Регуляторные пептиды и половые стероидные гормоны в регуляции размножения двустворчатых моллюсков и морских ежей

Вараксин, Анатолий Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляторные пептиды и половые стероидные гормоны в регуляции размножения двустворчатых моллюсков и морских ежей
ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные пептиды и половые стероидные гормоны в регуляции размножения двустворчатых моллюсков и морских ежей"

Р Г Б ОД

\ 2 СЕН

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

На правах рукописи УДК 591.48:591.16

Вараксин Анатолий Алексеевич

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ И ПОЛОВЫЕ СТЕРОИДНЫЕ ГОРМОНЫ .В РЕГУЛЯЦИИ РАЗМНОЖЕНИЯ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ И ЫОРСКИХ МЕЙ

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Владивосток 1994

Работа выполнена в Институте биологии моря ДВО РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Н.Иванков

доктор биологических наук, профессор В.М.Колдаев

доктор биологических наук А.Л.Дроздов

Ведущая организация - Институт биологии .развития РАН

Защита диссертации состоится " ^/с>г /"-¿У//. М-К94 г. в час на заседании Специализированного совета

Д 084.24.01 при Владивостокском государственном медицински институте по адресу: 690600, Владивосток, лр.Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского института.

Диссертация разослана г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доцент Г.Ы.Холоденко

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Познание закономерностей развития половых клеток, нереста, оплодотворения и раннего эмбриогенеза морских беспозвоночных за последние годы все больше смещается в область исследования механизмов регуляции этих процессов. Большое внимание уделяется значению экологических факторов, холинергической и моноаминергической системы, внутриклеточным мессенджерам и молекулярным механизмам (Касьянов и др., IS80. Размножение,..., М.: Наука. 134 е.; Деридович, Хотим-ченко, 1985. Биол.моря. 3: 53-58; Eckberg, 1988. Biol. Bull., 174: 95-108; Motavkine, Varaksine, 1989, La Reproduction ..., Brest: Ifremer. 250 p.; Хотимченко и др., IS93. Биология ..., М.: Наука. 169 е.). Важным компонентом нервной регуляции функций в организме является пептидергическая система.

Представления о регуляторных пептидах претерпели за последние годы чрезвычайно бурное развитие. К настоящему времени сформировались понятия об особенностях их биосинтеза и процес-синга, локализации, распространении, функциональной непрерывности, регуляторном континууме, состоящем из регуляторных пептидов и сопряженных с ними межклеточных сигнализаторах другой природы (Ашмарин, Каменская, 1988. Итоги науки и техники. Т. 34. 184 е.; Ашмарин и др., 1989. Физиол. ж. 75: 627-632; Замятин, 1990. Ж. общ. биол. 51: 147-162 и др.). Подавляющее большинство сведений о регуляторных пептидах получено на позвоночных животных. В последнее время эндогенные регуляторные пептиды найдены в нервной системе, пищеварительном тракте, половой железе, эндокринных и других органах и тканях ряда беспозвоночных животных. Накапливаются данные о их участии в регуляции различных функций, в том числе и репродуктивной. Структурное сходство функционально значимых участков регуляторных пептидов беспозвоночных и позвоночных животных указывает на то, что, очевидно, общие принципы их взаимодействия с рецепторами у тех и других животных могут быть очень похожими или даже одинаковыми. В то же время функциональные проявления регуляторных пептидов у беспозвоночных и позвоночных разнятся.

Их особое место среди эндогенных биологически активных веществ определяется многочисленностью, полифункциональнос-

тью каждого пептида в сочетании с перекрыванием функций между разными регуляторными пептидами, а также способностью служить материальной основой для передачи сигналов между интегративны-ми системами организма. Однако это не умаляет значения в процессах регуляции размножения других регуляторных систем, таких, например, как моноаминергическая или холинергическая, с которыми они тесно взаимодействуют.

Кооперативное действие регуляторных систем опосредуется в гонаде половыми стероидными гормонами. Их значение в регуляции функций у .позвоночных изучено достаточно обстоятельно. У беспозвоночных эти факторы долгое время оставались неизвестными и лишь в последние десятилетия стероидные гормоны были найдены у многих морских беспозвоночных, в том числе и у двустворчатых моллюсков,« морских ежей. Основные пути их синтеза и обмена, очевидно, сходны у всех животных. Уже в первых исследованиях было высказано предположение, что в регуляции половой системы двустворчатых моллюсков и иглокожих стероидные гормоны выполняют функции аналогичные таковым у млекопитающих. Однако многие стороны их функциональной значимости оставались неизвестными. Очень важен вопрос о месте, которое занимают половые стероидные гормоны в общей системе регуляции функций гонады. Это потребовало обратить более пристальное внимание на их участие в гаметогенезе.

Открытие донервной регуляции эмбриогенеза стимулировало исследование эндогенных механизмов регуляции раннего эмбрионального развития (Бузников, 1987. Нейротрансмиттёры М.: Наука, 232 е.). Учитывая имеющиеся представления, можно предполагать, что пептидергическая и стероидергическая системы играют важную роль в раннем эмбриогенезе двустворчатых моллюсков и морских ежей.

Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в установлении пептидергических механизмов регуляции пролиферации, роста, созревания и формирования половых клеток, нереста и раннего эмбрионального развития у двустворчатых моллюсков и морских ежей.

В основные задачи работы входило:

I) Охарактеризовать пептидергическую нейросекреторную систему, ее структурные и функциональные изменения на протяжении репродуктивного цикла. Выявить наличие, локализацию и содержание регуляторных пептидов в нервной системе и половой

железе;

2) Проследить морфологические связи между нервной системой и половой железой, получить ультраструктурные, гисто- и иммуноцитохимические доказательства пептидергической иннервации половой железы;

3) Выяснить значение некоторых регуляторных пептидов, гормональных и внутриклеточных механизмов их действия на пролиферацию гониев, рост и созревание ооцитов, нерест и раннее эмбриональное развитие;

4) Описать наличие и локализацию ферментов стероидогене-за и половых стероидных гормонов, выявить и охарактеризовать соматические стероидергические элементы половой железы, исследовать способность половых клеток, эмбрионов и личинок к синтезу половых стероидных гормонов;

5) Показать значение половых стероидных гормонов в пролиферации, росте, созревании и формировании половых клеток;

6) Выявить наличие и значимость функциональных связей между пептидергической системой и половыми стероидными гормонами и их взаимодействие с межклеточными регуляторами другой природы.

Научная новизна. В работе выявлены структурные и функциональные изменения Пептидергической нейросекреторной системы на протяжении репродуктивного цикла и нереста. Доказана пептидер-гическая иннервация половой железы. Выявлено наличие, локализация и содержание некоторых регуляторных пептидов и показано их- значение в гонадогенезе. Разные этапы развития половой клетки контролируются различными регуляторными пептидами.

Локализованы основные ферментные системы обмена полоеых стероидных гормонов. В семенниках и яичниках двустворчатых моллюсков-и морских ежей выявлены и охарактеризованы стерои- ■ дергические элементы. Впервые, кроме соматических стероидерги-ческих элементов, ферменты стероидогенеза и половые стероидные гормоны найдены в ооцигах и клетках сперматогенного ряда -сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах и сперматозоидах. Утверждается, что половая клетка двустворчатых моллюсков и морских ежей функционирует как стероидцептивная-стероидерги-ческая система.

У самцов этих животных половые стероидные гормоны ускоря-ютпролиферацию сперматогониев, созревание сперматоцитов П,

формирование сперматид и сперматозоидов, не влияя на созревание сперматоцитов I. У самок стероидные гормоны повышают про-лиферативную активность гониев, ускоряют цито- и трофоплазма-тический рост за счет активации синтетических процессов как в половой железе, так и в самом ооците.

Реинициация мейоза в ооцитах контролируется гонадостиму-лирующим регуляторным пептидом. Гормональная индукция мейоза является многоступенчатым процессом. Выявлено, что серотонин выполняет функцию эндогенного гормонального фактора реинициа-ции мейоза в ооцитах двустворчатых моллюсков. Доказано, что действие серотонина осуществляется через специфические серото-ниновые рецепторы. Впервые подробно исследованы внутриклеточные механизмы передачи сигнала с серотонинового рецептора в ооцит, которая протекает по Са^-фосфоинозитидзависимому пути. Активными участниками усиления рецепторзависимых внутриклеточ- . ных сигналов является арахидоновая кислота и ее липоксигеназ-ный метаболит - 5-гидроксиэйкозагетраеновая кислота.

Выявлено, что серотонин, являясь мейозиндуцирующим веществом у двустворчатых моллюсков, вызывает нерест у этих животных. Простагландины усиливают нерест, не влияя на реинициацию мейоза в половой клетке.

Регуляторные пептидергическая и стероидергическая системы, формирующиеся в процессе развития половой клетки, сохраняются после ее созревания, участвуют в оплодотворении и начина-' ют функционировать на ранних стадиях эмбриогенеза, осуществляя регуляцию нормального развития.

Теоретическое и практическое значение работы. Выполненная работа носит экспериментально-теоретический характер. Полученные сведения раскрывают механизмы регуляции гаметогенеза, нереста и раннего эмбрионального .развития и могут быть использованы в разработке способов контроля нар. размножением морских беспозвоночных. На основании полученных данных разработан и предложен способ стимуляции нереста у двустворчатых моллюсков. Способ прост и удобен в исполнении как в лабораторных, так и полевых условиях и не оказывает отрицательного влияния на развитие потомства. Способ защищен авторским свидетельством. Знание особенностей полового цикла самцов приморского гребешка и его регуляции позволило разработать способ оценки гонадотроп-

ной активности химических соединений. Использование самцов этого моллюска в качестве тест-объекта дает возможность дифференцированно оценивать пролиферативную активность гониев, ге-нез сперматоцитов I, сперматоцитов П, сперматид и сперматозоидов после действия различных природных или синтетических химических соединений, чего нельзя выявить при использовании традиционных лабораторных животных. Способ защищен авторским свидетельством.

Апробация работы. Основные результаты были представлены на I и П Всесоюзных .конференциях по нейроэндокринологии (Ленинград, 1S74; Иваново, 1982), УП Международном симпозиуме по нейросекреции (Ленинград, 1976), Пятом и Восьмом Всесоюзных совещаниях по изучению моллюсков (Ленинград, 1975, 1987), IУ Всесоюзном коллоквиуме по иглокожим (Боржоми, 197Э), Х1У Тихоокеанском научном конгрессе (Хабаровск, 1979), У1 Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981),П Всесоюзном съезде океанологов (Севастополь, 1982), Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки" (Суздаль, 1989), Советско-Финском симпозиуме по биологии развития (Суздаль, 3991), Региональной конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных "Простые нервные системы" (Минск, 1991), Восьмом международном рабочем совещании по пек-тинидам (Франция, 1991), рабочем совещании "Консервация генетических ресурсов" (Пущино, 1992), научных семинарах и конференциях Института биологии моря ДВО РАН.

. Объем и структура работы. Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада, обобщающего результаты, представленные в 44 публикациях в отечественных и международных изданиях;

2. МАТЕРИМ И МЕТОДЫ

Основные наблюдения и экспериментальные исследования выполнены на двустворчатых моллюсках: приморском гребешке Mizn-hopecten yessoensis, мидии Грея Crenomytilus grayanus, спизуле сахалинской Spisula sachalinensis, анадаре.Броутона Anadara broughtoni, мерценарии Mercenaria stimpsoni, гребешке Свифта Swiftopecten swifti и черном и сером морских ежах Strongylo-centrotus nudus и Strongylocentrotus intermedius. При выпол-

нении отдельных разделов работы использовали двустворчатых моллюсков: мактру Mactra sulcataria, модиолуса Modiolus dif-fioilis, глициыериса Glycymeris yessoensis, гигантскую устрицу Crassostrea gigas.

Для изучения структуры пептидергической нервной системы, ее изменений на протяжении репродуктивного цикла, исследования половых и соматических элементов гонады, обеспечивающих развитие половых клеток и нерест, оценки экспериментального влияния регуляторных пептидов, половых стероидных гормонов, других биологически активных соединений на гаметогенез применены световые и электронно-микроскопические морфологические и морфометрические методы. Действие регуляторных пептидов, биогенных аминов, полиненасщенных »ирных кислот и их метаболитов, блокаторов липоксигеназного окисления полиненасыщенных жирных кислот, кальциевых ионофоров, ингибиторов На+/н+-обме-на на реинициацию мейоза и внутриклеточные механизмы этого процесса исследовали цитоспектрофлюорометрическим методом с применением флюоресцентных зондов по изменениям содержания свободного и связанного кальция в клетке и уровня цитоплазма-тического рН. Методами световой и электронной гистохимии определяли характеристики холинергических и моноаминергических структур и локализацию ферментов обмена стероидных гормонов. Локализацию и идентификацию регуляторных пептидов и стероидных гормонов в половых клетках, эмбрионах и личинках проводили иммуногистохимическиыи методами с применением соответствующих антисывороток. Количественное определение этих веществ проводили •радиоиммунологическим методом. Синтетические процессы в гонаде и половых клетках исследовали авторадиографическими и биохимическими методами. Методики экспериментальной эмбриологии применяли при исследовании механизмов нереста и раннего эмбрионального развития.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Локализация и идентификация регуляторных пептидов

Для выполнения этой работы необходимо было показать наличие и локализацию регуляторных пептидов. В первую очередь, мы обратили внимание на семейство опиоидных пептидов. С тех

пор как в нервной системе млекопитающих были найдены опиоидные рецепторы, а позднее и сами опиоидные пептиды, эндогенные опио-иды описаны у всех исследованных беспозвоночных и позвоночных животных и человека.

