Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктура и техмерная организация ядрышек на разных этапах клеточной дифференцировки и опухолевого роста

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктура и техмерная организация ядрышек на разных этапах клеточной дифференцировки и опухолевого роста"

>,\ к Л ^ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА,

ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 576.3.

ЧЕЛИДЗЕ Павел Вениаминович

УЛЬТРАСТРУКТУРА И ТРЕХМЕРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЯДРЫШЕК НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ОПУХОЛЕВОГО РОСТА

03.00.11 — эмбриология, гистология, цитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1990

Работа выполнена в лаборатории биологии развития Тбилисского государственного университета.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор И.И.Кикнадзе доктор биологических наук, профессор В.Ю.Поляков доктор биологических наук, Е.В.Зыбина

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР

на заседании Специализированного о ..

сертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: Москва, Ц9899, Ленински а горы, МГУ, Биологический факультет

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан м Ь 990г.

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

'~Ч I. ВВЕДЕНИЕ

.■^¿Sv, I

Актуальность проблемы. Одним из свойств генома эукариотов является группировка многократно повторяющихся рибосомных генов /р-генов/, кодирующих последовательноста IBS-, 28S- и 5,8S-pPHK, в кластеры, лежащие в специализированных сегментах некоторых хромосом, носящих название НОР". Процессы, связанные с формированием рибосом, характеризуются строгой пространственной упорядоченностью и доступны визуальному наблюдению. Все эти процессы развиваются в специализированной области ядра - в ядраже, где концентрируются интенсивно транскрибирующие р-гены и продукты их активности, а также осуществляются различные стадии процессинга ново-синтезированной пре-рРЕК вплоть до сборки зрелых прерибосомных субъединиц. Молекулярные события, связанные с биогенезом рибосом, отражаются в структурной организации ядрышка. В составе ядрышек интерфазных клеток принято различать следующие структурные элементы:

- фибриллярные центры /Щ/ - структуры, содержащие рДДК и белки /например, Ag -белки, РНК-полимеразу I и топоизомеразу I/, соответствующие ЯОР митотических хромосом; входящая в состав Щ рДНК выявляется преимущественно в виде фибрилл толщиной 2-5ям;

- плотный фибриллярный компонент /ПФК/ представленный РНП-фибриллами толщиной 4-8нм, в состав которых входят новосинтезированная пре-рЕНК и Ag -белки;

- гранулярный компонент в виде РНП-частиц, диаметром Ю-25нм представляет собой прерибосомы на разных этапах созревания;

- около- и внутриядрышковый' хроматин /ассоциированный с ядрышком хроматин / образовав ДНП-фибриллами диаметром 20-30нм; внутриядрышковый хроматин структурно связан с ФЦ и по данным не-радиоавтографической гибридизации la situ содержит рДНК /Th^ry, Thiry-Blalse, 1989/;

• - ядрышковые вакуоли /лакуны/ - светлые зоны внутри ядрышка, материал которых по структуре не отличим от

•Принятые сокращения: ЯОР - ядрышкообразующие районы; ФЦ - фибриллярный центр; ПфК - плотный фибриллярный компонент; Ад-бзлки, зоны - аргентофильнне белки, зоны.

нуклеоплазмы; предполагают, что вакуолярный компонент может принимать участие в депонировании, процессинге и транспорте рРШ.

Структурная организация ядрышка, зависящая от количественного соотношения и определенной топографии вышеуказанных структур, сильно варьирует и тесно связана с его функциональной активностью, т.е. с уровнем синтеза предшественника рРНК со скоростью процес-синга и выхода зрелых субъединиц прерибосом из ядрышка в нуклео-плазму. В целом тонкие изменения ультрасгруктуры ядрышка отражают вариабельность уровня метаболизма клетки. Этим южно объяснить неослабевающий интерес к изучению структуры ядрышка.

Среди всего разнообразия морфологических вариантов организации ядрышка описанных к настоящему времени, можно вьщелит? несколько главных типов, что послужило основой для классификации ядрышек. Впервые данные о структуре и функциональной активности ядрышек были обобщены в классификации Буша и Сметаны /Buscht Smeta-na, 1970, Smetaaa, 1974 /. Согласно этой классификации, на све-тооптическом и ультраструктурном уровнях удается различить пять основных морфологических типов ядрышек: компактные, нуклеолонем-ные, кольцевидные, сегрегированные и микроядрышки.

Компактные ядрышки в световом микроскопе выглядят практически однородными и отличаются крупными /3-4мкм/ размерами. На ультратонких срезах этот тип характеризуется хорошо выраженными ФЦ /0,1-0,5мкм/, а также высокой степенью развития и равномерным распределением гранулярного компонента. Компактные ядрышки обнаруживаются главным образом в интенсивно пролиферирую-щих или растущих клетках животных и растений.

Нуклеолонемные ядрышки имеют в основном крупные размеры /2-4мкм/ и характерное нитчатое строение. На ультраструктурном уровне нуклеолонема представляет собой сильно извитые электроноплотные тяжи, диаметром 150-200нм, состоящие из ПФК и гранулярного компонента. Ядрншки значительного числа объектов характеризуются малыми размерами /"50-80нм/ и высоким числом ФЦ. Цуклеолонемньге ядрышки встречаются в активно синтезирующих белки и пролиферирующих клетках.

Кольцевидные ядрышки в световом микроскопе имеют форму кольца с оптически светлой центральной зоной; их диаметр составляет~1мкм. На ультратонких срезах видно, что центральную часть кольцевидных ядрышек занимает один крупный ФЦ, окруженный РНП-фибриллами и гранулами. Кольцевидные ядрышки ветре-

чаются в клетках с низким уровнем синтеза рРНК /дифференцированные и обработанные ингибиторами клетки/.

Сегрегированные ядрышки. Основным морфологическим признаком сегрегированных ядрышек считают пространственное разделение /сегрегацию/ их структурных компонентов и сравнительно небольшие размеры /до 1-2мкм в диаметре/. Возникновение сегрегированных ядрышек наблюдается после действия различных ингибиторов синтеза рРНК.

Микроядрышки. Это наиболее неоднородная группа, к которой относят ядрышки крайне малых /до I мкм/ размеров. Они встречаются при очень низком уровне или полном отсутствии транскрипции.

Основ классификации Буша и Сметаны придерживается значительное число исследователей /Öernandez-Verdun, 1986 /. В то же время, эта классификация не учитывает всего многообразия морфологических типов ядрышек, выделяемых в большом числе объектов растительного и животного происховдения. Так, в нее не вошла достаточно обширная группа вакуолизированных ядрышек и многие другие формы. Кроме того приведенная классификация основана,главным образом,на результатах свето-оптических исследований и ультраструктурного анализа случайных срезов и не учитывает современных представлений о трехмерной и функциональной связи основных структурных компонентов. В связи с этим возникает необходимость в обновлении существующей классификации ядрышек на основании того фактического материала, который накоплен по данному вопросу за последнее время. Важно подчеркнуть, что новая классификационная система должна основываться, главным образом, на результатах анализа объемной структуры ядрышка.

Вследствие лабильности структурной организации ядрышка, исследование случайных сечений малоэффективно, что делает необходимым использование методов стереологического анализа. Наиболее успешно применяется трехмерная реконструкция изучаемых структур с помощью серийных ультратонких срезов / Goessens, 1984; Dupui-Ooin, 1986; Hernandez—'"srdua, "Э86; Зацепина и др,г 1988; Zatsepina et al., 1988 -939; Geraud et al,, 1988; Motte et al , 1988; Bourgeois, Hubtr*,- 1988 и др /, Несмотря на трудоемкость, это единственный метод £ позволяющий воссоздать картину строения ядрышка в объеме.

За последнее время в изучении объемной структуры и функционирования ядрышка достигнуты значительные успехи. Диапазон проводимых работ чрезвычайно широк и включает направление., имеющие отнюдь не только теоретическую ценность. Сильно прогрессируют исследования

ядрышек и ЯОР лри опухолевом росте и других заболеваниях человека /Мамаев и др., 1981, I984;ELoton et al., 1982, 1983, 1984, 1907; Jacksoa-Cook et al., 1935; Hernandez-Verdun, 1986; Crocker, liar, I9S7;Dercnzini et al., 1989/. Углубление знаний в этом.направлении является важным этапом изучения механизмов функционирования одного из главных звеньев генома эукариотов, что может способствовать решению многих медикобиологических проблем.

Несмотря на обилие работ, существует ряд принципиальных вопросов, без решения которых невозможно получить полное представление об организации и функционировании ядршка. Так, в настоящее время трехмерные исследования ограничены лишь несколькими типами'ядрышек, что не позволяет выработать общие принципы морфофункциональг^й характеристики известных разнообразных форм ядрышка. Не исследована в деталях динамика структурных преобразований ядрышка ери переходах из неактивной формы в активную и наоборот. Мало изучен вопрос о корреляции количества и размеров ЯОР в митотических клетках с числом и размерами <1Ц в интерфазе на соответствующих стадиях диф-ференцировки. Большой интерес представляет объемная реконструкция Ag-зон, что дает возможность топографической и количественной оценки Ag-белков в различных типах ядрышек. Следует подчеркнуть, что реакция на As-белки является надежным цитохимическим тестом, широко используемым для выявления зон активной транскрипции и районов, содержащих р-гены с потенциальной активностью. И, наконец, практически не исследованы пространственные изменения ядрышковых компонентов при различных патологических состояниях, в том числе при опухолевом росте.

Цель и задачи работы. Исходя из вышесказанного, основной целью настоящей работы было создание принципиальной схемы структурной организации ядрыика и динамики перестроек его компонентов при разн*х уровнях функциональной активности р-генов в норме,в условиях искусственного подавления синтеза рРНК противоопухолевым антибиотиком адриабластином и при опухолевой трансформации. Поставленная задача решалась на основе стереологического и морфометрического анализа объемных изображений разнообразных форм ядрышек в процессе диффе-ренцировки, в ее терминальных стадиях и в опухолевых клетках.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

I. Установить глазные закономерности организации и взаимосвязи ядршковых компонентов в основных морфофункциональных типах ядрышек: высокоактивных /компактных и нуклеолонемных/; умеренно-ак-

тивных /ретикулярных и вакуолизированных/; малоактивных /кольцевидных/ и неактивных /сегрегированных ядрышках и в свободных фибриллярных центрах/.

2. Описать динамику структурных переходов при активации и инактивации ядрышка.

3. Определить основные количественные параметры ядрышка и его компонентов в вышеуказанных типах /количественная ж объемная характеристика ядрышек, <ЗЦ, РНП-части и вакуолярной системы/.

4. Установить корреляцию между числом ЯОР и ФЦ в митозе, интерфазе и в процессе дифференцировки клеток.

5. Установить взаимосвязь между количественными характеристиками и общей структурной организацией ядрышек в клетках дифференцированных тканей с различным уровнем функциональной активности.

6. Изучить количественные параметры и пространственную организацию ядрышек в условиях искусственного ингибирования синтеза рРНК на примере процесса сегрегации ядрышковых компонентов.

7. Провести стереологическое и морфометрическое изучение распределения аргентофильных белков в активно пролиферирующих, дифференцирующихся, терминально дифференцированных клетках, а такяе

в условиях искусственного подавления синтеза рРНК.

