Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства аденилатциклазной системы ооцитов морских звезд и ежей

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Свойства аденилатциклазной системы ооцитов морских звезд и ежей"

Институт биологии моря Дальневосточного отделения РАН

ЛАМАШ Нина Евгеньевна

СВОЙСТВА АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИСТЕМЫ ООЦИТОВ МОРСКИХ ЗВЕЗД И ЕЖЕЙ

Специальность 03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 1993

Работа выполнена в лаборатория цитофиоиологии и фармакологии Института биологии мора ДВО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ю.С. Хотимченко

*

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук A.A. Максимович

кандидат биологических наук П.М. Жадан

Ведущее научно-исследовательское учреждение:

Институт эволюционной фшзиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, С.-Петербург.

Защита диссертации состоится У £ " ¿с. ¿^ 1Я94 г. часов на (заседании Специализированного совета К 003.66.02. при Институте биологии морд ДВО РАН по адресу: 690041 г. Владивосток, Пальчевского 17, Институт биологии моря. . -

С диссертацией можно оонакомиться в Центральной библиотеке ДВО РАН.

Ученый секретарь Совета

кандидат биологических наук С.М. Гнеодидова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Расшифровка механизмов действия биологически активных веществ на клетки-мишени ведет к пониманию закономерностей регуляции клеточной активности и позволяет осуществлять направленный контроль процессов жизнедеятельности. Проблема функционирования внутриклеточных регуллторных систем связана с решением таких фундаментальных проблем биологии развития как созревание реагирующих систем распивающихся организмов, приобретение ими способности специфически отвечать на воздействие индуктора. В конечном итоге, именно на клеточном уровне реализуются все регуляторные воздействия, обеспечивающие развитие органиома, его существование как единой системы, гомеостао и адаптацию к изменяющимся условиям внешней среды (Турпаев, Манухин, 1981).

Данная проблема прямо сшгоана и с таким важным вопросом естествознания как формирование и развитие половых клеток. Нервная система окапывает регуля'горное действие на гаметогенео морских беспозвоночных с помощью химических передатчиков - медиаторов и гормонов (Walkei, 1984.; Paiisi et al., 1987; Smiley, 1990). Достаточно обширный фактический материал доказывает участие биогенных моноаминов, медиаторов моноаыинергической системы, в регуляции роста и созревания гамет морских беспозвоночных. Исследования в этой области ведутся по таким направлениям как идентификация биогенных моноаминов в нервной ткани (Cottieli, Pentieath, 1970; Pentreatb, 1972; Huet, Franquinet, 1981; Хотимчемо, 1989); изучение сезонной динамики уровня этих веществ в ДНС и половых жешзах (Хотимченко, Деридович, 1988); выяснение роли биогенных моноамннов в регуляции обмена веществ в гонадах (Khotimchenko, 1982), стимуляции вымета половых клеток (Iwata, 1976; Matsutam, Namura, 1982). Молекулярные механизмы действия медиаторов моноаминергичесхой системы на половые клетки поучены крайне слабо. Лишь экспериментальные исследования, посвященные влиянию ка-техоламинов и: индолилалкиламинов на активность аденилатциклазы

оодитов и орелых яитт иглокожих, позволяют предположить участие аде-,нилатциклазной системы в проведении регупяторного сигнала, индуцированного биогенными моноаминами (Renaud et al., 1983; Shenker et al., 1985; Parisi et al., 1987; Хотшгченю, 1989). В смой с этим возникают следующие вопросы. Какие рецепторы опосредуют действие биогенных моноаминов? Каким обраоом эти рецепторы взаимодействуют с адени-латциклаоой? Каковы свойства и особенности регуляции аденилатци-клааы в половых клетках? Как поменяется функциональная активность аденилатциклазы в период внутригонадного оогенеоа? Ответы на эти вопросы особенно необходимы в смок с открытием донервных нейро-трансмлттеров и рецепторных образований как внутри ооцитов, так и на поверхностной мембране (Буоников, 1987; Kusano et al., 1978, 1982; Miledi, 1980; Eusebi et al., 1984). В этом отношении ооциты иглокожих представляют удобную модель для изучения функционального соотношения внутриклеточных и расположенных на клеточной поверхности трансмиттерных рецепторов, а также для исследования взаимодействия отек'рецепторов с внутриклеточными регуляторными системами. Уникальность этой модели заключается и в том, что исследования можно проводить каж на живых клетках, так и на мембранных препаратах.

Цель и оадачд работы. Цель работы состояла в изучении структуры и механизма действия аденилатцмлаоной системы-ооцитов иглокожих. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Методами световой цитохимии и электронной гистохимии исследовать локализацию аденилатцикпаяы в гонадах иглокожих.

2. Изучить свойства и особенности регуляции активности аденилатциклазы. Сравнить полученные результаты с литературными данными.

3. Выявить и идентифицировать клеточные рецепторы, связанные с аденилатциклаоой.

4. Провести исследования функциональной активности аденипатци-кдаоной системы в период роста ооцитов и в раннем эмбриогенезе.

Научная новизна. Впервые проведены детальные исследования свойств

аденилатцикпаоы ооцитов иглокожих. Показано, что аденипатциклахза входит в состав мембранного комплекса, включающего, кроме фермента, рецепторную и регуляторную субъединицы.