Иммуноцитохишческими-методами выявлено, что энкефалиним-мунореактивные нейроны локализованы в висцеральных, цереброп-левральных и педальных ганглиях мидии Грея, приморского гребешка, анадары Броутона. Во всех нервных ганглиях двустворчатых моллюсков найдены вещество Р-иммунореактивные нейроны. Это-униполярные клетки, располагающиеся по одиночке или небольшими группами в местах выхода нервов. Широко распространены в нервной системе двустворчатых моллюсков <ЖР§амид- и инсулиниммуно-реактивные нейроны, а в нейропиле, коннективах и комиссурах найдены очень мелкие энкефалин-, ШРФамид- и вещество Р-иммунореактивные волокна.

Энкефалиниммунореактивный материал найден нами в растущих ооцитах и клетках сперматогенного ряда - сперматогониях и спер-матоцитах I.

3.2. Влияние некоторых регуляторных пептидов на сперматогенез двустворчатых моллюсков

Ранее в цереброплевральных ганглиях и гемолимфе двустворчатых моллюсков найден фактор, стимулирующий пролиферацию спер-матогониев. Он является пептидом с небольшой молекулярной массой и, как полагают, относится к группе регуляторных пептидов с митогенным действием (Mathieu et al., 1988. Gen. Сотр. Endocrinol., 72: 257-263; Toullec et al., 1988. J. Exp. Наг. Biol. Ecol., 119: 111-117)» Как показано нами выше, кроме фактора пролиферации сперматогониев в нервной системе и половой железе двустворчатых моллюсков содержатся другие регуляторные пептиды. Исследовано влияние некоторых из них, в частности, пептидного ыорфогена гидры, на гаметогенез приморского гребешка. С этой целью пептидный морфоген гидры растворяли в стерилизованной морской воде и вводили в аддукторную мышцу по 0,2 мл раствора, содержащего 5 мкг пептида, ежедневно на протяжении двух недель на различных стадиях полового цикла. На стадии начала гаметоге-неза (октябрь) после введения животным пептидного морфогена гидры средняя площадь профильного поля ацинуса возрастает почти в 1,5 раза (табл. I). Цитологический анализ показывает, что

у контрольных животных на долю вторичных сперматогониев в это время приходится почти 9Ь% клеток, присутствующих в ацинусах. Значительно меньшую долю составляют первичные сперматогонии. Первичные и вторичные сперматогонии располагаются по периферии ацинуса, формируя зону размножения и роста - другой важный мор-фоыетрический показатель состояния половой железы. Площадь профильного поля зоны размножения' и роста у опытных животных возрастает более, чем в 3 раза, по сравнению с контролем. Плотность вторичных сперматогониев также значительно увеличивается. По существующим представлениям начало пулу вторичных сперматогониев дают первичные крупные гонии. Очевидно, этим следует объяснять тот факт, что одновременно с резким увеличением плотности вторичных сперматогониев плотность первичных уменьшается. В зоне размножения и роста в ацинусах половой железы моллюсков из опытной группы имеются сперыатоциты I на стадии начала профазы мейоза.... .

Опыты, проведенные во второй половине декабря, т.е. в период начала созревания сперматоцигов I, показали, что площади ацинусов и зоны размножения и роста у опытных животных увеличиваются незначительно (табл. 2). Доля сперматогониев в ацинусах контрольных животных составляет 100%, а после введения пептидного морфогена гидры, как и на стадии начала развития, в ацинусах моллюсков появляются сперыатоциты I начала профазы мейоза. Другие сперматогенные клетки в гонаде отсутствуют.

В январе у моллюсков доля сперматоцитов I в семеннике значительно возрастает. Появляется небольшое число сперматоцитов П. В этот период сперматогенез приморского гребешка удобно использовать как модель для оценки действия химических соединений на сперматоцитогенез. Введение пептидного морфогена гидры показывает, что хотя площадь профильного поля возрастает незначительно, площадь зоны .размножения и роста увеличивается на большую величину. Ьто свидетельствует об активации пролиферации сперматогониев. Цитологический анализ показывает, что одновременно возрастает доля сперматоцитов I начала профазы мейоза, в то время как количество сперматоцитов I конца профазы мейоза и сперматоцитов П у животных в опыте, по сравнению с контрольными, снижается (табл. 3). Ьто указывает на то, что наряду с гониальной пролиферативной активностью пептидный морфоген гидры обладает спо-

Влияние пептидного морфогена гидры на морфометрические и цитологические характеристики семенника приморского гребешка в период пролиферации гониев (октябрь)

Группа Площадь, отн. ед. Плотность, отн. ед.

ацинус зона размножения и роста первичные спермато-гонии вторичные спермато-гонии спермато-циты I

Контроль 0,55+0,14 0,06+0,01 Опыт 0,79+0,22х 0,20+0,03х 1,5+0,4 16,4+5,1 1,2+0,4 31,3+6,5* 5,1+3,5

Примечание. Здесь и далее х - р<0,05 - уровень значимости различий относительно контрольной группы животных.

Таблица 2

Влияние пептидного морфогена гидры на морфометричеекие и цитологические характеристики семенника приморского гребешка в период созревания сперматоцитов I (вторая половина декабря)

Группа Площадь, отн. ед. Доля сперматогенных клеток, %

ацинус зона .размножения и роста спермато-гонии сперматоциты I начала профазы мейоза сперматоциты I конца профазы мейоза сперматоциты П

Контроль 0,62+0,02 0,43+0,03 100 - - -

Опыт 0,78+0,05х 0,52+0,06* 96 4 - -

Влияние пептидного морфогена гидры на морфометрические и цитологические характеристики семенника приморского гребешка в период созревания сперматоцитов I (январь)

Группа Площадь, ото. ед. Доля сперматогенных клеток, %

ацинус зона размножения и роста спермато-гонии сперматоци-ты I начала профазы мейоза сперматоци-ты I конца профазы мейоза сперматоциты П

Контроль Опыт

0,73+0,03 0,46+0,03 0,83+0,05* 0,6910,06*

25 27

30 38

35 29

10 8

I—I

со

собностыо ускорять созревание сперматоцитов I начала профазы мейоза, не влияя на созревание сперматоцитов I конца профазы мейоза и сперматоцитов П.

Ко второй половине февраля основными сперматогенными клетками в гонаде являются сперматоциты I и сперматоциты Д. Пептидный морфоген гидры вызыв^г накопление сперматоцитов I на чала профазы мейоза. Сперматиды и сперматозоиды отсутствуют, т.е. формирование сперматид под влиянием пептидного морфогена гидры не происходит (табл. 4). Таким образом, пептидный морфоген гидры вызывает резкое увеличение пролиферативной активности сперматогониев, что, очевидно, является наиболее характерны физиологическим свойством пептида и, в меньшей степени, ускоряет созревание сперматоцитов I начала профазы мейоза. Пептидный морфоген гидры не оказывает влияния на созревание сперматоцитов I конца профазы мейоза, формирование сперматид и спер-матазоидов. Полученные данные о действии пептидного морфогена гидры представлены в виде следующей схемы: Первичный сперматогоний

| (-»О пролиферация

Вторичный сперматогоний

| (-+) созревание

Сперматоцит I начала профазы мейоза

| (-) созревание

Сперматоцит I конца профазы мейоза

| (-) созревание

Сперматоцит П

| (-) формирование

Сперматида

| (-) формирование

Сперматазоид

Наличие в нервной системе и сперматогенных клетках других иммунореакгивных регуляторных пептидов поставило вопрос о их возможном значении в сперматогенезе зтого моллюска. Ыы обратили внимание на синтетический аналог лейэнкефалина даларгин, в молекуле которого, в отличие от эндогенного лейэнкефалина, глицин заменен на Д-аланин, а к С-терминальной части добавлен аргинин. Даларгин обладает опиоидными свойствами, однако модификация молекулы лейэнкефалина привела к появлении новых свойств: даларгин не вызывает привыкания, физической зависимости

Влияние пептидного морфогена гидры на морфометрические и цитологические характеристики семенника приморского гребешка в период созревания сперматоцитов П (вторая половина февраля - первая половина марта)

Группа Площадь, отн. ед. Доля сперматогенных клеток, %

ацинус зона размножения и роста спермато-гонии спермато-циты I начала профазы мейоза спермато-циты I конца профазы мейоза спермато-циты П

Контроль 0,78+0,03 0,61+0,02 5 23 30 42

Опыт 0,90+0,05х 0,80+0,03х 3 44 32 21

ы сл

и толерантности, что характерно для многих опиоподобных веществ (Титов и др., 1935. Бюл. ВКНЦ, 2: 72-76).

Применение даларгина и обработка материала велись как указано выше. Используя морфометрический анализ и цитологическую оценку состояния семенника, мы не обнаружили каких-либо изменений в процессах пролиферации сперматогониев, созревании.или формировании сперматогенных клеток.

Характеристике взаимодействия синтетических опиоидных пептидов с их рецепторами помогает наличие специфических антагонистов. Одним из таких соединений является налоксон, который связывается с опиоидными рецепторами мю- и дельта-типов,но при этом не вызывает биологического ответа и блокирует эффекты аго-нистов этих рецепторов. Ежедневные иньекции даларгина в аддукторную мышцу приморского гребешка в течение 2-х недель в дозах от 10 до 100 мкг/кг веса не оказывают влияния на морфометричеекие и цитологические показатели семенника приморского гребешка в период пролиферации сперматогониев. Это подтверждает сведения, полученные при исследовании действия даларгина..

3.3. Влияние регуляторных пептидов на пролиферацию сперматогониев опосредуется простагландинами

Как известно из литературы и было показано нами выше, некоторые регуляторные пептиды обладают мощными митогенными свойствами (Rozengurt, 1986. Science, 234-: 161-166; Zagon, 1987. Brain Res., 412: 68-72 ). На основании этих сведений было предположено, что действие фактора пролиферации сперматогониев у двустворчатых моллюсков, подобно другим .регуляторным пептидам у млекопитающих, опосредуется эйкозаноидами, в частности, простагландинами, принимающими участие в контроле пролиферации различных типов клеток у позвоночных животных ( Hori et al., 1991. Biochem. Biophys. Res. Commun., 174: 758-766 ). Для проверки этого предположения мы провели исследование влияния индометацина (блокатора циклоксигеназного окисления полиненасыщенных жирных кислот), арахидоновой кислоты и продуктов ее циклоксигеназного пути окисления - простагландина Е£ и проста-гландина F2 аС на пролиферацию сперматогониев у приморского гребешка.

Результаты этого исследования приведены на рис. I. В сентябре, в начале периода пролиферации, плотность сперматогониев

в ацинусах семенников животных контрольной группы невелика и составляет 6,8+1,4 усл. ед. Введение индометацина вызывает увеличение плотности сперматогениев в 2,9 раза (рис. 1а). К началу октября плотность сперматогониев у животных контрольной группы возрастает до 17,6+3,2 усл.ед. Введение индометацина в этот период увеличивает плотность сперматогониев примерно в такой же степени, как и в предыдущем случае (рис. 16). Ко второй половине октября исходная плотность сперматогониев в ацинусах животных контрольной группы составляет 144,0+15,4 усл. ед. Ин-дометацин в этот период также вызывает значительное увеличение плотности сперматогониев, хотя в меньшей степени, чем в начале периода пролиферации. Введение арахидоновой кислоты подавляет пролиферацию, а совместное с ней введение индометацина устраняет тгибирущее действие арахидоновой кислоты (рис. 1в).

Рис. I. Изменение плотности сперматогониев в ацинусах семенника приморского гребешка после введения индометацина, арахидоновой кислоты, простагландина F2oi и простагландина Eg. Время проведения опытов: а - сентябрь, б - начало октября, в -середина октября, г - конец октября. I - контроль; введение: 2 - индометацина, 3 - простагландина 4 - арахидоновой кислоты, 5 - арахидоновой кислоты совместно с индометацином, 6 - простагландина Eg.