8. Изучить особенности организации и количественного соотношения ядрышковых компонентов в процессе нарастающей вакуолизации ядрышка, связанной с его инактивацией.

9. Охарактеризовать особенности ультраструктурной и трехмерной организации ядрышек клеток человека, находящихся в состоянии опухолевого роста.

10. Изучить ультраструктуру и трехмерную организацию ядрышек разных вариантов доброкачественных и злокачественных опухолей чело-

*Многие авторы /см., например,Негпапйег-Уегашг, 1986/ используют термины "нуклеолонемные" и ."ретикулярные" ядрышки как синонимы. Впервые ретикулярные ядрышки вцделены в самостоятельный тип в классификации Челидзе и Зацепиной /1988/. Основой для такого разделения послужило то, что несмотря на формальное сходство указанных двух типов /сетчатое строение, отчетливо выраженные вакуоли и др./ группа ядоышек, отнесенная нами к ретикулярному / р а -бекулярному/ типу, по ряду признаков отличается от нуклео-лоне'мных и характеризуется: /I/ выраженным губчатым /трабекулярным/ строением; /2/ слабым развитием ШК и гранулярного компонента; /3/ хорошо выраженными ФЦ; /4/ интенсивно развитым вакуолярным компонентом так, что система вакуолей и РНП-структуры развиты примерно в одинаковой степени.

века, отличающихся по степени злокачественности, гистогенезу и органной принадлежности.

Научная новизна. Получен ряд принципиально новых фактов, раскрывающих основные закономерности морфофункциональной организации ядрышек в процессе митоза, дифференцировки, а также при опухолевой трансформации.

Среди новых и наиболее существенных результатов, в первую очередь, мояно выделить следующие. /I/. Разработана новая классификация ядрышек, основанная на стереологическом и морфометрическом анализе его компонентов. /2/. Существенным представляется установление структурной непрерывности между ФЦ, внутриядрышковым и околоядрышко вым хроматином. Эти наблюдения позволяют говорить о наличии -диной функциональной системы, включающей активный хроматин ФЦ и остальной инактивированный хроматин ядрышка. /3/.Получена детальная картина объемной организации ядрышка на последовательных этапах процессов активации и инактивации метаболизма рРНК. Даны подробные характеристики общей структурной организации ядрышка и количественные параметры отдельных его компонентов, начиная от полностью инактивиро-ванного состояния в виде свободного ФЦ, через промежуточные этапы нарастания функциональной активности вплоть до высокоактивных нук-леолонемных и компактных ядрышек. Подобным образом охарактеризованы последовательные стадии преобразования структуры ядрышек в процессе инактивации. /4/.Установлены неизвестные ранее взаимоотношения ¡/.езду объемными характеристиками ЯОР хромосом и ФЦ ядрышек на разних стадиях эритропоэза. На стадии проэритробласта мелщу суммарными объемами метафазннх ЯОР и интерфазных ФЦ существует четкое соответствие. По мере дифференцировки происходит прогрессирующее снижение общего объема ФЦ. Параллельная трехмерная реконструкция -зон ядрышек позволила связать уменьшение общего объема ФЦ в дифференцирующихся эритроидных клетках с потерей части Ае-белков. /5/.Использование ультраструктурного анализа ядрышка позволило установить неизвестную'ранее функциональную гетерогенность эпителиаль ных клеток проксимального отдела, нефрона в пределах одного канальца. Этот факт подтверждается наличием корреляции между различными вариантами ультраструктурной организации ядрышка и интенсивностью синтеза в клетках РНК, определяемого по включению н -уридина. /б/.Стереологический анализ позволил выявить ряд специфических приз наков объемной организации ядрышка в опухолевых клетках человека, в частности, появление в ядрышках гигантских фибриллярных центров

з крайне сложным рельефом при инвазивных формах рака молочной же-пезы.

Практическая ценность работы. Результаты стереологического и иорфометрического анализа ядршка и аргентофильных зон могут использоваться в целях оценки уровня синтеза рРНК в норме и при различных патологических процессах. Данные, полученные при изучении структурной организации ядрышек доброкачественных и злокачественных опухолей различных органов человека, могут быть использованы для определения степени злокачественности, гистогенеза и йругих свойств опухолевых клеток, учитываемых при дифференциальной диагностике новообразований.

Результаты стереологического и морфологического анализа ядрышка и аргентофильных районов в условиях подавления синтеза рРНК противоопухолевым антибиотиком адриабластином могут быть использованы для наблюдения за фаркакодинамикой и побочными эффектами этого широко распространенного хштотерапевтического препарата.

Основные результаты исследования включены в учебную программу курса лекций по биологии клетки на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Тбилисского государственного университета.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуадены на 6 Всесоюзном совещании эмбриологов /Москва, 1981/; Всесоюзном симпозиуме "Белки и экспрессия генома" /Канев, 1983/; Всесоюзном симпозиуме "Реактивность клеточных органелл" /Тбилиси, 1983/; 9 и 10 Всесоюзных симпозиумах по структуре и функциям клеточного ядра /Пущино, 1984; Черноголовка, 1987/; Советско-Финляндском симпозиуме по проблемам биологии развития /Тбилиси, 1984/; Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза" /Харьков, I9S7/; II Международном рабочем совещании по ядру /Суздаль, 1989/, семинарах сектора электронной микроскопии Мекфакуль-тетской проблемной НЖ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А,Н.Белозерского МГУ и ряда институтов АН СССР и АН ГССР, заседании Латвийского общества АГЭ /Рига, 1988/. По материалам диссертации опубликованы 33 печатных труда и монография "Ультрас.рук-тура и функции ядрышка интерфазной клетки" /"Мецниереба", Тбилиси, 1985/.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 371 страницах машинописного текста /собственного текста 299 страниц/, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы / глава I/, раздела собственных исследований /глава II/, обсувдения полученных дан-

ных /глава III/, заключения, выводов и указателя литературы, содер^-жащего 612 источников, из них - 69 отечественных и 543 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 178 монталсами микрофотографий, элек-тронограмм и объемных моделей, 29 таблицами, а также б схемами и 2 графиками.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССВДОВАНШ II.I. Краткая характеристика объектов и методов исследования

В работе использованы клетки различных тканей печени, почки и сердца половозрелых беспородных мышей, весом 20-25г, самцов Оелых крыс. /ЮОг/, морских свинок /250-300г/, эмбрионов мыши /12-19 дней внутриутробного развития/ и новоровденных мышат, а также П-суточных куриных зародышей. С целью активации гепатоцитов у мышей удаляли 2/3 печени. Ыатериал исследовали через 1-24ч после частичной гепа-тэктомие. Для повышения функциональной активности клеток эпителия проксимального отдела нефрона часть мышей подвергали односторонней нефрэктомии и исследовали корковый слой почки через 1-48ч после операции. С целью подавления синтеза рРНК самцам крыс в хвостовую вену однократно вводили водный раствор противоопухолевого антибиотика адриабластина /"Parmitalia Carlo ЕхЪа", Италия/ в концентрации 4мг на кг веса тела. Исследовались клетки сердечной мышцы через 2,4,8, 12 и 24ч после инъекции.

Анализ человеческого опухолевого материала проводился на следующих типах новообразований: /1/доброкачественной /^иброаденома/ и злокачественной /инвазивная протоковая карцинома/ опухоли одного органа - молочной железы; /2/злокачественной опухоли эпидермального генеза /плоскоклеточный рак/ в различных органах - кожи, гортани, легкого, пищевода, языка, прямой кишки и шейки матки; /3/двух форм злокачественной опухоли разного генеза /плоскоклеточный и мелкоклеточный рак/ одного органа - легкого. Использовался послеоперационный материал онкологических больных со следующим диагнозом: фиброаденома молочной железы /2 случая/, инвазивная протоковая карцинома молочной железы /6/, плоскоклеточный рак кожи /3/, гортани /3/, легкого /3/, шейки матки /3/, пищевода^/3/, языка /2/, прямой кишки /3/ и мелкоклеточный рак легкого /2/.

•Послеоперационный онкологический материал получен из ОНИ МЗ ГССР г. ВОКЦ А.,Б СССР. Автор благодарит к.м.н. И.В.Топурия и Д.м.н. ^.Г.Силагадзе за содействие, оказанное при взятии опухолевого материала

Подробно методы фиксации и подготовки материала для световой' и электронной микроскопии описаны в работах, приведенных в списке литературы /I - 22/. В случае опухолей коки, гортани, легкого, языка, пищевода, прямой кишки и шейки матки эпвдермальннй генез устанавливался с помощью мококлональных антител А 6/1 к базальноклеточ-ному антигену в соответствии с методикой, описанной нами ранее /Силагадзе и др., 1987/. Окраска на Ад -белки проводилась по методике Зацепиной и Сметаны /аасерхпа et а1., 1984; Зацепина, Сметана, 1985/*. При радиоавтографическом анализе мышам вводили раствор н3-уридина /удельная активность 7.8-20 С1 /ммол/ в дозе Ю-20мкС1 на грамм веса животного. Полутонкие и ультратонкие срезы покрывали эмульсией типа М или ПР-2М** и экспонировали в течение 20-60 дней.

Методы стереологического и морфометрического анализа подробно описаны в статьях, приведенных в списке литературы /15, Г7, 18/. В дифференцированных тканях в каждом типе клеток были исследованы полные серии срезов каждого из 10 и более ядер. При построении трехмерных моделей ядрышка выбирали 4 из 10 ядер каждого типа клеток, причем в одном случае производили реконструкцию двух ядрышек. Для стереологического анализа интерфазных и делящихся клеток эритроидного ряда приготовляли полные серии ядер пяти проэритробластов /три диплоидных и два теграплоидных/, пяти базофильных, трех полихромато-фильных эритробластов, шести нормобластов, а также метафазных пластинок пяти проэритробластов и двух базофильных эритробластов. Пло-идность клетки определялась по числу и структуре центриолей /Воробьев , Ченцов, 1982/. Во всех остальных случаях реконструировали от 3 до 5 ядрышек. Плотность упаковки фибриллярного материала, входящего в состав ФЦ, определяли с помощью денситометра МБ-4, используя негативные изображения клеток, отснятых на одном срезе и проявленных в одинаковых условиях.

11.2. Результаты и обсуждение

11.2.1. Стереологический и морфомегрический анализ ядрышек Я0Р и Ае -зон в процессе дифференцировки эритроид-ных клеток печени зародыша мыши

Известно, что при созревании клеток эритроидного ряда, происходит постепенное снижение уровня транскрипции р-генов, вплоть до

'Автор благодарит д.б.н. 0.В.Зацепину за содействие, оказанное при окраске на Ае -белки.

"Эмульсия ПР-2М получена из Ленинградского Радиевого института АН СССР им. Б.Г.Хлопика.

полного выключения синтеза рРНК на терминальной стадии дифференци-ровки /Зиегапа, 1980 /. В связи с этим дифференцирующиеся эритроб-ласты представляют собой удобную модель для изучения объемной организации ядрышка при естественной инактивации синтеза рРНК. Однако, важным представляется изучить прежде морфологию, число и размеры потенциально активных ЯОР в делящихся эритробластах.

