Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация ядрышек ооцитов морского ежа PARACENTROTUS LIVIDUS.

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация ядрышек ооцитов морского ежа PARACENTROTUS LIVIDUS."

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

ОД На правах рукописи

ЧУДИНОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

УДК 576.315.45:591.465.12

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЯДРЫШЕК ООЦИТОВ МОРСКОГО ЕЖА РА11АСЕ1ЧТКОТШ ЫУГОШ.

03.00.11

эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998 г.

Работа выполнена в секторе электронной микроскопи Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерског (директор- академик РАН В.П.Скулачев) Московског Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

проф. В.Ю. Поляков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Г.И. Кирьянов

кандидат биологических наук, Т.П. Маршак

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии

им. В.А.Энгельгарда, РАН.

■7 •/ / /г ос/

Защита диссертации состоится " Ж ' " ^^ 1998 г. в /о часс на заседании диссертационного совета Д 053.05.68 в Московско Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адрес 119899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГ! Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомится в библиоте! Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "

Ученый секретарь совета Кандидат биологических наук

1998г.

—■—-у

Е.Н.Калистратова

Общая характеристика работы.

Ядрышко представляет собой сложную комплексную структуру, включающую рибосомные гены и продукты их транскрипции на различных стадиях процессинга (Goessens, 1984, Jordan, 1984, Hajiolov, 1985). Интегральной частью ядрышек является ядрышковый организатор - специфический локус ядрышкообразующей хромосомы, содержащий гены рРНК. По-видимому, ДНК ядрышкового организатора присутствует в ядрышке в виде активно транскрибирующейся матрицы и частично репрессированного хроматина, т.к. показано, что в большинстве соматических клеток транскрибируется только около половины рибосомных генов (Hadjiolov, 1985). На этом уровне экспрессии рибосомных генов ДНК ядрышкового организатора формирует в ядрышке специфические дискретные структурные комплексы в состав которых входят фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент. По некоторым данным, транскрипция генов рРНК происходит на поверхности плотного фибриллярного компонента, обращенной к фибриллярному центру, тогда как собственно фибриллярные центры содержат не транскрибируемые в данное время последовательности (Hadjiolov, 1985, Jordan et. al, 1995). Количество и размеры фибриллярных центров зависят от характера дифференцировки клеток и от интенсивности синтеза рибосомной РНК (Goessens, 1984, Челидзе и Зацепина, 1988, Hernandez-Verdun, 1991, Shaw and Jordan, 1995). Показано, что при естественном или экспериментальном ингибировании синтеза рРНК в ядрышках происходит уменьшение количества фибриллярных центров и увеличение их размеров (Goldblatt et. al., 1969, Челидзе и Зацепина, 1988, Зацепина и др., 1989). Обратная картина -увеличение числа фибриллярных центров и уменьшение их размеров - наблюдается при активации транскрипции рРНК (Зацепина и др., 1988). В то же время известны клеточные системы, в которых фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент отсутствуют (Knibiehler et. al, 1982, 1984, Amicura et. al, 1987). К ядрышкам такого типа относятся и ядрышки ооцитов морского ежа P.Iividus (Verney and Moyer, 1967, Millonig et al., 1968). Ядра ооцитов P.Iividus содержат единственное гигантское ядрышко, состоящее из плотной периферической области и центральной области. Структур, соответствующих фибриллярным центрам, плотному фибриллярному компоненту и гранулярному компоненту, в ядрышках ооцитов P. lividus выявить не удается. Биохимическими

методами показано, что для ооцитов P.lividus характерен высокий уровень синтеза рРНК, который в процессе созревания ооцитов увеличивается (Sconzo et. al, 1972, Giudice, 1973). На ранних стадиях эмбриогенеза зарегистрировано полное отсутствие синтеза рРНК, поэтому необычно высокая степень экспрессии рибосомных генов в оогенезе необходима для обеспечения белоксинтезирующей системы дробящихся бластомеров (Barbieri et. al, 1992). Поскольку размер и структура ядрышка находится в тесной корреляции с функциональной нагрузкой (Show and Jordan, 1995), необычное строение ядрышка ооцитов P.lividus может быть связано с сверхпродукцией рибосомных генов. В связи с тем, что ядрышки такого типа изучены недостаточно подробно, цель настоящей работы заключалась в детальном изучении ультраструктуры и гистохимии ядрышек ооцитов P.lividus на последовательных стадиях созревания.

Цели и задачи.

Основная цель данной работы заключалась в изучении преобразований аппарата рибосомного синтеза в условиях "суперпродукции" рРНК. В качестве объекта использовались ядрышки в созревающих ооцитах морского ежа Paracentrotus lividus.

Конкретными задачами работы являлось:

1)анализ ультраструктурной организации ядрышка и динамики его формирования в оогенезе;

2)изучение топологии аргентофильных белков в ядрах, мейотических хромосомах и ядрышках;

3)исследование организации ядрышкообразующего района хромосом в ходе преобразования ядрышка;

4)выявление локализации РНК-содержащих структур в ядрышках;

5)анализ структурной организации ядрышка и его основных компонентов в условиях подавления синтеза рРНК актиномицином

Д-

Научная новизна и практическое значение работы.