Установлено, что основные свойства аденилатцииаоного комплекса ооцитов амурской овеоды, такие как: кинетические константы воаимо-действия фермента с субстратом; способность активироваться ионами магния, марганца, фтора, гуаниловыми нуклеотидами и биогенными моно-аминамисхожи со свойствами одноименного комплекса соматических клеток других животных организмов. Особенность регуляции аденилат-циклаоы ооцитов ¡заключается в том, что рецепторная субъединица представлена рецепторами двух типов - дофаминовыми и адренергическими, свяоанными с ферментом черео стимулирующий -белок.

Впервые идентифицированы адренорецепторы в ооцитах амурской овеоды. Радиолигандный аналио покаоал, что оти рецепторы относятся к /3-типу. Показано, что по мере роста ооцитов активность аденилатци-клаоы снижается. Это свяоано с уменьшением количества фермента в мембране и изменением механшма регуляции его активности, что выражается в "исчезновении" рецепторов к биогенным моноаминам, свяоан-ных с С3-белком.

Теоретическое и практическое аначение. Совокупность полученных в работе данных дает детальную картину функционирования аденилатцииаоного комплекса в ооцитах иглокожих - важнейшей системы регуляции клеточной активности. Это расширяет представления о механизмах действия медиаторов моноаминергической системы на формирование и развитие половых клеток. Исследование особенностей регуляции активности аденилатцихлааы в оогенеое вносит определенный вклад в понимание эволюционных процессов становления гормональных регупятор-ных систем.

Иовестно, что адеиилатцикпаяная система половых и соматических клеток имеет больше сходств, чем раоличий. В смой с этим, ооциты иглокожих являются наиболее вероятным претендентом на роль модельного объекта для исследований действия многих биологически активных

веществ и биопрепаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Советско-финском симпозиуме по биологии развития "Сигнальные молекулы и клеточная дифференцировка" (Суздаль, 1991), на Международной конференции "Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий" (Санкт-Петербург, 1992), на 8 Международной конференции по иглокожим (Дижон, Франция, 1993), на ежегодных отчетных сессиях ИБМ (1992, 1993).

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура д объем диссертация. Работа состоит ио введения, 6 глав, выводов; список литературы включает 190 источников, в том числе 166 иностранных. Диссертация положена на 135 стр. и включает 3 таблицы, 28 рисунков (трафики, схемы, микрофотографии).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на иглокожих, обитающих в проливе Старка (зал. Петра Великого, Японское море),- двух видах морских ежей Strongy-locentrotus intermedius (серый еж), S. audus (черный еж),- и двух видах морских овеод - Asterias amurensis (амурская овеода), Aplielasterias japónica (афеластерия японская). Животных собирали с помощью легководо-лаоной техники и либо сразу обрабатывали, либо помещали в аквариумы с аэрируемой проточной морской водой, где они находились до опытов.

Для гистологических исследований материал фиксировали в жидкости Буона и заключали в парафин по общепринятым методикам. Среоы толщиной 3-5 мкм, приготовленные на санном микротоме, окрашивали гематоксилином Эрлиха.

Модифицированным для светооптической микроскопии способом исследовали яокалиоацию аденилатцихлаоы в ооцитах. Для получения оо-цитов, женские гонады извлекали из лучей половозрелых морских овеод, промывали в искусственной ледяной бескальцевой морской воде и быстро раореоали на мелкие кусочки. Суспензию ооцитов фильтровали че-рео тонкий гас и отмывали от фолликулярных клеток в этой же воде

трехкратным нереосаждением с помощью ручной центрифуги в течение 2-3 мин. Зрелые яйца морского ежа получали методом описанным Г.А.Буониковым (1975).

Для выявления локализации аденилатциклаоы клетки фиксировали 2,5% глутаральдегидом на 0,1 М Трис-малеатном буфере, содержащем 4,5% глюкооы, pH 7,4, в течение 30 мин. Промывали тем же буфером, содержащем 8% глюкозы, 2 раса по 10 мин п помещали на 90 мин в инкубационную среду: 0,88 М Трис-малеатного буфера, pH 7,4; 0,5 аденшшли-мидодифосфата; 8% глюкозы; 2 мМ теофиллина; 4 мМ MgSO4 . В конце инкубации добавляли 2,4 мМ Pb[NO^)2 и выдерживали материал в течение 4 ч при комнатной температуре. Промывали дистилированной водой, обрабатывали 1% уксусной кислотой 1 мин. Для перевода неокрашенного пирофосфата свинца в темноокрашенный продукт материал 5 мин обрабатывали 0,5% раствором Na2S, оаключали в глицерин-желатину; Контрольные обраоцы инкубировали в среде бео субстрата. Количественное определение активности аденилатциклаоы проиоводила на цитофо-тометре "Vilsers". Использовали маску A4, ,\ = 550 нм.