йетафазные ппоэритробластц и базофилъные эритробласты. Реконструкция трехмерной структуры и морфометрический анализ ЯОР метафаз-ных хромосом показал следующее. При обычной фиксации и контрастировании, как и при окраске АеНО^ в проэритробластах выявляется 12 ЯОР В базофильных эритробластах число ЯОР уменьшается до 8. При обычном контрастировании ЯОР имеют эллиптическую форму и преимущестт ;нно гладкие контуры. Такая же морфология ЯОР обнаруживается во время окраски нитратом серебра. В проэритробластах ЯОР разных хромосом резко различаются по размерам, так что можно выделить, по крайней мере, три класса ЯОР: малые - 0,022-0,044мкм3; средние - 0,051-О.Оббмкм3 и большие - 0,073-0,166мкм3. В базофильных эритробластах размеры ЯОР меньше, однако, и тут можно выделить три класса: 0,016-0,028икм3; 0,032-0,044мм3 и 0,068-0,086мкм3.

Сравнение размеров ЯОР метафазных хромосом пяти проэритроблас-тов и двух базофильных эрктробластов выявило близкие значения суммарных объемов ЯОР в разных клетках. При этом средний суммарный объем ЯОР в проэритробластах составлял около 0,725;^0,010л!юл3. В базофильных эритробластах вместе с уменьшением числа ЯОР наблюдается понижение их среднего суммарного объема приблизительно в 2 раза /0,344;!0,022мкм3/. При окраске метафазных ЯОР на ;-;-белки в трех проэритробластах также было отмечено сходство суммарных объемов Я01 разных клеток; средний суммарный объем был равен~0,661^0,010мкм3.

Гя'У'вренцирумщеся интерйазные эритроидные клетки. Результаты морфометрического анализа ядрышек и ФЦ на основных стадиях эритро-поэза представлены в таблице I. Интерфазные проэритро-б л а с т ы содержат одно крупное ядрышко, которое характеризуется отчетливой нуклеолонемной структурой и хорошо развитым гранулярным компонентом /около 68й от объема ядрышка в диплоидных и 1А% в тетраплоидных клетках/. Анализ серийных срезов показывает, что в прояритробластах многочисленные ФЦ имеют преимущественно сферическую корму и довольно равномерно распределяются в объеме ядрышка /рис. 1,а/. Буклеолонема, состоящая главным образом из ПЖ, предст! ляет собой непрерывный тяж, объединяющий все На долю ШК прихо-

Таблица I. Результаты морфометрического анализа ядрышек и ФЦ зритроидных клеток зародышей мыши

Стадия и плоид-ность клеток V ядрышка на клетку шал Среднее кол-во ФЦ 7ср. ФЦ мкм 2>ср. ФЦ на клетку мкм

Проэритробласт, 2с Проэритробласт, 4с Базофильный эритробласт, 2с Полихромато-йильный эритробласт, 2 с Нормобласт, 2с 17.700 88 0.0042^0.0001 0.369-0.008

29.443 118 0.0064^0.0004 0.749^0.742

4.586 0.547 0.102 7.6 4,3 2.7 0.0248^.0050 0.0259-0.0013 0.0390-0.0020 0.170^0.013 0Л11-0.002 0.102^0.011

дится около 18% объема ядршка, а вместе с ФЦ суммарный объем нук-леолонемного тяжа составляет ^20$.

Ядрышкам проэритробластов свойственно достаточно интенсивное развитие вакуолей. Так, средний суммарный объем вакуолярного компонента в диплоидных и тетраплоидных проэритробластах составляет около 12% от объема ядрышек.

Анализ серийных срезов ядрышек проэритробластов, окрашенных на Ай-белки, показывает, что Ав-зоны представляют собой единый непрерывный тян со средним суммарным объемом около 3.041^0 ЛЗОмкм3 от объема ядрышка/.

Базофильные эритробласты содержат два ядрышка, которые заметно уменьшаются в размерах и обедняются гранулами. Количество ФЦ на ядро по сравнению с проэритробластамл уменьшается до 3-12, а средний объем индивидуальных ФЦ повышается почти в 6 раз. При этом средний суммарный объем ФЦ уменьшается более чем в 2 раза. Помимо сферических /рис. 1,6/ часто встречаются ФЦ, имеющие сложную "разветвленную" конфигурацию /рис. 1,в/.

Изучение серийных срезов ядрышек, окрашенных серебром, указывает на резкое изменение характера распределения Ав-белков, которые сосредоточены в смещенных на периферию крупных округлых ФЦ, о • которых отходят многочисленные отростки. Остальная часть фибриллярного- тела ядршка базофильных эритробластов Ад- отрицательна.

В полихроматофильных эритроблас-т ах 'ядрышки практически лишены гранулярного компонента и представлены ФЦ, окруженные слоем ПФК /рис. 1,г,д/. В ядрах этих клеток можно обнаружить 4-5 ядрышек. Их суммарный объем на ядро сокра-

щается до 0.547мкм3. Объем индивидуальных ФЦ увеличивается в среднем приблизительно в 6 раз, а их средний суммарный объем сокращается по сравнению с проэритробластами более,чем в 3 раза.

При реконструкции трехмерной структуры ядрышек полихромато-фильных эритробластов, окрашенных нитратом серебра, обращает на себя внимание заметное сглаживание контуров Ав-зон. Окрашенные серебром ФЦ имеют эллиптическую форму с 1-2 небольшими выростами.

В яормобластах из всех компонентов ядрышка обычно сохраняются ФЦ, лишенные РНП-материала /свободные ФЦ/. Форма ФЦ в нормобластах приближается к сферической или овальной /рис. 1,е/. Количество свободных ФЦ на ядро колеблется от I до 3. Их средний объем,по сравнению с проэритробластами,повышается более,чем в 9 раз однако средний суммарный объем сокращается почти в 4 раза.

Рис. I. Трехмерные модели, демонстрирующие структуру и характер распседеленкя <Щ ядрышек эритроидных клеток печени зародышей мыши: а - ядоишко псоэритробласта; б,в - ядрышки среднего /б/ и позднего /в/ базо^ильных рритробластов; г,д - полихроматофильные эритроб-

- 13 -

ласты; е - распределение свободных <БЦ в ядре нормобласта. ФЦ обозначены цифрами; прерывистая линия - фибриллярный компонент; я - ядро; яш - ядрышко.

После окраски серебром в ядре выявляются 1-3 ФЦ эллиптической формы с гладким контуром. По сравнению с проэритробластами,в нормо-бластах наблюдается значительное уменьшение А§ -белков. Средний суммарный объем дискретных А^-зон нормобластов снижается,по сравнению с непрерывным аргентофильным тяжем нуклеолонемных ядрышек проэритробластов приблизительно в 30 раз. Обобщенные данные морфо-метрического анализа Ag-зoн метафазных и интерфазных проэритроб-ластов и нормобластов печени зародыша мыши представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты морфометрического анализа суммарных

объемов Ае-положительных ЯОР метафазных проэритроб-ластов и Ав-зон интерфазных: эритробластов -

Тип клеток Количество исследованных клеток Количество ЯОР и ав-зон 3 А5+- ЯОР и аз-зон мкм-3

МЁТАФАЗНШЗ ПРОЭРИТРОЕЛАСТЫ 5 12 0.661^0.010

ИНТШАЗНЫЕ ПРОЭРИТРОЕЛАСТЫ 3 I /непрерывный тяж нуклеоло-немы/ 3.041^0.130

БОРЮЕЯАСТЫ 3 3 /дискретные зоны, соответствующие свободным ФЦ/ 0.099^0.001

Важно подчеркнуть тот факт, что при полной инактивации р-генов на терминальных стадиях дифференцнровки эритроидных клеток нормо-бласты теряют значительно большее количество Ае-белков, чем при временном прекращении синтеза рРНК в процессе формирования метафазных ЯОР в проэритробластах.

11-2,2 Трехмерная организация ядрышек дифференцирующихся мегакариоцитов печени зародыша мыши

Предшественники мегакариоцитов - мегакариобласты использовались для сгереологического и морфомегрического анализа компактных ядрышек. Эти клетки содержат одно гипертрофированное ядрышко со средним диа-метром~ 19,150мкм3, с хорошо выраженными ФЦ и сильно развитым гра-

нулярным компонентом /~90% от объема ядрышка/. Лакунарная система1 выражена слабо /около 3%/. Стереологическин и морфометрический анализ выявил ряд специфических признаков в строении ядрышек компактного типа. Они содержат один или два достаточно крупных /до 0,170 мкм3/ щЦ и 4-6 меньших размеров /0,016-0,040мкм3/. Характерно и то, что во всех исследованных наш случаях крупные фЦ имели краевое расположение и граничили с нуклеоплазмой. Средний суммарный объем ФЦ составляет 0,327^0,015мкм3. Компактные ядрышки характеризуются достаточно хорошо развитым БФК /около 5% от объема ядрышка/, кото-рил либо формирует на поверхности ФЦ "шапочки", либо образует более протяженные зоны, напоминающие нуклеолонему. В последнем случае возникает промежуточная группа - компактно-нуклеолонемные я рышки /16/. В более зрелых клетках /промегакариоцитах и мегакариоцитах/ присутствуют ядрышки с типичной нуклеолонемной структурой.

II.2.3. Характер распределения Ag -зон в ядрышках дифференцирующихся эндотелиоцитов кровеносных сосудов печени и сердца зародышей мыши

Созревающий эндотелий сосудов сердца и печени эмбрионов мыши удобно использовать для описания структурной организации ядрышка и характера распределения Ag -белков на завершающих стадиях дифферен-цировки, непосредственно предшествующих появлению в клетке кольцевидного ядрышка. • -Исследование ядрышек дифференцирующихся эндотелиоцитов сосудов печени и сердца эмбрионов мыши и новорожденных животных указывает на ядрышковый полиморфизм в клетках, находящихся на разных стадиях созревания. В основном различия касаются числа и размеров ФЦ и степени развития ПФК. На серийных срезах среди эндотелиоцитов можно обнаружить клетки с ядрышками, напоминающими по структуре ретикулярный тип. Количество ФЦ в таких ядрышках составляло 5-6. Кроме того, в эмбриональном сердце и печени встречаются клетки, содержащие типичные кольцевидные ядрышки и близкие к ним формы с 2-3 ФЦ. Следует отметить, что кольцевидные ядрышки являются характерным признаком зрелых эндотелиоцитов,с отчетливо выраженными признаками диф-ференцировки сосудистой выстилки, такими как уплощение клеток, появление межклеточных контактов типа замков, многочисленные пиноци-тозные пузырьки и др.

Такой же полиморфизм отмечается при окраске ядрышек эндотелия сосудов печени и сердца на Ag-белки. Как показывает исследование

серийных срезов, ядрышки эндотелиоцитов могут иметь одну крупную / kg -зону /кольцевидные ядрышки/ или 5-6 зон меньших размеров /ретикулярные ядрышки/. Как правило, Ag-зоны имеют неровные границы, и от них отходят многочисленные отростки. Однако, в популяции эндотелиоцитов с кольцевидным ядрышком нередко встречаются овальные Ag -зоны с гладким контуром. По мера созревания клеток,частота встречаемости кольцевидных ядрышек, обнаруживающих при окраске серебром

одну Ag-зону, увеличивается.