Впервые с использованием современных гистохимических методов и методов электронной микроскопии изучена структурная организация ядрышка в условиях суперпродукции рРНК. Методом компьютерной реконструкции определена топология аргентофильных белков ядрышка, участвующих в процессах транскрипции и процессинга рРНК. С использованием светоопти-

ческой и электронно-микроскопической техники (реакция Фёльгена и окраска амином осмия) проведен анализ динамики реорганизации ядрышкообразующих районов хромосом при активации транскрипции рРНК. Методом регрессивной окраски свинцом (Bernhard, 1969) локализованы РНК-содержащие структуры в ядрышках с различной функциональной активностью. Подробно исследована ультраструктурная организация, распределение аргентофильных белков и РНП-продуктов в ядрышках, экструзирующихся из ядер, на заключительных стадиях оогенеза. Изучена реакция основных компонентов ядрышка на ингибирование синтеза рРНК с помощью актиномицина Д. На основании полученных данных предложена динамическая модель ядрышка, находящегося в условиях суперпродукции рРНК.

В ходе работы был модифицирован метод окраски амином осмия, благодаря чему удалось достигнуть более высокой контрастности в селективной окраске ДНК. Предложенная модификация может использоваться в исследованиях по клеточной биологии, биологии развития, онкологии.

Полученные результаты имеют теоретическое значение для расширения и уточнения современных представлений о структурной организации высоко активного мейотического ядрышка.

Апробация диссертации.

Основные результаты работы были представлены на девятой международной конференции, посвященной проблемам биологии развития и клеточной дифференцировки (Италия, 1996), а также на ряде семинаров в НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ и семинаре Университета г. Палермо, Италия.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 127 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, состоящий из 201 источника. Диссертация иллюстрирована 1 таблицей и 44 рисунками.

Материалы и методы исследования.

1. Объект исследования.

В качестве объекта исследования использовали морского ежа Paracentrotus lividus (Средиземное море, Италия).

2. Получение фракции изолированных ооцитов P.lividus.

Для получения фракции изолированных ооцитов использова-

ли метод механической диссоциации гонад. Гонады измельчали скальпелем в небольшом количестве морской воды. Полученные фрагменты ткани и ооциты несколько раз переосаждали в фосфатном буфере (рН8), содержащем 1% сахарозы и 2,5% NaCl и пропускали через капроновый фильтр. Очищенную таким образом суспензию ооцитов фиксировали для световой и электронной микроскопии.

3. Приготовление образцов для электронной микроскопии.

Суспензию ооцитов фиксировали 2%-ным глутаровым альдегидом на 0,1 М фосфатном буфере (рН8) с добавлением 1% сахарозы и 2,5% NaCL 4-12 ч при 4°С. После фиксации клетки дважды промывали в дистиллированной воде. Полученный осадок разделяли на две части. Для регрессивной окраски по методу Бернара (Bernhard, 1969) ооциты обезвоживали в этаноле и заключали в Эпон. Другую часть клеток постфиксировали 1%-ным раствором четырехокиси осмия (от 4 до 10 ч), обезвоживали в этаноле, контрастировали в 1%-ном уранил-ацетате, растворенном в 70%-ном этаноле, и после дальнейшей дегидратации заключали в Эпон. Аналогичным образом фиксировались кусочки гонад. Для анализа ооцитов на последовательных стадиях созревания, клетки различного размера маркировали в световом микроскопе и прицельно резали на ультратоме LKB-III, после чего срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963) и фотографировали в электронном микроскопе HU-11В

4. Приготовление препаратов для световой микроскопии.

Для световой микроскопии полутонкие срезы (0,5-2 мкм) материала, заключенного в Эпон, помещали на предметные стекла и фотографировали в микроскопе "Opton" по методу фазового контраста и в проходящем свете (объективы х40 и х100, окуляр хЮ).

5. Регрессивная окраска свинцом по методу Бернара.

Для регрессивной окраски свинцом по методу Бернара (Bernhard, 1969) ультратонкие срезы помещали в спиртовой 2%-ный раствор уранил-ацетата на 1-4 мин при комнатной температуре или в водный 2%-ный раствор уранил-ацетата на 15-30 мин при 7°С. Затем срезы промывали в дистиллированной воде и обрабатывали 0,2 М раствором ЭДТА в течение 30-60 мин. После промывания и тщательного высушивания срезы докрашивались цитратом свинца в течение 3 мин.

6. Окрашивание азотнокислым серебром по методу выявления ядрышкового организатора.