Электронно-цитохимическим методом (Culter, 1983; Zajic, Schacht, 1983) исследовали покалтзацию аденилатциклаоы в клетках гонад. Кусочки тканей префшхпровали в 1% растворе глутаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере в течение часа при 0°С, отмывали и помещали на 30 мин при 20°С в инкубационную среду: 100 мМ Т^ис-малеатпого буфера, 5 мМ МдС12, 5 мМ SrCl2, 0,5 мМ 5-аденилллимидодифосфат, 5 мМ теофиллина, 207 мМ NaCl и 10% декстрозы; осмотичность среды 1200 mOsM; pH 8,6. Для проявления стронциевого преципитата испольоовали 2% раствор Pb{NO^)2* После ополаскивания, фиксации и дегидратации материал «заключали в Эпон 812. Контрольные обраоцы инкубировали в среде бео субстрата й в среде с субстратом, к которой добавляли 10 мМ фторида натрия, либо нагревали инкубационную среду до 60"С для инактивации фермента.

Локализацию адренорецепторов в ооцитах изучали методом радиоавтографии. Клетки инкубировали в искусственной морской воде, содержащей 10_еМ меченого [3Н]-дигидроальпренолола (L-Dichydroalprenolol-1-

propil-2,3-3H, удельная активность 2,005 ТБк/ммоль, "Izinta"). Черео 90 мпн ооциты осаждали с помощью ручной центрифуги и после двухкратной отмывки охлажденной искусственной морской водой фиксировали в 3% растворе гяутаральдегида на морской воде. Парафиновые среоы толщиной 5 мкм покрывали фотоэмульсией марки "М", время экспозиции составляло 45 суток. После проявления среоы окрашивали гематоксилин-эооином.

Для идентификации адренорецеиторов испольоовали метод радиоли-гандного анадиоа. Суспеноию ооцитов инкубировали в искусственен морской воде с добавлением определенного количества меченого [3Н]-дигидро-альпренолола в присутствии или отсутствии агонпстов или антагонистов различных рецепторов. Общий объем пробы составлял 1 мл. Реакционную смесь инкубировали 30 мин при 15°С и пропускали черео GF/C фильтр. Фильтры промывали и после высушивания помещали в виалы, оаливали 5 мл сцинцилляционной жидкости марки Ж-8, .черео 2-3 ч подсчитывали радиактявность с помощью "SL-4221" (Франция). Неспецифическое связывание определяли при добавлении в среду инкубации 10-4М немеченого пропранолола. Для определения специфического свяоываншг ио среднего еначения общего вычитали неспецифичесхое свявыванне.

Активность аденплатциклаоы определяли в мембранных препаратах ооцитов морских овеод и гомогенатах яиц и ранних эмбрионов морского ежа модифицированным методом Ткачука и Балденкова (1978). Мембранную фракцию ооцитов морских овеод получали методом Doree (1978). Яйца и оародышей морскою ежа S.intexmedius гомогенжшро-вали не более двух мин в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 7,4, содержащем 2 мМ ЭДТА. Количество цАМФ определяли методом Джильмана (Gilman, 1970) с помощью набора реактивов "Cyclic АМР assay Kit" фирмы Amer-sham (Англия).

Концентрацию белка в образцах определяли методом Gieenbeig и Jaddock (1982) с помощью БФ-реактива.

Экспериментальные методы. Для изучения свойств аденилатциклаз-ной системы в раннем эмбриогенеое морского ежа животных собирали в сеоон раомножения. Получение половых продуктов, оплодотворение и

е

рапвитие оародышей проводили по методике Г.А. Бутэникова (1975). Эксперименты по изучению влияния биогенных моноаминов на сооревание ооцитов морских овеод выполняли в период нереста. Для индукции сооревания применяли арахидоновую кислоту в конечной концентрации 5 • 10~5М. В опытах с ооцитами испольоовали только тех животных, у которых процент индуцированного созревания составлял не менее 98%. Выделенные ооцпты инкубировали при 20"С в искусственной морской воде (10%-ная суспеноия объемом 1 мл) в трех вариантах опытов: без добавок (для определения процента спонтанного сооревания), с добавлением арахидоновой кислоты (дм определения процента индуцированного сооревания), с. добавлением арахидоновой кислоты после 20 мин преин-кубации ооцитов с различными концентрациями препаратов. Исходные растворы адреналина, норадреналина, дофамина были приготовлены на искусственной морской воде. Процент сооревания определили черео 30 мин после начала инкубации по числу ооцитов с растворенным зародышевым пузырьком из расчета на 100 клеток.

Для работы исполъоовались следующие препараты : дофамин гидрохлорид ("Fluka"), норадреналин битартрат, адреналин ("Serva"), арахи-доновая кислота, выделенная ио бычьей печени (Лаборатория сравнительной биохимии Института биологии моря).

Данные обрабатывали методами вариационной статистики. Различия между средними величинами считали достоверными при Р < 0,05.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА В ООЦЕТАХ МОРСКОЙ ЗВЕЗДЫ И МОРСКОГО ЕЖА

Локадпоация аденилатциклавы. Зерна осадка цитохимической реакции, выявляющие локализацию фермента, располагаются над поверхностью ооцитов в виде ^дельных олектрошю-гоютных гранул. По мере роста и сооревания реакция на аденилатциклаоу уменьшается и в зрелых яйцах морских ежей она практически отсутствует.

В гонадах амурской овеоды электронно-плотные оерна осадка видны на плаомалемме клеток целомического эпителия (особенно на микроворсинках и жгутиках) и гладких мышечных клетках стенки гонады. В оо-дитах гранулы обнаруживаются в толще плазматической мембраны. Во внутриклеточных структурах аденилатциклаоа отсутствует.

