Heck et al., 1988; Drake et al., 1989; Woessner et al., 1991).

Напротив, уровень экспрессии ХСАР-Е и pEg7 медленно повышался при переходе от Gi фазы к митозу. В митозе уровень этих белков был менее чем в 2 раза выше по сравнению с Gi (Рис. 2). Таким образом, можно говорить о том, что уровень белков ХСАР-Е и pEg7 лишь незначительно повышается одновременно с увеличением размеров клеток.

Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических хромосомах.

Характер распределения антител к белку ХСАР-Е на митотических хромосомах различается в зависимости от фазы митоза. Начиная с ранней профазы, антитела к ХСАР-Е локализуются в аксиальных районах хромосом в виде дискретных блоков. На этой стадии митоза в кариоплазме видны гомогенно флуоресцирующие ядрышки, размеры которых значительно меньше интерфазных. В метафазе и анафазе интенсивность флуоресценции хромосом значительно возрастает (Рис. 3). Сравнительный анализ индивидуальных хромосом, окрашенных DAPI и антителами к ХСАР-Е, показывает, что на этой стадии митоза антитела взаимодействуют только с аксиальными областями хроматид. При этом сохраняется дискретность флуоресценции антител в аксиальных районах, а в сестринских хроматидах выявляется симметричное расположение слабо и сильно флуоресцирующих зон (Рис. 4). В самом начале телофазы интенсивность флуоресценции хромосом резко снижается и в средней телофазе, одновременно с началом их деконденсации, антитела к ХСАР-Е перестают выявляться на хромосомах. В поздней телофазе, по мере формирования дочерних ядер, белок не выявляется в хромосомах и выявляется в цитоплазме. Одной из особенностей распределения белка ХСАР-Е в делящихся клетках является то, что сильная флуоресценция антител наблюдается в полюсах митотического веретена.

Эти данные хорошо согласуются с ранее полученными данными о другой субъединице конденсинового комплекса, белке pEg7 (Cubizolles et al., 1998). Характер взаимодействия этого белка с хромосомами принципиально не отличается от распределения ХСАР-Е. В профазе антитела к ХСАР-Е выявляются в аксиальных районах хромосом в виде дискретных блоков, в метафазе и анафазе они преимущественно взаимодействуют с аксиальными участками сестринских хроматид, где симметрично располагаются в виде дискретных ярко флуоресцирующих блоков (Рис. 5). Максимальной флуоресценцией обладают хроматиды метафазных хромосом и анафазные хромосомы; одновременно с началом деконденсации хромосом в телофазе интенсивность флуоресценции значительно ослабевает. Кроме того, в профазных клетках выявляются гомогенно флуоресцирующие "остаточные" ядрышки и глобулярные кариоплазматические структуры.

Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в клетках, подвергнутых гипотоническому шоку.

Поскольку считается, что основной функцией конденсинов является формирование и поддержание высших уровней структурной организации митотических хромосом, одним из подходов для анализа функциональной роли конденсинов и характера их взаимодействия с хромосомами может служить ндуцированное изменение компактизации митотических хромосом in vivo. Искусственное изменение структурного состояния хромосом в живых клетках вызывали инкубацией клеток в гипотонической среде. Такое воздействие является структурно обратимым, поэтому можно установить связь между присутсвием конденсинов и структурной целостностью хромосом. Сравнение митотических хромосом, окрашенных флуорохромом DAPI, в контрольных клетках и в клетках, подвергнутых гипотоническому шоку, показывает, что обработка живых клеток 30% раствором среды L-15 в течение 5 минут приводит к увеличению диаметра хромосом и одновременно снижает интенсивность их окрашивания (Рис. 6, 7). Это означает, что гипотоническое воздействие на живые клетки вызывает частичную деконденсацию митотических хромосом. Общая морфология хромосом в этих условиях сохраняется. Через 15 минут инкубации начинается постепенная адаптация клеток к гипотонической среде, сопровождающаяся реконденсацией хромосом; примерно через 30 минут хромосомы возвращаются в конденсированое состояние, близкое к контрольному. Таким образом, реакция митотических хромосом на гипотоническое воздействие представлена двумя фазами: быстрая деконденсация и следующая за ней постепенная реконденсация хромосом. Анализ локализации антител к белку pEg7 в клетках, подвергнутых гипотоническому шоку, показывает, что в фазе деконденсации наблюдается выход части pEg7 в цитоплазму, окружающую хромосомы (Рис. 6, а, Ь). В то же время, в телах деконденсированных хромосом сохраняются тонкие аксиальные структуры, состоящие из мелких флуоресцирующих гранул. Через 30 минут после воздействия, когда наступает фаза реконденсации, хромосомы полностью теряют способность связывать антитела к этому белку и вся флуоресценция локализуется в цитоплазме (Рис. 6, е, f). Аналогичная динамика перераспределения после гипотонического воздействия наблюдается и для ХСАР-Е (Рис. 7).

Так же как и pEg7, белок ХСАР-Е начинает выявляться в цитоплазме во время фазы деконденсации, однако метка выявляется и в хромосомах. Во время фазы реконденсации белок ХСАР-Е полностью локализуется в цитоплазме, окружающей хромосомы.

Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках в условиях блокады митоза.

В митозе конденсины сохраняют ассоциацию с конденсированными хромосомами. Эта ассоциация может быть следствием их функциональной активности, а может служить механизмом их переноса в дочерние клетки. В связи с этим необходимо исследовать поведение конденсинов в хромосомах, пребывающих в конденсированном состоянии длительное время. Такого состояния можно достичь, обрабатывая митотические клетки цитостатиками. В настоящей работе для этой цели использовались нокодазол и таксол. Клетки инкубировали в среде, содержащей 0.5 мкг/мл нокодазола или 10 мкг/мл таксола, фиксировали через разные промежутки времени и окрашивали антителами к белкам ХСАР-Е или pEg7. В течение 6 часов наблюдений происходило накопление метафазных клеток, при этом хромосомы в них сохраняли компактную структуру. Важно отметить, что в данных условиях не наблюдалось реверсии митоза, то есть перехода клеток в интерфазу без расхождения хромосом. При этом, в клетках, обработанных нокодазолом, антитела к pEg7 и к ХСАР-Е перестают окрашивать хромосомы уже через 3 часа после начала воздействия (Рис. 8, 9). В клетках, инкубированных в среде, содержащей таксол, также наблюдается снижение интенсивности окрашивания митотических хромосом антителами к pEg7 и ХСАР-Е и появление метки в цитоплазме (Рис. 10, 11). Можно предположить, что отсутствие окрашивания хромосом связано с их суперкомпактизацией. Поэтому в качестве контроля использовались антитела к топоизомеразе П. В этих условиях антитела выявляют топоизомеразу II в осевых областых компактизованных хромосом, что делает данное предположение маловероятным.

Локализация белков ХСАР-Е, pEg7 и мажорных белков ядрышка в интерфазных клетках.

Как следует из экспериментов по анализу уровня экспрессии белков ХСАР-Е и pEg7, их количество в течение клеточного цикла остаётся постоянным. В связи с этим, возникает вопрос об их функциональной роли в интерфазе. Для ответа на этот вопрос был проведен иммуноцитохимнческий анализ локализации белков ХСАР-Е и pEg7 в интерфазных клетках.

В интерфазных клетках линии XL2 при окрашивании антителами к белку ХСАР-Е интенсивно флуоресцируют ядрышки и несколько (от 1 до 4) мелких глобулярных структур в кариоплазме (Рис. 12). Слабая флуоресценция наблюдается также в кариоплазме. Следует отметить, что локализация исследуемого белка в ядрышке не зависит от фазы клеточного цикла, поскольку окрашивание ядрышка наблюдается во всех интерфазных клетках. Двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и флуорохромом DAPI показывает, что белок ХСАР-Е не связан с околоядрышковым хроматином.

Большинство ядер культивируемых клеток XL2 содержат 1 -2 округлых или эллипсовидных ядрышка. Как показывает ультраструктурный анализ, ядрышки имеют типичные для этих органоидов структурные домены: гранулярный компонент и так называемые фибриллярные комплексы (Shaw and Jordan, 1995; Scheer and Hock, 1999), состоящие из фибриллярных центров и окружающего их плотного фибриллярного компонента (Рис. 13).

Несмотря на некоторые данные о локализации субъединиц конденсинового комплекса в ядрышках, полученные недавно (Cabello et al., 2001; Freeman et al., 2000), в настоящее время отсутствуют сведения о внутриядрьппковой компартментализации этих белков. Для более детального исследования топологии ХСАР-Е в интерфазных ядрах было использовано двойное окрашивание клеток линии XL2 антителами к ХСАР-Е и антителами к маркерным белкам внутриядрышковых доменов. Для визуализации фибриллярных центров использовались антитела к UBF, для визуализации плотных фибриллярных компонентов - антитела к фибрилларину, и для гранулярных компонентов использовались антитела к белку В23 (Scheer and Hock, 1999; Olson et al., 2000).

Полученные данные показывают, что в ядрышках белок ХСАР-Е колокализуется с В23. Оба белка располагаются на периферии ядрышек в виде сплошной сферы или одной -трёх полусфер, окружающих фибриллярные комплексы (Рис. 14). С фибрилларином наблюдается лишь частичная колокализация, с белком UBF колокализации нет (Рис. 15, 16).

Ультраструктурный анализ распределения антител, конъюгированных с золотом показывает, что ХСАР-Е локализован в гранулярном и плотном фибриллярном компонентах ядрышка. В некоторых случаях материал плотного фибриллярного компонента, включающий метку, внедряется в фибриллярные центры в виде электронно-плотных тяжей. Собственно в фибриллярных центрах ХСАР-Е не выявляется (Рис. 17).