Осадок очищенной фракции ооцитов фиксировали 2% параформальдегидом в смеси, содержащей 1 часть фосфатного буфера (PBS, ph 7,8) и 4 части фосфатного буфера Зеренсена (0,1N, ph 7,8) с добавлением 1% сахарозы и 2,5% NaCl. Время фиксации -15 мин. Затем клетки промывали дистиллированной водой и постфиксировали смесью, содержащей 3 части метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты 30-40 мин. По окончании фиксации клетки регидратировали в этаноле понижающейся концентрации (100°, 70°, 50°, 30°, 10°) и переводили в дистиллированную воду. Общее время регидратации составляло около 30-40 мин. Окрашивание AgN03 проводили в смеси, содержащей равные объемы следующих растворов: а) 0,5 г AgN03 (Merck) на 1мл дистиллированной воды и б) 1 мг желатина (Merck), растворенного в 1 мл 2% (по объему) муравьиной кислоты (Robert-Fortel et al., 1993). Окрашивание проводили при 60°С до появления темно-коричневого цвета раствора (около 5 мин). Затем клетки промывали в большом объеме холодной (4°С) дистиллированной воды, дегидратировали в этаноле возрастающей концентрации и заключали в Эпон по стандартной методике.

Для световой микроскопии ооциты заключали в Эпон на предметных стеклах и фотографировали в микроскопе "Opton" в проходящем свете. Также фотографировали полутонкие срезы (2-3 мкм) препаратов, заключенных в Эпон.

Для электронной микроскопии клетки различного размера маркировали в световом микроскопе и прицельно резали на ультратоме LKB-III, после чего срезы монтировали на бленды с подложкой из формвара и фотографировали в электронном микроскопе HU-11В.

7. Реконструкция ядрышка.

Реконструкцию ядрышка производили на стадии "большого" ооцита с использованием 17 полутонких серийных срезов, сфотографированных в световом микроскопе, путем их последовательного совмещения.

8. Реконструкция аргентофильного материала ядрышка.

Оптические срезы ядрышка получали на микроскопе "Opton"

в проходящем свете, используя иммерсионный объектив "Планапохромат" хЮО и черно-белую матричную цифровую ПЗС

камеру (World Precision Instruments). Камера устанавливалась таким образом, что размер одного пикселя в изображении составлял 0,070,08 мкм. Последовательные оптические срезы записывали на твердый диск персонального компьютера. Полученные изображения обрабатывали с помощью программного пакета "Adobe Photoshop".

9. Выявление ДНК с помощью реакции Фельгена.

Для реакции Фельгена ооциты фиксировали 4%-ым параформальдегидом на буфере Зеренсена (pH 8,2) с добавлением 1% сахарозы и 2,5% NaCL 1ч. Затем ооциты заливали в Lowycril К4М при t -20°С. Реакцию проводили на полутонких срезах (0,5-2 мкм). Срезы обрабатывали ацетоном в течение 1 мин, гидролизовали в 5н HCl при 37°С в течение 7 мин. Препараты помещали в реактив Шиффа на 30-40 мин, после чего, стекла споласкивали в четырех сменах сернистой воды, промывали в дистиллированной воде и высушивали. Структуры органелл клеток наблюдали с помощью фазового контраста. Фельген-положительные структуры идентифицировали в проходящем свете, а затем сравнивали с фазово-контрастным изображением тех же клеток.

10. Выявление ДНК с помощью реакции с амином осмия.

Амином осмия окрашивали клетки, заключенные в Lowycril К4М, предварительно маркированные в световом микроскопе. С блока последовательно удаляли полутонкие срезы до тех пор пока на поверхности блока не появится ядрышко. Подготовленный таким образом блок помещали в 5N HCL на 7 мин при t 37°С, промывали водой 20 мин. Блок резали на ультратонкие срезы и монтировали их на золотые сеточки. 1%-ый раствор Os-амина насыщали SO2 15 мин. Сеточки окрашивали 1 час при t 37°С в плотно закрытом контейнере. Препараты наблюдали в электронном микроскопе HU-11.

11. Обработка актиномицином Д.

Выделенные ооциты инкубировали в морской воде с добавлением актиномицина Д в концентрации 10мкг/мл в течение 3 часов. Затем клетки промывали несколько раз фосфатным буфером (pH 8,2) и фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом на фосфатном буфере 2 часа. Часть обработанных ооцитов окрашивали азотнокислым серебром (см. п. 3.5), другую заключали в Lowycril К4М при t 60°С.

Результаты.

1. Общая морфология ядрышек ооцитов морского ежа P.Iividus.

Как известно из литературных данных, созревание ооцитов морских ежей сопровождается значительным увеличением объема ооплазмы: чем больше диаметр ооцита, тем он ближе к завершению оогенеза (Millonig et al., 1968, Jondeung and Czihak, 1982). Принимая во внимание размеры клеток, можно выделить три группы ооцитов: "малые", "средние" и "большие" ооциты (таблица 1). Согласно Миллонигу (Millonig et al., 1968) эти группы соответствуют стадиям вторичного оогония, превителлогенеза и вителлогенеза. В оогенезе морских ежей P.Iividus имеет место такое явление как экструзия ядрышка- выход ядрышка из ядра в цитоплазму незадолго до первого редукционного деления, поэтому отдельно рассматривались ооциты с ядрышком, находящимся вне ядра.