Таким образом, ооциты исследованных видов иглокожих проявляют аденилатцикдаоную активность. Плаоматическая мембрана является основной и единственной структурой, содержащей фермент. По мере роста и дифференциации ооцятов происходит уменьшение интенсивности реакции на аденилатциклаэу, и она становится минимальной в закончивших рост ооцитах.

Каталитические свойства аденияатциклазы. Баоальная активность аденилатциклаоы мембран ооцитов амурской овеоды составляет в среднем 8-12 пмоль цАМФ/мг белка/10 мин, а в некоторых случаях - до 24 ед. Скорость реакции зависит от времени ее протекания и концентрации мембранного белка. При оптимальных условиях (концентрация белка - 50-70 мкг в пробе; время инкубации - 20 мин) насыщение фермента субстратом происходит при концентрации АТФ 2,2 мМ (рис.1), Кто=0,45 мМ, Ктаа1=25 пмоль цАМФ/мг белка/10 мин.

Необходимым условием для проявления активности аденилатциклаоы является присутствие в среде инкубации одного из ионов: либо магния, либо марганца. Эти ионы, вероятно, формируют комплекс с АТФ, который и является субстратом ферментативной реакции. При насыщающих концентрациях (2,5 мМ для МдС12 и 5 мМ для MnCh ) активность аденилатциклаоы в экспериментах, когда субстратом реакции служит комплекс ЛГп2+-АТФ, составмет 159 пмоль цАМФ/мг белка/10 мин, а в экспериментах с Мдг+-АТФ - лишь 18 ед. Следовательно, увеличение концентрации ионов магния и марганца до насыщающих концентраций вызывает однонаправленный (стимулирующий), но отличающийся по силе действия эффект. Форсколин - активатор аденилатциклаоы соматических кпеток - усиливает каталитическую активность фермента ооцитов в 7 pao.

Регуляция аденилатциклаоы G-белками. Для выявления взаимодействия аденилатциклаоы с G-белками в качестве функциональных оондов

1/8

Рис. 1: Зависимость активности аденилатциклаоы от концентрации субстрата в присутствии 5 мМ МдС!?.

А - в обычных координатах. По оси абсцисс - концентрация АТФ в мМ, по оси ординат - агтивность аденилатдвклвоы в пмоль цАМФ/мг белга/10 мин. Б - в обратных координатах Лайнуивера-Борка. По оси абсцисс - обратная величина концентрации субстрата. По оси ординат — обратная величина начальной скорости ферментативной реакция.

Таблица 1: Влшшис модифи1аторов регуляторного в-белка на актлвность адеиллатциллаоы мембран ооцитов амурсжоа овеоды.

Модификаторы Концентрация Активность

вещества аденилатциклаоы

' . (М) (пмоль цАМФ/мг белка/10 мин)

Баоальиаа 8,9 ±0,9

МаР м-2 425,1 ±32,1

Холерный 100 мкг/мл 48,1 ±8,1

токсин

Коклюшный 10 мкг/мл 28,2±6,0

токсин

ГТФ Ю-5 54,2 ±2,0

ГИТФ 10~5 204,4 ±18,4

применяли гуалиловые нуклеотиды (ГТФ и его негидролизуемый аналог - ГИТФ), фторид натрия и бактериальные токсины - холерный и коклюшный. ГТФ в концентрации 10~5М увеличивает активность адени-латциклаоы в 6 рао, а ГИТФ - в 23 раоа (таблица 1). Аденилатциклаоа* ооцитов амурской овеоды характеризуется высокой чувствительностью к активирующему действию фтористого натрия. Активность фермента при добавлении 10 мМ ¡ЫаР увеличивается в 48 рао. Холерный и коклюшный токсин стимулируют аденилатцжклаоу мембран.

Отмеченная способность аденилатциклаоы отвечать усилением активности на воздействие гуаниловых нуклеотидов, фторида натрия и бактериальных токсинов ухаоывает на существование функциональной связи в-белка (или белков) с ферментом в плазматической мембране ооцитов амурской овеоды.

Влияние биогенных моноаминов на активность аденилатциклазы. Ад-реналян и норадреналин оказывают зависимый от дооы стимулирующий эффект на аденилатцшшазу при концентрациях от Ю-8 до 10~5М

й И С

ш 40 о

и я

<30 в s с

EJ20

л К о 2 10 В

I I J 1 I I I I I I I I—1 I I I

10"а 10~3 10" 10 10"° 10" Биогенные моноамины, M

10"

Рис. 2: Влияние биогенных моноамннов на активность аденилатциклаоы. По оси абсцисс - концентрация норадренвлнна (1), адреналина (2), дофамина (3), серотонина и триптамина (4); по оси ординат - активность аденилатциклаоы в пмоль цАМФ/мг белка/10 мин.

(рис.2). Зависимость скорости формирования дАМФ го АТФ от действия воорастающих концентрации дофамина описывается кривой, состоящей тз двух различных по высоте пиков. Первый, больший пик, регистрируется при концентрации дофамина 10~7М, второй,. меньший -при 10~5М. Серотонин и триптамин в диапазоне исследуемых концентраций (Ю-8 -т- 10_4М) не влияют на басальную активность фермента.