При сходных условиях фиксации, белок pEg7 в составе интерфазных ядрышек не выявляется. В интерфазных клетках антителами к этому белку интенсивно окрашивается кариоплазма (Рис. 18). Однако, модификация процедуры фиксации, в частности использование метанольной фиксации и метанольной фиксации с предварительным лизисом в Triton XI00 позволяет визуализовать этот белок в составе периферичесих районов ядрышка.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что некоторые субъединицы конденсиновых комплексов входят в состав гранулярного компонента ядрышка.

Влияние актиномицина Д и ДРБ на локализацию ХСАР-Е в ядрышках интерфазных клеток.

Для того, чтобы ответить на вопрос о возможных функциях конденсинов в ядрышке, клетки подвергались воздействию актиномицина Д и ДРБ. Поскольку в гранулярном компоненте ядрышка происходят терминальные этапы процессинга и сборка прерибосомных частиц (Olson et al., 2000), ингибирование синтеза рРНК приводит к истощению пула зрелой рРНК и рибосом. Поведение конденсинов в этих условиях может отражать характер их взаимодействия с различными компонентами ядрышка.

Длительная инкубация клеток линии XL2 с актиномицином Д приводит к типичной сегрегации ядрышка на 2 компартмента, содержащей гранулярный и фибриллярный компоненты (Рис. 19). Антитела против ХСАР-Е гомогенно окрашивают лишь часть сегрегированного ядрышка. Двойное окрашивание клеток антителами и DAPI показало, что зона распределения антител в ядрышке не совпадает с зонами конденсиованного хроматина. Двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и фибрилларину или UBF показало, что эти белки в сегрегированном ядрышке не колокализуются (Рис. 20, 21). Напротив, В23 и ХСАР-Е в таких ядрышках колокализуются (Рис. 22). На ультраструктурном уровне антитела, меченые коллоидным золотом выявляются в гранулярном компартменте сегрегированного ядрышка. В фибриллярном компартменте метка отсутствует (Рис. 23).

После инкубации клеток с ДРБ, композиция гранулярного компонента ядрышка практически не изменяется, а крупные фибриллярные комплексы диссоциируют на несколько более мелких структур, содержащих фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент (Рис. 24). Как и в контроле, каждая такая структура по периферии декорируется антителами к фибрилларину (Рис. 25), а в центральной области содержит UBF (Рис. 26). Двойное окрашивание ядрышек антителами к ХСАР-Е и белкам В23 и фибрилларину показывает, что ХСАР-Е колокализуется с В23, но не колокализуется с фибрилларином (Рис. 27). На ультраструктурном уровне после воздействия ДРБ антитела к ХСАР-Е декорируют в сегрегированных ядрышках зоны, соответствующие ГК и ПФК. В остаточном материале ФЦ метка отсутствует (Рис. 28).

Иммунолокализация белков ХСАР-Е и коилина в интерфазных клетках.

Как было описано выше, помимо ядрышек, практически во всех ядрах интерфазных клеток антитела к ХСАР-Е декорируют небольшие глобулярные структуры в кариоплазме. Их количество варьирует от 2 до 5 на ядро, а размер от 0.3 до 1 мкм. Белок В23 колокализуется с ХСАР-Е только в крупных таких структурах и отсутствует в мелких. Известно, что другими внутриядерными структурами, содержащими белок В23, являются тельца Кахаля, или так называемые кольчатые тельца (Gall, 2001). В связи с этим, проводилось окрашивание клеток Х1-2 антителами к коилину - маркерному белку кольчатых телец. Полученные данные показывают, что коилин локализуется в кариоплазме некоторых клеток в виде многочисленных мелких глобулярных локусов (Рис. 29). Однако в этих локусах не наблюдается колокализации коилина с белком ХСАР-Е (Рис. 29).

Помимо ядрышек и кариоплазматических структур, в интерфазных ядрах наблюдается слабая флуоресценция антител к ХСАР-Е в кариоплазме. На ультраструктурном уровне, после окрашивании антителами, коньюгированными с золотом, метка выявляется во всем объеме ядра строго в связи с ДНП-фибриллами (Рис. 17).

Для идентификации молекулярных компонентов, с которыми, предположительно, может бьггь ассоциирован ХСАР-Е, клетки, пермеабилизованые в ФСБ, обрабатывались нуклеазами (ДНКазой или РНКазой).

Обработка клеток ДНКазой приводила к полному гидролизу ДНК, что видно по окраске DAPI (Рис. 30). При этом наблюдались существенные изменения в распределении белков. Так, антитела к ХСАР-Е окрашивали ядрышки гомогенно, по всему объёму, кроме того, наблюдался выход этого белка в цитоплазму.

После воздействия на клетки, лизированные в ФСБ РНКазой, ХСАР-Е не выявлялся в ядрышках, при этом также наблюдался выход ХСАР-Е и коилина в цитоплазму (Рис. 30).

Локализация ХСАР-Е в нуклеоидах и ядерном матриксе.

Наличие в структуре SMC белков участков, образующих при димеризации coiled-coil структуры, характерные для многих белков, способных образовывать фибриллярные структуры (например белки промежуточных филаментов), позволило высказать предположение о скелетной роли SMC белков в структурной организации хромосом (Strunnikov, 2000). Нельзя исключить, что подобную функцию эти белки выполняют и в ядрышке. Для ответа на этот вопрос были проведены эксперименты по получению ядерного матрикса.

Препараты ядерного матрикса были получены несколькими способами. Во-первых, были получены нуклеоиды по методу Шеваля и Полякова (2002). Полученные в условиях стабилизации ядерного матрикса нуклеоиды имеют типичную структуру: они представлены остаточными ядрами с фибриллярно-гранулярной сетью ДНК-содержащего материала и окружающим их гало экструзированной из ядер ДНК (Cook and Brazell, 1975; Lebkowski and Laemmli, 1982; Шеваль и Поляков, 2002) (Рис. 31). В этих условиях вокруг ядрышек четко выявляются зоны, интенсивно окрашенные DAPI (Рис. 31).

В нуклеоидах белки ХСАР-Е и В23 колокализуются в остаточных ядрышках и глобулярных структурах в кариоплазме (Рис. 31). Аналогично клеткам, фиксированным in situ, метка выявляется по периферии ядрышек в виде одной - трёх полусфер или колец; кариоплазматические структуры сохраняют размер и форму, как в контроле. Наложение изображений показывает, что DAPI-положительный материал и белок ХСАР-Е не колокализуются ни в ядрышках, ни в глобулярных структурах (Рис. 31). В условиях экстракции 2М NaCl антитела выявляются в цитоплазме, но в большинстве клеток распределение экстрагированного из ядер ХСАР-Е не совпадает с зонами экструзированной ДНК (Рис. 31).

Следующим этапом было воздействие ДНКазой. В препаратах ядерного матрикса. полученных после обработки ДНКазой, ядра практически перестают окрашиваться DAPI. Антитела к ХСАР-Е и В23 окрашивают ядрышки аналогично ядрышкам неэкстрагированных клеток, однако интенсивность флуоресценции выглядит более слабой по сравнению с "интактными" нуклеоидами. Значительная флуоресценция наблюдается в цитоплазме, что свидетельствует о выходе части ХСАР-Е и В23 из ядер в результате обработки (Рис. 31).

Предварительная обработка РНКазой приводит к тому, что в препаратах ядерного матрикса вокруг ядрышек и кариоплазматических структур образуются зоны, интенсивно окрашивающиеся DAPI (Рис. 31). Окраска антителами к ХСАР-Е выявляет очень слабую, близкую к фоновой, флуоресценцию в ядрышках и сильную флуоресценцию в цитоплазме. Белок В23 практически не выявляется в составе ядрышек, но наблюдается сильная флуоресценция антител в цитоплазме. Совмещение изображений ядер, окрашенных DAPI и антителами к ХСАР-Е показывает, что этот белок не колокализован с DAPI-позитивными участками (Рис. 31).

Локализация ХСАР-Е в хромосомном скзффолде.

В делящихся клетках, пермеабилизованных в условиях стабилизации хромосомного скэффолда и экстрагированных 2М NaCl, окрашивание DAPI выявляет остаточные хромосомы в виде длинных извитых нитей (Рис. 32). В профазе и анафазе антитела к ХСАР-Е окрашивают сестринские хроматиды гомогенно, в «средней» метафазе, до начала расхождения хроматид к полюсам, отчетливо выявляется более интенсивная флуоресценция центромерных районов. Помимо хромосом, в митотических клетках, экстрагированных 2М NaCl антитела к ХСАР-Е декорируют перицентриолярные районы, окружающие разошедшиеся к полюсам центриоли (Рис. 32).

Обсуждение.

В работе показано, что белки — субъединицы конденсинового комплекса играют важную функциональную роль и в интерфазе и в митозе. В связи с тем, что функции на этих стадиях клеточного цикла могут быть различны, целесообразно обсудить отдельно их роль в митотических хромосомах и интерфазных клетках.

В настоящей работе изучена динамика внутриклеточной локализации белков ХСАР-Е и pEg7 в норме и при экспериментальных воздействиях, вызывающих искусственное изменение структурного состояния митотических хромосом и ядрышка в живых клетках.

В полном соответствии с данными литературы, в контрольных делящихся клетках линии XL2 оба белка выявляются в митотических хромосомах, начиная со стадии профазы, до телофазы. При этом конденсины располагаются в виде близких по размеру блоков, симметрично в аксиальных областях сестринских хроматид. Это хорошо согласуется с данными о том, что куриный белок SCII, гомолог ХСАР-Е, является мажорным белком скэффолда митотических хромосом (Saitoh et al., 1994). Также было показано, что компоненты комплекса конденсинов взаимодействуют с другим ключевым белком скэффолда, топоизомеразой II (Bhat et al., 1996; Maeshima and Laemmli, 2003). Ранее светооптическими и электронно-микроскопическими методами было показано, что гипотонический шок приводит к значительной деконденсации периферического материала митотических хромосом, при сохранении его относительно высокой плотности в аксиальных районах (Зацепина и др., 1989). К аналогичным результатам приводит экстракция гистонов из изолированных митотических хромосом. Эти данные интерпретируются как одно из доказательств существования в митотических хромосомах непрерывного осевого белкового скэффолда (Saitoh, Laemmli, 1994). Предполагается, что белки ХСАР-С/Е и топоизомераза II являются интегральными компонентами скэффолда и обеспечивают специфическую радиально — петлевую организацию хроматина в интерфазных и митотических хромосомах (Gasser, 1995). Согласно известной гипотезе о функциональной роли скэффолда, эти данные можно трактовать как доказательство прямого участия конденсинов в митотической компактизации хромосом. Однако поведение конденсинов в клетках, адаптирующихся к гипотонической среде, заставляет усомниться в том, что ХСАР-Е и pEg7 играют роль структурных белков.