Таблица 1. Диаметр клетки, ядра и ядрышка в созревающих ооцитах P.Iividus._

Стадия оогенеза Диаметр клетки (мкм) Диаметр ядра (мкм) Диаметр ядрышка (мкм)

"Малые" ооциты 10-20 7-15 0,5-2

"Средние " ооциты 20-50 15-35 2-6

"Большие" ооциты 50-90 35-45 6-10

Ооциты с ядрышками, находящимися вне ядра 80-90 8-10

На всех стадиях развития ядрышки выделенных ооцитов, так же как ооцитов в интактных гонадах, состоят из двух основных структурных компонентов: плотной периферической области и центральной области. Исследование ультратонких срезов ооцитов на различных стадиях созревания показало, что наиболее "стабильной" по своей ультраструктуре является плотная периферическая область ядрышка. На всех стадиях оогенеза этот компонент содержит плотно упакованные фибриллы и гранулы диаметром около 15 нм. Центральная область претерпевает значительные изменения.

Ядрышко "малых" ооцитов представляет собой плотное экруглое тельце, как правило, вплотную прилегающее к ядерной эболочке. Периферическая область представлена неравномерной по толщине узкой зоной гранулярно-фибриллярного материала. В зо-

не, где сфера утончается, ядрышко контактирует с мейотическими хромосомами. Внутренняя область ядрышка в "малых" ооцитах заполнена рыхло упакованными фибриллами. На срезах центральная область "малых" ооцитов часто имеет неправильную форму (рис. 1, а).

Рис.1. Схема структурной организации ядрышек "малых" (а), "средних" (б) и больших (в) ооцитов РЛмёиэ. Чёрным цветом показан плотный гранулярно-фибриллярный материал, светлосерым рыхлый фибриллярный материал, тёмно-серым цветом обозначены области компактно уложенных фибрилл.

Ядрышко "средних" ооцитов также содержит два основных компонента: плотную периферическую область и центральную область. В периферической области наблюдаются вакуоли низкой плотности. На ультратонких срезах видно, что вакуоли заполнены тонкими фибриллами (3-5 нм). В центральной области наблюдаются островки овальной формы, сформированные плотно упакованным фибриллярным материалом (рис. 1, б).

На более поздних стадиях созревания ооцитов центральная область претерпевает существенные изменения. В ее составе появляются компактные фибриллярные структуры переменной толщины (от 50 до 80 нм). Промежутки между этими структурами заполонены тонкими фибриллами (5-7 нм толщиной). Плотная периферическая область неравномерно утолщена. В некоторых случаях видно как от периферической области в центральную отходит вырост, сформированный плотным гранулярно-фибрил-

О

а

лярным материалом. Если срез проходит в плоскости, перпендикулярной выросту, то в центральной области наблюдается островок из плотного материала.

Для детального анализа пространственного расположения основных компонентов ядрышка была проведена их трехмерная реконструкция. Она показала, что плотная периферическая область представляет собой полую сферу, толщина которой неоднородна; в месте контакта с мейотическими хромосомами она резко утончается. Мелкие вакуоли, расположенные в периферической области, не составляют единую систему, но в некоторых случаях сообщаются с центральной областью (рис. 1, в).

Формированию зрелой яйцеклетки предшествует разрушение ядра "большого" ооцита и выход ядрышка в цитоплазму. На начальных этапах экструзии ядрышко не отличается от нормального по набору и расположению основных структурных компонентов, связь между хромосомами и ядрышком сохраняется. На заключительных стадиях оогенеза ядрышко представлено материалом фибриллярной природы. В зрелой яйцеклетке оформленного ядрышка не содержится .

Для общего представления преобразований структурных компонентов ядрышек в оогенезе необходимо также рассмотреть ядрышки соматических клеток морского ежа. С этой целью изучались клетки кишечника, осуществляющие эндоцитоз, клетки гаструлы и призмы, в которых зарегистрирован синтез рибосомной РНК (Кагавакл, 1967).

В цитоплазме клеток кишечника наблюдается большое количество гранулярного эндоплазматического ретикулума. Ядро неправильной формы содержит округлое ядрышко диаметром около 1 мкм. Ядрышко представлено гранулярно-фибриллярным материалом (гранулы диаметром около 15 нм и фибриллы диаметром 5-7нм). В ядрышках наблюдаются неровности в распределении материала. В толще ядрышка наблюдаются области с более высокой степенью упаковки гранулярно-фибриллярного материала.

Ядрышки, представленные гранулярно-фибриллярным материалом, характерны для гаструлы, тогда как на стадии призмы в ядрышке дифференцируются два структурных компонента: менее плотный кор и более плотный кортекс. Центральная часть представлена рыхло расположенными фибриллами, а перифериче-

екая . - плотно упакованным гранулярно-фибриллярным компонентом.

2. Локализация рибонуклеопротеидов в ядрышках ооцитов Р.1т(1и8.