Для определения специфичности действии биогенных моноаминов на аденилатциклаоную активность ооцитов использовали блокаторы различных рецепторов : альпренолоп - блокатор адренорецепторов /?-типа, фентоламин - блокатор а-адренорецепторов, галоперидол - блокатор дофаминовых рецепторов.

Альпренолоп подавляет стимулирующий эффект, вызванный адреналином и норадреналином, но не дофамином. Ингибирующее действие аль-

I !

пренолола носит дозозависимый характер. Назальный уровень ферментативной активности не наменяете! при действии альпренолола в отсутствии адреналина, норадреналина и дофамина. Фентоламин даже при высокой концентрации (10~4М) не подавляет усиление активности циклаоы, вызванное норадреналином, адреналином и дофамином. Галоперидол частично блокирует эффект дофамина, но не других моноаминов.

Проведенные ¡экспериментальные исследования, во-первых, докалывают наличие в мембранах ооцитов амурской звезды рецепторных образований, чувствительных к адреналину, норадреналпну и дофамину, стимуляция которых активирует аденилатцихдазу, во-вторых, свидетельствуют о том, что эти редепторные структуры могут быть подобны /?-адренергическим и дофаминовым рецепторам, описанным в соматических клетках позвоночных.

ХАРАКТЕРИСТИКА АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ ООЦИТОВ АМУРСКОЙ ЗВЕЗДЫ

Радоавтографдческое исследование локализации адренорецепторов. После инкубации оодитов в искусственной морской воде с антагонистом /?-адренерецепторов [3Н]-дигидроальпренололом ([3Н]-ДНА) метка, маркирующая места связывания меченого питан да обнаруживается в мембране и внутри клеток. Добавление в среду инкубации немеченного антагониста этого же типа рецепторов пропранолола приводит к исчезновению метки из ооцитов.

Идентификация рецепторов ооцитов. Изучение кинетики связывания [3Н]-ДНА с рецепторами ооцитов проводили на ннтактных клетках, предварительно освобожденных от фолликулярных клеток и студенистой оболочки для обпегчения доступа меченого вещества к участкам специфического связывания. Зависимость между количеством ооцитов и количеством специфически связанного [3Н]-ДНА носит линейный характер при концентрации клеток не более чем 5000 в 1 мл инкубационной среды, что соответствует примерно 240 мкг белка. Процесс связывания [3Н]-дигидроальпренолола характеризуется насыщаемостью (рис.3). Анализ

кривой насыщения по методу Скотчарда выявил один класс связывающих мест с Кс = 0,62 ± 0,02 нМ и максимальным связыванием - 567,6 ± 5,4 фмоль/мг клеточного белка. Коэффициент Хилла равен 1, то есть связывание не носит кооперативного характера. Исследование скорости формирования и распада комплекса лиганд-рецептор показывает, что связывание ооцитами [3Н]-ДНА достигает равновесия через 30-35 мин при 15°С. Дальнейшее увеличение времени инкубации не вызывает достоверных изменений уровни специфического связывания. Скорость ассоциации (К+1) составляет 0,102 мин-1нМ-1. Добавление в инкубационную среду адреналина в концентрации 10-4М приводит к распаду комплекса лиганд-рецептор через 18 мин (период полужизни комплекса 9 мин, а скорость диссоциации - 0,074 мин-1). По соотношению констант скоростей ассоциации и диссоциации вычислили константу связывания - Кс = 0.73 нМ. Эта же константа была вычислена по кривой насыщения и составила 0.62 нМ. Хорошее соответствие значений констант связывания, полученное в различных экспериментах, свидетельствует о высокой степени специфичности связывания [3Н]-ДНА ооцитами.

Еще одним звеном, доказывающим специфичность связывания меченого дигидроальпренолола, являются результаты, полученные при тестировании способности различных веществ замещать его в центрах специфического связывания. В этой серии экспериментов из катехола-минов использовали адреналин, норадреналин и дофамин. В хачестве-аятагонистов адренорецепторов /3-типа служил фентоламин. Наиболее сильным ингибитором связывания меченого соединения был альпрено-лол (рис.4). Полумаксимальное ингибирование связывания (/С50) наблюдается при концентрации альпренолола 7 ■ 10-8М. Другой антагонист - пропранолол конкурирует оа места специфического связывания с гораодо меньшим сродством (/Си = 2- 10_3М). Фентоламин в пределах исследуемых концентраций практически не вытесняет меченый лп-ганд. Из агонистов наиболее сильным ингибитором оказался адреналин (/С50 = 2 • 10_7М). Действие норадреналина было слабее. Полумаксимальное ингибирование наблюдается при концентрации норадреналина 9 • 10-7М. Ни фентоламин, ни дофамин даже при высоких концентрациях

Рис. 3: Специфическое связывание (3Н]-днгидроалытренолола ооцитами амурской овеоды в присутствии возрастающих концентраций меченного лиганда. По оси абсцисс - концентрация [3Н]-дигидроальпренолола в пМ; по оси ординат - специфическое связывание (В), выраженное в фмолях на мг клеточного белка.

(Ю-5—10_4М) не конкурируют с меченым лигандом оа места специфического связывания.