Это дает основание считать, что ингибирующее действие на пролиферацию сперматогониев способны оказывать продукты цикло-ксигеназного окисления арахидоновой кислоты. У позеоночных животных отмечено увеличение синтеза простагландина Eg в .фибро-бластах кожи, макрофагах и других клетках после действия веществ, обладающих митогенным свойством. Одновременно, но с меньшей активностью образуются простагландины Ag, 6-кето-Р1<?(_ ^Bachwich et al., 1986. Biochem. Biophys. Res.' Сошшип., 136: 94-101).

а 5 □'

so so - rf- 02

30 so - к Ш 3

10 ■Ä 10 '■ff

soo >00 100

г э 4

- шш 5

- ^ 6

- rf

Введение простагландина Е£ блокирует пролиферацию сперматого-ниев у приморского гребешка более, чем в 2 раза (рис. I г). Простагландин ^2с<.'гакже замедляет пролиферацию сперматогониев, хотя в меньшей степени, чем простагландин Е£ (рис. I а).

Известно, что у позвоночных животных именно простагланди-ны, главным образом простагландин Ео, оказывает отрицательное влияние на пролиферацию клеток при действии различных митоге-нов. Очевидно, что это свойство простагландинов проявляется при регуляции пролиферации сперматогониев у двустворчатых моллюсков.

3.4. Стероидергические элементы половой железы двустворчатых моллюсков и морских ежей

Гистохимическое изучение локализации ЗВ- и 17£-гидрок-систероиддегидрогеназ у приморского гребешка и мидии Грея показало, что эти ферменты выявляются как в семенниках, так и в яичниках исследованных животных. Высокая активность ферментов отмечается в телах и отростках вспомогательных клеток. Известно, что эти клетки выстилают ацинус, имеют' широкое основание размером до 12 мкм и отростки, направленные к центру ацинуса. Количество таких клеток на протяжении полового цикла остается относительно постоянным. Эти клетки делят ацинусы на отделы -компартменты, в которых развиваются половые элементы.

Гранулы диформазана, распределенные диффузно по цитоплазме, выявляются также в гранулярных амебоцитах. Эти клетки имеют хорошо развитые отростки, прилегающие к половым элементам. Размер гранулярных амебоцитов у приморского гребешка составляет около 10 мкм, а у мидии Грея - 20 мкм. Цитоплазма богата крупными округлыми митохондриями с плотным матриксом. Хорошо развиты эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. В зоне этих органелл имеются многочисленные гранулярные включения. Немногочисленные электронноплотные гранулы ферроцианида меди, указывающие на локализацию ферментов, располагаются вблизи гладкой эндоплазматической сети или прилегают к наружной поверхности ее мембраны, а их скопления выявляются в глобулах.

У морских ежей активность ферментов стероидогенеза локализована в хорошо развитых вспомогательных клетках половых желез. Эти клетки при световом микроскопировании имеют неправильную форму без четких границ и многочисленные отростки.

Ядра - вытянутые или овальные.

Ранее у морской звезды Asterias rúbeas удалось выявить элементы по ультраструктурной характеристике сходные со стеро-идпродуцирущими клетками позвоночных (Schoenmakers et al., 1981. Cell Tissue Ees., 217: 577-597), но локализация ферментов обмена в половых железах беспозвоночных оставалась неизвестной. Обнаруженная нами высокая активность 3ß- и 1?В- гидроксисте-роиддегидрогеназ в отдельных вспомогательных клетках двустворчатых моллюсков и морских ежей и гранулярных амебоцитах двустворчатых моллюсков, их ультрасгруктурная характеристика и тесная взаимосвязь с половыми элементами доказывает стероидерги-ческую природу этих клеток.

3.5. Локализация ферментов стероидогенеза в половых клетках

Кроме специализированных стероидергических элементов у двустворчатых моллюсков и морских ежей ферменты стероидогенеза локализованы в половых метках. Как правило, зерна диформазана в ооцитах при выявлении 5В-гидроксистероиддегидрогеназы располагаются диффузно, а при выявлении 17В-гидроксистероиддегидро-геназы, главным образом, перинуклеарно. В процессе роста ооци-тов отмечается изменение активности ферментов. Интенсивность гистохимической реакции в молодых растущих ооцитах выше, чем в крупных свободнолежащих ооцитах трофоплазматического роста. Активность 3ß- и 17-б-гидроксистероиддегидрогеназ в ооцитах, закончивших рост, невысокая и сохраняется на таком уровне до нереста. Достоверность этих сведений подтверждается обнаружением иммуноцитохкмическим методом наличия зстрадиола в яйцеклетках морских ежей (Вараксин, Вараксина, 1590).

Положительную реакцию на ферменты дают различные популяции клеток сперыатогенного ряда. Невысокая активность 3ß- и Ч7^-гидроксистероиддегидрогеназ выявляется в сперматогониях. В период созревания сперматоцитов и формирования сперматид и сперматозоидов их активность возрастает.

В ооцитах млекопитающих также показано присутствие различных ферментов стероидогенеза ( Niimura et al., 1980. Jap. J. Zootech. Soi., 51: 191-196; Patinawin et al-, 1980. J. Steroid Biochem., 13: 1277-1281)и определено содержание 3ß-гидроксистероиддегидрогеназы (Tsutsumi et al., 1982. Folia

Endocrinol. Jap.j 58: -1321-1322). Более того иммуноцитохими-ческими методами в ооцитах человека найдены прогестерон и эст-радиол и доказана их эндогенная природа (Suzuki et al-, 1983-Fertil. Steril.,39:683-689). Известно, что сперматозоиды морских ежей и устрицы гигантской способны превращать зстрадиол в эстрон, а тестостерон - в андростендион. Эти сведения позволяют считать, что гаметы способны продуцировать и трансформироват половые стероидные гормоны, которые, очевидно, играют важную роль в их развитии и оплодотворении. С другой стороны, большая часть авторов рассматривает половую клетку как мишень для стероидных гормонов. Полученные нами и имеющиеся в литературе сведения позволяют рассматривать половую клетку двустворчатых моллюсков и морских ежей как стероидцептивную-стероидергическую систему. Это заключение послужило основой для проведения исследований значения половых стероидных гормонов в гаметогенезе двустворчатых моллюсков и морских ежей.

3.6. Влияние половых стероидных гормонов на оогенез ■

Нами изучено влияние половых стероидных гормонов на оогенез на различных стадиях полового цикла у приморского гребешка и морских ежей. У приморского гребешка на стадии половой инертности через 30 сут после введения прогестерона и тестостерона масса яичника и гонадный индекс практически не меняются, но достоверно возрастают после введения эстрадиола. Во всех случаях в половых железах наблюдается увеличение числа гониев и появление ооцитов малого роста, в то время как у животных контрольной группы последние отсутствуют.

Половые железы моллюсков, взятые на стадии начала роста, содержат преимущественно ооциты, вступающие в фазу большого роста. Однократное введение эстрадиола, прогестерона и тестостерона увеличивает через 15 сут массу гонады на 20-30%, объемы* ацинусов в 1,5-2 раза, а ооцитов на 30-40%. Повторное введение половых стероидных гормонов оказывает более выраженное действие на гонаду. Достоверно увеличиваются масса половой железы и гонадный индекс, объемы ацинуса и зоны, занятой половыми клетками. Объем ооцитов более чем в три раза превышает этот показатель в контроле. В половой железе присутствуют все типы клеток - от оогониев до ооцитов, закончивших рост и потерявших связь с базальной мембраной.

Половые стероидные гормоны повышают митотическую активность гониев в 2,5 раза. Наряду с этим увеличивается количество ооцитов малого роста в 2-4 раза, а ооцитов большого роста -на 55-65%. Численность пристеночнолежащих ооцитов уменьшается, а свободнолежащих увеличивается. Эти данные свидетельствуют об активации пролиферации гониев и роста ооцитов. Анализ частот распределения ооцитов по диаметру показывает, что у опытных животных отмечается большая гетерогенность и значительно более широкий разброс диаметра ооцитов. Размер половых клеток увеличивается в 1,5 раза и достигает 65 мкм, в то время как в контроле не превышает 40 мкм.

Однократное введение эстрадиола и тестостерона на преднерестовой стадии вызывает увеличение массы яичников более чем на 25$. Одновременно повышается гонадный индекс и возрастает объем ацинусов. На фоне этих показателей наблюдается интенсивный рост ооцитов, что проявляется в увеличении их объема почти в 10 раз, а ядер - в 3 раза. Формируются свободнолежащие клетки, завершающие трофоплазматический рост. Меняется картина размерных частот распределения ооцитов. Если в контроле размер ооцитов колеблется от 15 до 60 мкм, с преобладанием клеток диаметром 35-45 мкм, то тестостерон вызывает массовое появление ооцитов диаметром 75-105 мкм, а эстрадиол - 95-110 мкм.

У морских ежей однократное введение эстрадиола на стадии начала развития приводит к увеличению почти.в 1,5 раза массы гонады, объема ацинусов - более чем в 3 раза, а объема половых клеток - на 30-40%. Соответственно изменяется клеточный состав гонады. Появляются крупные свободнолежащие половые клетки, третью часть которых составляют зрелые яйцеклетки, отсутствующие у животных контрольной группы. При повторном введении эстрадиола объем ооцитов увеличивается на 40-55%, в 2,5 раза возрастает объем ядер. Доля пристеночнолежащих ооцитов сокращается до 66,2%, число крупных свободнолежащих клеток, готовых к созреванию, увеличивается в 5 раз, а зрелых яйцеклеток - более чем в 2 раза.

Введение эстрадиола в период активного гаметогенеза увеличивает массу половой железы на 50%, объем ацинусов - в 3,5 раза, а объем половых клеток - в 3 раза. В ацинусах содержатся преимущественно зрелые половые клетки и небольшое число свободнолежащих ооцитов трофоплазматического роста.

Значение половых стероидных гормонов в размножении беспозвоночных долгое время оставалось неизвестным. Было показано, что введение эстрадиола гигантской устрице приводит к увеличению дыхания и гликолиза в яичнике ( Mori, 1968. Bull. Jap. Soc. Sei. Pish., 34: 915-919 ). Позднее биохимическими методами обнаружено изменение содержания некоторых половых стероидных гормонов в ходе репродуктивного цикла у морской звезды ( Schoennaiers, Dieleman, 1981. Comp. Endocrinol., 4-3: 915-919). После нереста уровень эстрогенов низок, их количество возрастает с началом роста ооцитов и снижается на преднерестовой стадии. Это дало авторам возможность считать, что 1?ß-эстрадиол функционирует в репродуктивной системе морских звезд как половой гормон. Результаты наших исследований показывают, что половые стероидные гормоны у самок двустворчатых моллюсков и морских ежей индуцируют развитие гонады, пролиферацию и рост половых клеток.

3.7. Половые стероидные гормоны ускоряют синтез белка в яичнике

Представленные выше сведения позволяют предполагать наличие связи сгероидогенеза с синтезом белка в яичнике двустворчатых моллюсков и морских ежей. Исследование синтеза белка проводили авторадиографическими и биохимическими методами спустя 48 ч после введения эстрадиола дипропионата. Изучение радиоавтографов показывает, что у контрольных животных интенсивность включения 3Н-лейцина в_ ядрышко, ядро и цитоплазму пристеночных и свободнолежащих ооцитов неодинакова (табл. 5). Наиболее интенсивно метится цитоплазма свободнолежащих ооцитов. Число зерен серебра над ядрами составляет 50-55/2 их количества над цитоплазмой ооцитов, ядрышко практически не метится. Зерна серебра над цитоплазмой ооцитов .распределены, как правило, небольшими группами, над ядром они сосредоточены по его периферии. Интенсивность включения 3Н-лейцина в исследуемые структуры пристеночных ооцитов была в несколько раз ниже.

Введение эстрадиола приводит к значительным изменениям белоксинтезирующей активности половых клеток приморского гребешка. Интенсивность включения 3Н-лейцина в ядро и цитоплазму ооцитов превышает контрольный уровень более чем в 3 раза, а в ядрышко - в 5-6 раз. Характер распределения метки над ооци-

тами гребешка после воздействия эстрадиола был таким же как в контроле. Блокаторы синтеза белка - пуромицин и актиноми-цин Д достоверно сникают интенсивность включения 3Н-лейцина в ооциты гребешков, подвергнутых воздействию эстрадиола (табл. 5). Актиномицин Д оказывает большее угнетающее действие на синтетические процессы, чем пуромицин. -

Исследование белкового синтеза в яичнике приморского гребешка, определяемого по включению 3Н-лейцина с учетом проницаемости клеток для предшественника, позволяет установить различия синтетических процессов в контроле и опыте. Расчетная величина синтеза белка у контрольных животных равна 435 имп/мин. Введение эстрадиола сопровождается резким увеличением скорости синтеза белка, уровень которого соответственно превышает контрольный на 72%. Анализ изменений объема внутриклеточного фонда свободного лейцина показывает, что после введения эстрадиола его величина практически не меняется и составляет I9I24, а в контроле - 20805 имп/мин соответственно. Введение эстрадиола увеличивает включение 3Н-лейцина в белки. Радиоактивность белковой фракции в данном случае равна 712, а в контроле - 398 имп/мин. Ускорение синтеза белка почти в 2 раза Наблюдается при неизменной проницаемости клеток для аминокислоты и постоянном фонде внутриклеточного лейцина.