В "малых" ооцитах после окраски по методу Бернара контрастируются рибосомы в цитоплазме, РНП-гранулы мейотических хромосом и центральная область ядрышка. Центральная область ядрышка "малых" ооцитов имеет неоднородную окраску: выявляются зоны овальной формы (0,1-0,2 мкм) с более интенсивной окраской, чем остальной материал центральной области. Периферическая область ядрышка полностью лишена окраски. Наиболее высокой степенью контраста обладают зоны вытянутой формы, находящиеся на границе центральной и периферической областей. Также окрашиваются фибриллы, плотно прилегающие к периферической области ядрышка со стороны нуклеоплазмы. На больших увеличениях видно, что Бернар-положительный материал в ядрышках "малых" ооцитов представлен в основном фибриллярным материалом.

В "средних" и "больших" ооцитах окрашиваются все структурные компоненты ядрышка, однако характер и интенсивность их окраски различна. Наиболее интенсивно окрашивается центральная область и радиально ориентированные фибриллы, прилегающие к периферической области со стороны нуклеоплазмы. Интенсивно окрашенные тонкие фибриллы наблюдаются и в вакуолях периферической области, сообщающихся с центральной областью. В центральной области РНП- положительные фибриллы формируют извитые тяжи, перемежающиеся материалом, в котором на больших увеличениях различимы слабо окрашенные тонкие фибриллы. Слабо окрашенные редко расположенные гранулы и фибриллы выявляются в периферической области. Основной материал периферической области остается не окрашенным. Подобный характер окраски сохраняется в ядрышках, находящихся вне ядра

3 Локализация ДНК.

На светооптическом уровне с помощью метода Фельгена ДНК выявляется в мейотических хромосомах и ядрышках ооцитов. Характер окрашивания ядрышек не одинаков и зависит от стадии созревания ооцитов.

В "малых" клетках большая часть ядрышек окрашивается по

Фёльгену. В "средних" ооцитах ДНК содержащий материал ядрышка формирует компактный тяж, пронизывающий тело ядрышка. В ядрышках "больших" ооцитов ДНК локализуется в центральной области и часто имеет форму кольца.

Более подробную информацию о распределении и структурной организации ДНК-содержащего материала ядрышек дает метод окраски амином осмия. Общий характер расположения материала, контрастирующегося в ядрах ооцитов амином осмия, строго соответствует распределению Фёльген-положительных компонентов на соответствующих стадиях роста клеток.

В телах мейотических хромосом на всех стадиях созревания ооцитов выявляются электронноплотные фибриллы толщиной 4-8 нм. Плотность упаковки этих фибрилл остается неизменной на всех стадиях оогенеза.

В то же время, ДНК-содержащий материал ядрышек в ходе оогенеза претерпевает значительные изменения в ультраструктуре. В "малых" ооцитах амин осмия контрастирует область ядрышек, располагающуюся на некотором расстоянии от их периферии; центральная зона ядрышка остается неокрашенной (рис. 4, а). Окрашенный материал представлен компактизованными фибриллами толщиной около 5 нм.

В "средних" ооцитах происходит значительная декомпактизация материала ядрышек, контрастирующегося амином осмия. ДНК-содержащий материал в ядрышках "средних" ооцитов представлен хаотично расположенными фибриллами диаметром около 5нм. ДНК-содержащий материал занимает протяжённую область в центре ядрышка.

Значительные изменения происходят с ДНК-содержащим материалом ядрышек в "больших" ооцитах. На ультратонких срезах ДНК-компоненты выявляется в виде многочисленных анастомозирующих кольцевых структурных комплексов, внешний диаметр которых колеблется от 0,2 до 0,6 мкм (рис. 4, б). Каждая кольцевидная структура имеет рыхлую периферическую область, состоящую из тонкофибриллярного материала и электронноплотных дискретных структур диаметром 30-50 нм, сформированные компактно уложенными фибриллами.

4. Локализация аргентофильных белков.

Локализация аргентофильных белков в ооцитах РЛтёив была изучена с помощью светооптической техники на тотальных препа-

ратах, полутонких срезах, на ультратонких срезах в электронном микроскопе. На тотальных препаратах и на полутонких срезах видно, что в ядрышках ооцитов аргентофильный материал локализован в центральной области и в соприкасающихся с ней вакуолях периферической области, периферическая область дает отрицательную реакцию на окраску AgNOз. Сопоставление ооцитов, находящихся на разных стадиях роста показывает, что общий объем зоны, занимаемой аргентофильными белками возрастает по мере роста ядрышка и центральной области. При этом, интенсивность импрегнации центральной области серебром не зависит от размера ядрышек и сохраняется неизменной до того момента, когда в клетках заканчивается профаза мейоза. В этот период разрушается оболочка ядра ооцита и ядрышко выходит в цитоплазму. В экструзированных ядрышках происходит декомпактизация аргентофильного материала; в некоторых случаях наблюдается полное отсутствие окраски серебром.

Кроме центральной области ядрышка, в созревающих ооцитах четко выраженной аргентофилией обладают мейотические хромосомы, на которых аргентофильные белки располагаются в виде дискретных глобул различного диаметра.