Таким образом, все соединения, способные взаимодействовать с выявляемыми с помощью меченого ДНА связывающими местами, являются либо адренергическими агонистами (адреналин, норадреналин), либо ад-ренергическими антагонистами (альпренолол, пропранолол). Эти места обладают свойствами рецепторов. Поскольку фентоламин не вытесняет меченый питанд, но ингибирующее действие адреналина выше, чем Но-радреналкна, а действие адреналина и норадреналина приводит к активации аденилатциклаоы, то на основании этих критериев (ЬеуНгЫ, 1978) выявленные нами ререцепторы можно отнести к адренергическим рецепторам 0-тша..

Рис. 4: Ингибирование специфического связывания [3Н]-дигидроальпренолола альпре-нололом (1), адреналином (2), пропранололом (3), норадреналнном (4), фентоламином и дофамином (5). По оса абсцисс - концентрация конкурентного соединения в М. По оси ординат - % ннгибирования специфического связывания. Концентрация ооцитов амурской овеоды в пробе составляла 2000-3000 клеток, концентрация меченого лн-ганда - 10~аМу время инкубации - 30 мин. при 18°С.

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНАЯ СИСТЕМА РАСТУЩИХ И ЗАКОНЧИВШИХ РОСТ ООЦИТОВ АФЕЛАСТЕРИИ ЯПОНСКОЙ

При иоучении состояния аденилатциклазы в растущих и оакончивших рост ооцитах установлено, что плаяматические мембраны этих клеток проявляют разную баоальную активность. В растущих ооцитах активность фермента составляет в среднем 10,9±0,9 пмоль цАМФ/мг белка/ 10 мин, тогда как в достигших максимального раомера и готовых к вымету ооцитах - 1,8 ±0,5 ед. По мере роста ооцитов наблюдается достоверное падение активности аденилатциклаоы. Для выяснения причин снижения активности фермента, исследовали влияние модификаторов различных субъединиц аденилатциклаоной системы на фермент рас-

тущих и (закончивших рост оодитов. Форсколин, действующий на каталитические свойства фермента, стимулирует скорость синтеоа цАМФ мембранами растущих ооцитов, и активность аденилатциклааы составляет в среднем 161,2 ±11,0 ед. У достигших максимального размера ооцитов аденилатциклаоа тоже активируется форсколином, однако (эффективность втого действия значительно меньше, и скорость синтеоа цАМФ - 8,9 ±0,8 ед. Уменьшение чувствительности аденилатциклаоы к воздействию форсколина связано, скорее всего, с уменьшением количества фермента в мембранах закончивших рост ооцитов.

Фторид натрия, взаимодействующий с регуляторным компонентом адепилатциклаоного комплекса, был самым сильным активатором фермента как растущих, так и закончивших рост ооцитов. Активность аденилатциклаоы мембран растущих ооцитов в присутствии 10-2М фторида натрия составляет в среднем 430,3±33,1 ед., а в мембранах, закончивших рост,- только 12.2 ± 1,4 ед. Другой модификатор регуляторной субъединицы - ГТФ,- усиливает ферментативную активность до 52,3 ± 2,0 ед. растущих ооцитов и полностью ингибирует фермент закончивших рост.

Активаторы рецепторной субъединицы - биогенные моноамины, - добавляли в инкубационную среду в конечной концентрации 10-5М. Адреналин, норадреналин и дофамин стимулируют аденилатциклазу мембран растущих ооцитов. Наиболее сильное действие на аденилатциклазу растущих ооцитов окапывает адреналин, и активация фермента составляет в среднем 380%. При действии норадреналина активность фермента увеличивается в среднем на 310%, стимулирующее действие дофамина значительно ниже, процент активации - 180%. При одновременном инкубировании мембран растущих ооцитов с биогенными моноамннами и ГТФ происходит суммирование их стимулирующего действия. Амплификация действия биогенных моноаминов гуаниловыми нуклеотидом указывает на сопряжение рецепторного и каталитического компонентов адени-латцжкпазной системы в растущих ооцитах посредством регуляторного белка.

При изучении влияния биогенных моноаминов на аденилатциклазу мембран ооцитов, закончивших рост, оказалось, что адреналин, норадре-

налин и дофамин даже при больших концентрациях (Ю-5) не влияют на активность фермента. Для того, чтобы убедиться, что аденилатциклаза закончивших рост и готовых к вымету женских гамет теряет чувствительность к биогенным моноаминам, проводили эксперименты по влиянию отих веществ на созревание нераарушенных ооцитов. Для индукции созревания необходимо падение уровня цАМФ, а препараты, повышающие концентрацию этого циклического нуклеотнда, препятствуют возобновлению мейотических делений. Исчезновение зародышевого пузырька кал в экспериментальных (препнкубированных в течение 15 мин с моноаминами) ооцитах, так и в контрольных (препнкубированных без моноаминов) начинается в среднем через 12-13 мин после воздействия арахи-доновой кислоты. В диапазоне исследуемых концентраций (Ю-8-г Ю-4) ни один из моноаминов не вызывает зависимого от дозы достоверного подавления созревания, что свидетельствует об отсутствии связи аденилатциклаоы с рецепторами к биогенным моноаминам.

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА В РАННИХ ЭМБРИОНАХ СЕРОГО МОРСКОГО ЕЖА

В сезон размножения серого морского ежа проводили изучение свойств аденилатциклаоы яиц и ранних эмбрионов. Активность аденилатциклаоы определяли в зрелых яйцеклетках, в зиготе (через 10 мин после оплодотворения), в зародышах на стадии двух бластомеров (через 1,5 ч.) и бластулы (через 5 ч.).