* * *

Данные, полученные при изучении эритроидных клеток, позволяют проследить зависимость изменения числа и размеров ЯОР и ФЦ как от уровня функциональной активности ядршек, так и числа р-генов. Примером клеток с одинаковой функциональной активностью, но с разной длоидностью являются ди- и тетраплоидные проэритробласты. Сравнение суммарных объемов ФЦ показывает, что в тетраплоидных проэритроблас-тах этот параметр в два раза выше,чем в диплоидных. Таким образом, есть основания полагать, что суммарные объемы ФЦ пропорциональны плоидности клетки, т.е. числу содержащихся в ней р-генов. Важно подчеркнуть, что на стадии проэритробластов между суммарными объемами метафазных ЯОР и ФЦ существует четкое соответствие, в то время как по мере дифшеренцировки происходит прогрессирующее снижение общего объема ФЦ. Кроме того,сравнение метафазных проэритробластов с базо-фильными эритробластами доказывает, что в процессе дифференцировки наблюдается снижение числа, индивидуальных размеров и суш/арных объемов ЯОР. В базофильннх эритробласгах число ЯОР сокращается до 2 на гаплоидный набор. При это ;, их суммарный объем уменьшается в два раза. Это совпадает с двукратным уменьшением суммарных объемов ФЦ в ингерфазяых базофильных эритробластах.

Инактивация ядрышек в процессе ди®;>еренцировки эритроидных клеток сопровождается уменьшением числа ФЦ, в то врет как размеры индивидуальных ФЦ увеличиваются. В нормобластах объемы ФЦ почти в Ю раз больше,чем в лроэритробластах- В целом эти наблюдения находятся в соответствии с данными других авторов, указывающими на то, го инактивация ядрышек приводит к уменьшению частоты встречаемости ФЦ /Jordan, Мс Govern, 1981; Seite, Patiusque, 1985; Hozak et al., 1986; Зацепина и др., 1988/. Уменьшение числа ФЦ на клетку и увеличение их индивидуальных размеров проще всего объяснить агрегацией отдельных ФЦ по мере инактивации ядрышка в процессе дифференцировки / Нетап-üez-Verdun, 1986/. Однако сравнение суммарных объемов ФЦ в проэрит-робластах и нормобластах говорит против этого упрощенного предполо-

Кения - уменьшение числа ФЦ сопровождается уменьшением их суммарных объемов. Уменьшение объемов ФЦ может быть отчасти связано с уплотнением упаковки их материала. Об этом свидетельствуют результаты денсктометрического анализа, который показал, что оптическая плотность ФЦ в проэритробластах почти в 1,5 раза нюхе, чем в нормоблас-тах. Другой причиной уменьшения суммарных объемов ФЦ может быть потеря части белкового компонента, например, аргентофильных белков. Об этом свидетельствует значительное сокращение суммарных объемов Ag -зон в нормобластах.

Полученные нами данные показывают, что количество ФЦ в интерфазных проэритробластах почти в 10 раз превышает количество ЯОР, выявляемых в метафазных хромосомах как при двойном контрастиро. лнии, так и при окраске haag-белки. Это означает, что в активных ядрышках один ЯОР образует более одного ФЦ. При инактивации ядрышек число ФЦ, образуемых одним ЯОР,прогрессивно падает. Сохранающиеся 4>Ц обнаруживают тенденцию к агрегации, в результате чего общее число ФЦ оказывается меньше количества ЯОР. При активации р-генов во время перехода проэритробластов из митоза в интерфазу происходит значительное /почти в 5 раз/ повышение суммарного объема Ag-зон, что свидетельствует об увеличении в активных ядрышках содержания Ag -белков.

По мере.диффереяцировки резко меняется и пространственная струк тура Ag-зон. Тот факт, что в ядрышках проэритробластов Ag -зоны соответствуют непрерывному тяжу нуклеолонемы, можно рассматривать как косвенное подтверждение наличия в нуклеолонеме активных р-генов Attire, Stahl, 1978/. Известно, чтoAg-бeлки связан'- с рДНК транскрипционной единицы и отсутствуют в. латеральных фибриллах пре-рРНК /Angelier et al., 1982; Olsoa et al., 1983; Jordan, 1987/. В базо-фильных эритробластах появляются дискретные Ag-зоны с многочисленными отростками, отходящими от поверхности ФЦ. По мере инактивации р-генов происходит постепенное сглаживание контуров ФЦ вплоть до появления сферических Ag-зон в нормобластах.

Суммируя данные, полученные при стереологическом и морфомзтри-ческом анализе ядрышек дифференцирующихся клеток, следует отметить, что активация ядрышка сопровождается усложнением рельефа, фрагментацией и ростом числа ФЦ, что может приводить к увеличению их рабочей поверхности üernandez-Verdun, 1986; Зацепина и др., 1988/. При инактивации ядрышка наблюдаются обратные изменения размеров, формы и числа ФЦ. Однако фрагментация ФЦ, очевидно, не единственный путь

увеличения их рабочей поверхности. 00 этом говорят данные морфомет-рического анализа компактных ядрышек мегакариобластов, отличающихся от нуклеолонемных ядрышек меньшим числом и большими размерами ФЦ. По-видимому, увеличение рабочей поверхности может происходить и за счет резкого увеличения объема ФЦ Aoessens, igs^i Seite, Pebuaque, 1985/.

II.2.4. Трехмерная организация ядрышек дифференцированных клеток и характер распределения в них Ag-зон

В задачу данной части работы входило изучение объемных и количественных характеристик ядрышек клеток, вышедших из митотического цикла. С этой целью были подобраны дифференцированные клетки мезен-химного и энтодермального генеза, различных органов мыши и морской свинки. В соответствии с типами ядрышек, изучаемые клетки были разбиты на три группы. В первую группу вошли эндотелиоциты капилляров печени и почки, гладкомышечные клетки артериол почки и фибробласты, характеризующиеся наличием малоактивных кольцевидных ядрышек с одним ФЦ. Вторую группу составили нефроциты проксимальных канальцев коркового вещества почки, отличающиеся ярко выраженным ядрышковым полиморфизмом /9/. Третью группу составили гепатоциты, в которых богато представлены ретикулярный и вакуолизированный типы ядрышек. С целью более детальной характеристики вакуолизированных ядрышек изучали гепатоциты Ii-суточных куриных зародышей, ядрышки которых претерпевают интенсивную вакуолизацию /10/.

Кольцевидные ядрышки эндотелиоцитов гладкомышечных клеток и фибробластов мыши. Исследование серийных срезов показало, что во всех рассмотренных случаях ядрышко содержит один ФЦ. При .этом обнаруживаются два типа ФЦ - сферические или в форме эллипса и сложной конфигурации.

Анализ серийных срезов показал, что РНП-часть кольцевидных ядрышек не образует замкнутой сферы, и всегда выявляются зоны /¡ti. более двух/, где ФЦ непосредственно связан с околоядрышковым хроматином. РЩ-материал кольцевидных ядрышек представлен преимущественно фибриллярным компонентом, который в различных районах обнаруживает неодинаковую плотность упаковки. Наиболее высокая плотность упаковки фибрилл обнаруживается в участках, непосредственно прилегающих к ФЦ, где формируется П-Ж. Последний не образует вокруг ФЦ сплошного замкнутого кольца, вследствие чего лишь часть поверхности ФЦ покры-

Та ВЖ в виде "шапочек". Степень развития ПФК в разных ядрышках не одинакова. Так, в кольцевидных ядрышках со сферическими ФЦ, объем П'Ж колеблется в пределах 0,017-0,026мкм3. Наибольшая степень развития П'ЬК наблюдается в кольцевидных ядрышках со сложным ФЦ. Объем 1Щ в таких ядрышках может достигать 0,032мкм3. Гранулярный кошонент развит слабо и преимущественно локализован в периферических частях ядрышка. Как правило, при сложной структуре ФЦ размеры зон гранулярного компонента /0,042шш3/ превышают таковые в ядрышках с эллиптическими фЦ /0,028-0,031мкм3/.

Вакуолярный компонент кольцевидных ядрышек представлен единой системой каналов /диаметр 40-80нм/, пронизывающих все тело ядрышка, в которых локализованы электроноплотные фибриллы, толщиной 20-Р0нм. Лакунарная система начинается на периферии ядрышка и,несколько расширяясь, заканчивается ка поверхности ФЦ. Электроноплотные фибриллы, локализованные в лакунах, образуют непрерывные тяжи, отходящие от околоядрышкового хроматина и соединяющиеся с ФЦ.

Изучение серийных срезов всего ядра показало, что число кольцевидных ядрышек в исследованных клетках может варьировать от 2 до 4. С помощью количественного анализа удалось установить, что рассмотренные четыре типа клеток достоверно различаются по средним объемам ядрышек, РШ-части и ФЦ.

Исследования серийных срезов после окраски клеток нитратом серебра показали, что по топографии, размерам и морфологии аргенто-филыше зоны соответствуют ФЦ, выявляемым в ядрышках после стандартной процедуры фиксации и окрашивания. Аргентофильные зоны имеют округлую или сложную конфигурацию. Чаще всего округлые Ае-зоны характеризуются сглаженной поверхностью, тогда как от сложных отходят разной длины выросты, вдающиеся в тело ядрышка. Количественный анализ показал, что Ае-белки сосредоточены в ФЦ и в прилегающем к нему ШК. Об этом свидетельствует соответствие размеров Ае-зон суммарному объему ФЦ и ПФК.

Кольцевидные и ретикулярные ядршки эндотелиоцитов, гладкомы-шечннх клеток и Фибробластов морской свинки. Как и у мышей, структура ядрышек всех перечисленных клеток морской свинки имеет сходный принцип строения. Поэтому ниже будут описаны лишь эндотелиоциты капилляров печени. Эндотелий капилляров печени морской свинки отличается от гомологичной ткани мыши рядом специфических особенностей. Во-первых, ядрышки эндотелиоцитов морской свинки характеризуются значительно более развитой вакуолярной системой и хорошо выраженным

нутриядршковым хроматином. Во-вторых, обращает на себя внимание' дрышковый полиморфизм. Встречаются два типа ядрышек - кольцевид-ые и ретикулярные.

Кольцевидные ядрышки содержат ФЦ эллиптической формы, на по-ерхности которого располагаются "шапочки" ПФК. Вследствие доста-очно высокой для кольцевидного ядрышка степени вакуолизации,прос-ранственная связь между ФЦ, вакуолярной системой, внутри-.и около-дрышковым хроматином выражена отчетливо /рис. 2/. Вакуоли в виде диной разветвленной сети каналов пронизывают все тело ядрышка и, аметно расширяясь, заканчиваются на поверхности ФЦ. По ходу лаку-арных каналов могут возникать локальные расширения, в которых вы-вляются небольшие блоки конденсированного хроматина. Такие же бло-и видны в расширенных частях лакун, лежащих на поверхности ФЦ. Ре-икулярные ядрышки эндотелия морской свинки характеризуются более рупными размерами и большим числом гранул. Количество ФЦ равно 4, и они имеют преимущественно вытянутую или бобовидную форму с ладким рельефом. К поверхности ФЦ примыкают небольшие "шапочки" ФК. Остальная часть тела ядрышка построена из менее плотно упако-анных фибрилл. На серийных срезах хорошо видна структурная связь

Рис. 2. Трехмерная модель кольцевидного ядршка эндотелиоцита капилляра печени морской свинки. ФЦ показан прерывистой линией; стрелки указывают на вакуоли и локализованный в них внутриядрышко-вый хроматин /выделен черным цветом/.