На электронно-микроскопических препаратах тонкодисперсные гранулы AgNOз, диаметром около 2,5-5 нм локализованы в центральной области ядрышка, причем характер их расположения различен у ядрышек ооцитов, находящихся на разных стадиях роста. В "малых" ооцитах гранулы (около 4нм в диаметре) образуют аргентофильную зону округлой или неправильной формы с неровными краями в центральной области ядрышка. Аргентофильный материал может иметь вид кольцевидного тяжа, занимающих периферию центральной области. В "средних", "больших" и в ооцитах с экструзированным ядрышком аргентофильный материал формирует анастомозирующие тяжи.

Информацию о пространственном расположении аргентофильных белков в центральной области ядрышка дают оптические срезы, полученные с помощью матричной цифровой ПЗС камеры. Изображение строилось таким образом, чтобы границы выделяемого объекта проходили между пикселями с максимальной разницей в интенсивности, что позволяет выявить зоны с высокой плотностью аргентофильного материала. Использование оптических сечений ядрышка с последующей рекон-

струкцией позволило показать, что аргентофильный материал располагается в центральной области не гомогенно, а в виде кластеров различного размера. Число и размеры кластеров возрастают по мере созревания ооцитов, в ооцитах ранних стадий развития наблюдается 1-2 кластера, а в ооцитах поздних стадий 5-6. Реконструкция ядрышек показала, что основная часть аргентофильного материала в ядрышках "средних" ооцитов имеет форму изогнутого тяжа (рис. 2, а), а в "больших" ооцитах кластеры аргентофильных белков анастомозируют в единую протяженную систему, которая занимает периферию центральной полости (рис. 2, б).

Рис. 2. Плоскостная реконструкция оптических сечений аргентофильного материала ядрышек "среднего" (а) и "большого" (б) ооцита.

Азотнокислым серебром окрашивались ядрышки клеток гаструлы и призмы, для которых показано высокая степень транскрипции рибосомных генов (Кагазакл, 1967). В ядрышках гаструлы на ультраструктурном уровне выявляется несколько округлых зон с аргентофильными гранулами. В ядрышках призмы аргентофильный материал занимает центральную часть ядрышка.

5. Влияние актиномицина Д на структуру ядрышек ооцитов Р.1шс1и8.

В "малых" ооцитах под влиянием актиномицина Д элементы плотной периферической области и центральной области сегрегируют и формируют две компактные зоны, одна из них сформирована плотно упакованным фибриллами, другая рыхло расположенными фибриллами (рис. 3, а).

В ядрышках "средних" ооцитов на ультраструктурном уровне центральная область и плотная периферическая область различаются по степени плотности фибриллярного материала. Вместе с тем в центральной области ядрышек наблюдаются полости, заполненные редко расположенными фибриллами (рис. 3, б). Каждая полость окружена ободком из плотно упакованных фибрилл. В центральной области также имеются тяжи из плотно упакованного фибриллярного материала.

Рис. 3. Схема структурной организации ядрышек "малых" (а), "средних" (б) и "больших" (в) ооцитов РЛмёш, обработанных актиномицином Д. Черным цветом показан плотный фибриллярный материал, серым - рыхлый фибриллярный материал, белым - полости центральной области.

Существенные изменения в структуре ядрышка наблюдаются в обработанных актиномицином Д "больших" ооцитах. Плотная периферическая область теряет свою целостность и приобретает вид полумесяца (рис. 3, в). Материал периферической области отличает-

ся от периферической области ядрышек интактных "больших" ооцитов полным отсутствием гранул и представлен плотно упакованными фибриллами. Центральная область заполнена рыхло расположенными фибриллами, плотнофибриллярных тяжей, характерных для ядрышек "больших" необработанных ооцитов, не наблюдается. В месте соприкосновения содержимого центральной области с нуклеоплазмой фибриллы ядрышка формируют пограничный слой, отличающийся от остальных фибрилл ориентацией по окружности. Как правило, с содержимым центральной области соприкасаются мейотические хромосомы. В ооцитах с ядрышком, находящимся вне ядра, плотная периферическая область занимает большую часть объема ядрышка и имеет вид полумесяца.

В ядрышках ооцитов, обработанных актиномицином Д, аргентофильные белки выявляются. Однако под воздействием актиномицина Д распределение аргентофильных белков меняется. В ооцитах ранних стадии развития аргентофильные гранулы располагаются в центральной области ядрышка, но по сравнению с необработанными клетками тех же стадий, аргентофильные гранулы распределяются неравномерно по объему центральной области. Наибольшее число гранул наблюдается на границе центральной и периферической областей.

У ооцитов более поздних стадий неравномерность распределения аргентофильных гранул выражена значительно сильнее. Аргентофильные гранулы плотнее расположены в месте соприкосновения центральной области с нуклеоплазмой. В крайнем варианте практически все гранулы концентрируются на границе центральной области и нуклеоплазмы.

Обсуждение результатов.