Введение в инкубационную среду блокаторов белкового синтеза приводит к угнетению синтетических процессов в яичнике. В среде с добавлением пуромицина происходит торможение включения" предшественника в белки более чем в 3 раза от уровня контроля. Одновременно наблюдается уменьшение скорости синтеза белка. Пуромицин снижает интенсивность скорости синтеза белка ■ на 52%, а актиномицин Д - на 67%. Анализ изменений внутриклеточного фонда 3Н-лейцина показывает, что его величина при введении в инкубационную среду блокаторов также уменьшается.

Таким образом, после введения эстрадиола дипропионата интенсивность включения меченого лейцина возрастает во всех изученных структурах ооцитов приморского гребешка. Увеличение белкового синтеза в ооцитах моллюска коррелирует с ускорением развития яичников и ростом половых клеток, что, очевидно, сопряжено с усилением процессов желткообразования (Зараксина, Ва-раксин, 1991). 0 возможной роли половых стероидных гормонов в вителлогенезе свидетельствуют данные, полученные на ооцитах

Таблица 5

Влияние эстрадиола дипропионата, пуромиц'ина и актиномицина Д на включение 3Н-лейцина в ооциты приморского гребешка

Варианты Пристеночнолежащие ооциты Свободнолежащие ооциты

опыта ядрышко ядро цитоплазма яДрышко ядро цитоплазма

I - контроль 0,4+0,05 3,6+0,4 6,4+0,6 1,2+0,08 11,2+1,0 20,6+1,9

п - эстрадиол-дипропионат 2,5+0,2х II,9+1,0х 22,8+0,3х 5,2+0,5х 32,5+3,2х 68,2+6,9х

ш - эстрадиол-дшропионат+ пуромицин I,5+0,13х в,5+о,ак 18,6+1,6х 2,9+0,25х 22,5+2,4х 47,5+4,4х

1У - эстрадиол-дипропионат+ актиномицин Д 0,6+0,06* 4,4+0,5х 7,810,7х 0,8+0,08х 13,3+1,Iх 23,6+2,Iх

Примечание, х _ р<о,05. Контролем для Ш и 1У вариантов служил вариант П опыта.

морских звезд ( Schoenmakers, 1981. Adv. Invert. Reprod., N.Y. etc: 127-150; Takahashi, 1982. Bull. Jap. Soc. Sei. Fish.,

48: 509-511).

Известны сведения о регуляции синтеза белка половыми стероидными гормонами в репродуктивном тракте млекопитающих. У этих животных способность гормонов оказывать биологическое действие связывают с наличием рецепторных белков. Обнаруженные в цитозоле пилорических придатков самок морских звезд специфические белки обладают высоким сродством и низкой связывающей емкостью к стероидным гормонам, что обусловливает возможное сходство механизмов действия стероидных гормонов у позвоночных и беспозвоночных жнзотнех ( De Waal et al., 1982. Mar. Biol. Lett., 3: 317-323).

Анализ полученных нами данных позволяет сделать вывод, что введение эстрадиола дипропионата приморскому гребешку повышает белоксинтезирующую активность половой клетки. Одновременно нарастает интенсивность синтеза белка в яичнике. Изменение уровня синтетической деятельности клеток сопряжено с эффективным включением предшественника в белки при постоянном пуле свободной аминокислоты и не зависит от скорости поступления предшественника в клетку. Это дает основание полагать, что половые стероидные гормоны у приморского гребешка имеют прямое отношение к регуляции синтеза белковых молекул в клетках половой железы.

3.8. Влияние половых стероидных гормонов на " сперматогенез

Исследование влияния эстрадиола, тестостерона и прогестерона на сперматогенез приморского гребешка показывает, что во всех случаях отмечается достоверное увеличение площади ацину-сов. Сперматогонии на стадии половой инертности немногочисленны и выраженной зоны размножения и роста в ацинусах не имеется. Поэтому основными морфометрическими и цитологическими параметрами на этой стадии развития половой железы, наряду с.площадью ацинусов, является плотность и состав сперматогенных клеток. При введении эстрадиола, тестостерона и прогестерона плотность сперматогониев возрастает в 2,6 4,1 и 1,6 раза соответственно. Другие клеточные элементы сперматогенного ряда в ацинусах отсутствуют .

Для определения влияния стероидных гормонов на пролиферацию гониев наиболее удобной является стадия начала гаметогене-за. В этот период идут активные процессы пролиферации, в гонаде накапливается пул сперматогониев, формирующих зону размножения и роста. После введения эстрадиола, прогестерона и тестостерона возрастает площадь ацинусов. Во всех случаях значительно увеличивается зона размножения и роста.

После завершения пролиферации сперматогониев в гонаде происходит созревание половых клеток. Введение самцам гребешка эстрадиола вызывает увеличение размеров ацинусов, при этом площадь зоны размножения и роста не меняется, но значительно, в 2,5 раза, возрастает площадь зоны формирования. Более резко меняются морфомегрические параметры при введении тестостерона, что выражается в увеличении зоны формирования в 3 раза. Сперма-тогонии единичны, но почти в 2 .раза после действия гормонов возрастает плотность сперматоцитов П. Меняется клеточный состаг зоны формирования. После введения эстрадиола в зоне формирования появляются средние (7%) и поздние (3%) сперматиды, а после введения тестостерона их доля увеличивается до 23 и 17% соответственно.

Литературные данные о физиологической значимости половых стероидных гормонов у самцов двустворчатых моллюсков, как и у других беспозвоночных, крайне ограничены. Известно, что введение тестостерона, прогестерона и эстрона виноградной улитке приводит к накоплению в овотестисе в основном сперматоцитов П, в то время как 19-нортестостерон, наряду со сперматоцитогене-зом, активирует формирование сперматозоидов ( Scaba, Bierbau-ег, 1979, 1981. Acta Biol. Med. Germ., 38: 1145-1148, Acta Biol. Acad. Sei. Hung.,32: 15-18). Полученные нами сведения позволяют считать, что половые стероидные гормоны - эстра-диол, тестостерон и прогестерон вызывают пролиферацию сперматогониев в семенниках 'приморского гребешка как на стадии относительной половой инертности, так и на стадии начала гаметоге-неза. Их действие особенно четко проявляется на стадии начала гаметогенеза, когда плотность гониев в ацинусах семенника увеличивается в несколько раз. Отсутствие сперматоцитов I свидетельствует о том, что половые стероидные гормоны не вызывают их созревания. Напротив, введение эстрадиола, тестостерона и прогестерона способствует накоплению в ацинусах сперматоцитов П

Формирование сперматид тоже ускоряется после введения гормонов, особенно тестостерона, который приводит к увеличению в ацину-^ сах количества поздних сперматид и сперматозоидов.

У морских ежей тестостерон и эстрадиол также оказывают стимулирующее действие на раззитие половой железы. Масса гонады возрастает почти на 5С$, одновременно увеличиваются гонадный индекс и размеры фолликулов. Их объем при действии тестостерона возрастает почти в 2, а эстрадиола - более чем в 2 раза. Цитологические наблюдения показывают, что в зоне размножения и роста возрастает число редукционных делений в спермато-г.енных клетках, что приводит к образованию большого числа сперматоцитов П. Увеличение зоны формирования происходит за

счет накопления сперматид и, главным образом,' сперматозоидов.

Сходные данные были получены при инъекции эстрадиола и эстрона самцам морских звезд ( Taiahashi, 1982. Bull. jap. Soc. Soi. Fish., 4-S: 509-511) и при действии тестостерона ацетата на креветок (Hagabhushanan, Kuliarni, 1981. Aquaculture, 25: 19-27). Увеличение размеров ацинусов, объемов зоны размножения и роста, зоны формирования, накопление сперматоцитов П и сперматозоидов у исследованных нами морских ежей после действия стероидных гормонов согласуется с данными, полученными нами на двустворчатых моллюсках. Таким образом, у самцов морских ежей, как и двустворчатых моллюсков, половые стероидные гормоны влияют, главным образом, на пролиферацию сперматогониев, сбзревание сперматоцитов П и спермиогенез.

3.9. Созревание ооцитов

3.9.1. Влияние серотонина на реинициацию мейоза в ооцитах двустворчатых моллюсков

Созревание ооцитов у большинства беспозвоночных и позвоночных животных блокируется на стадии профазы мейоза I. В таком состоянии они могут остазаться долгое время и затем возобновлять мейоз в стзе? на экстраклеточный сигнал. Зтот процесс включает разрушение зародышевого пузырька, конденсацию хромосом и образование веретена деления. Позднее выделяется первое полярное тельце и развитие ооцитов вновь блокируется на ста- . дии метафазы П как, например, это происходит у большинства млекопитающих, амфибий и рыб. У морских звезд мейоз после

гормональной стимуляции претерпевает все стадии до полного завершения, а у некоторых беспозвоночных он вновь блокируется в метафазе I- Реинициация мейоза после второго блока и активация ооцита к последующему развитию вызывается оплодотворением (Eckberg, 1988. Biol. Bull., 1?4: 95-108; Guerrier et al., 1990. Int.! J. Dev. Biol., 34: 93-109). -

Созревание половой клетки тесно скоррелировано с овуляцией и нерестом. Ведущим фактором, вызывающим разблокировку мейоза и овуляцию ооцита у млекопитающих, амфибий и рыб, является гонадотропный гормон. У иглокожих сходным по значению с гонадотропкым гормоном позвоночных выступает гонадостимулирую- • щее вещество. Оно выделено из радиальных нервов морских звезд, является пептидом с молекулярной массой около 2100 дальтон, однако его структура не расшифрована. У заднежаберных моллюсков первичным стимулом, вызывающий реинициацию мейоза и экструзию.,-гамет, является гормон овуляции, регуляторный пептид, синтезируемый нейросекреторными клетками париетовисцерального ганглия. Подобный по химической структуре и биологическому действию регуляторный пептид найден у заднежаберных и легочных брюхоногих моллюсков. У двустворчатых моллюсков также выделен гонадотропный регуляторный пептид с неизвестной пока структурой, вызывающий разрушение зародышевого пузырька ( Fang et al., 1985. Acta Oceanol. Sin., 4-: 107-112). Ранее мы наблюдали усиленное выведение нейросекреторного материала из нейросекреторкьгх клеток у двустворчатых моллюсков перед нерестом. За несколько дней до нереста почти все клетки освобождаются от нейросекрета, который локализуется з нерзкых волокнах. В гонаде этих жизотных описаны пептидергические терминала, содержащие гранулы неодинакового размера и разной плотности, которая меняется, очевидно, по мере секреции материала в ткани органа или его сосудистую систему (Мотавкин, Вараксин, 1983). Наличие таких аксонов среди коллагеновых волокон и мышечных клеток гонады подтверждает участке гонадотропного регуляторного пептида в созрезакии яйцеклеток и нересте у зтих кивоткых.

Гормональная инк/кцая рекнициации мейоза является многоступенчатым процессом. У рыб и амфибий действие гонадотропного гормона опосредуется синтезом в фолликулярных клетках стероидных гормонов, вызывающих созревание ооцита ( Nagaharaa, 1987. Devel. Growth Differ., 29: 1-12). У морских звезд гонадо-

стимулирующий регуляторный пептид стимулирует синтез в фолликулярных клетках мейозиндуцирутощего вещества - I ыетиладенина.

У двустворчатых моллюсков таким мейозиндуцирующим фактором, очевидно, является серотонин. Добавление серотонина к взвеси яйцеклеток дозозависимо индуцирует разрушение зародышевого пузырька в ооцитах спизулы сахалинской. Количество яй- . цеклеток с разрушенным зародышевым пузырьком значительно воз- : растает при концентрации серотонина в инкубационной.среде выше 0,1 мкм (рис. 2). Разрушение зародышевого пузырька в ооци-тах спизулы сахалинской после их активации серотонином протекает, по-видимому, с участием ионов кальция. Так ли это происходит в природе? Ответить на этот вопрос помогло исследование механизмов этого процесса.

100 -

Ю'9 10'' 10'' 10'6 10'* 10-*

Рис. 2. Влияние серотонина на разрушение зародышевого пузырька в ооцитах спизулы сахалинской. По оси абсцисс -концентрация серотонина, в Ы; по оси ординат - доля яйцеклеток с разрушенным зародышевым пузырьком, в %.

3.9.2. Изучение ионных механизмов внутриклеточной

сигнализации при индукции реиницяации мейоза серотонином

При добавлении серотонина к ооцитаы спизулы сахалинской наблюдается увеличение содержания свободного кальция в цито-золе (рис. 3). Нарастание концентрации [Са^+1± 'происходит в течение первых 5-6 мин при температуре 18-20 С. После быстрой фазы наступает медленная фаза роста, продолжающаяся около 20 мин, после чего концентрация 1 вновь уменьшается-.