Сравнение количественных параметров разных типов ядрышег внут-и одной популяции клеток указывает на более выраженную у морских винок гетерогенность ¡слеток,по сравнению с теми же тканями мыши, качестве примера,сравним средние значения изученных параметров ольцевидных и ретикулярных ядрышек эндотелия капилляров печени, ретикулярных ядрышках наблюдается увеличение количества ФЦ при ниженки их средних индивидуальных объемов в два раза. Средний бъем ядрышка возрастает почти в три раза. Средний суммарный объем

Ц с вакуолярной системой.

у

у. и ч

■V - .4

& ."-г

'4.

ФЦ и вакуолярного компонента ретикулярных ядрышек увеличивается • более,чем в 2 раза.

Стереологический и морфометрический анализ клеток, окрашенных нитратом серебра, указывает на соответствие объемов Ае-зон и суммарных объемов ФД и ПФК. При этом в ретикулярных ядрышках число Ан-зон возрастает до 4-6, а их средний суммарный объем увеличивается почти в 3 раза..

Ядрышки эпителия проксимального отдела нефрона мыши. Полиморфизм ядрышек нормального эпителия проксимальных канальцев обнаруживается при исследовании полутонких срезов коркового вещества почки. В соответствии с размерами ядрышка можно выделить три основные группы нефроцитов. Самая многочисленная составляет~52% и вк: этает клетки с диаметром ядрышек 0,8-1,5мкм. Во вторую группу /^ 37%/ вошли клетки, с диаметром ядрышек 1,5-2,5мкм. Третья группа клеток ЛИЙ/ содержала ядрышки диаметром 2,5-Змкм. Важно подчеркнуть, что ядрышковый полиморфизм можно выявить в пределах одного канальца.

Прицельное изучение клеток с различным диаметром ядрышек в электронном микроскопе и стереологический анализ показали, что первую группу, в основном, образуют клетки с кольцевидными ядрышками, содержащими один эллиптический ФЦ с гладкой поверхностью /рис. 3,а/. Кроме того, первую группу составляют клетки, имеющие близкие к кольцевидно^ типу ядрышки, в которых выявляются 2-3 ФЦ /промежуточные ядрышки первой группы/ /рис. 3,6,в/. В промежуточных ядрышках первой группы наблюдается постепенное усложнение рельефа ФЦ. Так, в ядрышках с двумя ФЦ /рис. 3,6/ оба имеют пока еще гладкую поверхность, однако, их рельеф отличается большей сложностью в ядрышках с тремя ФЦ /рис. 3,в/. Ядрышки второй группы нефроцитов /рис. 3, г,д/ характеризуются лучшей выраженностью вакуолярного компонента, гранулярной части и ПФК. Последний нередко организован в тяжевид-ные структуры. Ва объемных моделях хсрвио видно, что в пространственном строении вакуоли образуют единую систему каналов, объединяю-|цих все ФЦ /рис. 3,д/. Количество ФЦ в таких ядрышках равно 5-6. В третью группу входят клетки, содержащие типичные ретикулярные ядрышки /рис. 3,е/. Количество ФЦ в ретикулярных ядрышках резко возрастает и достигает 18-22. Степень развития вакуолярной системы, гранулярного компонента и ПФК в таких ядрышках заметно выше по сравнению с предыдущим группами.

Установлено, что размер ядрышзк четко коррелирует с интенсив-

Рис. 3. Структура, количество и распределение ФЦ в ядрышках различных групп нефроцитов. а - кольцевидное ядрышко нефроцитов первой группы; б,в - промежуточные ядрышки первой группы нефроцитов с 2 и 3 ч>Ц; г,д - ядрышки второй группы нефроцитов; на рис. 3,д показана трехмерная организация вакуолярного компонента /стрелки/; е - ретикулярное ядрышко третьей группы нефрг датов; ¿Д равномерно распределены по всему объему ядрышка

'ностью включения Н3-уридина. При этом клетки с наиболее крупными' ядрышками г2.5-Змкм/ более интенсивно метятся радиоактивным предшественником.

Подсчет количества ядрышек с различный диаметром через 22ч после односторонней нефрэктомии показал, что процентное соотношение клеток различных групп меняется,по сравнению с контролем: содержание клеток первой группы уменьшается на 24%, а второй и третьей групп увеличивается на 9$ и 15% соответственно.

Анализ морфометрических данных выявил резкие различия между основными количественными параметрами ядрышек в клетках рассмотренных групп. Если сопоставить объемы ядрышек различных форм, выявляемых в проксимальных канальцах, то оказывается, что средний объем ядрышек второй, группы приблизительно в 3,5 paja, а ретикулярных в 14 раз превышает таковой в ядрышках кольцевидного типа. Рост количества ФЦ /с I - в кольцевидных, до 6 - во второй группе и 22 - в ретикулярных ядрышках/ сопровождается уменьшением их индивидуальных размеров, в то время как суммарные объемы ФЦ прогрессивно растут. Увеличение объема ядрышек второй группы и ретикулярной формы связано не только с нарастанием объемов РНД-части. Частично это происходит из-за разрыхления ядрышка вследствие появления во второй группе и заметного расширения в ретикулярных ядрышках вакуоляр-ной системы. Примечательно, что в ретикулярных ядрышка-v средний объем вакуолярного компонента А 21% от объема ядрышка/ увеличивается, по сравнению с таковым во второй группе /~4%/ более v гч в 20 раз.

Стереологический анализ выявил гетерогенность распределения A.g -зон в ядрышках. Соответственно, на препаратах, окрашенных нитратом серебра в пределах одного канальца, встречаются все фо^мы ядрышек: с одной, двумя, термя и множеством /до 20/ A-g-зон. Данные сравнительного стереолог~'ческого и морфометрического анализа показали, что зоны, в которых выявляются Ag-белкй по форме, числу, размерам и локализации соответствуют ФЦ ж ПФК, выявляемых при обычной фиксации и контрастировании. Во второй груше и ретикулярных ядрышках размеры A.g-3oa меньяе, чем в кольцевидных ядршках. Они формируют дискретные структуры сферической, эллиптической, а также ' неправильной и тяжевидной формы. Суммарный объем Ag-зон во второй группе /0.277^0 ЛОмкм3/ и ретикулярных ядрышках /0.971^0.ОЮмкм3/ значительно превышает эти же параметры ядрышек кольцевидного типа /0.033*0.ООЗмкм3/ и близких к ним форм с 2-3 ФЦ /0.043^0.002мкм3/.

- 23 -

Кольцевидные и ретикулярные ядрышки эпителия проксимального отдела нейрона морской свинки. Для проксимальных канальцев почки морской свинки характерен ядрышковый полиморфизм. Правда, различные структурные варианты организации ядршка представлены тут не в таком разнообразии, как это наблюдается в нефроцитах мыши. Отмечены лишь два типа ядрышка - кольцевидные и ретикулярные. Как и в проксимальном отделе нефрона лгали, ядрышковый полиморфизм обнаруживается в пределах одного канальца.

Принцип структурной организации, количественные характеристики и аргентофмьные свойства ядрышек обнаруживает те ле закономерности, что и в кольцевидных и ретикулярных ядрышках эндотелия капилляров печени морской свинки.

Ретикулярные и вакуолизированяые ядрышки гепатоцитов мыши. морской свинки и П-суточных куриных зародышей. Ядрышки диплоидных гепатоцитов исследованных двух видов грызунов характеризуются интенсивно развитым вакуолярным компонентом, занимающим от 37^ до 60$ объема к. .рышка.

Анализ серийных срезов показывает, что ретикулярные ядрышки имеют форму близкую к эллипсу и гладкий рельеф. Как и в ранее рассмотренных клетках, тело ретикулярных ядрышек гепатоцитов представлено сетью трабекул фибриллярно-гранулярной структуры. Однако, из-за сильно развитого вакуолярного, компонента диаметр трабекул ядрышек гепатоцитов заметно меньше,по сравненью с ядрышками уже рассмотренных клеток.

Фибриллярные центры распределены по всему ядрышку и лежат на границе трабекул и вакуолей. Они имеют эллиптическую форму и преимущественно гладкую поверхность. Анализ серийных срезов показал, что Пч?Х формирует небольшие "шапочки" на поверхности ФЦ.

В отличие от гепатоцитов морской свинки,в печени мыши часто встречаются вакуолизированнне ядрышки, характеризующиеся резким ассимзтричвым расширением одной или двух вакуолей. Стереологичес-кий анализ показал, что гигантские вакуоли сообщаются с нуклеоплаз-мой и с вакуолями меньших размеров. В таких ядрышках ФЦ хорошо выражены и лзжат на границе с вакуолями. Создается впечатление, что при вакуолизации ядрышка ФЦ "оттесняются" в периферические области ядрышка. Зоны БФК на поверхности ФЦ выракены слабее,чем в ретикулярных ядрышках.

Анализ морфоматрических данных показал, что в ядрышках этого типа по сравнению с ретикулярным РНП-часть редуцирована. Количест-

во ФЦ в вануолизированных ядрышках понижено, а'размеры индивидуальных ФЦ вытечем в ретикулярном типе. В то же время,в процессе вакуолизации ядрышек гепатоцитов мыши отмечается достоверное понижение средних суммарных объемов ФЦ. Вакуолярный кошонент заметно преобладает над РНП-часты» и составляет около 60$ от объема ядрышка /в ретикулярном типе около 37%/.

Через 16-22ч после частичной гепатэктомии подавляющее большинство гепатоцитов содержит типичные нуклеолонемные ядрышки. По морфологии, количественным параметрам и аргентофильным свойствам ядрышки гепатоцитов оперированных животных походят на нуклеолонемные ядрышки проэритробластов.

Процесс вакуолизации ядрышка не во всех объектах протекает одинаково. Об этом свидетельствуют данные стер-'ологического и мор-фометрического анализа разнообразных форм вакуолизированных ядрышек гепатоцитов куриного зародыша. Вакуолизированные ядрышки печеночных клеток куриного зародыша отличаются от таковых в гепатоцитах мыши более интенсивной вакуолизацией /гигантские вакуоли могут занимать до 85Я объема ядрышка/, преобладанием гранулярного компонента на

фоне резкой редукции ПФК и слабо выраженными ФЦ.

* • *

. Суммируя результаты стереологического и морфометрического анализа и аргентофильных свойст ядрышек дифференцированных клеток, моя но сказать следующее. Исследование показало отсутствие в каждом из рассмотренных типов ядрышка ярко выраженных структурных признаков тканевой или органной специфичности в пределах одного вида животного. В то же время,различия в структурной организации ядрышек, относящихся к одно ну типу, хорошо прослеживаются при сравнении клеток гомологичных тканей мыши и морской свинки. В противоположность этому количественные параметры компонентов ядрышка обнаруживают заметную вариабельность при с; .внеяш не только различных тканей и органов одного вида животного, но и в пределах одного типа клеток.