В большинстве активных ядрышек соматических клеток различают фибриллярные центры, плотный фибриллярный компонент, гранулярный компонент (Goessens, 1984, Jordan, 1984, Hernandez-Verdun, 1991, Show and Jordan, 1995). Считается, что в фибриллярных центрах расположена неактивная в отношении транскрипции рДНК и некоторые белки, специфически ассоциированные с рДНК, плотный фибриллярный компонент представляет новосинтезированные РНК-транскрипты, а гранулярный компонент - предрибосомные частицы различной степени зрелости; синтез рибосомной РНК происходит на границе фибриллярного центра и плотного фибриллярного компонента

(Mosgoler et al., 1993, Hozak et al., 1994, Junera et al., 1995, Show and Jordan, 1995). При активации метаболизма клетки увеличивается количество цистронов, принимающих участие в транскрипции рРНК, вследствие чего уменьшается размер индивидуального фибриллярного центра. В то же время описаны ядрышки в которых фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент отсутствуют (Knibiehler et al., 1982, 1984, Amicura et al., 1987, Scheer et al., 1997). Ядрышки такого типа наблюдаются и в ооцитах P.lividus. Одна из версий, объясняющих отсутствие стандартного набора компонентов ядрышка, была предложена для ооцитов саранчи. Высокая интенсивность синтеза рРНК, необходимая для оогенеза саранчи, по-видимому, достигается за счет активации большинства рибосомных генов (Scheer, 1997), в результате чего фибриллярные центры, содержащие не транскрибируемые рибосомные гены, исчезают. Возможно, в ооцитах P.lividus имеет место аналогичный механизм усиления рибосомного синтеза. Такое предположение можно сделать на основании анализа пространственных и конформационных преобразований ДНК-содержащих структур ядрышка в оогенезе P.lividus. На начальных этапах развития ядрышковый хроматин находится в конденсированном состоянии. По мере созревания ооцитов происходит постепенная декомпактизация внутриядрышкового хроматина. Преобразования ДНК-содержащих структур коррелируют с ранее полученными данными об увеличении интенсивности синтеза рРНК в оогенезе P.lividus (Sconzo et al., 1972) и, по-видимому, отражают процессы активации рибосомных генов. Перестройка внутриядрышкового хроматина, приводящая к появлению сетеобразно расположенных ДНК-фибрилл, описана в стимулированных к росту гепатоцитах, в которых происходит резкое усиление рибосомного синтеза (Derenzini, 1983).

Известно, что в структурно-функциональной организации ядрышка важную роль играет семейство белков, которые при определенных условиях приобретают сродство к ионам серебра -так называемые аргентофильные белки ядрышек. Показано, что аргентофильные белки локализуются в фибриллярных центрах и плотном фибриллярном компоненте ядрышек соматических клеток (Hernandez-Verdun, 1991). Полученные в настоящей работе данные показывают что, во-первых, аргентофильные белки локализуются в центральной области ядрышек на всех стадиях роста ооцитов и, во-

вторых, количество аргентофильных белков возрастает пропорционально увеличению объема центральной области. Как показала регрессивная окраска свинцом, в центральной области локализуется фибриллярный материал, содержащий РНК. Наличие в центральной области ДНК-содержащих структур, аргентофильных белков и РНП-фибрилл свидетельствуют о том, что транскрипция, так же как начальные этапы процессинга, осуществляются именно в центральной области ядрышка. Отсутствие аргентофилии в экструзированных ядрышках на заключительных стадиях оогенеза, когда транскрипция рибосомных генов прекращается, и значительное уменьшение аргентофильности центральной области при искусственном ингибировании синтеза рРНК служат дополнительным подтверждением этого предположения.

В современной литературе принято считать, что биосинтез рибосом является "векторным" процессом, который начинается в ДНК-содержащей фибриллярной области ядрышка и продолжается в его гранулярном компоненте (Show and Jordan, 1995). В случае ооцитов P. lividus зоной процессинга и формирования предрибосомных частиц можно считать периферическую область ядрышка. В пользу этого предположения имеются следующие данные, показывающие общие свойства периферической области ядрышек ооцитов и гранулярного компонента ядрышек соматических клеток животных и растительных объектов: (1) в периферической области обнаруживаются РНП-частицы диаметром около 15 нм, соответствующие предшественникам рибосом; (2) периферическая область не содержит аргентофильных белков, которые, как известно, не принимают участие в поздних этапах процессинга РНК и не обнаруживаются в гранулярном компоненте "стандартных" ядрышек; (3) при созревании ооцитов наблюдается пропорциональный рост как центральной области, где осуществляется транскрипция рРНК, так и периферической области. Не окрашиваемый методом регрессивной окраски материал периферической области представлен, по-видимому, белковым компонентом, функции которого могут заключаться в обеспечении высокого уровня скорости процессинга и транспорта рРНК.