После кратковременного набухания, вызванного гипотоническим шоком, хромосомы вступают в обратимую реконденсацию, которая осуществляется без участия конденсинов: в реконденсированных хромосомах антитела к белкам ХСАР-Е и pEg7 не выявляются. Таким образом, первичную деконденсацию хромосом после гипотонического шока можно рассматривать как своего рода сигнал, индуцирующий полный выход конденсинов из состава хромосом. Независимо от того, какие факторы вызывают реконденсацию хромосом в условиях адаптации клеток к гипотонической среде, важно, что конденсины в этом процессе не принимают никакого участия, т.к. локализуются не в хромосомах, а в цитоплазме. К аналогичным выводам об отсутствии у конденсинов структурной функции приводят данные о динамике ХСАР-Е и pEg7 в клетках, блокированных на стадии метафазы нокодазолом и таксолом. Эти агенты были нами выбраны потому, что они обладают разным механизмом действия на митотическое веретено. Обработка нокодазолом приводит к деполимеризации микротрубочек, и полному разрушению митотического веретена (De Brabander et al., 1977). Таксол, напротив, понижает критическую концентрацию полимеризации тубулина, что приводит к формированию дополнительных нецентросомальных фокусов полимеризации микротрубочек в цитоплазме митотических клеток и вызывает блок митоза вследствие нарушения обмена тубулина (Lee et al., 2001). Однако, и в том и в другом случае хромосомы способны достигать нормальной степени компактизации и сохранять ее в течение нескольких часов. Как оказалось, хромосомы, блокированные на стадии метафазы, полностью теряют связь с ХСАР-Е и с pEg7, но при этом остаются длительное время в конденсированном состоянии. Существенное снижение интенсивности окрашивания антителами к ХСАР-Е и pEg7 митотических хромосом в этих условиях, по-видимому, не является следствием прямого действия цитостатиков на характер взаимодействия конденсинов с хроматином, а, скорее, связано только с выходом белков ХСАР-Е и pEg7 из митотических хромосом. Таким образом, результаты экспериментов с длительным воздействием нокодазола и таксола позволяют заключить, что белки ХСАР-Е и pEg7 не являются необходимыми для поддержания структурной целостности высших уровней организации хроматина, как это предполагалось ранее (Hirano, 1998), то есть, не могут играть роль гипотетических белковых "скрепок". Возможно, конденсины необходимы только на начальных этапах формирования "высших" уровней компактизации ДНК в митотических хромосомах, а не для стабилизации их макромолекулярной структуры, которая достигается в результате действия других структурных белков. Постоянное присутствие конденсинов на хромосомах в течение всего митоза может обеспечивать их пассивное перераспределение в дочерние ядра. Возможно также, что конденсины не принимают непосредственного участия в компактизации хромосом, а являются составной частью аппарата когезии. Как известно, процессы когезии и конденсации строго координированы и необходимы для достижения правильной сегрегации генетического материала в митозе (Hirano, 1998; Losada and Hirano, 2001). Данные о том, что связывание конденсинов специфическими антителами приводит к нарушению конденсации хромосом в системе in vitro (Hirano, 1998; Hirano et al., 1997; Cubizolles et al., 1998) можно объяснить тем, что в этих условиях нормальная конденсация хромосом не может начаться, поскольку нарушен аппарат когезии. Данные о колокализации конденсинов с топоизомеразой II также подтверждают такое объяснение (Gasser, 1998). Недавно было получено и генетическое доказательство того, что название конденсинов не вполне отражает приписываемую им функцию в клетке: мутанты по гену DCAP-G (Drosophila melanogaster) имели нормально конденсированные хромосомы, но в них наблюдались нарушения при расхождении сестринских хроматид (Lee et al., 2001). Исходя из вышеизложенных данных, принципиальная роль конденсинов в процессе компактизации хромосом, по нашему мнению, может быть пересмотрена. Вероятно, этот комплекс белков принципиально важен в другой структурной перестройке, идущей параллельно конденсации хромосом - разделении сестринских хроматид. Однако без интактности этой системы, включающей кроме конденсинов топоизомеразу II и другие белки, процесс конденсации хромосом в клетке не инициируется. Такая регуляция является, по-видимому, эволюционно выработанной для предотвращения нарушений при расхождении хромосом в митозе и втором делении мейоза. Эти данные согласуются с гипотезой о взаимосвязи двух комплексов - когезинов и конденсинов в начале митоза (Losada and Hirano, 2001).

Вопрос о функциональной роли конденсинов в интерфазе в настоящее время остаётся открытым. По предположению Cabello (Cabello et al., 2001) белок hCAP-H, локализованный в ядрышках, ассоциирован с рибосомной ДНК и выполняет роль фактора, модулирующего её структурное и функциональное состояние. Эта гипотеза согласуется с данными, полученными методом иммунопреципитации, по которым в клетках дрожжей S. cerevisiae конденсины ассоциированы с рДНК (Freeman et al., 2000).

Ранее многими авторами была показана способность 13S конденсинов или отдельных SMC белков связывать ДНК in vitro (Akhmedov et al., 1998; Sutani and Yanagida, 1997; Kimura and Hirano, 1997) и взаимодействовать с конденсированными хромосомами как in vivo, так и in vitro (Hirano and Mitchison,1994; Freeman et al., 2000). Можно предположить взаимодействие ХСАР-Е с нетранскрибирующимися цистронами рДНК, которые в виде компактизованного хроматина могут плотно прилегать к ядрышку (Graf and Kobel., 1991) или, в некоторых случаях, интеркалировать в гранулярный компонент. У X. laevis примерно 500 цистронов рРНК на гаплоидный набор (Wallace and Birnstiel, 1966) расположены в коротком плече 12 хромосомы (Kahn, 1962), рядом с центромерой (Graf and Kobel, 1991). Таким образом, в интерфазе центромерный район 12 хромосомы находится в непосредственной близости от ядрышка. He-случайная ассоциация центромер с ядрышками была показана и для других типов клеток (Stahl et al., 1976; Cerda et al., 1999; Chou and DeBoni, 1996; Haaf and Schmid, 1989; Lee et al., 1999; Leger et al., 1994; Park and DeBoni, 1992), предполагается, что это важно для регуляции транскрипции рРНК. Однако, двойное окрашивание клеток флуорохромом DAPI и антителами показывает, что белок ХСАР-Е не выявляется в зонах локализации околоядрьппкового хроматина. Нуклеазные обработки клеток также показывают, что в ядрышке белок ХСАР-Е по-видимому не связан с хроматином.

Для понимания роли конденсинов в ядрышке принципиально важно знать, в каком из основных его субдоменов — гранулярном компоненте, фибриллярных центрах или в плотном фибриллярном компоненте, локализованы эти белки. В качестве иммуноцитохимических маркёров этих субдоменов мы использовали антитела к их мажорным белкам: В23, транскрипционному фактору UBF и фибрилларину (Spector et al.,1984; Zatsepina et al., 1993; Shaw and Jordan, 1995). Как показало двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и к каждому из перечисленных белков, в ядрышках клеток Xenopus laevis белок ХСАР-Е колокализуется только с В23 и частично с фибрилларином, но не с UBF. В соответствии с современными представлениями о молекулярной организации ядрышка (Shaw and Jordan, 1995), отсутствие колокализации ХСАР-Е с UBF и фибрилларином означает, что ХСАР-Е не ассоциирован с транскрибирующейся рДНК, и по-видимому, не участвует в начальных этапах процессинга рРНК. Косвенно, в пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что подавление синтеза рРНК актиномицином Д, блокирующее формирование новых предшественников рРНК (Puvion-Dutilleul, 1992), не приводит к удалению из "остаточного" гранулярного компонента диссоциированного ядрышка ХСАР-Е и/или к его депонированию в плотном фибриллярном компоненте. После воздействия аналога аденозина ДРБ, который вызывает интенсивную деградацию 32S рРНК, но лишь частично подавляет синтез 45S рРНК (Granick, 1975), ХСАР-Е так же остаётся в гранулярном компоненте ядрышек и в плотном фибриллярном компоненте. На этом основании можно предположить, что в гранулярном компоненте ядрышка ХСАР-Е ассоциирован с процессирующейся 45 S рРНК, но не входит в состав зрелых прерибосомных частиц.

В работе была проведена точная иммунолокализация ХСАР-Е в основных субдоменах интерфазных ядрышек. Окраска антителами к ХСАР-Е, конъюгированными с золотом показала, что в ядрышках клеток фиксированных in situ, этот белок локализован в гранулярном компоненте и в плотном фибриллярном компоненте, тогда как фибриллярные центры всегда остаются свободными от метки. Аналогичный характер распределения антител, конъюгированных с золотом наблюдается в ядрышках после подавления синтеза рРНК актиномицином Д и при блоке процессинга ДРБ. На основании этих данных можно сделать вывод, что ХСАР-Е не взаимодействует с активированными генами рибосомной РНК, находящимися в фибриллярных центрах.

Возникает вопрос, с какими компонентами (ДНК, РНК или белками) взаимодействует ХСАР-Е в интерфазном ядре, в том числе в плотном фибриллярном и в гранулярном компонентах ядрышка.