Для ответа на вопрос - принимает ли участие внутриклеточное депо кальция в формировании (Са^"*] 1 сигнала, были проведены опыты на ооцитах, окрашенных хлортетрациклином. Как видно из рисунка 4, серотонин вызывает выброс Са^"г из внутрикле-

точных структур, очевидно, в первую очередь, из эндоплазмати-ческого ретикулума. Выход из эндоплазматического ретикулума происходив в течение 5-о мин, что соответствует быстрой фазе роста [Са^+] 1 , наблюдаемой на рисунке 5.-Затем происходит медленный рост флюоресценции хлортетрациклина, что отражает возвращение Са в эндопдазматический ретикулум и, примерно, через 42 мин уровень Са^ в эндоплазма?ическом ретику-луме достигает исходного. Таким образом, внутриклеточное депо половой клетки вновь заполняется кальцием и только после этого времени она будет готова к восприятию следующего сигнала.

Рис. 3. Изменение концентрации свободного Ca¿+ в ооцитах спи-зулн сахалинской под действием серотонина, измеренное по флюоресценции lndo-1. Уменьшение флюоресценции соответствует росту [Ca2+]i . Возбудаение -365 нм, регистрация -. 490 мл.

Рис. 4. Изменение концентрации Саг_г во внутриклеточных структурах ооцита, спизулы сахалинской под действием серотонина, измеренное по флюоресценции хлор-тетрациклина. Уменьшение флюоресценции соответствует выходу Са^+ из депо, а -.клетки не отмыты от хлор-тетрациклина; б - клетки отмыты от внешнего хлортетрациклина. Возбуждение - 405 нм, регистрация - 530 нм.

Известно, что при активации рецепторов, сопряженных с фосфоинозитидной системой внутриклеточной передачи сигнала, происходит не только мобилизация Са^+ из эндоплазматического ретикулума, но таюке активируется Иа.+/Е+- обмен, что приводит

Сг

\ * 4т!п

S \

\ ..... \ / ......••••'

{[со "к

Cr I

fol II i

. \ 4mtn

к увеличению рН цитозоля клетки. С помощью флюоресцентного индикатора рН показано, что серотонин вызывает быстрое защелачи-вание цитозоля в течение 14 мин. Затем снижается даже ниже исходного уровня (рис. 5). При добавлении ингибиторов Na+/H+ -обмена защелачивания цитоплазмы ооцита мы не наблюдали.

Рис. 5. Изменение pHi в ооци-тах спизулы сахалинской под влиянием серотонина, измеренное по флюоресценции 2,7-бис-карбоксиэтил-б(б)-карбоксифлю-оресцеина. Возбуждение - 436 нм; регистрация - 530 нм.

3.9.3. Действие некоторых полиненасыщенных жирных

кислот и их метаболитов на реинициацию мейоза

У многих беспозвоночных найдены эйкозаноиды - продукты окислительного метаболизма полиненасыщенных жирных кислот и прежде всего С-20 кислот (Ruggeri, Throughgood, 1985- Маг. Ecol. Erogr. Ser., 23: 3501-306). В половой железе двустворчатых моллюсков выявлены проста гландины и гидроксикислоты. Содержание некоторых из них в значительной степени меняется на протяжении репродуктивного цикла и достигает максимума к началу нереста (Ono et al., 1982. Наг. Biol. Lett., 3: 223230; Ruggeri, Thoroughgood, 19S5» Prostagland. Leukotrien. Me4>, 20 : 69-77)- Мейддер с соавторами (Meijer et al., 19S6. Dev.Biol.,114-:22-32)показали, что липоксигеназные метаболиты полиненасыщенных жирных кислот индуцируют созревание ооцитов у морских звезд. Кажется естественным предположение, что индуцированное серотонином разрушение зародышевого пузырька протекает с участием метаболитов полиненасыщенных жирных кислот, которые выступают в качестве вторичных мессенджеров внутриклеточной передачи сигнала с серотонинового рецептора.

Добавление к суспензии ооцитов ключевых жирных кислот (п-6) серии - линолиевой и арахидоновой индуцирует разрушение зародышевого пузырька аналогично действию серотонина. Зй-козапентаеновая и докозогексаеновая кислоты, относящиеся к (п-3) серии, не вызывают реинициацию мейоза (рис. 6). 5-липо-

Сг

й?5у 1

f " | 4 mm

IpH'L Ч......--•"'

ксигеназные производные - 5-гидроксиэйкозатетраеновая и 5-гид-роксиэйкозапентаеновая кислоты действуют таким же образом как и их соответствующие метаболические предшественники - ара-хидоновая кислота и эйкозапентаеновая кислота (рис. 7). Другие жирные кислоты - 5,6-дегидроарахидоновая, арахидиновая, октадекапентаеновая не вызывают реинициацию мейоза.Специфический ингибитор липоксигеназного. пути окисления полиненасыщенных жирных кислот нордигидрогуаретиковая кислота блокирует разрушение зародышевого пузырька. После ее добавления к взвеси ооцитов до конечной концентрации 10-20 мкМ разрушение зародышевого пузырька, стимулированное серотонином или ионофором ^23187' не пРоисхоАиТ-

Рис. б. Влияние некоторых полиненасыщенных жирных кислот (п-6 ) и (п_3 ) серий на разрушение зародышевого пузырька в ооцитах спизулы сахалинской. Ооциты были обработаны арахи-доновой (светлые кружки), лино-левой (темные кружки), эйкоза-пентаеновой (светлые квадраты) и докозагексаеновой (темные квадраты) кислотами. По оси абсцисс - концентрация, в Ы; по оси ординат - доля ооцитов с разрушенным зародышевым пузырьком, в %.

Серотонин содержится в нервной системе,' половой железе и целомической жидкости двустворчатых моллюсков (Деридович, Хотимченко, 1988. Биол. моря, 5: 3-16). Гистофлюоресцентными и иммуногистохимическими методами показано распределение серо-тонинергических нейронов в ганглиях и иннервация серотонинер-гическиыи нервными волокнами оболочки, стенки ацинусов и половых протоков гонады некоторых видов этих животных (Вараксин и др., 1983; Katsutaui, Noaura, 1936. Cell Tissue Bes., 244: 515-517). Зти сведения, а также дозозависимый характер действия серотонина на разрушение зародышевого пузырька и недавнее

сообщение о наличии серотониновых рецепторов на поверхности ооцитов спизулы ( Kadam et al., 1988. Biol. Bull., 175: 310) дают основание считать, что серотонин в данном случае играет роль нейрогормона и является эндогенным фактором реинициации мейоза у двустворчатых моллюсков.

Рис. 7. Влияние 5-гидроксиэй-козатетраеновой (темные кружки) и 5-гидроксиэйкозапентае-новой (светлые кружки) жирных кислот на разрушение зародышевого пузырька в ооцитах спизулы сахалинской. По оси абсцисс - концентрация, в М; по оси ординат - доля ооцитов с разрушенным зародышевым пузырьком, в %.

Известно, что реинициация мейоза у морских звезд вызывается липоксигеназным производным арахидоновой 5,8,11,14-20:4 кислоты - 8-гидрокси-5,9,П,14-эйкозатетраеновой кислотой. Другие жирные кислоты, в структуре которых имеются двойные связи в положении 5,8,II-углеродного скелета, также способны вызывать реинициацию мейоза у этих животных, при этом наличие двойной связи при С-8 абсолютно необходимо для проявления биологической активности. Гораздо меньшую активность в отношении реинициации мейоза у морских звезд проявляют кислоты с двойными связями при 6,9,12 атомах углерода (Meijor et al., 1986. Prostagl. Leutotrien. Med., 23: 179-184-). Однако не все иглокожие отвечают созреванием ооцитов на действие 8(Е)-гидрокспэйкозатет-• раеновой кислоты и эти различия являются доказательством того, что яйцеклетки беспозвоночных могут иметь липоксигеназы с различной специфичностью.

Можно полагать, что действие серотонина, линолиевой кислоты, арахидоновой кислоты и ее окисленного метаболита 5-гид-роксиэйкозатетраеновой кислоты на разрушение зародышевого пузырька у двустворчатых моллюсков сопряжены друг с другом. Это взаимодействие, очевидно, осуществляется в половой клетке на уровне внутриклеточных механизмов трансдукции сигнала. Наличие на поверхности ооцита спизулы серотониновых рецепторов дает

основание считать, что серотонин оказывает влияние непосредственно на мембранные рецепторы половой клетки. Известно, что одним из молекулярных механизмов действия серотонина на эффек-торную клетку является активация аденилатциклазной системы (Sonetti et al., 1987. Neurochem. Int., 11: 119-126). В другом случае в качестве вторичного мессенджера выступает Са который регулирует в клетке многие формы активности, в частности, сосфолилидзависимую лротеинкиназу ( Berridge, 1985-Triangle, 24: 79-90; Eckberg, 1988. Biol. Bull., 174:95-108).

В яйцеклетках спизулы сахалинской, образующийся после добавления серотонина Са2+, очевидно, активируя Са^+-зависимую фосфолипазу Ag, приводит к образованию свободной арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран, а затем ее липоксигеназных метаболитов и, в конечном итоге, вызывает разрушение зародышевого пузырька. Такой путь реинициации мейоза описан у некоторых видов морских звезд. Другой возможный способ образования пула арахидоновой кислоты в клетке связан с влиянием Са^+ на активность инозитолспецифической фосфолипазы С' с образованием диа-цилглицерина, который, в свою очередь, гидролизуется диглице-ридацилгидролазой с образованием арахидоновой кислоты. Мы не располагаем данными какой из двух выше указанных путей преобладает у двустворчатых моллюсков. Однако только экзогенная Са*"+ -активируемая фосфолипаза С вызывает созревание ооцитов у морских звезд (Meijer et al., 1984. Dev. Biol., 106: 368-378).

Таким образом, полученные нами и тлеющиеся в литературе сведения дают основание считать, что реинициация мейоза у двустворчатых моллюсков инициируется гонадостимулирующим регуля-торным пептидом. Серотонин у этих животных подобно 1-метиладе-нину у иглокожих, является ыейозиндуцирующим веществом. Передача сигнала с серотонинового рецептора в клетку происходит по Са^+-фосфоинозитедзависимоыу пути. Активным: ' участником механизмов усиления рецепторзависимых внутриклеточных сигналов является метаболит арахидоновой кислоты - 5-гидроксиэйкозаТет-раеновая кислота.

3.10. Нерест

Как было отмечено выше, нерест у двустворчатых моллюсков стимулируется гонадотропныы регуляторным пептидом. Его влияние на овуляцию и нерест опосредуется у животных различных уровней

развития веществами разной химической природы. Так, если у морских звезд I-метиладенин одновременно с созреванием ооцитов вызывает нерест у этих животных, то у двустворчатых моллюсков таким промежуточным индуктором является серотонин.

Действительно, еще 30 лет назад было предположено, что серотонин принимает участие в нересте у моллюсков ( Mann, 1963-Nature, 199: 1066-1067). Задачей настоящей работы явилось исследование влияния серотонина на стимуляцию нереста у двустворчатых моллюсков, выяснение некоторых механизмов его действия и разработка удобного способа стимуляции нереста у этих животных. Основные опыты проведены на приморском гребешке в конце апреля - начале мая до начала нереста моллюсков в естественных условиях. Повышение температуры воды в аквариумах, содержащих акклимированных к нерестовой температуре воды животных, до 15°С .приводит к вымету гамет у самцов приморского гребешка через 4 ч, а у самок - через б ч после начала стимуляции. У животных без предварительной акклимации нерест начинается позднее. Введение серотонина приводит к резкому сокращению времени, необходимого для стимуляции нереста. Так, у самцов нерест начинается через 10-20 мин, а у самок - через 30-50 мин после инъекции. У неак-климированных животных в преднерестовый период после инъекции серотонина нерест у самок не происходит в течение 24 ч, хотя у самцов он протекает в те же сроки, что и у акклимированных животных. Во второй полозине мая, когда в природе начинается естественный нерест моллюсков, а температура воды поднимается до Ю-12°С, нерест как у самцов, так и у самок легко вызывается инъекцией серотонина.

Развитие эмбрионов и личинок после оплодотворения гамет, полученных с помощью обоих методов, протекает сходным образом. Выделение полярных телец происходит через 3-4 мин. Через 1-1,5 ч начинается первое деление, а второе - через 14-15 ч. Вращение зародышей в культуре отмечается через 17 ч после' оплодотворения, а массовое всплытие происходит через 20-22 ч. Характерная для двустворчатых моллюсков асинхронность развития на ранних стадиях утрачивается к этому периоду. Спустя трое суток основная масса личинок в обеих культурах находится на стадии прямозамко-вого велигера. Личинки активно плавают и питаются. Первые велико нхи, которые легко идентифицировать по образованию макушки, появляются в культурах на девятые сутки развития. На 16-20-е

сутки развития в культурах большинство личинок находится на стадии развитого великонха. Отклонений в развитии при этом не наблюдается. У великонхов в обеих культурах имеются хорошо сформированные внутренние органы, идет образование ноги. Педи-велигеры размером 250 мкм появляются в культурах на 28-е сутки развития. Они передвигаются с помощью хорошо сформированной-ноги, однако не утрачивает способности к плаванию. Выживаемость личинок не зависит от метода стимуляции нереста и составляет от I до 2% (Вараксин, Найденко, 1989).