Баоальная активность фермента минимальна до оплодотворения и составляет 8,1 ± 0,8 пмоль цАМФ/мг белка/10 мин. Самая высокая аде-нилатцик ладная активность регистрируется на стадии первого деления дробления 36,1±3,3 пмоль цАМФ/мг белка/10 мин. В эмбрионах на стадии бластулы активность циклаоы в 1,5 раза ниже, чем у дробящихся зародышей, но в 2,8 раза выше, чем у зрелых яиц и составляет 22,5 ±2,2 ед. При добавлении в среду инкубации фторида натрия в концентрации Ю-2 М скорость синтеза цАМФ увеличивается. В зрелых яйцеклетках, на стадии первого деления дробления и бластулы активация аденилатци-

клазы фторидом натрия составляет 130-170%. На 10 мин после оплодотворения стимулирующий эффект этого модификатора достоверно выше и активность фермента - 221%.

Гуаниловые нуклеотиды стимулируют ферментативную активность неоплодотворенных яиц. В орелых яйцеклетках негидролиоуемый аналог ГТФ - гуанооинимидотрифосфат (ГИТФ) - при концентрации 10~4 М в среднем на 323% усиливает скорость синтеоа цАМФ, тогда как ГТФ при такой же концентрации - на 265%. Действие ГИТФ на аденилатци-клаоу сильнее, чем ГТФ. На 10-ой минуте после оплодотворения, а также на стадии второго деления дробленая стимулирующее действие гуанияо-вых нуклеотидов сохраняется, и аденилатциклаза более чувствительна к ГИТФ, чем к ГТФ. В зиготах активация аденидатцикпавы ГИТФ -265%, а ГТФ - 165%, на стадии первого деления дробления - 280% и 171%, соответственно. На стадии бластулы аденилатциклава теряет чувствительность к гуаниловым нуклеотидам, что свидетельствует о нарушении взаимодействия фермента с регупяторным С?5-белком.

При исследовании влияния дофамина на аденилатциклазу яйцеклеток и бластул оказалось, что дофамин в концентрации Ю-5 М стимулирует ферментативную активность неоплодотворенных яиц (процент активации составляет 227%) и его действие усиливается в присутствии ГИТФ. На стадии бластулы дофамин не эффективен, даже при совместном действии с ГЕТФ.

Полученные данные пооволяют говорить о функционировании в аде-нилатциклаоной системе яиц морского ежа гуанилнуклеотидсвяэываю-щих белков, ответственных оа сопряжение рецептора с каталитическим компонентом системы. В раннем эмбриогенезе происходят события, приводящие к потере способности аденилатцикяаоы на стадии бластулы регулироваться дофамином и ГИТФ, что, вероятно, свяоано с изменением механизма взаимодействия элементов аденилатциклазной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты работы показывают, что в ооцигах иглокожих существует аденилатцикпаоная система, локализованная в плазматической мембране.

Стимулирующее действие фторида натрия, гуаниповых нуклеотидов и холерного токсина на аденилатциклазу мембран ооцитов свидетельствует о вовлечении в регуляцию ферментативной активности С^-белка. Активация аденилатциклазы дофамином, блокируемая галоперидолом, и адреналином и норадреналином, чье действие снимается альпренололом, а также потенцирование действия этих биогенных моноаминов гуани-ловыми нуклеотидами, пооволяют считать, что ооциты морских звезд содержат рецепторы двух типов, сопряженные с аденилатциклаоой через Од-белок - дофаминовые и адренергические. Анализ мест связывания специфического антагониста Д-адренергических рецепторов [3Н]-ДНА ооцитами амурской звезды показывает, что что адренергические рецепторы представлены рецепторами /?-типа.

Исследование динамики активности аденилатциклазы в период роста ооцитов покаоывает, что ее минимальный уровень совпадает с низкой гаметогенетичесхой активностью половых желео. К концу "внутриго-надного" оогенеза активность аденилатциклазы минимальна. Снижение ферментативной активности обусловлено уменьшением количества самого фермента и изменением механизма регуляции аденилатциклазы 05-белком. Результатом етого изменения, в конечном счете, является потеря реактивности аденилатциклааы к биогенным моноаминам перед нерестом, что указывает на исчезновение (инактивацию) рецепторрв к этим нейротрансмиттерам. Эксперименты по влиянию биогенных моноаминов на созревание ооцитов подтверждают предположение о нарушении взаимодействия элементов комплекса: адренергические или дофаминовые рецепторы - С5-белок - аденилатциклаоа в закончивших рост и готовых к вымету ооцитах.

Обнаруженные изменения механизма регуляции активности адени-латциклаоы в процессе роста ооцитов обусловлены различным функциональным состоянием гамет во время роста' и в момент его окончания. В период роста происходят интенсивные обменные процессы, направленные на накопление белков, лииидов, углеводов, нуклеиновых кислот и других биохимических компонентов клетки, необходимых для структурного и энергетического обеспечения будущего зародыша (Айоенштадт, 1984).

В закончивших рост, готовых к вымету ооцитах эти процессы уже оа-вершены, поэтому растущие ооциты в большей степени нуждаются в регуляции коррекции развития, осуществляемой внешними сигналами, чем зрелые клетки, у которых, вероятно, включаются автономные регу-ляторные механизмы.