Кольцевидные ядрышки оказались подходящей моделью для исследования объемной структуры ядрышка, формы ФЦ и его взаимосвязи с другими ядрыщовыми компонентами. Стереологический анализ дал наглядное представление о принципе морфофункциональной организации кольцевидных ядрышек. Обнаружение двух типов ФЦ может указывать на то, что ядршки, содержащие ФЦ со сложной конфигурацией, функционально более активны по сравнению с ядрышками, ФЦ которых имеют эллиптическую форму. Об этом же свидетельствуют и морфхжетрические

данные, в частности, нарастание в ядрышках, содержащих ФЦ со сданной структурой, объема ПФК и гранулярного компонента. Очевидно усложнение формы ФЦ предшествует их фрагментации, что функционально может быть связано с увеличением рабочей поверхности ФЦ и усилением транскрипции рДНК.

Существенным представляется установление структурной непрерывности между ФЦ, внутри- и околоядрышковым хроматином, а также лакунарной системой. Эти наблюдения позволяют говорить о наличии единой функциональной системы, включающей растянутый р-хроматин ФЦ /Ьегепг1п1 еЬ а1., 1982, 1983, 1987/ и остальной ассоциированный с ядрышком хроматин.

Стереологический и морфометрический анализ выявил структурную гетерогенность фибриллярной части кольцевидных ядрышек. В эндотелии печени мыши ПФК в среднем составляет 0,024мкм3 /~6% от объема ИШ-части ядрышка/. Остальная часть тела ядрышка приходится на фибриллярный материал, характеризующийся меньшей,по сравнению с ПФК • электронной ллотностью.и гранулярную часть. Гетерогенность фибриллярной части ядрышка отчетливо проявляется при окраске на Ае-бел-ки, которые сосредоточены в ФЦ и прилегающих к нему "шапочках" ПФК и, как правило, отсутствуют в остальных районах ядрышка. Таким образом, можно говорить не только о структурной, но и функциональной гетерогенности фибриллярной части ядрышка-

Эпителий проксимального отдела нефрона почки мыши в норме и после односторонней нефрэктомии оказался удобной моделью для изучения структурных перестроек компонентов ядрышка при переходах из одного морфофункционального типа в другой в пределах О0-периода. Обнаруженные нами разнообразные формы ядрышка отражают последовательные переходы в процессе активации клетки, начиная с малоактивного кольцевидного ядрышка через промежуточные этапы /промежуточные ядрышки первой и второй групп/ вплоть до ретикулярных ядрышек. При этом в ядрышках развиваются процессы, рассматриваемые как признаки активации р-генов: фраг.'.'пнтация и увеличение числа ФЦ; уменьшение размеров индивидуальных ФЦ; увеличение суммарных объемов ФЦ и ПФК; рост суммарных объемов Ай-зон; прогрессивное нарастание объема ядрышек и РНБ-части; расширение лакунарной системы. Промежуточные ядрышки первой и второй групп следует рассматривать как начальные этапы активации ядрышка. Э .1 неизвестные ранее формы дают наглядное представление о постепенных изменениях организации и количественных параметрах на ранних стадиях активации, предшеству-

- 26 -

ющих формированию ретикулярного или нуклеолонемного ядршек.

Сам по cede факт ядршкового полиморфизма в нефроцитах проксимальных канальцев, указывающий на неодинаковую интенсивность про дукции клетками рРНК в пределах одного канальца, представляется ин тересным. Различия в ультраструктуре ядрышек можно рассматривать, как свидетельство того, что несмотря на сходную высокую степень дифференцировки, этот тип эпителия представляет собой весьма гетерогенную клеточную популяцию. Функциональная гетерогенность эпителия проксимальных канальцев подтверждается начилием корреляции меж ду различными вариантами ультраструктурной организации ядрышка и интенсивностью синтеза РНК, определяемого по включению Б3-уридина.

Исследование ретикулярных и вакуолизированных ядрышек гепато-цитов ¡дыши и морской свинки доказало, что nj-1 гипертрофии вакуодяр ного компонента /свыше 505? от объема ядрышка/ развиваются процессы рассматриваемые как признаки понижения уровня активности р-генов /снижение числа и суммарных объемов ФЦ, возрастание размеров индивидуальных ФЦ, резкое сокращение РНП-части/. Сравнение процесса ва куолизации в гепатоцитзх мыши и куриного зародила позволило выделить две разновидности вакуолизированных ядрышек - фибриллярно-гра нулярные и гранулярные.

II.2.5. Стереологический и морфометрический анал, з ядрышек и A.S-30H клеток сердечной мышцы крысы при действии адриабластина

Среди большого числа ингибиторов метаболизма нуклеиновых кислот, особый интерес вызывают те соединен! , которые применяются в качестве фармакологических препаратов. Расшифровка механизмов их действия на клетки необходима для корректного применения в медицинской практике. К таким препаратам относится противоопухолевый антибиотик адриабластин, получивший широкое применение при химиотерапии новообразований человека разного генеза и локализации /Berg, 1984/. Однако, применение этого антибиотика в качестве противоопухолевого препарата осложняется рядом побочных эффектов, ере-ди которых в первую очередь выделяют миотоксичность /в том числе кардаотоксичност:-./ адриабластина /Di Marco et al., 1982/. ß связи с этим ¡слетки сердечной мышцы крысы -представляют собой удобную модель для изучения изменений структурной организации ядрышка и характера распределения Ag-белков при действии этого ингибитора рРНК

Ядрышки нормальных клеток сердечной мышцы имеют сравнительно

небольшие размеры /средний объем - г.вбб^.ОбОкмк3/ и достаточно • отчетливую нуклеолонемную структуру со множеством ФЦ /12-16/. ПФК Ьормирует единую систему, вклгачгющую тяяси нуклеолонемы и "шапочки" прилегающие к поверхности ФЦ. Гранулярный компонент развит умеренно и сосредоточен главным образом по периферии яуклеолонемншс тяжей. При окраске ядрышек кардиомиоцитов нитратом серебра видно, что Ае-Зелки собраны в округлые и тяжевидные зоны, соответствующие ФЦ и яуклеолонеме /средний суммарный объем - О.ббЗ^^Омкм3/.

Адриабластин вызывает резкие изменения в ультраструктуре ядры-лек подавляющего большинства клеток миокарда крысы. Реакция ядрышка, наблюдаемая уже через 2ч , выражается в утере нуклеолонемной эрганизащш, сильной редукции гранулярного компонента и резким уплотнением тела ядрышка, состоящего в основном из фибриллярного компонента. Количество ФЦ снижается до 1-3; при этом их размеры замет-яо возрастают. Так, через 4ч после действия антибиотика объем ядрышка понижается почти в 3 раза /1.047^0.020етл3/. Размеры индивидуата-зых ФЦ,по сравнению с контролем,повышаются приблизительно в 3 раза, а то время,как их средний суммарный объем понижается более,чем в 2 раза.

В сегрегированных ядрышках кардиомиоцитов, подвергшихся воздействию адриабластина, существенно меняется морфология и размеры Ag-зон. ав-белки сосредоточены, главным образом, в дискретных структурах, которые по топографии, числу и размерам соответствуют ФЦ. Остальная часть тела ядрышка, которая при двойном контрастировании запоминает фибриллярный компонент, А§- отрицательна. После действия ингибитора средний суммарный объем Ай-зон сокращается до 0,073^ ),007ацш3, что указывает почти на 12 кратное уменьшение количества -белков.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при искусст-зенном подавлении синтеза рРНК изменения в количественных параметрах ядршка и Ае-зон схожи с таковыми, наблюдаемыми при естественной инактивации. Вместе с тем получено еще одно подтверждение высказанному выше предположению о функциональной гетерогенности фибриллярной части ядршка. Об этом говорят результаты сравнения объемов &Ц, ШК и ад-зон после двойного контрастирования ж окраски серебром. 1ри двойном контрастировании ядршка кардиомиоцитов контрольной группы животных средний суммарный обг: ,м ФЦ и ПФК составляет 5К от збъема ядршка. В клетках, окрашенных нитратом серебра, получены близкие значения среднего суммарного объема А§-зон, который состав-

лял 44% от объема ядрышка. При двойном контрастировании сегрегированных ядпышек средний суммарный объем ФЦ составляет^ 9$ от объема ядрышка. Так как в ядрышках кардиомиоцитов, подвергшихся воздействию адриабластина, основная масса Ад-белков сосредоточена в ФЦ, общий объем Ае-зон также понижается,по сравнению с контролем до 9%. Таким образом, нет оснований говорить о функциональной идентичности электроноплотного фибриллярного материала, образующего тело сегрегированных ядрышек, и ПФК.

11.2.6. Ультраструктура и трехмерная организация ядрышек клеток доброкачественных и злокачественных опухолей различных органов человека

II.2.6Л. Опухоли молочной железы

Фиброаденома. При гистологическом анализе парафиновых и полутонких срезов были обнаружены типичные для этой формы опухоли признаки / АЬтей, 1978/. Опухолевые клетки образуют характерные тубуляр-ные структуры. Ба полутонких срезах ядрышки имеют небольшие размеры /в среднем 1,3мкм в диаметре/ и выглядят,как оптически плотные округлые структуры.

• На ультраструктурном уровне ядрышки опухолевых клеток характеризуются высокой электронной плотностью РШ-части, представленной, в основном, фибриллярным компонентом. Ядрышки имеют примембранное расположение и окружены крупными блоками околоядрншково. о хроматина. При анализе серийных'срезов и пространственной реконструкции оказалось, что ядрышки клеток фиброаденома имеют гладкую поверхность. Их максимальный диаметр равен 1,5-2мкм. Количество ФЦ варьирует от 2 до 4; ФЦ хорошо выражены и часто имеют краевое расположение. В этих случаях наблюдается непосредственная связь ФЦ с блоками околоядрышкового кс денсированного хроматина.

Внутриядрншковый хроматин хорошо развит и при трехмерном анализе удается наглядно продемонстрировать его организацию и связь с ФЦ и вакуолярной системой /рис. 4,а,б/. Оказалось, что внутрияд-рышковый хроматин локализованный в каналах вакуолярной системы связывает между собой все ФЦ. В свою очередь, 'тяжи внутри..лрышково-го хроматина обнаруживают структурную непрерывность с околоядрышко-вым хроматином.

Инвазивная протоковая карцинома. При предварительном светооп-тическом анализе опухолевой ткани, были отобраны шесть наиболее

злокачественных вариантов, когда клетки образовывали сплошной пласт 5ез каких-либо признаков тубулярных и протокообразных структур.