Использование инъекций серотонина для стимуляции нереста у других двустворчатых моллюсков в преднерестовый период дает сходные положительные результаты. Представляет, например, особый интерес выяснение возможности использования серотонина для стимуляции нереста у мидии Грея, у которой долгое время не удавалось получить массового вымета гамет с помощью существующих методов (Дроздов и др., 1983. Биол. мидии Грея. М.: Наука, с. 35-41). В этой работе авторы сообщают, что при использовании 0,5 М раствора хлористого калия или при надрезании гонады они получали небольшое количество г.амет, однако при этом образовывалось много отходов в виде незрелых ооцитов и обрывков соединительной ткани. Инъекция 0,25 мл 0,001 М раствора серотонина креатинин-сульфата вызывает массовый вымет гамет как у самцов, так и у самок мидии Грея. Степень оплодотворения полученных гамет высока; развитие эмбрионов и личинок не отличается от описанного ранее. В полученной нами культуре развитие оплодотворенных яйцеклеток прослежено до стадии Ееликонха. При этом отмечается отсутствие отклонений в развитии эмбрионов и личинок и их высокая выживаемость (Найденко, Вараксин, 1988).

Это дает основание считать, что серотонин, подобно 1-мети-ладенину у иглокожих, является природным посредником действия гонадостимулирующего гормона как на созревание гамет, так и нерест у двустворчатых моллюсков.

3.II. Эмбриональное развития

3.II.I. Регуляторные пептиды участвуют в регуляции эмбрионального и личиночного развития

Очевидно, способность к синтезу регуляторных петидов, как и некоторых других биологически активных соединений, сохраняется после оплодотворения и проявляется уже на ранних ста-

днях эмбрионального развития. Это предположение основывается на ряде сведений, а именно: I) регуляторные пептиды продуцируются клетками различных типов, а не только секреторными; 2) регуляторные пептиды возникли на очень ранних стадиях эволюционного развития; 3) они многочисленны и широко распространены в природе; 4) рецепторы к регуляторным пептидам находят на клетках различных типов; 5) один и тот же пептид и его рецепторы могут функционировать на различных этапах жизненного цикла,при этом его функции могут меняться; 6) предымплантаци-онные зародыши млекопитающих способны переживать "in vitro11 в простых культуральных средах, но их развитие значительно замедлено по сравнению с этим процессом,протекающим "in vivo". Эти данные априори свидетельствуют в пользу участия гормонов пептидной природы в регуляции ранних стадий эмбрионального развития.

Показано, что эмбрионы на ранних стадиях развития продуцируют инсулин. Предымплантационные зародыши мышей споссЛны к рецепторно опосредованному связыванию инсулина, начиная с вось-миклеточной стадии ( Heyner et al., 1989- Dev. Biol., 134: 48-58). Типичные инсулиновые рецепторы широко распространены в эмбрионах различных видов птиц, а у эмбрионов цыплят найдены рецепторы к инсулино.подобному фактору роста. Эндогенные полипептидные стимуляторы^ роста найдены в зародышах вьюна, а предымп-лантационные зародыши мышей продуцируют гомологи эпителиального фактора роста и фактора роста фибробласгов ( Rappolee et al., 1988. Science, 241: 1823-1825).

Клонирование кДНК рецептора фактора роста фибробластов показало наличие ыЕНК этого рецептора в зародышах амфибий, а недавно рецепторы, специфически связывающие трансформирующий фактор роста, найдены в ранних зародышах вьюна. Авторы отмечают исключительно широкую распространенность трансформирующего фактора роста и его рецепторов в тнанях млекопитающих, в том числе и на ранних стадиях эмбрионального развития (Стойка и др., 1993. Онтогенез, 24: 38-42).

В эмбрионах морских ежей идентифицирована mFHK, кодирующая белок, сходный по структуре с эпидермальным фактором роста позвоночных (Yang et al., 1989- Science, 246: 806-808). Ранее нами было показано наличие энкефалиноподобного материала в оого-ниях и ооцитах двустворчатых моллюсков и морских ежей. Центры

связывания опиатов, предполагаемые эндогенные лиганды и специфическое связывание опиатного антагониста налоксона с мембрана:-:! обнаружены в ооцитах амфибий (Вакалкин и др., 1984. Биохимия, 49: 883-888).

Приступая к выполнению настоящей работы, мы исходили из предположения, что способность к синтезу опиоидных пептидов сохраняется после созревания и оплодотворения половой клетки и проявлегся уже на ранних стадиях эмбрионального развития. Для доказательства этого предположения использовали культуру дробящихся зародышей черного морского ежа, являющуюся удобным и широко применяемым тест-объектом при исследовании биологического действия различных химических соединений на эмбриональное развитие. Через 5 мин после оплодотворения в культуру развивающихся зародышей добавляли блокагор опиатных рецепторов на-локсон. На стадиях двух бластомеров, средней бластулы, поздней гаструлы и плутеуса учитывали доли нормальных и аномальных зародышей и выявляли наиболее характерные отклонения_в.,раавизди.-Кроме этого, определяли чувствительность .бластулы и гаструлы к различным концентрациям налоксона после его добавления в культуру.

Уже на стадии двух бластомеров отмечается дозозависимое торможение развития эмбрионов и увеличение числа аномалий. Среди последних наиболее часто встречаются неразделившиеся оплодотворенные яйцеклетки, зародыши с врезающейся бороздой дробления и неправильной формой бластомеров (рис. 8). На стадии бластулы число аномальных эмбрионов возрастает, их доля при концентрации налоксона, равной 25 мкг/мл, достигает 100%. Среди аномалий у зародышей, развивающихся в среде с концентрацией налоксона 5 и 25 мкг/мл, преобладают неразделившиеся и разрушающиеся оплодотворенные яйцеклетки, зародыши с неправильной формой и .расположением бластомеров, неравномерным дроблением. Эмбрионы, развивающиеся в среде с концентрацией налоксона 0,5 мкг/мл, имеют строение нормальных бластул, однако часть из них лишена оболочки оплодотворения, тогда как в контроле последние на этой стадии имеются (рис. 8; 2, 4, 5, 7-9). Такие аномально развивающиеся зародыши не проходили стадию вылупления, не всплывали и в дальнейшем погибали.

Всплывшие личинки достигают стадии гаструлы. При концентрации налоксона 0,5 мкг/мл видимых аномалий не наблюдается,

Стадия РАЗВИТИЯ Концентрация нааоксона в мкг/мл

КОНТРОЛЬ 0,5 5 25

2 ЁААСТОМЕРА |© §Э О?

средняя БЛАСТУЛА §э §9 сР

ПОЗ АН Я Я ГАС ГРУ Л А гибель

ПЛУТЕ У С % ГИБЕЛЬ ГИБЕЛЬ

Рис. 8. Развитие морского ена З-ЬгопктйосеЫгго-Ьиз пМиз и характерные аномалии при действии различных концентраций на-локсона. I - нормальные двубластомерные зародыши, 2 - недробя-щиеся оплодотворенные яйцеклетки, 3 - врезающаяся борозда дробления, 4 - неправильная форма яйцеклеток и бластомеров, 5 - разрушающиеся оплодотворенные яйцеклетки, б - нормальная бластула, 7 - бластула без оболочки оплодотворения, 8 - зародыши с неправильным расположением бластомеров, 9 - зародыши с неравномерным дроблением, 10 - нормальные поздние гаструлы, II - средняя га-струла, 12 - погибшие зародыши, 13 - паренхимулообразные зародыши, 14 - нормальные плутеусы.

однако часть личинок отстает в развитии, их архентерон доходит лишь до середины бластоцеля. Большая часть личинок, развивающихся в среде с концентрацией налоксона 5 мкг/мл, к стадии поздней гаструлы погибает, а меньшая была представлена уродливыми паренхимулообразными зародышами, и лишь единичные особи имеют строение нормальных бластул (рис. 8; 10-13). При концентрации налоксона 25 мкг/ыл все личинки к стадии поздней гаструлы погибают. На стадии плутеуса нормальные личинки были обнаружены в контроле и в среде с концентрацией налоксона, равной 0,5 мкг/мл. При концентрации налоксона 5 и 25 мкг/мл личинки до этой стадии не развиваются.

Чувствительность зародышей при добавлении в культуру дробных концентраций налоксона на стадиях бластулы и гаструлы неодинакова (рис. 9). Гаструла почти в два .раза более чувствительна к действию блокагора, чем бластула (Вараксин и др., 1990).

Таким образом, опиатный антагонист налоксон уже со стадии двух бластомеров дозозависимо тормозит дробление и развитие зародышей морского ежа и вызывает появление аномалий различных морфологических типов, а чувствительность зародышей к налоксону по мере их развития меняется. Это указывает на участие опиоид-ных пептидов в регуляции эмбриогенеза. Помимо опиоидных пептидов в ранних эмбрионах животных обнаружены другие биологически активные вещества.

3.11.2. Стероиддегидрогеназы и половые стероидные гормоны локализованы в зародышах и личинках морских ежей

Выше была описана локализация ферментов стероидогенеза и стероидных гормонов в половых и вспомогательных- клетках гонады и значение последних в гаметогенезе двустворчатых моллюсков и

Рис. 9. Изменение чувствительности бластулы (I) и гаструлы (2) к .различным концентрациям налоксона.

Абсцисса - концентрация налоксона, ордината - доля зародышей с блокированным и ' аномальным развитием.

20 40 МКГ/МЛ

морских ежей. Логично допустить, что способность к синтезу стероидных гормонов сохраняется после оплодотворения и проявляется на ранних стадиях эмбрионального развития.

Цитохимическими методами нами показано наличие и локализация 3ß- и 17В- гидроксистероиддегидрогеназ в оплодотворенных яйцеклетках, эмбрионах на стадиях 2-х и 32-х бластомеров, средней бластулы, личинках на стадиях гаструлы и плутеуса. В зиготе гранулы диформазана равномерно распределены по цитоплазме, их плотность невысока, но больше чем в неоплодотворен-ной яйцеклетке. Оболочка оплодотворения не содержит продуктов реакции. У дву- и четырехклеточных эмбрионов активность ферментов повышается. На стадии 32-х бластомеров, после завершения периодасинхронных дроблений, отмечается дальнейшее повышение активности ферментов. Гранулы диформазана располагаются в .. бластомерах и не найдены в микромерах. С началом гаструляции активность ферментов снижается. 3ß- и 1?В- гидроксистероидде-гидрогеназы сосредоточены в области первичной кишки. На стадии плутеуса невысокая активность ферментов найдена на вершине оральной лопасти, в области желудка и, в меньшей степени, на апикальном конце личинки.

Иммуноцитохимическая локализация эстрадиола-17В подтверждает эти данные. Комплекс эстрадиола с антителами образуется на всех исследуемых стадиях, но уровень люминесценции и локализация комплекса в эмбрионах и личинках неодинаковы. У 4-х и 8-клеточных эмбрионов люминесценция выше, чем в неоплодотворен-ной яйцеклетке, что, очевидно, обусловлено увеличением внутриклеточного содержания эстрадиола. В бластомерах наблюдается равномерное .распределение люминесцирующего комплекса антиген-антитело. Сходная по интенсивности и гомогенная люминесценция клеток выявляется на стадии бластулы. С началом гаструляции интенсивность свечения возрастает и меняется характер его распределения. Флюоресценция наблюдается в области первичной кишки и в прилегающих участках вегетативного полюса, а на стадии плутеуса - в области желудка, по краю оральной лопасти и, в .меньшей степени, на анимальном конце личинки.

О присутствии зв- и 17В- гидроксистероиддегидрогеназ и ряда других ферментов стероидогенеза в предымплантационных эмбрионах млекопитающих сообщено в отдельных работах (Niinura et al., 1980. Jap. J. Zootech. Sei., 51: 191-196). Активность

ферментов стероидогенеза на ранних стадиях развития довольно высока и возрастает после инъекций хорионического гонадотропи-на ( Tsutsumi et el., Folia Endocrinol. Jap., 58: 13211322). Более того, по содержанию серотониноподобных веществ, катехоламинов, ацетилхолина, способных выполнять на этих стадиях онтогенеза ряд функций, а также по уровню чувствительности к антагонистам трансмиттеров и основным характеристикам ре-цепторных структур, ооциты и ранние зародыши как беспозвоночных так и позвоночных животных сходны между собой.