По результатам иммуноголдинга, часть ХСАР-Е локализуется на фибриллах хроматина в интерфазном ядре, что соответствует ранее полученным данным (Schmiesing et al., 2000). С помощью окраски амином осмия (Derenzini et al., 1987) и методом локализации терминальной трансферазы (Thiry et al., 2000) показано, что ДНК входит в состав гранулярного компонента ядрышка в виде небольших кластеров ДНП фибрилл. Частичный выход ХСАР-Е из ядрышка после воздействия ДНКазы можно объяснить гидролизом ДНК во внутриядрышковом хроматине. В то же время, практически полное удаление метки после обработки РНКазой пермеабилизованных клеток или нуклеоидов позволяет утверждать, что ХСАР-Е в ядрышке преимущественно взаимодействует с рибосомальной РНК. Известно, что формирование прерибосомных частиц — векторный процесс, направленный от фибриллярных комплексов к периферии ядрышка, начальным этапом которого является транскрипция рРНК. Сведения о точной локализации сайтов транскрипции рРНК противоречивы: по некоторым данным экспрессия рибосомных генов осуществляется на границе между плотным фибриллярным компонентом и фибриллярным центром (Dundr, Raska, 1993; Mosgoller et al., 1998), по другим - в дискретных компартментах плотного фибриллярного компонента (Stanek et al., 2001; Koberna et al., 2002) или в фибриллярных центрах (Thiry et al., 2000; Mais, Scheer, 2001). В плотном фибриллярном компоненте начинается процессинг новообразованной рРНК, который завершается в гранулярном компоненте (Shaw et al., 1995; Cmarko et al., 2000). Маркерным белком ранних этапов процессинга является фибрилларин, локализованный в плотном фибриллярном компоненте (Puvion-Dutilleul, Christensen, 1993). Поскольку в ядрышках клеток XL2 ХСАР-Е никогда не колокализуется с UBF, только частично колокализуется с фибрилларином, мажорным белком ПФК и полностью колокализуется с белком гранулярного компонента В23 и на основании данных об электронно-микроскопической иммунолокализации ХСАР-Е можно сделать общий вывод о том, что главная функция этого белка в ядрышках - участие в процессинге рРНК.

Вопрос о конкретной функциональной роли ХСАР-Е на разных этапах биогенеза рибосом, также, как и о механизме его действия, остается открытым, отчасти, потому, что до сих пор не существует однозначного мнения о механизме действия SMC белков. Показано, что 13S конденсины в комплексе с топоизомеразами и АТФ индуцируют положительную суперспирализацию циклической ДНК in vitro (Kimura, Hirano, 1997). Возможно, что ХСАР-Е и топоизомераза I включены в котранскрипционные модификации рибосомной ДНК, которые происходят в фибриллярных центрах и плотном фибриллярном компоненте. Однако, данные о том, что ХСАР-Е является мажорным белком гранулярного компонента, отсутствует в фибриллярных центрах, и только частично колокализован с фибрилларином в плотном фибриллярном компоненте, делает это предположение маловероятным.

Другая гипотеза - ХСАР-Е, в комплексе с топоизомеразой II и белком В23, которые входят в состав гранулярного компонента (Tavormina et al., 2002; Niimi et al., 2001), контролирует фолдинг pPHK в формирующихся прерибосомных частицах. Последнее не означает, что ХСАР-Е взаимодействует непосредственно с процессирующейся рибосомной РНК, а возможно с другими компонентами ядрышка. Одним из таких компонентов являются РНП-частицы, содержащие метаболически стабильные низкомолекулярные РНК (нмРНК) U-типа (U3, U8, U14 и U22) (Maxwell and Fournier, 1995). По некоторым данным, именно нмРНК способны связывать специфические нерибосомные белки, необходимые для процессинга pPHK (Maxwell and Fournier, 1995). Некоторые из этих белков выявлены не только в ядрышках, но также в кариоплазме или в цитоплазме. В настоящей работе нерибосомный белок ХСАР-Е обнаружен, помимо ядрышек, в глобулярных структурах кариоплазмы, где он колокализуется с В23 и фибрилларином. По таким параметрам, как размеры (0,3-1 мкм), количество (2-5 на ядро) и способности преципитировать с антителами к фибрилларину и В23, эти структуры могут соответствовать тельцам Кахаля (Cojal bodies) или, по другой терминологии, кольчатым телам (Gall, 2000). Характерной особенностью этих органоидов является наличие нмРНК U3, U8, U14 и U22, различных факторов транскрипции, сплайсинга и энзиматической модификации белков (Gall, 2000). В ряде экспериментов показано существование прямой связи между кольчатыми телами и ядрышком. Так, после инъекции флуоресцентно меченых нмРНК в овоциты Xenopus laevis, они сначала накапливаются в тельцах Кахаля, а затем мигрируют в ядрышки (Narayan et al., 1999). Аналогичная динамика описана для белка Noppl40 (Meier, Blobel, 1994) и для маркерного белка телец Кахаля р80 коилина (Lyon et al., 1997). По одной из гипотез, тельца Кахаля представляют собой своего рода "распределительные центры" ядра, из которых к сайтам транскрипции и процессинга РНК (в том числе и в ядрышко) транспортируются специфические факторы (Frey et al., 1999). Истощением пула этих факторов в кольчатых телах можно объяснить тот факт, что ингибирование синтеза рРНК ос-аманитином или актиномицином Д приводит к выходу нмРНК из телец Кахаля (Carmo-Fonseca et al., 1992). В полном соответствии с цитированными данными, антитела к ХСАР-Е так же перестают выявляться в составе глобулярных структур в кариоплазме после действия на клетки Xenopus laevis актиномицина Д. Это позволяет выдвинуть предположение о существовании "обратной связи" между пулом ХСАР-Е в кариоплазматических структурах и метаболической активностью ядрышка. Можно предположить, что ХСАР-Е в гранулярном компартменте ядрышек рекрутируется в виде комплекса с частицами, содержащими нмРНК, для участия в одном из этапов процессинга рРНК. Однако, двойное иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и коилину показало, что глобулярные структуры в кариоплазме не являются кольчатыми тельцами. Тем не менее, функции этих структур могут быть аналогичными. Показано, что в кольчатых тельцах содержатся нмРНК и белки, необходимые для процессинга РНК (Gall, 2000).

Возможно, в глобулярных структурах, содержащих ХСАР-Е также депонируются те белки и низкомолекулярные РНК, которые необходимы для созревания и компактизации прерибосомных частиц в ядрышках. Маловероятным представляется тот факт, что эти структуры соответствуют фокусам фосфорилирования гистона НЗ, описанным Schmiesing et al (2000).

Структурным субстратом ядрышек и кариоплазматических структур, на котором могут быть иммобилизованы ХСАР-Е в комплексе с ДНК, рРНК или нмРНК, по-видимому, является белковый матрикс. В пользу этого можно привести следующие аргументы. Во-первых, после обработки пермеабилизованных клеток 2М NaCl значительная часть ХСАР-Е выявляется в остаточных ядрах нуклеоидов. Во-вторых, некоторое количество белка сохраняется в элементах внутриядерного остова, в остаточных ядрышках и SMS-bodies после исчерпывающей обработки ДНКазой, т.е. в условиях получения "классического" ядерного матрикса.

Изначально SMC белок Sell, гомолог белка ХСАР-Е, был идентифицирован как мажорный компонент хромосомного скэффолда (Lewis and Laemmli, 1982). Процедура получения ядерного матрикса in situ позволила выявить связь ХСАР-Е со скэффолдом митотических хромосом, в полном соответствии с данными Maeshima and Laemmli (2003). Это согласуется с гипотезой, по которой ХСАР-Е в комплексе с белками скэффолда и топоизомеразой II кооперационно участвуют в организации высших уровней компактизации хроматина (Saitoh et al., 1995). Яркая флуоресценция центромерных районов хромосом в средней метафазе, по-видимому, связана с тем, что только в этих районах хромосом сохраняется когезия сестринских хроматид и, следовательно, более высокая концентрация ХСАР-Е.

На основании вышеизложенных данных можно сделать вывод о том, белок ХСАР-Е играет важную роль не только в митозе, но и в интерфазе. В митозе, в составе конденсинового комплекса этот белок участвует в конденсации митотических хромосом и, возможно в регуляции процесса разделения сестринских хроматид. В интерфазе белок ХСАР-Е участвует в структурно-функциональной организации ядрышка.

Выводы.

1. Ассоциация белков ХСАР-Е и pEg7 с хромосомами не является необходимым условием для восстановления и поддержания конденсированного состояния митотических хромосом после искусственной деконденсации in vivo под действием гипотонического воздействия.

2. Искусственное поддержание митотических хромосом в конденсированном состоянии при воздействии нокодазола и таксола не сопровождается постоянной ассоциацией 13S конденсинов с хромосомами.

3. Уровень экспрессии белков ХСАР-Е и pEg7 значительно не изменяется в течение клеточного цикла.

4. В интерфазе белки 13S конденсинового комплекса входят в состав гранулярного и плотного фибриллярного компонентов ядрышка. Ассоциация ХСАР-Е с ядрышком прямо или косвенно опосредована его взаимодействием с РНК.

5. Связь ХСАР-Е с гранулярным компонентом не зависит от уровня транскрипционной активности рибосомных генов и процессинга рРНК.

6. При экстракции хроматина in situ ХСАР-Е сохраняет ассоциацию с остаточным ядрышком. Взаимодействие ХСАР-Е с этой структурой прямо или косвенно опосредовано его взаимодействием с РНК.

7. Идентифицированы ядерные домены, содержащие ХСАР-Е и некоторые компоненты ядрышка. Данные домены не являются тельцами Кахаля. 4 »

Список литературы.

Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. 1983. Электронно-микроскопическое изучение хромонемы и хромомеров в митотических и интерфазных хромосомах. // Цитология. Т.25, стр. 123-129.

Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. 1989. Дифференциальная деконденсация митотических хромосом при гипотонической обработке клеток как возможная причина G-сегментации. // Цитология, том 30(10), стр. 1172-1179. Збарский И.Б., Кузьмина С.Н. Скелетные структуры клеточного ядра. — М.: Наука, 1991.-246 с.

Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. 1988. Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ при их обратимой искусственной деконденсации in vivo. // Цитология, том 30(8), стр. 926-932.

Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. 1990. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искусственной деконденсации in vivo. И Цитология, том 32(5), стр. 449-453.

Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. 1994. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. - СПб.: Наука, 1994. — 400 с. Тихоненко А.С., Беляева Н.Н., Павлов С.Б., Черни JI.E., Мартынкина Л.П., Попенко В.И., Беспалова И.А., Кочкина И.М. 1985. Электронно-микроскопическое изучение структурных изменений хроматина в различных функциональных состояниях ядра Bursaria trunoatella и Physarus polycephalum. // Молек. Биол. Т. 19, стр. 87-97. Храпунов С.Н., Драган А.Н., Бердышев Г.Д. Структура и функция хроматина. - Киев, "Вища школа", 1987. - 167 с.

9. Ченцов Ю.С., Поляков В.Ю. Ультраструктура клеточного ядра. - М. Наука, 1974. — 152 с.

10. Ченцов Ю.С. Общая цитология: Учебник.-З-е изд. перераб. и доп.- М.: Изд-во МГУ, 1995.-384 с. Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. 2002. Иммуноцитохимическое изучение распределения PCNA в ядрах со стабилизированным и нестабилизированным ядерным матриксом. Биол. мембраны, том 19, стр. 237-242.

12. Adolph K.W., Cheng S.M., Paulson J.R., Laemmli U.K. 1977. Isolation of protein scaffold from mitotic Hela cell chromosomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 74, p. 486-499.

13. Adachi Y., Kas E., Laemmli U.K. 1989. Preferential, cooperative binding of DNA topoisomerase II to scaffold-associated regions. IIEMBO J. V. 8, p. 3997-4006.

14. Adachi Y., Luke M., Laemmli U.K. 1991. Chromosome assembly in vitro. Topoisomerase II is required for condensation. // Cell. V. 64, p. 137-148.

15. Bak A.L., Zeuthen J., Crick F. 1977. Higher-order structure of human mitotic chromosomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. V. 74, p. 301-315.

16. Bhat M.A., Philp A.V., Glover D.M., Bellen H.J. 1996. Chromatid segregation at anaphase requires the barren product, a novel chromosome associated protein that interacts with topoisomerase II. // Cell. V. 87, p. 1103-1114.

17. Bolla R.I., Braaten D.C., Shiomi Y., Hebert M.B., Schlessinger D. 1985. Localization of specific rDNA spacer sequences to the mouse L-cell nucleolar matrix. // Mol. Cell Biol. V. 5. N. 6, p. 1287-94.

18. Bustin M., Neihert N. 1979. Antibodies against chromosomal HMG protein stain the cytoplasm of mammalian cells. // Cell. V.16, p. 181-189.

19. Cabello O.A., Eliseeva E.D., He W., Youssoufian H., Plon S.E., Brinkley B.R., Belmont J.W. 2001. Cell Cycle-dependent expression and nucleolar localization of hCAP-H. // Mol. Biol. Cell. V. 12. N. 11, p. 3527-37.

20. Carmo-Fonseca M., Pepperkok R., Carvalho M.T., Lamond A J. 1992. Transcription-dependent colocalization of the Ul, U2, U4/U6 and U5 snRNPs in coiled bodies. // J. Cell Biol. V. 117.N. l,p. 1-14.

21. Christensen M.O., Barthelmer H.U., Boege F., Mielke C. 2002. The N-terminal domain anchors hirnian topoisimerase I at fibrillar centers of nucleoli and nucleolar organizer regions of mitotic chromosomes. // J. Biol. Chem. V. 277. N. 39, p. 35932-35938.

22. Christensen M.O., Larsen M.K., Barthelmes H.U., Hock R., Andersen C.L., Kjeldsen E.K., Knudsen B.R., Westergaard O., Boege F., Mielke C. 2002. Dynamics of human DNA topoisomerases Ila and lip in living cells. // J. Cell Biol. V. 157. N.l, p.31-44.

23. Chuang P.T., Lieb J.D., Meyer B. 1994. DPY-27: a chromosome condensation protein homolog that regulates C. elegans dosage compensation through assotiation with the X chromosome. // Cell. V. 79, p. 459-474.

24. Chuang P.T., Lieb J.D., Meyer B. 1996. Sex-specific assembly of a dosage compensation complex on the nematode X chromosome. // Science. V. 274, p. 1736-1738.

25. Cmarco D., Verschure P.J., Rothblum L.I., Hernandez-Verdun D., Amalric F., van Driel R., Fakan S. 2000. Ultrastructural analysis of nucleolar transcription in cells microinjected with 5-bromo-UTP. //Histochem. Cell Biol. V. 113, p. 181-187.

26. Comings D.E., Okada T.A. 1970. Whole mount electron microscopy of meiotic chromosomes and synaptonemal complexes. // Chromosoma. V. 30, p. 269-286.

27. Comings D.E., Okada T.A. 1973. Mechanisms of chromosome banding. Whole-mount electron microscopy of banded methaphase chromosomes and a comparison with pachytene chromosomes. // Exp. Cell Res. V. 93, p. 267-274.

28. Cubizolles F., Legagneux V., Le Guellec R., Chartrain I., Uzbekov R., Ford C., and Le Guellec K. 1998. pEg7, a new Xenopus protein required for mitotic chromosome condensation in egg extracts. // J. Cell Biol. V. 143. N. 6, p. 1437-46.

29. Darwiche N., Freeman L.A., Strunnikov A. 1999. Characterization of the components of the putative mammalian sister chromatid cohesion complex. И Gene. V. 233, p. 39-47.

30. De D.N. 2002. Protein constitution of the chromosome axis. // Chromosoma. V. 111, p. 6979.

31. De Brabander M., De May J., Joniau M., Geuens G. 1977. Ultrastructural immunocytochemical distribution of tubulin in cultured cells treated with microtubule inhibitors. // Cell Biol. Int. Rep. V. 1. N.2, p. 177-83

32. Derenzini M., Hernandez-Verdun D., Farabegoli F., Pession A., Novello F. 1987. Structure of ribosomal genes of mammalian cells in situ. // Chromosoma. V. 95, p. 63-70.

33. Dundr M., Misteli T. 2001. Functional architecture in the cell nucleus. I I Biochem. J. V. 356, p. 297-310.

34. Dundr M., Raska I. 1993. Nonisotopic ultrastructural mapping of transcription sites within the nucleolus. // Exp. Cell Res. V. 208, p. 275-281.

35. DuPraw E.J., Bahr G.F. 1969. The arrangement of DNA in human chromosomes, as investigated by quantitative electron microscopy. // Acta Cytologica. V. 13, p. 188-205.

36. Earnshaw W.C. 1991. Large scale chromosome structure and organization.// Curr. Topics Struct.Biol. V. l,p. 237-244.

37. Earnshaw W.C., Heck M.M.S. 1985. Lokalization of topoisomerase II in mitotic chromosomes. // J. Cell Biol. V.100, p. 1716-1725.

38. Earnshaw W.C., Halligan В., Cooke C.A., Heck M.M.S., Lin L.F. 1985. Topoisomerase II is a structural component of mitotic chromosome scaffolds. // J. Cell Biol. V. 100, p. 1706

39. Earnshaw W.C., Laemmli U.K. 1983. Architecture of metaphase chromosomes and chromosome scaffold. // J Cell Biol. V. 96, p. 84-93.

40. Finch J.T., Klug A. 1976. Solenoidal model for superstructure in chromatin.// Proc. Natl. Acad. Sci. V. 73, p. 1897-1901.

41. Fontana F. 1781. Traite' sur le venin de la vipe're, p.268. Florence.

42. Freeman L., Aragon-Alcaide L., Strunnikov A. 2000. The condensin complex governs chromosome condensation and mitotic transmission of rDNA. // J. Cell Biol. V. 149. N. 4, p. 811-824.

43. Frey M.R., Bailey A.D., Weiner A.M., Matera A.G. 1999. Association of snRNA genes with coiled bodies is mediated by nascent snRNA transcripts. // Curr. Biol. V. 9, p. 126-35.

44. Gall J.G. 1963. Chromosome fibers from an interphase nucleus. // Science. V.139, p. 120121.

45. Gall J.G. 1966. Chromosome fiber studied by a spreading technique. // Chromosoma. V. 20, p. 221-233.

46. Gall J.G. 2000. Cajal Bodies: The First 100 Years. // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. V.16, p. 273-300.

47. Gasser S.M. 1995. Coiling up chromosomes. // Current biology. V. 5. N. 4, p. 357-359.

48. Gasser S.M., Laroche Т., Falquet J., Boy de la Tour E., Laemmli U.K. 1986. Metaphase chromosome structure. Involvement of topoisomerase II. // J. Mol. Biol. V. 188, p. 613-629.

49. Gerdes M.G., Carter K.C., Moen P.T. Jr., Lawrence J.B. 1994. Dynamic changes in the higher-level chromatin organization of specific sequences revealed by in situ hybridization to nuclear halos. // J. Cell Biol. V. 126, p. 289-299.

50. Giet R., Glover D.M. 2001. Drosophile Aurora В kinase is required for histone H3 phosphorylation and condensin recruitment during chromosome condensation and to organize the central spindle during cytokinesis. // J. Cell Biol. V. 152, p. 669-682.

51. Golomb H.M., Bahr G.F. 1974. Correlation of the fluorescent banding pattern and ultrastructure of human chromosomes. // Exp. Cell Res. V.84, p. 121-126

52. Goodwin G.H., Walker J.M., Johns E.W. 1978. The high-mobility group (HMG) non-histone chromosomal proteins. In: Busch H (ed). The cell nucleus, V.6. Academic press, New York, p. 129-137.