На полутонких срезах видны очень плотные,крупные /диаметром до 5мкм/ округлой (¡юрт ядршки, в центральной части которых нередко зидна достаточно хорошо развитая светлая вакуоль. При ультраструк-гурном анализе обращает на себя внимание высокая электронная плот-юсть ядрышек клеток инвазивного протокового рака. На случайных сре-?ах ФЦ хорошо вырежет и часто имеют неправильную форщг. Фибрилляр-¡ьй и гранулярный компонент развиты приблизительно в одинаковой сте-1ени, На поверхности ФЦ образуются "шапочки" ПФК, последние не всегда удается различить на фоне уплотненного тела ядрышка. Еще одним сарактерным признаком ядрышек этой формы опухоли является многочио-юнные микрос ферулы / ВизсЬ, Бирала, 1970; На<Ц1о-оу, 1985/, которые на случайных срезах имеют вид округлых светлых юлостей или удлиненных каналов с постоянной шириной 35-40нм, в центре которых расположены электроноплотные гранулы и тяжи диаметром Ю-ЭОнм. С 1.омощыо стереологического анализа удалось показать, что >лектроносветлая часть микросферул соответствует непрерывному, силь-га извитому каналу вакуг-трной системы, а локализованные в них электроноплотные тяжи внутриядрышкового хроматина структурно связаны с >Ц и околоядршпковым хроматином.

Б целом ядрышки инвазивной протоковой капцинош обладают доста-ючно специфической ультраструктурой и не походят ни на один из опийных в литературе типов /см. классификацию: Зинаид, 1974; Негаап-1ег-Уег<1ш1, 1986; Челидзе, Зацепина, 1988/.

Стереологический анализ показал, что главной отличительной чертой клеток инвазивной протоковой карциномы являются гигантские ФЦ, срайне неправильной формы. В ядрышках содержится либо один сильно )азветвленный ФЦ, либо 2-3 с таким же сложным рельефом /рис. 3,в,г/.

11.2.6.2. Эпидермоидный рак различных органов человека

На гистологическом уровне клетки плоскоклеточного рака в рас -:мотренных органах /кожа, гортань, легкое, язык, пищевод, прямая шиша и шейка матки/ имеют, в основном, веретеновидную форму и обра-¡уют сплошной пласт пли узелки с характерным слоистым расположением слеточных рядов, а иногда и с базальной ориентацией на границе со ;тромой. На полутонких срезах хорошо видно, что ядрышки имеют крайне ^правильную извитую форму.

На ультраструктурном уровне веретеновидные клетки имеют четкие

- ЭЭ -

границы и контактируют друг с другом либо с помощью выростов, либо тесно гоилегая одна к другой. Основными тканеспецифическими признаками являются хорошо выраженные десмосомы и тонофибриллы.

Ядрышки гипертрофированы и при всех локализациях опухоли характеризуются сходной структурной организацией. Они состоят из хорошо выраженных, рыхло лежащих тяжей яуклеолонемы. На объемных моделях /рис. 4,д/ хорошо видно, что нуклеолонема образует непрерывный, сильно извитой тяж, объединяющий все ФЦ. Нуклеолонемяые тяжи, имеющие в трехмерном строении самую причудливую организацию, образуют многочисленные пэтли и выросты, выступающие глубоко в нуклео-плазщ. Гранулярная часть резко редуцирована. Многочисленные хорошо выраженные ФЦ имеют 0,4 - 0,6мкм в диаметре и характеризуются эллиптической формой со сглаженной поверхности. Эта разновидность ядрышек была выделена нами в отдельную группу псевдонук-леолонемных ядрышек.

11.2.6.3. Мелкоклеточный рак легкого

Гистологически опухолевая ткань в исследованных нами случаях мелкоклеточного рака легкого обнаруживает типичное строение /Кра-евский и др., 1982/. На полутонких срезах ядрышки имеют небольшие размеры, округлую или эллиптическую форму и характеризуются высокой оптической плотностью. '

На ультраструктурном уровне опухолевый пласт состоит из клеток с сильно инвагинированными ядрами и высокой степенью конденсации хроматина. Ядрьшки имеют эллиптическую форму, гладкую поверхность и сравнительно небольшие размеры /средний диаметр ~ 2,5мкм/. РШ-часть отличается высокой электронной плотностью и состой"1 преимущественно из фибриллярной части, занимающей центральную область ядрышка, в то время как гранулярный компонент развит слабее и образует периферический слой. Отчетливо видимые ФЦ в количестве 3-4 сосредоточены в центральной части ядрышка /рис. 4,е/. Они имеют сравнительно небольшие размеры /диаметр 0,3 - 0,4мкм/ и овальную форму.

* • *

Проведенный сравнительный ультраструктурный и стереол-гичес-кий анализ ядрышек доброкачественной и злокачественной форм опухолей молочной железы позволил выявить следующие особенности. В отличие от доброкачественной формы опухоли, для ядрышек злокачественной характерны крупные размеры, а также существенно более выраженное

Рис. 4. Структура, количество и распределение ФЦ в опухолевых клетках различных органов человека; а,б - ядрышко фиброаденомы молочной железы с 4 ФЦ; на рис. 4,6 стрелки указывают на вакуоли и локализованный в них внутриядршковый хроматин /выделен черным цветом/; в,г - ядршки инвазивной протоковой карциномы молочной келезн со сложными ФЦ; ядрышко, показанное на рис. 4,в, содержит I сильно "разветвленный" ФЦ /стрелки/; д - два псевдонуклеолонемных ядтлпка в ядре клетки плоскоклеточного рака гортани; ФЦ выделены претпвис-той линией; е - ядрышко мелкоклеточного рака легкого; яо - ядесная оболочка; яш - ядрышко

развитие гранулярного компонента и наличке гигантских сложных ФЦ. Факт усложнения рельефа ФЦ кажется нам наиболее интересным. Такое изменение структуры фибриллярных центров приводит к значительному увеличению их поверхности, что в свою очередь может быть связано с интенсификацией синтеза пре-рРНК. Подобные структурные изменена ФЦ ранее не отмечались и проявляются лишь при стереологическом анализе.

Плоскоклеточный рак независимо от локализации опухоли характеризуется сходной структурой. Причиной слабого развития грануляр ного компонента в ядрышках плоско клеточных карцином, по всей вероятности, является усиленный транспорт прерибосом из ядрышка. По лученные нами результаты позволяют утверждать, что гипертрофирова ные, фибриллярные псевдонуклеолонемные ядрышки являются формой, характерной для эпидермоидных раков.

Одним из существенных отличий двух форм злокачественных опухолей - плоскоклеточного и мелкоклеточного рака легкого является тип ядрышка. Необходимо подчеркнуть различный гистогенез плоскоклеточного и мелкоклеточного рака. Хотя в вопросе о тканевом происхождении мелкоклеточного рака меньше ясности, большинство исследователей считает, что источником новообразований являются клетки эндокринной или ке АПУД систем /Краевский и др., 1982/.

Результаты светооптического и ультраструктурного исследованю ядрышек опухолевых клеток, отличающихся по степени малигнизации и гистогенезу, указывают на то, что данные о структурной эрганизацш ядрышка могут быть использованы в целях дифференциальной диагноси ки новообразований человека.

i

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты стереологического и морфометрического анализа ядрышек клеток различных тканей мыши, крысы, морской свинки и куриного зародыша дают наглядное представление о принципе структурной организации ядрышковых компонентов в семи наиболее распространенна морфофункпрозальных типах. Полученные данные позволили выделить три формы ядрышка - ретикулярные и вакуолизированные ядрышки, а также свободные ФЦ - в самостоятельные типы. Кроме того, помимо основных типов описаны ядрышки переходных форм, например, компакт-но-нуклеолонемные, псевдонуклеолонемные, ядрышки промежуточных групп, характерные для нефроцитов мыши и др. На основании полученного фактического материала и литературных сведений, накопленных

ю данному вопросу за последнее время, наш разработана новая клас-¡ификация /16/. Предлагаемая классификация основана на результатах галичественного и трехмерного анализа структурной организации ядрыш-са, а также учитывает данные о характере распределения Ае -белков, [омимо описанных в работе ядрышек в эту классификацию мы включили :ще две относительно редко встречающиеся формы - ядрышки типа сора - сердцевина и плотные фибр и л -[ярные ядрышки. Тип кора-сердцевина отличается тем, 1то центральную область ядрышка занимает ПФК, а гранулы образуют шпрерывный периферический слой. Плотные фибриллярные ядрышки ха->актеризуются высокой степенью упаковки РНП-фибрилл и большинство 13 них имеет малые размеры /~1мкм в диаметре/.

Принимая во внимание размеры ядрышек, а также степень развития I топографию их основных структурных компонентов, следует различать ювять основных морфологических типов ядрышек: I - компактные, II -1уклеолонемк. ,е, III - ядрышки типа кора-сердцевина, 1У - ретикуляр-ше /трабекулярные/, У - вакуолизированные, У1 - кольцевидные, УИ -зегрегированные, УШ - плотные фибриллярные и IX - свободные ФЦ.' Зкорее всего, описанные в литературе микроядршпш соответствуют иотным фибриллярным ядрышкам и свободным ФЦ /Бирала, ВиасЪ, 1974; Зп^апа, Ыкоузку, 1978/.

Данные о различной функциональной активности указанных морфо-югических типов ядрышек позволяют выделить среди них высокоактив-ше /компактные и нуклеолонемные, а также ядрышки типа кора-сердце-зина/, умеренноактивные /ретикулярные и вакуолизированные/, малоактивные /кольцевидные и сегрегированные/ и неактивные /плотные [шбриллярные ядрышки и свободные ФЦ/ ядрышки.

При обычной функциональной нагрузке, соответствующей физиологическим потребностям определенной популяции клеток, скорости протекания процессов, связанных с биогенезом рибосом, постоянны, поэтому структура ядрышка остается практически неизменной. Изменений соотношения уровней этих процессов, наблюдаемое, например, в ходе .неточного цикла в процессе дифЛеренцировкн при ингибирогании или активации синтеза рРНК, морфологически проявляется в перестройках структуры ядрышка и в переходах одного морфофункцкояального типа в другой. При этом в динамике структу ных переходов при естественной или искусственной активации и инактивации ядрышка четко прослеживается строго определенная этапность перестройки, а также корреляция между структурно.® и количественными характеристиками ядр.'г:-ка. На пис. 5 представлена схед'.а таких структурных переходов. 2а

исходную форму ядрышек приняты нуклеолонемяые ядрышки, которые наиболее распространены и свойственны подавляющему большинству объектов с активно работающими р-генами. При дополнительном усилении транскрипции или /и/ замедлении транспорта рибосом нуклеолонем-ные ядрышки могут гипертрофироваться и трансформироваться в ядрышки компактного типа. Напротив, во время снижения уровня синтеза рРНК происходит обеднение нуклеолонемных ядрышек гранулярным компонентом, уменьшение их размеров и переход в ретикулярные и вакуо-лизированные.' Подобные перестройки структуры ядрышка оказываются обратимыми, так что при повышении уровня синтезам процессинга рРНК ретикулярные и вакуолизированные ядрышки могут вновь трансформироваться в ядрышки,нуклеолонемного типа. На возможность перехода ретикулярных и вакуолизированных ядрышек в н>клеолонемные указывают данные, полученные при исследовании нормально функционирующих и стилулированных к пролиферации гепатоцитов. При сильном торможении синтеза рРНК нуклеолонемные ядрышки существенно обедняются гранулярным компонентом, резко уменьшаются в размерах и уплотняются. В результате образуются кольцевидные, сегрегированные или плотные фибриллярные ядрышки. Полное подавление транскрипции приводит к возникновению свободных ФЦ. Ее вызывает сомнения тот факт, что при определенных условиях указанные изменения могут оказаться обратимыми. Так, в дифференцированных клетках, содержащих кольцевидные ядрышки и свободные ФЦ, образование нуклеолонемных ядрышек можно индуцировать действием фитогемагглютинина или путем их сл яния с активными /опухолевыми/ клетками / 1985/.