В ооцитах кабы и вьюна описано наличие высокоаффинного связывания лигандов опиатных рецепторов и эндогенные опиоидные вещества, способные реагировать с каппа-опиатными рецепторами (Бакалкин и др., 1984. Биохимия, 49: 883-888 ; Яковлев и др., 1986. Докл. АН СССР, 286: I7I8-I72I). Зти сведения подтверждаются иммуноцитохимическим выявлением лей- и метэнкефалинов в оогониях, ооцитах и сперматогенных клетках двустворчатых моллюсков, морских ежей и некоторых других беспозвоночных. Мет- и лейэнкефалины без различий в их локализации обнаружены в первичных и вторичных сперматогониях и сперматоцитах I у крыс (Engelhard t et al., 1986. Arch. Androl«, 17: 49-56). Опиатные сигма-рецепторы найдены также на ранних стадиях .развития зародышей вьюна и, очевидно, вовлечены в регуляцию морфогенеза (Калюжный и др., 1986. Докл. АН СССР, 290: 974-978 ; Калюжный и др., 1987. Биохимия, 52:335-341; Калюжный и др., 1989. Бюл. экспер. биол. мед., 108: 622-624). Таким образом, в наличии ме-диаторных веществ, опиоидных пептидов, стероидных гормонов, соответствующих им рецепторных центров и их характеристиках в половых клетках и ранних зародышах имеется ряд общих признаков.

Результаты наших исследований наличия и локализации ферментов стероидогенеза и половых стероидных гормонов в яйцеклетках, эмбрионах и личинках морских ежей укладываются в отмеченную закономерность. Известно, что как у беспозвоночных, так и позвоночных животных существует тесная взаимосвязь между обменом биогенных аминов, стероидных и пептидных гормонов (venturini et al., 1986. Handbook Сотр. Opioid Relat. Neuropeptide Mechanisms, V. 1, p. 245-254; Бузников, 1987. Нейротрансмиттеры ..., M.: Наука. 232 е.). Предполагается, что стероидные гормоны и регуляторные пептиды, выявленные в половых клетках и на ранних стадиях эмбрионального развития, взаимодействуя с други-

ми биологически активными веществами, играют важную роль в росте и созревании ооцитов, оплодотворении, дроблении и эмбриональном развитии.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что исследованные животные обладают развитой пептидергической нейросекреторной системой. Получены цитологические доказательства связи нейросекреции с половой активностью, которые основываются на наблюдении сочетанных во времени гисто-физиологических процессов в гонаде и нервных ганглиях, положительной корреляции между секреторной активностью нейронов и го-надогенезом и пептидергической иннервации гонады двустворчатых моллюсков и морских ежей, то есть наличия прямых путей доставки пептидных гормонов к месту их действия. Иммуноцитохимическими методами в нервной системе двустворчатых моллюсков локализованы энкефалин-, вещество Р-, -ШРФамид- и морфогениммунореактивные нейроны, а в нейропиле, комиссурах и коннективах - мелкие нервные волокна, имиунореактивные к тем же пептидам. Найдено, что содержание некоторых из идентифицированных регуляторных пептидов подвержено сезонным изменениям и они оказывают влияние на размножение. Так, пептидный морфоген при введении животным ускоряет пролиферацию гониев, созревание ооцитов I начала профазы мейоза и образование ооцитов малого роста.

Выявлено, что влияние регуляторных пептидов на пролиферацию гониев опосредуется простагландинами. Известно, что у позвоночных животных простагландины угнетают пролиферацию клеток при действии пептидных митогенов. Введение двустворчатым моллюскам индометацина увеличивает плотность сперматогониев в аци-нусах. Арахидоновая кислота угнетает пролиферацию, а совместное введение с ней индометацина устраняет этот эффект. Наиболее выраженное ингибирующее влияние характерно для простагландина Е^. Очевидно, свойство простагландинов угнетать пролиферацию клеток проявляется у двустворчатых моллюсков и их следует рассматривать как гормоны аутокринного или паракринного действия.

При исследовании механизмов действия пептидного морфогена было найдено, что он повыаает обмен полоеых стероидных гормонов. В период пролиферации гониев пептидный ыорфоген в значительной степени увеличивает активность 5оС -редуктазы. По мере зазершения

пролиферации уровень превращения тестостерона в ЗоС-восстановленные метаболиты под влиянием пептидного ыорфогена снижается. Это дает основание полагать, что влияние регуляторных пептидов на оо- и сперматогенез связано со стероидными гормонами.

Нами обнаружена активность ферментов обмена половых стероидных гормонов ЗВ- и 17В- гидроксистероиддегидрогеназ в гранулярных амебоцитах и вспомогательных клетках гонады исследованных животных. Зти сведения, а также характерные ультраструктурные особенности этих клеток и тесная взаимосвязь с половыми элементами позволяет рассматривать их в качестве соматических стероидергических элементов, гомологичных специализированным стероидогенным клеткам позвоночных животных.

Помимо соматических стероидергических элементов, ферменты стероидогенеза обнаружены в клетках сперматогенного ряда и ооцитах. В процессе роста ооцита активность ферментов меняется. Она значительно выше в растущих ооцитах, чем в ооцитах, заканчивающих трофоплазматический рост. Известно, что ооциты млекопитающих содержат и другие ферменты стероидогенеза ( Tsutsumi et al., 1982. Folia Endocrinol. Jap., 39: 683-689). В ооцитах человека найдены прогестерон и эсградиол и доказана их эндогенная природа (Suzuli et al., 1983. iertil. Steril., 39: 683-689). Нами в половых клетках морских ежей обнаружен эстра-диол. Таким образом, половая клетка исследованных еивотных способна к эндогенному синтезу стероидных гормонов, что с учетом имеющихся сведений, позволяет рассматривать ее как стероидцеп-тивную-стероидергическую систему. Это заключение послужило основой для детальных экспериментальных исследован:::": значения половых стероидных гормонов в размножении двустворчатых моллюсков и морских ежей.

Эстрогены, андрогены и прогестерон у самцов двустворчатых моллюсков и морских ежей ускоряют пролиферацию гониев, созревание сперматоцитов П, формирование сперматид и сперматозоидов, а у самок - пролиферацию гониев, цито- и трофоплазматический рост ооцитов. Исследование динамики синтетических процессов показало, что эстрадиол активирует синтез белка в яичнике. Изменения синтетической активности сопряжены с эффективным включением 3Н-лейцина в белки при постоянном пуле свободной аминокислоты и не зависят от скорости поступления предшественника в клетку. Блокаторы белкового синтеза пуромицин и актиномицин Д

достоверно снижают скорость синтеза белка. Авторадиографические данные указывают на повышение включения 3Н-лейцина в ооци-ты после введения эстрадиола экспериментальным животным. Это свидетельствует о усилении белоксинтезирующей активности клетки и подтверждает цитологические наблюдения участия половых стероидных гормонов в гаметогенезе.

Известно, что ведущим фактором, вызывающим овуляцию и нерест у позвоночных, является гонадотропный гормон. У иглокожих подобную функцию выполняет гонадостимулирующее вещество. Мы отмечали интенсивное выведение пептидергического нейросекре-торного материала из нейросекреторных клеток перед нерестом у двустворчатых моллюсков. Нейросекреторный материал в этот период легко обнаруживается в пептидергических нервах гонады. Серо-тонин индуцирует нерест у двустворчатых моллюсков. Простаглан-дин S,2o¿ ускоряет нерест, а индометацин блокирует его. Сравнение некоторых характеристик нереста, стимулированного инъекцией серотонина и таким наиболее часто применяемым индуктором нереста, как повышение температуры воды, а также наблюдения над развитием эмбрионов и личинок, показали, что серотонин вызывает у двустворчатых моллюсков полноценный физиологический нерест. Эти наблюдения и имеющиеся сведения о наличии у двустворчатых моллюсков регуляторного пептида с гонадостимулирующей функцией, вызывающего нерест у этих животных ( Pang et al., 1985- Acta Oceanol. Sin., 107-112),указывают, что механизмы нереста у двустворчатых моллюсков сходны с таковыми других животных.

Показано, что реинициация мейоза в ооците у двустворчатых моллюсков индуцируется серотонином. Известно, что серотонин содержится в нервной системе, половой железе и целомической жидкости этих животных (Деридович, Хотимченко, IS88. Виол.моря,■б: 3-16). Нами выявлены локализация серотонинергичесхих нейронов и иннервация серотонинергическими нервами оболочки, стенки аци-нусов и протоков половой железы двустворчатых моллюсков. Исследование механизмов реинициации мейоза показало, что серотонин действует через специфические рецепторы на цитоплазматической мембране ооцита. Передача сигнала с серотонинового рецептора в клетку происходит по Са^+-фосфоинозитидзависимому пути. Одновременно в ооците повышается Na+/H+ -обмен, что приводит к изменению рН цитозоля клетки. Активными участниками усиления ре-цепторзависимых внутриклеточных сигналов являются арахидоновая

кислота и ее липоксигеназный метаболит - 5-гидроксиэйкозатетра-еновая кислота. Другие производные пол«ненасыщенных жирных кислот не оказывают такого действия, а ингибиторы липоксигеназно-го окисления полиненасьпценных жирных кислот блокируют разрушение зародышевого пузырька после действия арахидоновой кислоты, серотонина или кальциевого, ионофора А23187. Эти сведения дают основание считать, что серотонин у двустворчатых моллюсков, подобно 1-метиладенину у иглокожих и прогестерону у рыб и амфибий, является эндогенным мейозиндуцирующим фактором.

Анализ полученных нами и имеющихся литературных данных показывает, что пептидергическая и стероидергическая системы начинают формироваться на ранних стадиях развития половой клетки. Метэнкефалин, нейропептид У, холецистокинин, половые стероидные гормоны и ферменты их обмена, выявляются в гониях,. сперма-тоцитах и растущих ооци-тах. Закончившие рост ооциты, спермати-ды и сперматозоиды содержат преимущественно предшественники ре-гуллторьых-пептидов, в малой степени подвергающиеся процеесингу. Сходным образом в половой клетке формируется моноаминергическая система, рецепторные структуры и системы внутриклеточных мес-сенджеров (Мотавкин и др., 1550. Регуляция ..., М.: Наука; Хо-тимченко и др., 1993. Биология ..., М.: Наука). Таким образом, сформировавшаяся половая клетка обладает основными регуляторны-ми системами. Более того, по содержанию серотонинопоцобных веществ, катехоламинов, ацетилхолина, а также по уровню чувствительности к антагонистам этих веществ и основным характеристикам рецепторных структур, ооциты и ранние зародыши как беспозвоночных, так и позвоночных сходны между собой. Результаты наших исследований пептидергической и стероидергической систем укладываются в отмеченную закономерность.

Показано, что в эмбрионах, начиная со стадии 2-х бластоме-ров,личинках на стадиях гаструлы и плугеуса содержатся ферменты стероидогенеза и свободный эстрадиол. В сравнении с неопло-дотворенной яйцеклеткой активность стероидогенеза значительно возрастает, начиная со стадии 4-8-ми бластомеров и сохраняется на стадиях бластулы, гаструлы и плутеуса. Специфический опиат-ный антагонист налоксон уже со стадии 2-х бластомеров дозозави-симо тормозит дробление и вызызает появление аномалий различных морфологических типов, а чувствительность разных стадий развития зародышей к налоксону неодинакова. Значение биогенных ами-

нов и ацетилхолина в раннем эмбриональном развитии описано достаточно подробно (Бузников, 1937. Нейротрансмиттеры ..., М.: Наука). Известно, что как у позвоночных, так и беспозвоночных животных существует тесная взаимосвязь между обменом биогенных аминов, ацетилхолина, стероидных и пептидных гормонов. Таким образом, регуляторные пептиды и половые стероидные гормоны включаются в физиологические механизмы на ранних стадиях эмбрионального развития.

На основе полученных сведений об эндогенных регуляторах и механизмах регуляции размножения исследованных животных разработан способ стимуляции нереста двустворчатых моллюсков (Варак-син.и др., 1986. Авт. св-во Я 1214040) и способ определения го-надотропной активности химических соединений (Вараксин и др., 1992. Авт. св-во № 1741687).

5. ВЫВОДЫ

1. Пептидергическая секреция претерпевает динамичные изменения, связанные с половой активностью исследованных животных. Об этом свидетельствуют:

- сочетанные во времени патофизиологические процессы в гонаде и нервных ганглиях;

- положительная корреляция между морфометрическими показателями нейронов, отражающих их секреторную активность, и ростом и развитием половых клеток;

- наличие в гонаде пептидергических аксонов, то есть прямых путей поступления нейрогормонов к месту их действия.

2. Иммуноцитохимическими методами в нервной системе и гонаде установлено наличие:

- нейронов, содержащих энкефалин-, вещество Р-, ФМРФамид- и морфогениммунореактивный материал;

- в нейропиле, комиссурах и коннентивах аксонов, иммунореактив-ных к тем же регуляторным пептидам;

- в гониях, растущих ооцитах и сперматоцитах I энкефалиниммуно-реактивного вещества.