53. Graf J.D. and Kobel H.R. 1991. Genetics of Xenopus laevis. И Methods Cell Biol. V. 36, p. 19-34.

54. Granic D. 1975. Nucleolar necklaces in chick embrio fibroblast cells. // J. Cell Biol. V. 65, p. 418-427.

55. Granboulan N., Granboulan P. 1965. Cytochemie ultrastructurale du nucleole: II etude des sites de synthese du RNA dans le nucleole et le noyau. // Exp. Cell Res. V.38, p. 604-619.

56. Griffith J.V. 1975. Chromatin structure: deduced from a mini chromosome.// Science. V. 187, p. 1202-1203.

57. Grosschedl R., Giese K., Pagel J. 1994. HMG domain proteins: architectural elements in the assembly of nucleoprotein structures. II Trends Genet. V.10, p.94-100.

58. Guacci V., Koshland D., Strunnikov A. 1997. A direct link between sister chromatid cohesion and chromosome condensation revealed through the analysis of MCD1 in S. cerevisiae. И Cell V. 91, p. 47-58.

59. Heck M.M.S. 1997. Condensins, cohesins and chromosome architecture: how to make and break a mitotic chromosome. // Cell. V. 91, p. 5-8.

60. Heitz E. 1931. Nukleolen und chromosomen in der gattung. // Vicia Planta. V. 15, p.495-505.

61. Hershko A. 1983. Ubiquitin: Roles in protein modification and breakdown. // Cell. V. 34, p. 11-12.

62. Hirano T. 1999. SMC2-mediated chromosome mechanics: a conserved scheme from bacteria to vertebrates? // Genes Dev. V. 13, p. 11-19.

63. Hirano Т., Kobayashu R., Hirano M. 1997. Condensins, chromosome condensation protein complexes containing XCAP-C, XCAP-E and Xenopus homolog of the Drosophila Barren protein. // Cell. V. 89, p. 511-521.

64. Hirano T. 1998. SMC protein complexes and higher-order chromosome dynamics. // Curr. Opin. Cell Biol. V. 10. N. 3, p. 317-22.

65. Hirano T. 2000. Chromosome cogesion, condensation, and separation. // Annu. Rev. Biochem. V. 69, p. 115-144.

66. Hirano Т., Mitchison T.J. 1993. Topoisomerase II does not play a scaffolding role in the organization of mitotic chromosomes assembled in Xenopus egg extracts. // J. Cell Biol. V. 120, p. 601-612.

67. Hirano Т., Mitchison T.J. 1994. A heterodimeric coiled-coil protein required for mitotic chromosome condensation in vitro. // Cell. V. 79, p. 449-458.

68. Holm C. 1994. Coming undone: how to untangle a chromosome. I I Cell. V. 77, p.955-957.

69. Jessberger R., Riwar В., Baechtold H., Akhmedov A.T. 1996. SMC proteins constitute two subunits of the mammalian recombination protein complex RC-1. // EMBO J. V. 15, p. 4061-4068.

70. Jessberger R., Frei C., Gasser S.M. 1998 Chromosome dynamics: the SMC protein family.// Curr. Opin. Genet. Dev. V. 8. N. 8, p. 254-9.

71. Jordan E.G. 1984. Nucleolar nomenclature. // J. Cell Sci. V. 67, p. 217-220.

72. Jordan E.G., Chapman J.M. 1971. Ultrastructural changes in the nucleoli of Jerusalem artishoke (Helianthus tuberosus) tube discs. I I J. Exp. Bot. V.22, p. 627-634.

73. Kimura K., Hirano T. 1997. ATP-dependent positive supercoiling of DNA by 13S condensin: a biochemical implication for chromosome condensation. // Cell. V. 90, p. 625

74. Kimura К., Cuvier О., Hirano Т. 2001. Chromosome condensation by a human condensin complex in Xenopus egg extracts. // J. Biol. Chem. V. 276, p. 5417-5420.

75. Kimura K., Rubenkov V.V., Crisona N.J., Hirano Т., Cozzarelli N.R. 1999. 13S condensin actively reconfigures DNA by introducing global positive writhe: implications for chromosome condensation. // Cell. V. 98, p. 139-248.

76. Kiryanov G.I., Manamshijan T.A., Polyakov V.Yu., Fais D., Chentsov Yu.S. 1976. Levels of granular organization of chromatin fiber. IIFEBS Lett. V. 67, p. 323-327.

77. Kiryanov G.I., Smirnova T.A., Polyakov V.Yu. 1982. Nucleomeric organization of chromatin. // Eur. J Biochem. V. 124, P. 331-338.

78. Kobema K., Malinsky J., Pliss A., Masata M., Vecerova J., Fiavlova M., Bednat J., Raska I. 2002. Ribosomal genes in focus: new transcripts label the dense fibrillar components and form clusters indicative of "Christmas trees" in situ. //J. Cell. Biol. V. 157. N.5, p. 743-748.

79. Koshlnd D., Strunnikov A. 1996. Mitotic chromosome condensation. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. V. 12, p. 305-333.

80. Laemmli U.K., Cheng S.M., Adolph K.W., Paulson J.R., Brown J.A., Baumbach W.R. 1978. Metaphase chromosome structure: The role of nonhistone proteins. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. V. 42, p.351-360.

81. Laloraya S., Guacci V., Koshland D. 2000. Chromosomal addresses of the cohesin component Mcdlp. // J. Cell. BioL V. 151, p. 1047-1056.

82. Larionov V., Karpova Т., Kouprina N., Kouravleva G. 1985. A mutant of Saccharomyces cerevisiae with impaired maintenance of centromeric plasmids. // Curr. Genet. V.10, p. 1520.

83. Lee L., Dej K., Kashevsky H., Wailace J., Ivanovska I., Orr-Weaver T. 2001. Regulation of Mitotic Progression in Drosophila. I IEMBO Workshop, Salamanca, Spain.

84. Lieb J.D., Albrecht M.R., Chuang P.T., Meyer B.J. 1998. MIX-1: an essential component of the C. elegans mitotic machinery executes X chromosome dosage compensation. // Cell. V. 92, p. 1-20.

85. Losada A., Hirano M., Hirano T. 1998. Identification of Xenopus SMC protein complexes required for sister chromatid cohesion. // Genes Dev. V. 12. N. 13, p. 1986-97.

86. Losada A., Hirano T. 2001. Intermolecular DNA interactions stimulated by the condensin complex in vitro: implications for sister chromatid cohesion. // Curr. Biol. V.ll, p. 268-272.

87. Losada A., Hirano T. 2001. Shaping the metaphase chromosome: coordination of cohesion and condensation. // BioEssays. V. 23, p. 924-935.

88. Losada A., Yokochi Т., Kobayashi R., Hirano T. 2000. Identification and characterization of SA/Scc3p subunits in the Xenopus and human cohesin complexes. // J Cell BioL V. 150, p. 405-416.

89. Lyon C.E., Bohmann K., Lamond A.I. 1998. Inhibition of protein dephosphorylation results in the accumulation of splicing snRNPs and coiled bodies within the nucleolus. // Exp. Cell Res. V. 230, p. 84-93.

90. Maeshima K., Laemmli U.K. 2003. A two-step scaffolding model for mitotic chromosome assembly.// Dev. Cell. V. 4, p. 467-480.

91. Mais Ch., Scheer U. 2001. Molecular architecture of the amplified nucleoli of Xenopus oocites. // J. Cell. Sci. V. 114, p. 709-718.

92. Maxwell E.S. and Fournier M.J. 1995. The small nucleolar RNAs. // Annu. Rev. Biochem. V. 35, p. 897-934.

93. McClintock B. 1934. The relation of a particular chromosomal element to the development of the nucleoli in Zea mays. // Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. V. 21, p. 294-328.

94. McGhee J.D., Felsendfeld G. 1980. Nucleosome structure. // Ann. Rev. Biochem. V. 49, p. 1113-1156.

95. Meier U.T., Blobel G. 1994. NAP57, a mammalian nucleolar protein with a putative homolog in yeast and bacteria. //J. Cell Biol. V. 127, p. 1505-14.

96. Michaelis C., Ciosk R., Nasmuth K. 1997. Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids. // Cell V. 91, p. 35-46.

97. Miller O.L., Beatty R.R. 1969. Visualization of nucleolar genes. // Science. V. 164, p. 955957.

98. Miller O.L. 1981. The nucleolus, chromosomes, and visualization of genetic activity. // J. Cell Biol. V.91, p. 15s-27s.

99. Mirsky A.E., Ris H. 1951. The composition and structure of isolated chromosomes. I I Ibid. V. 34, p. 475-492.

100. Mosgoller W., Schofer C., Weseirska-Gadek J., Steiner M., Muller M., Wachtler F. 1998. Ribosomal gene transcription is organized in foci within nucleolar components. // Histochem. Cell Biol. V. 109, p. 111-118.

101. Narayanan A., Speckmann W., Terns R., Terns M.P. 1999. Role of the box C/D motif in localization of small nucleolar RNAs to coiled bodies and nucleoli. // Mol. Biol. Cell. V. 10, p. 2131-47.

102. Navaschin M. 1934. Chromosome alteratons caused by hibridization and their bearing upon certain genetic problems. // Cytologia. V.5, p. 169-203.

103. Nelson H.C.M., Finch J.T., Luisi B.F., Klug A. 1987. The structure of an oligo (dA)-oligo (dT) tract and its biological implications. //Nature. V.330, p.661-664.

104. Okada T.A., Comings D.E. 1980. A search for protein cores in chromosomes: is the scaffold an artifact? // Amer. J Hum. Genet. V. 32, p. 814-832.

105. Ochs R.L., Lischwe M.A., Spohn W.H., Busch H. 1985. Fibrillarin a new protein of the nucleolus identified by autoimmune sera. // Biol. Cell. V. 54, p. 123-134.