У иглокожих в регуляции развития половых клеток участвуют медиаторы моноаминергичесхой системы - биогенные моноамины, которые на уровне гонады функционируют как нейротрансмиттеры (Хотим-ченко, 1989), и наиболее вероятной внутриклеточной системой, опосредующей действие этих соединений, является аденияатциклазная. Для этого в мембранах растущих ооцитов есть соответствующие рецепторы, сопряженные с аденилатцнкпаоои через (7s-6enoK.

Установлено, что у морских ежей после оплодотворения, происходит активация аденилатцииаоной системы. Существующие данные о способности серотонина повышать интенсивность цитохимической реакции на аденилатциклазу у дробящихся зародышей морского ежа (Ростомян и др., 1985), реактивность циклазы к дофамину после оплодотворения (Parisi et al, 1987) л неспособность аденилатциклаоы стимулироваться этим же трансмиттером на стадии бластулы указывают на то, что различные трансмиттеры функционируют на определенных стадиях раннего эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Аденилатцикпаоа в ооцитах морской «звезды Asterias amurensis в морского ежа Stiongyloceatrotus nudus локализуется в плазматической мембране. В цитоплаоматических структурах ооцитов различных размерных групп фермент не выявляется.

2. Аденипатцнкяаоа, ооцитов морской овеоды Asterias amurensis входит в состав мембранного комплекса, включающего, помимо фермента, рецептор и регуляторный G-белок. В качестве субстрата фермент использует комплекс Мд2+-АТФ с Кт = 0,45 мМ и К^ = 25 пмоль цАМФ/ мг белка/10 мин. Выявлена зависимость каталитической активности аде-

нилатциклаоы от ионов магния и марганца.

3. Биогенные моноамины (адреналин, норадреналин и дофамин) оказывают стимулирующее действие на аденилатциклаоу ооцитов морских звеод. а-адренергический блокатор фентоламин не влияет на активацию фермента биогенными моноаминами; /С?-адренергический блокатор альпренолол подавляет действие адреналина и норадреналина, а дофаминовый блокатор галоперидол - дофамина. Это свидетельствует о взаимодействии аденилатциклазы с рецепторами, по крайней мере, двух типов - адренергетескими и дофаминовыми.

4. В ооцитах морской овеоды Asterias amurensis выявлены Д-адренерги-ческие рецепторы с K¿ для [3Н]-дитидроальпренолола 0,62 нМ и максимальным числом связывающих мест 567,6 фмоль/мг белка. По способности агонистов и антагонистов конкурировать за участки специфического свяоывания их можно расположить в следующий ряд убывающей эффективности: альпренолол > адреналин > норадреналин > пропрано-лол. Особенности действия этих веществ на аденилатциклазную активность свидетельствуют, что идентифицированные рецепторы в растущих ооцитах взаимодействуют с циклаоой.

5. По мере роста ооцитов морских звезд и ежей интенсивность цитохимической реакции на аденилатциклаоу снижается. Данные биохимических исследований аденилатциклаоной системы растущих и закончивших рост ооцитов морской овеоды Aphelasterias japónica свидетельствуют об уменьшении количества фермента и изменении свойств регуляторного G-белха. В готовых к вымету ооцитах аденипатциклаоа не взаимодействует с рецепторами биогенных моноаминов и Gs-белком. Обнаруженная негативная регуляция ГТФ активности фермента позволяет предположить, что аденилатцихлаоа закончивших рост ооцитов связана с G,-белком.

6. Аденилатцнклаоа зрелых яйцеклеток морского ежа Strongylocentro-tus intermedius функционально активна на ранних стадиях эмбриогенеза. В яйцеклетках, оиготах и дробящихся зародышах фермент сопряжен с дофаминовыми рецепторами посредством регуляторного Gs-белка. На стадии бластулы происходят события, приводящие к потере связи ци-

клады с поверхностной мембраной. Вероятно, в ото время большее она-чение приобретают регуляторные системы, локализованные во внутриклеточных структурах.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kreimer D.I., Lamash N.E., Fedoseev V.Ya., Grishchenko V.M. Change in water-soluble Ca2+-calmodulin target proteins during embryogenesis of the sea urchin Strongylocentiotus inteimedius. // Онтогенез. 1991. T.22. N 4.

2. Lamash N.E., Khotimchenko Yu.S. Properties of the adenylate cyclase in the oocyte of starfish Asteiias amuiensis. 11 Сотр. Biochem. Physiol. 1992. V. 103. N 2. P.379-382.

3. Ламаш H.E., Хотимченко Ю.С. Характеристика аденилатциклазы на донервных стадиях эмбриогенеза морского ежа. // Тез. докл. межд. конф. "Нейрофармахология на рубеже двух тысячелетий". С.-Петербург. 1992. Р.119.

4. Ламаш Н.Е. Свойства аденилатциклаяы яиц и эмбрионов морского ежа Strongylocentiotus inteimedius. // Биология моря. 1993. N 4.

5. Lamash N.E.,Karaseva Е.М., Khotimchenko Yu.S. Alteration of starfish oocyte adenylate cyclase properties, j j Сотр. - Biochem. Physiol. 1993.

P.421.

V.105. N 3. P.531-534.