3. В гонаде двустворчатых моллюсков и морских ежей:

- имеются стероидпродуцирующие соматические элементы, представленные вспомогательными клетками и гранулярными амебоцитами;

- гонии, ооциты и сперматогенные клетки способны к рецепции половых стероидных гормонов и содержат ферменты стероидоге-неза и половые стероидные гормоны эндогенного происхождения;

- половая клетка функционирует как стероидцептивная-стероидер-гическая система.

4. При эндогенном введении пептидного морфогена повышается активность ферментов обмена половых стероидных гормонов, усиливается пролиферация гониев, ускоряется созревание сперматоци-тов I начала профазы мейоза и образование ооцитов малого роста.

5. Половые стероидные гормоны при введении их экспериментальным животным ускоряют у самцов пролиферацию гониев, созревание сперыатоцитов П, формирование сперматид и сперматозоидов, а у самок - пролиферацию гониев, цито- и трофоплазматический рост за счет активации синтетических процессов как в половой железе, так и в самом ооците.

6. Мейоз в ооците двустворчатых моллюсков инициируется се-ротонином. Передача сигнала с рецептора в клетку происходит по Са^+-фосфоинозитидзависимому пути. Активными участниками механизмов усиления внутриклеточных сигналов являются арахидоновая кислота и ее липоксигеназный метаболит - 5-гидроксиэйкозатетра-еновая кислота.

7. Регуляция оо- и сперматогенеза у двустворчатых моллюсков и морских ежей совершается по единой для этих филетических групп схеме: секреция регуляторного пептида-» синтез половых стероидных гормонов —>активация гаметогенеза.

8. Нерест запускается гонадотропным регуляторным пептидом, действие которого опосредовано у двустворчатых моллюсков серо-тонином. Простагландин Р^ ускоряет нерест, не влияя на созревание ооцита.

9. Формирующиеся в ооците пептидергическая и стероидерги-ческая системы сохраняются после его созревания и начинают функционировать в раннем эмбриогенезе, осуществляя регуляцию развития.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУЫЖОВАНЫ В СЛЕДУЩИХ РАБОТАХ:

Монографии

1. Мотавкин П.А., Вараксин A.A. Гистофизиология нервной системы и регуляция размножения у двустворчатых моллюсков. М.: Наука. 1983. 208 с.

2. Motavkine P.A., Varaksine A.A. La Reproduction chez les Mollusques Bivalves. Hole du Système Nerveux et Régulation. Brest: IFRÜMER. 1989» 250 p.

Статьи, тезисы докладов, авторские свидетельства

3. Вараксин A.A. Развитие половой железы и дифференциров-ка пола у морского ежа Strongylooentrotus nudus // Зоол. ж. 1980. Т. 59, 12. С. 1895-1896.

4. Вараксин A.A. Медиаторы нервной системы морского двустворчатого моллюска Patinopecten yessoensis (Jay) // Физиология и биохимия медиаторных процессов: Тез.докл. М.: Наука. 1980.

С. 42.

5. Вараксин A.A. Иннервация стенки половой железы приморского гребешка Patinopecten yessoensis (Jay) // Гистофизиология эффекторных и рецепторных механизмов нервной системы морских организмов. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1980. С. 21-26.

. 6. Мотавкин П.А., Вараксин A.A. Типы аксонов и синапсы в нейропиле висцерального ганглия приморского гребешка patinopecten yessoensis (Jaу)// Там же. С. 27-32.

7. Мотавкин П.А., Вараксин A.A. Регуляция и пути управления гаметогенезом у иглокожих и двустворчатых моллюсков // У1 ' Всесоюз. совещание эмбриологов: Тез. докл. Ы. : Наука. 1981.

С. 27.

8. Хотимченко Ю.С., Вараксин A.A., Мотавкин П.А. Механизмы и пути регуляции репродуктивных процессов у иглокожих и двустворчатых моллюсков // Второй Всесоюз. съезд океанологов: Тез. докл. Севастополь. 1962. С. III—112.

9. Вараксин A.A., Деридович И.И., Вараксина Г.С. Эндокринология размножения у двустворчатых моллюсков // Биология шель-фовых зон Мирового океана: Тез. докл. Ч. 2. Владивосток: ДВНЦ

АН СССР. 1982. С. 61-62.

10. Вараксин A.A. Нервная система ыидии Грея // Биология мидии Грея. 1.1.: Наука. 1983. С. 15-22.

11. Бородулин Ю.Г., Вараксин A.A. К вопросу о механизме формирования биоэлектрической активности висцерального ганглия приморского гребешка, вызванной раздражением механорецепторов гонады // Х1У съезд Всесоюз. физиол. об-ва им. И.П.Павлова.

Л-;'Наука. IS83. С. 132.

12. Вараксин A.A., Деридович И.И., Швалева Н.И. Иннервация половой железы двустворчатых моллюсков // Архив анатомии, гистол. и эмбриол. 1983. Т. 84, № I. С. 43-49.

13. Вараксин A.A., Деридович И.И. Морфофункциональная характеристика стенки половой железы приморского гребешка // Биол. моря. 1984. Jí 3. С. 60-66.

14. Мотавкин П.А., Вараксин A.A. Мелкие гранулосодержащие клетки центральной нервной системы двустворчатого моллюска Patinopecten yessoensis (Jay)- // Архив анатомии, гистол. и эмбриол. 1985. Т. 88, i? 6. С. 13-16.

15. Вараксин A.A., Мотавкин П.А., Бородулин Ю.Г. Способ стимуляции нереста морского гребешка. Авторское свидетельство № I2I4040 СССР. Заявл. 20.06.84,; опубл. 28.02.86. Бюл. ff 12.

16. Вараксин A.A. Нервная система // Приморский гребешок. Владивосток: ДЗНЦ АН СССР. 1986. С. 36-47.

17. Вараксина Г.С., Вараксин A.A. Влияние эстрадиола дип-ропионта на оогенез морского ежа Strongylocontrotus nudus

// Биол. моря. 1387. JM. С. 47-52.

' 18. Вараксина Г.С., Виноградов В.А., Вараксин A.A. Действие даларгина на развитие зародышей морского ежа // Бюл. экспер. биол. и медицины. 1987. Т.103, 3. С. 384.

19. Вараксин A.A., Виноградов В.А., Мотавкин П.А., Зверков И.В., Тгеценко В.А. Локализация пептидного "морфогена гидры" в нейронах моста головного мозга у человека // Архив анатомии, гистол. и эмбриол. 1987. Т. 93, К1 5. С. 34-36

20. Найденко Т.Х., Вараксин A.A. Стимуляция нереста у моллюсков и оценка жизнеспособности эмбрионов и личинок // Моллюски. Результаты и перспективы их исследования: Тез. докл. Ji., 1987. С. 34S-35I.

21. Вараксина Г.С., Вараксин A.A. Половые стероидные гормоны у морских ежей // Медико-социальные аспекты проблемы "Человек-океан": Тез. докл. Владивосток, 1988- С. 270.

22. Вараксина Г.С., Вараксин A.A. Локализация I7ß -гидро-ксистероиддегидрогеназы в гонадах двустворчатых моллюсков приморского гребешка и мидии Грек // Архив анатомии, гистол. и эмбриол. 1988. Т. 95, № II. С. 79-82.

23. Мотавкин П.А., Вараксин A.A., Низяева Е.П., Реунова О.В. Типы нейронов центральной нервной системы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay) // Архив анатомии, гистол. и эмбриол. 1988. Т. 95, № 12. С. 14-20.

24. Найденко Т.Х., Вараксин A.A. Нерест и развитие мидии Грея в лабораторной культуре J J Биол. моря. 1988. № 3. С. 58-62.

25. Вараксин A.A., Найденко I.X. Сравнительная характеристика различных методов стимуляции нереста у приморского гребешка // Биол. моря. 1989. № 2. С. 66-69.

26. Вараксин A.A. Наличие эстрадиола в зародышах и личинках морского ежа Strongylocentrotus intermedius // Ж.эвол. биох. и физиол. 1989. Т. 25, № I. С. 128-129.

27. Мотавкин П.А. Вараксин A.A., Масленникова Л.А., Варак-сина Г.С. Сперматогенез приморского гребешка как модель для оценки гонадотропной активности химических соединений // Препринт. Владивосток: ДВО АН СССР, 1989. 47 с.

28. Вараксин A.A., Вараксина Г.С., Латышев H.A., Реунова О.В. Действие простагландина на эмбриональное и личиночное развитие морского ежа Strongylocentrotus intermedius // Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки: Тез; докл. Суздаль, 1989. С. 33.

29. Вараксина Г.С., Вараксин A.A. Половая клетка двустворчатых моллюсков и морских ежей как стероидцептивная-стероидер-гическая система // Там же. С. 34.

30. Вараксин A.A., Вараксина Г.С., Малахов В.В. Действие . опиатного антагониста налоксона на эмбриональное и личиночное развитие морского ежа Strongylocentrotus nudus // Докл. АН СССР. 1990. Т. 311, № I. С. 224-227.

31. Вараксин A.A., Масленникова Л.А., Вараксина Г.С. Способ оценки гониальной пролиферагизной активности фармакологических препаратов // Цитология, биохимия и физиология морских организмов. Владивосток: ДВО АН СССР, 1990. С. 91-95.

32. Вараксина Г.С., Вараксин A.A. Локализация 3ß -гидрок-систероиддегидрогеназы в яичниках и семенниках приморского гребешка и мидии Грея // Цитология. 1990. Т. 32, ),'= 2. С. I28-I3I.

33. Вараксина Г.С., Вараксин А.А. Влияние эстрадиола и тестостерона на сперматогенез морского ежа Strongylocentro-tus nudus // Биол. моря. 1990. Ji 2. С. 47-51.

34. Вараксин А.А., Ушева Л.Н., Зверков И.В. Локализация иммунореактивного лейэнкефалина в пищеварительной железе приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay) // Архив анатомии, гистол. и эмбриол. 1990. Т; 98, 1Г" I. С. 71-74.

35*. Вараксин А.А. Вараксина Г.С. Локализация эстралила в яйцеклетках, зародышах и личинках морского ежа strongylocen-trotus intermedius // Онтогенез. IS90. T. 21, îi 3. С. 303-306.

36. Вараксина Г.С., Вараксин А.А. Действие эстрадиола, прогестерона и тестостерона на оогенез приморского гребешка // Биол. моря. 1991. № 3. С. 61-68.

37. Вараксина Г.С., Вараксин А.А. Локализация стероидде-гидрогеназ в семенниках и яичниках морского ежа // Биол.моря. 1991. 1? 2. С. 77-82.

38. Varaksin А.А.,.batyshev H.A., Varaksina G.S., Kara-seva E.M., Reunova O.V., Khotimchenko ïu.S. Involvement of arachidonic acid and its metabolites in regulation of germ cells of marine bivalve molluscs and echinoderms // Онтогенез. 1991. T. 22, №4. С. 428-429. (Abst. Soviet-Finnish Symp. "Signal Molecules and Cell Différenciation". Suzdal, 1991.

39. Varaksin A.A., Varaksina G.S., Reunova O.V., Laty-shev N.A. Significance of serotonin and fatty acids for stimulation of spawning and meiosis reinitiation in oocytes of bivalve molluscs //Reg. Meet.'Intern. Soc. Invert. Neurobiology. Minsk, 1991. P. 10340. Вараксин А.А., Масленникова Ji.А., Вараксина Г.С. Способ определения гонадотропной активности химических соединений. Авторское свидетельство SU 1741687 А 01 К 61/00. Заявл. 01.06. 89; опубл. 23.06.52 . Бюл. » 23.

41. Varaksin A.A., Varaksina G.S., Reunova O.V., batyshev N.A. Effect of serotonin, some fatty acids and their metabolites on reinitiation of meiotic maturation in oocytes of bivalve Spisula sachalinensis (Schrenk) // Сотр. Biochem. and Physiol. 1992. V. 101C, N 3- P- 627-630.

42. Вараксина Г.С., Вараксин А.А., Масленникова Л.А. Значение половых стероидных гормонов в сперматогенезе приморского гребешка // Биол. моря. IS92. 'Г- 1-2. С. 77-83.

43. Мотавкин П.А., Коцюба Е.П., Вараксин A.A. Нейроны холинергической синаптической передачи двустворчатых моллюсков // Цитология. 1992. Т. 34, № 5. С. 58-64.

44. Вараксин A.A., Реунова О.В. Влияние индометацина, ара-хидоновой кислоты и некоторых ее метаболитов на пролиферацию сперматогониев у приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // Ж. эвол. биох. и физиол. 1993. Т. 29, ff' 3. С. 330-334. ^ ■

Информация о работе

Вараксин, Анатолий Алексеевич
доктора биологических наук
Владивосток, 1994
ВАК 03.00.11

Автореферат

Похожие работы