106. Olins A.L., Olins D.E. 1974. Spheroid chromatin units (n-bodies).// Science. V. 183, p. 330-332.

107. Olson M.O.J., Hingorani K., Szebeni A. 2002. Conventional and nonconventional roles of the nucleolus. // Int. Rev. Cytol. V. 219, p. 199-266.

108. Paulson J.R., Laemmli U.K. 1977. The structure of histone-depleted metaphase chromosomes. // Cell. V. 12, p. 817-828.

109. Puvion-Dutilleul F., Christensen M.E. 1993. Alterations of fibrillarin distribution and nucleolar ultrastructure induced by adenovirus infection. // Eur. J. Cell. Biol. V. 61. N. 1, p.168-76.

110. Puvion-Dutilleul F., Mazan S., Nicoloso M., Pichard E., Bachellerie J.P. and Puvion E. 1992. Alterations of nucleolar ultrastrucrure and ribosome biogenesis by actinomycin D. Implications for U3 snRNP function. // Eur. J. Cell Biol. V. 58, p.149-162.

111. Rechsteiner M. 1987. Ubiquitin-mediated pathways for intracellular proteolysis. // Annu. Rev. Cell Biol. V.3,p.l-30.

112. Richmond T.J., Finch J.T., Rushton В., Rhodes D., Klug A. 1984. Structure of the nucleosome core particle at 7A resolution. // Nature. V. 311, p. 532-537

113. Saitoh N., Goldberg I., Earnshaw W.C. 1995. The SMC proteins and the coming of age of the chromosome scaffold hypothesis. // BioEssays. V.17. N. 9, p. 759-766.

114. Saitoh N., Goldberg I., Wood E.R., Eamshaw W.C. 1994. SCII: an abundant chromosome scaffold protein is a member of a family of putative ATPase with an unusual predicted tertiary structure. // J. Cell. Biol. V. 127, p. 303-318.

115. Saitoh, Y., Laemmli, U. K. 1994. Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the highly AT-rich scaffold. // Cell. V. 25. N. 76,609-22.

116. Saka Y., Fantes P., Sutani Т., Mclnerny C., Creanor J., Yanagida M. 1994. Fission yeast cut3 and cutl4, members of a ubiquitous protein family, are required for chromosome condensation and segregation in mitosis. // EMBO J. V. 13. N. 20, p. 4938-52.

117. Saka Y., Sutani Т., Yamashita Y., Saitoh S., Takeuchi M., Nakaseko Y., Yanagida M. 1994. Fission yeast cut3 and cut 14, members of a ubiquitous protein family, are required for chromosome condensation and segregation in mitosis. // EMBO J. V. 13, p. 4938-4952.

118. Scheer U. and Hock R. 1999. Structure and function of the nucleolus. // Curr. Opin. Cell Biol. V. 11, p. 385-390.

119. Schmiesing J.A., Ball A.R., Gregson H.C., Alderton J.M., Zhou S., Yokomori K. 1998. Identification of two distinct human SMC protein complexes involved in mitotic chromosome dynamics. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95, p. 12906-12911.

120. Schmiesing J.A., Gregson H.C., Zhou Z., Yokomori K., 2000. A Human Condensin Complex Containing hCAP-C-hhCAPE and CNAP1, a Homolog of Xenopus XCAP-D2, Colocalizes with Phosphorylated Histone H3 during the Early Stage of Mitotic Chromosome Condensation. // Mol. Cell Biol. V. 20. N. 18, p. 6996-7006.

121. Sedat J., Manuelidis L. 1978. A direct approach to the structure of eucaryotic chromosomes. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. V. 42, p. 331-350.

122. Shaw J., Jordan E.G. 1995. The nucleolus. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. V. 11, p. 93-121.

123. Shaw P.J., Highett M.I., Beven A.F., Jordan E.G. 1995. The nucleolar architecture of polymerase I transcription and processing. // EMBO J. V. 14, p. 2896-2906.

124. Sheval E.V., Prusov A.N., Kireev I.I., Fais D., Polyakov V.Y. 2002. Organization of higher-level chromatin structures (chromomere, chromonema and chromatin block) examined using visible light-induced chromatin photo-stabilization. // Cell Biol Int. V. 26. N. 7, p. 579-91.

125. Smith H.C., Rothblum L.I. 1987. Ribosomal DNA sequences attached to the nuclear matrix. // Biochem. Genet. V. 25. N.l 1-12, p. 863-79.

126. Spector D.L., Ochs L., Busch H. 1984. Silver staining, immunofluorscence, and immunoelectron microscopic localization of nucleolar phosphoproteins B23 and C23. // Chromosoma. V. 90, p. 139-148.

127. Steen R.L., Cubizolles F., Le Guellec K., Collas P. 2000. A kinase-anchoring protein (AKAP95) recruits human chromosome-associated protein (hCAP)-D2/Eg7 for chromosome condensation in mitotic extract. //J. Cell Biol. V. 149. N. 3, p.531-536.

128. Stein G.S., Montecino M., Andre j. van Wijnen, Stein J.L., Lian J.B. 2000. Nuclear Structure-Gene Expression Interrelationships: Implications for Aberrant Gene Expression in Cancer. // Cancer Research. V. 15. N. 60, p. 2067-2076.

129. Strunnikov A.V. 1998. SMC proteins and chromosome structure. // Trends Cell Biol. V. 8, p. 454-459.

130. Strunnikov A.V., Larionov V.L., Koshland D. 1993. SMC1: an essential yeast gene encoding a putative head-rod-tail protein is required for nuclear division and defines a new ubiquitous family. //J. Cell BioL V. 123,p. 1635-1648.

131. Strunnikov, A.V., Hogan E., Koshland D. 1995. SMC2, a Saccharomyces cerevisiae gene essential for chromosome segregation and condensation defines a subgroup within the SMC family. // Genes Dev. V. 9, p. 587-599.

132. Stubblefield E., Wray W. 1971. Architecture of the Chinese hamster chromosome. Chromosoma. V. 32, p. 262-294.

133. Stursberg S., Riwar В., Jessberger R. 1999. Cloning and characterization of mammalian SMC1 and SMC3 genes and proteins, components of the DNA recombination complexes RC-1. // Gene. V. 228, p. 1-12.

134. Subirana J.A., Minoz-Guerra S., Martinez A.B., Perez-Grau L., Marcet X., Fita I. 1981. The subunit structure of chromatin fiber. // Chromosoma. V. 83, p. 455-471.

135. Sumara I., Vorlaufer E., Gieffers C., Peters B.H., Peters J.M. 2000. Characterization of vertebrate cohesin complexes and their regulation in prophase.// J. Cell Biol. V. 151, p. 749762.

136. Sutani Y., Yuasa Т., Tomonaga Т., Dohmae N., Takio K., Yanagida M. 1999. Fission yeast condensin complex: essential roles of non-SMC subunits for condensation and Cdc2 phosphorylation of Cut3/SMC4. // Genes Dev. V. 13, p. 2271-2283.

137. Sutani Т., Yanagida M. 1997. DNA renaturation activity of the SMC complex implicated in chromosome condensation. // Nature. V. 388, p. 798-801.

138. Taniguchi Т., Takayama S. 1986. Higher-order structure of metaphase chromosomes: evidence for a multiple coiling model. // Chromosoma. V. 93, p. 511-514.

139. Tavormina P.A., Come M-G., Hudson JR., Mo Y-Y., Beck W.T. 2002. Rapid exchange of mammalian topoisomerase Ila at kinetochores and chromosome arms in mitosis. // J. Cell Biol. V. 158. N. l,p. 23-29.

140. Thiry M., Cheutin Т., O'Donohue M-F, Kaplan H., Ploton D. 2000. Dynamics three-dimensional localozation of ribosomal RNA within the nucleolus. // RNA. V. 6, p. 17501761.

141. Thiry M., Ploton D., Menager M., Goessens G. 1993. Ultrastructural distribution of DNA within the nucleolus of various animal cell lines or tissues revealed by terminal deoxynucleotidyl transferase. // Cell Tissue Res. V. 271. N. 1, p. 33-45.

142. Thoma F., Koller Т., Klug A. 1979. Involvement of histone H in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin. // J Molec. Biol. V. 83, pt. l,p. 403-427.

143. Uemura Т., Ohkura H., Adachi Y., Morino K., Shiozaki K., Yanagida M. 1987. DNA topoisomerase II is required for condensation and separation of mitotic chromosomes in S. pombe. II Cell. V. 50, p. 917-925.

144. Uhlmann F., Nasmyth K. 1998. Cohesion between sister chromatids must be established during DNA replication. // Curr. Biol. V. 8, p. 1095-1101.

145. Uzbekov R., Chartrain I., Philippe M., Arlot-Bonnemains Y. 1998. Cell cycle analysis and conditions of synchronisation of Xenopus cell culture line XL-2. // Exp. Cell Res. V. 242, p. 60-68.

146. Uzbekov R., Prigent C., Arlot-Bonnemains Y. 1999 Cell cycle analysis and synchronization of the Xenopus laevis XL2 cell line: study of the kinesin related protein XlEg5. // Micr. Res. Tech. V. 45, p. 31-42.

147. Waizenegger I.C, Hauf S., Meinke A., Peters J-M. 2000. Two distinct pathways remove mammalian cohesin from chromosome arms in prophese and from centromeres in anaphase. //Cell. 103:399-410.

148. Woodcock C.L.F., Frodo L.L.Y., Rattner J.B. 1984. The higher order structure of chromatin: evidence for a helical ribbon arrangement. // J Cell Biol. V. 99, p. 42-52.

149. Zatsepina O.V., Voit R., Grummt I., Spring H., Semenov M.V., Trendelenburg M.F. 1993. The RNA polymerase I-specific trnscriptionally active and inactive ribosomal genes. // Chromosoma. V. 102, p. 599-611.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Тимирбулатова Э.Р., Грабеклис С.А., Узбеков Р.Э., Ле Геллек К., Киреев И.И. 2000. Изучение роли конденсинов в формировании высших уровней организации хромосом эукариот. // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов", Москва, выпуск 4, стр. 72-73.