Данные, полученные при изучении опухолевых клеток, позволяют заключить, что процесс малигнизавди приводит к существенной перестройке ядрышка, специфичной для каждой патологии. При этом ¿з злокачественных опухолях могут появляться нетипичные, патологические формы ядрышка, заметно г сличающиеся от всех типичных примеров нормальной организации, приведенных в классификации.

1У. ВЫВОДЫ

I. При активации и инактивации ядрышка четко прослежг^ается строго определенная динамика объемной организации ядрышка, а также корреляция между трехмерной организацией и количественными параметрами ядршока. Каждому этапу перестройки соответствует определенный морфо^ункциональный тип ядрышка, характеризующийся конкрет-

Рис. 5. Схема наблюдаемых /сплошные линии/ и предполагаемых /прерывистые линии/ структурных переходов между различными типами ядрышек. I -9 - морйологическиэ типы и их основные промежуточные г?др-мы. I - компактное; 2 - нуклеолонемное ядрышко; 2'- компактно-нук-леолонемное ядрышко; 2 - псевдонуклеолонемное ядрышко; 3 - ядрышко типа кора-сердцевина; 4 и 4'- ретикулярное ядоыико и близкое к нему промежуточное ядрышко второй группы; 5 - вакуолизироЕаннпе ядрышки; 6 и б', 6'; 6"'- кольцевидное яд^-пико и слизкие к нег<7 промехг/точннэ формы первой группы; 7 - сегрёгишванное ядрышко; 8 -"плотное сиб-

риллярн'ое ядрышко; 9 - свободный ФЦ. На схеме не учтены структурные изменения ядрышек при опухолевом росте.

ными количественными параметрами.

2. Активация ядрышка выражается в следующем: а/ усложнении рельефа и фрагментации ФЦ;

б/ прогрессивном росте числа ФЦ и увеличении их суммарных

объемов /размеры индивидуальных ФЦ при этом сокращаются* в/ формировании из дискретных зон ПФК, расположенных на поверхностй Й1,''единого нуклеолонемного тяжа, объединяющего все ФЦ;

г/ нарастании гранулярной части вплоть до ЗОЙ от объема ядрышка; ' "

д/ расширении вакуолярного компоненте до 12% от объема ядрышка в нуклеолонемном и до 45$ - в ретикулярном ядрышк*

3. Топография, трехмерная структура и количественные параметр! Аб-зон и вместе взятых ФЦ и ПФК в процессе активации р-генов совпадают.

4. Перестройки ядрышка при его инактивации развиваются в направлении, обратном таковым,-при активации. При этом уменьшение количества и суммарных объемов ФЦ происходит за счет их агрегации и-потери части Ав-белков. В неактивных ядрышках основная масса Ае -белков сосредоточена в ФЦ.

5. В процессе дифференцировки клеток эритроидного ряда происходит уменьшение числа Ав-положительных ЯОР. Это хорошо коррелирует с прогрессивным уменьшением суммарных объемов как ФЦ, так и

Ав -зон.

6. В проэритробластах суммарный объем ЛОР соответствует обще-ыу ФЦ в интерфазе. В процессе дифференцировки эритроидных юг ток наблюдается прогрессивное уменьшение суммарных объемов как ФЦ, так и Ае-зон.

7. Меаду ФЦ, внутри- и околоядрьшковым хроматином, а также вакуолярным компонентом обнаружена тесная структурная связь. Эти наблюдения позволяют говорить о наличии единой функциональной системы, включающей активный хроматин ФЦ и остальной инактивированный

. хроматин ядрышка.

8. В вакуолизированных ядрышках животных 'клеток проявляются признаки понижения функциональной активности, по сравнению с ретикулярным и нуклеолонемным типами. В трехмерном строении гигантские вакуоли представляют собой полости, сообщающиеся с нуклеоплазмой.

9. Процесс вакуолизации молено рассматривать как универсальное

- 37 - ■ •

вление и реальную стадию в цепи последовательных этапов перестрой-и ядрышка, связанную с его инактивацией.

10. В пределах одного вида животного ядрышки не обнаруживают труктурных признаков тканевой или органной специфичности. В то же ремя,при сравнении клеток гомологичных тканей,выявлены межвидовые азличия структурной организации ядрышек, относящихся к одному типу, оличественные параметры компонентов ядрышка обнаруживают заметную ариабельность при сравнении не только различных тканей и органов иного вида, но и в пределах одного типакпетрк.

11. Ядрышки опухолевых клеток человека характеризуются рядом пецифических свойств, регистрируемых только с помощью стереоана-иза. К таким признакам относится наличие в ядрышках клеток злока-эственних опухолей гигантских ФЦ со сложной поверхностью и сильно азветвлеяной сети узких каналов вакуолярной системы с локализо-анными в них тяжами внутриядршкового хроматина.

12. Морфология нетипичных, патологических форм ядрышка опухо-звых клето: соответствует степени малигнизации и гистогенезу яо-эобразований. Ряд признаков, регистрируемых с помощью нетрудоем-ах методов светооптичесого исследования полутонких срезов и обыч-эй электронномикроскопической техники могут быть использованы в злях дифференциальной диагностики.

СПИСОК ОСНОВНЫХ: РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИЙ

. Челидзе П.В., Туманишвили Г.Д. Ультраструктура кольцевидных ядрышек в гепатоцитах куриных зародышей //Цитология, 1979, т.21, №2, с. I23-I3I. . -

, Челидзе П.В., Джинджолия Ш.Р. Фибриллярные центры и кольцевидные ядрышки в клетках различных тканей П-суточннх куриных зародышей //Цитология, 1981, т.23, Ш!, с. 753-769. . Челидзе П.В., Джинджолия Ш.Р., Туманишвили Г.Д. Ультраструктура кольцевидных ядрышек клеток различных объектов //Мат. У1 Всесоюзного совещания эмбриологов, Москва, 1981. , Челидзе П.В. Фибриллярные центры в ядрышках клеток культуры СПЗВ после действия актиномицином Д //Цитология, 1982, т.24, №2, с. 137-143.

, Туманишвили Г.Д., Челидзе П.В. Ультраструктура и функции кольцевидных ядрышек, фибриллярных центров и ядрышковнх вакуолей //Цитология, 1983, т.25, №, с. 863-882. , Челидзе П.З., Агладзе А.Г., Туманишвили Г.Д. Ультраструктура и

' поведение фибриллярных центров и вакуолярной системы ядрышек клеток 0ПЭЗ и гепатоцитов куриных зародышей при действии ингибиторов. транскрипции //Мат. Всесоюзного симп. "Белки и экспрессия генома", Канев, 1983.

7. Челидзе П.В., Лариони П.К., Агладзе А.Г., Дотнджолия Œ.P. Ультраструктура и поведение ядрышка и фибриллярных центров в процес се дифференцировки эритробластов печени 12-суточных эмбрионов мыши //Цитология, 1984, т.26, Я8, с. 878-885.'

8. Чзлидзе П.В., Туманишвили Г.Д. Ультраструктура и трехмерная организация ядрышка дифференцированных и дифференцирующихся клеток на примере эндотелиоцитов капилляров печени и эритроидных: клеток //Мат. Советско-Финляндского симп. по проблемам биологи развития, Тбилиси, 1984.

9. Челидзе П.В., Пухаева Р.Г., Туманишвили Г.Д. Ультраструктура и трехмерная организация ядрышек дифференцированных клеток //Мат, IX Всесоюзного симп. "Структура и функции клеточного ядра", Пущине, 1984.,

10. Челидзе П.В. Ультраструктура и функции ядрышка интерфазной кле1 ки. - Мецниереба: Тбилиси, 1985, 119 с.

11. Мантейфель В.М., Челидзе П.В. Изменение ¡гонкой-организации неа тивных кольцевидных ядрышек зрелых лимфоцитов крысы на ранних стадиях бласттрансформации.//йолек. биол., 1986, т.-О, Ш, с.

564-572.

12. Челидзе П.В., Зацепина О.В. .Изучение Ае+-белков ядркг-;К дифференцирующихся эритробластов мыши //Мат. X Всесоюзного симп. "Структура и функции клеточного ядра", Черноголовка, 198?.

13. Челидзе П.В., Туманишвили Г.Д., Пухаева р.г., Агладзе А.Г. Тре мерная организация ядрышка и ядрышкообразующих районов не_.роци тов проксимальных канальцев мыши. Морфометрнческий и стереолог ческий анализ //Мат. "сесоюзного симп. "Молекулярные и функвдо нальные механизмы онтогенеза", Харьков, I9S7.

14. Мантейфель В.М., Челидзе П.В., Зеленин A.B. Перестройки ядрыше в стимулированных, к пролиферации гепатоцитах и усиление их трг скрипционной функции //Молек. биол., 1987, т.21, №2, с, 403-41

15. Челидзе П1В., Пухаева Р.Г., Туманишвили Г.Д-„ Трехмернаг орган! зация ядрышка и ядрышкообразунвдх районов дифференцированных клеток. I. Кольцевидные ядрышки эндотелиоцитов, гладкомышечныз клеток и фибробластов мыши //Цитология, 1988, т.ЭО,- №2, с. I3Î 141.

.6. Челидзе П.В., Зацепина 0.В. Морфофункциональная классификация ядрышек //Успехи совр. биол.., 1988, т.105, №2, с. 252-268.

.7. Zatsepina O.V., Ch.elid.ze P.V., Chentsov Yu.S. Changes la the number and volume of fibrillar centres with the inactivation of nucleoli at erythropoiesis //J.Cell Sci,, 1988, v.91, p.4-39-446.

!8. Зацепина O.B., Челидзе П.В., Ченцов Ю.С. Изменение числа и размеров фибриллярных центров при инактивации ядршек в процессе эритропоэза //Онтогенез, 1989, т.20, Ш, с. 40-45.

;9. Челидзе П.В., Мантейфель В.М. Ультрасгруктура и возможная роль вакуолярного кошонента ядрышек гепатоцитов //Цитология, 1989, т.31, Ж, с. 23-28.

0. Chelidze Р.У. The ultrastructure and. three-dimensional organization of human tumor cells nucleoli in vivo and in vitro // Abstracts of 11th Nuclear Workshop, Suzdal, 1989.

:I. Челидзе П.В., Тодрия T.B., Агладзе А.Г., Топурия И.В., Силагад-зе Д.Г., Пирадашвили к.Е. Трехмерная организация ядрышек доброкачественных и злокачественных опухолевых клеток различных органов человека //Цитология.

2. Мантейфель В.М., Ащгэйчук Т.Н., Нару Т.й., Челидзе П.В., Зеленин А.В. Активация транскрипционной функции в лимфоцитах под влиянием облучения Не-Не лазером//Молек. биол.