Усиление транскрипционной активности в оогенезе P.lividus (Sconzo et al., 1972) коррелирует не только с увеличением количества аргентофильных белков и конформационными пере-

стройками ДНК-содержащего материала, но и с появлением в центральной области извитых тяжей фибриллярной природы. Ретикулярная организация характерна для ядрышек с высокой активностью как соматических клеток (Show and Jordan, 1995), так и ооцитов многих организмов (Mirre and Stahl, 1981, Antoine et. all., 1987, Shah et al., 1996). Однако, в отличии от выше указанных примеров, центральная область ядрышек ооцитов P.lividus практически не содержит гранул. Можно предположить, что в связи с высокой интенсивностью синтеза, транскрипты рРНК не формируют РНП-комплексов и, поэтому, не визуализируются на ультратонких срезах.

[Г Г] Заключительные этапы процесс и ига

Рис. 4. Схема организации ядрышек "малых" (а) и "больших" (б) ооцитов

Ультраструктурное и гистохимическое изучение ядрышек в созревающих ооцитах P.lividus и сопоставление наших результатов

а

11еактивная ДНК Область транскрипции рДНК

Начальные этапы процессипга рРНК

с описанием структурно-функциональной организации ядрышек соматических и репродуктивных клеток других организмов позволяет заключить, что аналогия между структурами ядрышек соматических клеток и ядрышек ооцитов Р..1тс1из отсутствует. В ядрышках ооцитов РЛмсЫв можно выделить следующие компоненты (рис. 4, а, б):

1)районы ядрышкового организатора хромосом;

2)центральную область, содержащую аргентофильные белки, участвующие в синтезе и начальных этапах процессинга рРНК и новосинтезированные РНК-продукты;

3)перифериче'скую область, в которой осуществляются поздние этапы созревания предшественников рибосом, и, вероятно, содержащую белковый матрикс;

4)мелкие вакуоли, входящие в состав периферической области, и, по-видимому, не несущие функциональной нагрузки.

Выводы.

1. Ядрышки ооцитов РЛтёиэ состоят из двух структурно и пространственно обособленных компонентов: плотной гранулярно-фибриллярной периферической области и менее плотной фибриллярной центральной области. Динамика структурных преобразований ядрышка, обусловленная активацией транскрипции, выражается в увеличении размеров перечисленных компонентов, в формировании ретикулярной организации центральной области, в возникновении вакуолей с редко расположенными фибриллами в периферической области.

2. По мере созревания ооцитов происходит декомпактизация внутриядрышкового хроматина. Характер конформационных изменений свидетельствует о том, что на заключительных стадиях оогенеза в транскрипции рРНК принимает участие большинство рибосомных генов.

3. Аргентофильные белки локализуются в центральной области ядрышка. Отсутствие аргентофильных белков в других компартментах свидетельствует о том, что транскрипция рРНК и начальные этапы процессинга осуществляются в центральной эбласти ядрышка.

4. С помощью компьютерной реконструкции последовательных оптических сечений показано, что 1ргентофильные белки располагаются в виде кластеров, количество <оторых возрастает по мере созревания ооцитов.

5. Регрессивная окраска свинцом по методу Бернара показала наличие фибриллярных форм РНП в центральной области ядрышка; в периферической области выявляются как РНП-гранулы, так и РНП-фибриллы. По мере созревания ооцитов количество положительно окрашенного материала увеличивается.

6. Реакция ядрышек на ингибирование синтеза рРНК с помощью актиномицина Д подтверждает предположение о том, что центральная область ядрышек является локусом транскрипции ядрышкообразующего района хромосом.

7. На основании полученных данных предложена динамическая модель структурной организации аппарата синтеза рибосом в условиях суперпродукции рРНК: транскрипция и начальные этапы процессинга рибосомных генов осуществляется в центральной области, поздние этапы процессинга осуществляются в периферической области.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Чудинова Е.М., Зацепина О.В., Фаис Д., Джудиче Д., Поляков В.Ю. Структурные и цитохимические особенности ядрышек в созревающих ооцитах морского ежа Paracentrotus lividus. Цитология, 1996, том 38, № 11, стр. 1145-1151.

2. Chudinova Е., Polyakov V., Fais D., Zatsepina О., Oliva A., Vorobiev I., Kireyev I., Caschino D., Giudice D. Localization of Ag-NOR proteins in giant nucleolus of sea urchin Paracentrotus oocytes. 9th International Conference of the ISD, Italy, 1996, p. 102.

3. Чудинова E.M., Зацепина О.В., Фаис Д., Джудиче Д., Поляков В.Ю. Локализация ДНК, РНК и аргентофильных белков в гигантских ядрышках ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Цитология, 1997, том 39, № 1, стр. 118.

4. Чудинова Е.М., Зацепина О.В., Воробьев И.А., Фаис Д., Киреев И.И., Джудиче Д., Поляков В.Ю. Локализация аргентофильных белков в ядрышках ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Цитология, 1998, том 40, №. 4, стр. 302-307.

5. Чудинова Е.М., Зацепина О.В., Фаис Д., Джудичи Д., Поляков В.Ю. Локализация ДНК в ядрышках созревающих ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Биол. Мембраны. 1998, в печати.