2. Тимирбулатова Э.Р., Грабеклис С.А., Узбеков Р.Э., Гулак П.В., Ле Геллек К., Поляков В.Ю. 2001. Исследование роли SMC белков в ядрышке. // Тезисы Всероссийского совещания "Клеточная биология на пороге XXI века", Санкт-Петербург, Цитология, т.43, № 4, стр. 402.

3. Грабеклис С.А., Тимирбулатова Э.Р., Узбеков Р.Э., Ле Геллек К., Гулак П.В., Киреев И.И. 2001. Исследование роли конденсинов в митотической компактизации хромосом. // Тезисы Всероссийского совещания "Клеточная биология на пороге XXI века", Санкт-Петербург, Цитология, т.43, № 4, стр. 335-336.

4. Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Гулак П.В., Поляков В.Ю., Узбеков Р.Э. 2002. Белок конденсинового комплекса ХСАР-Е связан с РНК в ядрышках клеток линии XL2. // Тезисы докладов и сообщений, представленных на XIV Всероссийский симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", Санкт-Петербург, Цитология, т. 44, №9, стр. 908.

5. Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Грабеклис С.А., Гулак П.В., Ле Геллек К., Поляков В.Ю., Узбеков Р.Э. 2002. Внутриклеточная локализация конденсинов ХСАР-Е и pEg7 в норме и при воздействиях, вызывающих искусственное изменение структурного состояния митотических хромосом. // Цитология, т. 44, № 6, стр. 576-584.

6. Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Картавенко Т.В., Гулак П.В., Поляков В.Ю., Ле Геллек К., Узбеков Р.Э. 2003. Исследование внутриклеточной локализации белка

ХСАР-Е в клетках линии XL2 (Xenopus laevis) в норме и при ингибировании транскрипции и процессинга рРНК. // Цитология, т. 45, № 3, стр. 290-297. Uzbekov R., Timirbulatova Е., Watrin Е., Cubizolles F., Ogereau D., Gulak P., Legagneux V., Polyakov V.Yu., Le Guellec K., Kireev I. 2003. Nucleolar association of pEg7 and XCAP-E, two members of Xenopus laevis condensin complex in interphase cells. // J. Cell Sci.V. 116, p. 1667-1678.

Иллюстрации

Рис. 1 Western Blot анализ специфичности антител к ХСАР-Е и pEg7 в экстракте клеток линии XL2. kDa 200116— 97 pEgr

B гГ сР kDa ^

200

11697

66

66 (Vtub

45

45

Рис. 2 Western blot анализ количества белков pEg7, ХСАР-Е, топоизомеразы II и pEg2 в клетках культуры XL2 на разных стадиях клеточного цикла.

Topo-ll Eg7

XOAP-E P- tubulin Eg 2

-o- Eg2 topo2 Eg7 XCAP-E

Рис.3 Распределение белка ХСАР-Е в митозе. a, b - профаза, с, d -метафаза, е, f -анафаза, g, h - poidww телофаза. а, с, е, g - DAPI; b, d, f, h -окрашивание антителами к белку ХСАР-Е. g h

Рис. 4 Детальная локализация белка ХСАР-Е в митотических хромосомах, а - DAPI; b - окрашивание антителами к ХСАР-Е.

Рис.5 Локализация белка pEg7 в митотических клетках линии XL-2. a, b - ранняя профаза, с, d - прометафаза, е, f - метафаза, g, h - ранняя анафаза, i, j - поздняя анафаза, k, 1 - телофаза. а, с, е, g, i, к - DAPI; b, d, f, h, j, 1 - окрашивание антителами к pEg7. л а •■ * * V ъ

О с •с ^ d щ ** е % f г j g h < • 1 • J t к 1

Рис. 6 Локализация pEg7 в митотических клетках в условиях гипотонии (30% среды L-15 и 70% дистиллированной воды), а, Ь, с - 5 минут воздействия, d, е, f- 15 минут воздействия, g, h, i - 30 минут воздействия. a, d, g - DAPI; b,e, h - pEg7, c, f, i - совмещение изображений. t v а b d e g h 1

Рис.7 Локализация ХСАР-Е в митотических клетках в условиях гипотонии (30% среды L-15 и 70% дистиллированной воды), а, Ь, с - 5 минут воздействия, d, е, f - 15 минут воздействия, g, h, i - 30 минут воздействия. a, d, g - DAPI; b,e, h — XCAP-E, c, f, i - совмещение изображений.

Рис.8 (I) Локализация pEg7 в митотических клетках после инкубации клеток в среде, содержащей 0.5 мкг/мл нокодазола. а, Ь, с - 3 часа воздействия, d, е, f - 6 часов воздействия. « a, d - DAPI; b, е - pEg7, с, f - совмещение изображений. (И) а- фазовый контраст, b- pEg7, с- топоизомераза И. 0

I)

Рис.9 Локализация ХСАР-Е в митотических клетках после инкубации клеток в среде, содержащей 0,5 мкг/мл нокодазола. а, Ь, с - 3 часа воздействия, d, е, f- 6 часов воздействия. • a, d - DAPI; b, е - ХСАР-Е, с, f - совмещение изображений. у

Рис.10 Локализация pEg7 в митотических клетках XL2 после инкубации в среде, содержащей 10 мкг/мл таксола. а, Ь, с - 3 часа воздействия, d, е, f — 6 часов воздействия. a, d - DAPI; b, е - pEg7, с, f - совмещение изображений. I v а d

Рис.И Локализация ХСАР-Е в митотических клетках после инкубации в среде, содержащей 10 мкг/мл таксола. а, Ь, с - 3 часа воздействия, I d, е, f — 6 часов воздействия. a, d - DAPI; b, е - ХСАР-Е, с, f - совмещение изображений. d e f

Рис. 12 Окрашивание интерфазных клеток антителами к белку ХСАР-Е. a-DAPI;b-ХСАР-Е. »

Рис.13 Ультраструктура ядрышек клеток линии XL-2.

ГК-гранулярный компонент, ПФК - плотный фибриллярный компонент, ФЦ — фибриллярный центр. г

Рис. 14 Двойное окрашивание клеток культуры XL2 антителами к белкам ХСАР-Е и В23. a-DAPI, b-ХСАР-Е,

С-В23, d - совмещение изображений. й a b с

Рис. 15 Двойное окрашивание клеток культуры XL2 антителами к белкам ХСАР-Е и фибрилларину. а - D API, b-ХСАР-Е, с - фибрилларин, d - совмещение изображений. а

Рис. 16 Двойное окрашивание клеток культуры XL2 антителами к белкам ХСАР-Е и UBF. а - DAPI, Ь- ХСАР-Е, c-UBF, d - совмещение изображений. а

Рис. 17 Ультраструктурный анализ распределения белка ХСАР-Е в ядрышке. ГК - гранулярный компонент; ПФК — плотный фибриллярный компонент, фибриллярный центр.

Рис. 18 Распределение белка pEg7 в интерфазных а - DAPI; b - pEg7.

Рис. 19 Ультраструктура ядрышек клеток культуры XL-2 после инкубации в среде, содержащей актиномицин Д.

ГК-гранулярный компонент, ФК-фибриллярный компонент.

Рис. 20 Двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и фибрилларину после воздействия актиномицином Д. а - DAPI, Ь-ХСАР-Е, с - фибрилларин, d - совмещение изображений.

Рис. 21 Двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и UBF после воздействия актиномицином Д. а - DAPI, Ь-ХСАР-Е, c-UBF, d

Рис. 22 Двойное окрашивание клеток антителами к ХСАР-Е и В23 после воздействия актиномицином Д. а - DAPI, Ь-ХСАР-Е, с -В23, а d

Рис. 23 Ультраструктурный анализ распределения белка ХСАР-Е в сегрегированном ядрышке после инкубации клеток в среде с актиномицином Д. w

Рис. 24 Ультраструктура ядрышек клеток линии XL-2 после воздействия ДРБ. ГК-гранулярный компонент, ФК-фибриллярный компонент.

Рис. 25 Иммунолокализация белков ХСАР-Е и фибрилларина в клетках после воздействия

ДРБ. a-DAPI,

Ъ-ХСАР-Е, с-фибрилларин, с d v Ж

4l'

Рис. 26 Иммунолокализация белков ХСАР-Е и UBF в клетках после воздействия ДРБ. а-ХСАР-Е, b-UBF, с- совмещение изображений.

Рис.27 Иммунолокализация белков ХСАР-Е и В23 в клетках после воздействия ДРБ. a-DAPI, b-XCAP-E,

C-B23, а

Рис.28 Электронно-микроскопический анализ распределения ХСАР-Е в ядрышках после воздействия ДРБ.

ГК - гранулярный компонент, ПФК - плотный фибриллярный компонент, ФЦ -фибриллярные центры.

Рис. 29 Иммунолокализация белков ХСАР-Е и коилина в клетках линии XL-2. а - DAPI, Ь-ХСАР-Е, с - коилин,

Рис. 30 Распределение белка ХСАР-Е в клетках линии XL-2 после воздействия ДНКазой (а, Ь, с) и РНКазой (d, е, f). a, d-DAPI, b, е-ХСАР-Е, а b с d e • • f

Рис. 31. Локализация ХСАР-Е и В23 в нуклеоидах (a-d), и в клетках со стабилизированным ядерным матриксом после воздействия ДНКазой (e-h) и РНКазой (i-1). a, е, i-DAPI, b, f, j - ХСАР-Е, c,g,k-B23, d, h, 1 - совмещение изображений.

Рис. 32 Локализация белка ХСАР-Е в хромосомном скэффолде. а - DAPI, Ь- ХСАР-Е, с-совмещение изображений.