Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Простогландины E2 и F2a и их значение в репродукции половых клеток приморского гребешка

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Простогландины E2 и F2a и их значение в репродукции половых клеток приморского гребешка"

П и V"

1 О Ш* «95

На правах рукописи

УДК 576.37:577.115

Реунова Ольга Владимировна

Простагландины Ьг и Рг« и их значение в репродукции половых, клеток приморского гребешка

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени ■ кандидата биологических наук '

Владивосток

1995

Рабата выполнена в Лаборатории цитофизиологии и фармакологии Инстит: та биологии моря ДБО РАК

Научный руководитель: доктор биологичесглх наук, профессор

Офмциэльные сйпонекты: доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук, доцент

Еедущее научно-исслс^ггАтедъское учреждение: Институт эволюционной морфологии и экологии км. А.Н.Северцева РАН, Москва.

Защгса диссертации состоится "21" апреля 1395 г. в 10 часов на заседании 'Специализированного соЕета Д 084.24.01 при Владивостокском государственном- медицинском институте по адресу: 690600, Владивосток, пр.Острякова, 2, т. 25-17-06.

С диссертацией ыомно 'ознакомится в библиотеке Владивостокского государственного медицинского института.

Автореферат диссертации разослан "£0"мартз 1995 г. ,.

Ю. С.Хотимченко

В.М.Колдаев С.М.Дгюба

Ученый секретарь Специализированного совета,-кандидат биологических наук,, доцент

Г.М.Холоденко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. . Раекифрсзка механизмов действия биологически активных веществ ведет к пониманию закономерности регуляции клеточной активности и позволяет осуществлять направленный контроль процессов жизнедеятельности. Проблема фуйкцконирования внутриклеточных.регулятсрных систем связана и с такт важным вопросов как формирование и развитие половы, клеток.

Достаточно обширный фактический чатериал покагывает' влияние на гаметогеиез двустворчатых моллюсков нейрсгормоксв, медиаторов нервного импульса, стероидных гормонов и некоторых -»ругих Сиоло-мгсеохн активных веществ ¡.Мотавкин' и др., 1990; Вараксин, 1994). Сведения оС одних оказались довольно полными, относительно других литературные ■ данные весьма не многочисленны и противоречива. К последней группе внутренних регуляторов можно отнести простаглан-дины - прс-иззолные арахкдоновой кислоты.

Простагландины являются автскринными или паракриннымл низкомолекулярными регуляторами • Это.'означает, что они функционируют или в пределах кяетки их вырабатывающей, или действуют нз соседние элементы (Дж. Теппермен, X. Темппе?рмен,- 1989). Биологическая-роль лростагландинов'убедительно доказана для реализации внутри«-' легочных процессов,- в которых-.посредниками белковых гормйнов и нейромедиатороо служат цАМФ, цГМ$ и кальций (Terragro, Terraugno, 1979; Aktories et al., 1983; Leger, 1993). .

Кроме прямого вмешательства в исполнение' эбфекторкых' актов простагландины изменяют синтез гормонов и медиаторов, поддерживая тем самым регуляторные механизмы на уровне их достаточной функциональной активности (Варфоломеев.. Мевх, 1985; Baker, 1931).

Как известно, у двустьорчатых моллюсков, и в частности, у приморского гребешка формирование г.амет, их пролиферация, рост и созревание, регулируются адрен-, пептид- и стероидергическими механизмами, что уже допускает участие простагландинов в репродукции пололчх клеток.- Наличие этих веществ в гонаде моллюска доказано, однако физиологическая роль, которую они играют в гаметоге-неэ° гребешка, остается в рамках предположений ''Hayashi, 1S86; Piretti et al., 1937; 1988; Osada, Nomura, 1990).

Црть и задачи работы. Цель работы заключалась в том, чтобы установить значение простагландинов Е2 и Fgct в регуляции гамето-генеза, главным образом, пролиферации сперматогониев и оогониев приморского гребешка.

В основные задачи работы входило:

1. Показать наличке простагландинов в гонаде.

2. Установить оезонную активность простатландин-синтетазы в зависимости от стадий зрелости гонады и ее локализацию в клетках половой железы. .

3. Исследовать морфологию половой железы в условиях введения в организм.гребешка простагландинов и их блскаторов.

<4. Доказать участие в регуляции .гаметогенеза циклооксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты- и оценить направленность их воздействия.

Научная .новизна; В работе установлены новые факты, доказывающее, * что помимо известны*, регуляторов - биогенных моноашнов, пептидных и стероидных-гормонов, в систему управления гаметогене.-ром моллюска должны Сыть включены простагдандины. Объектом прило-•жения их Являются гонии, размножение которых они тормозят на; стадии пролиферацэт. Использование специфических ингибиторов (индо-

метацина и аспирина) снимает простагландиновый блок и усиливает 'накопление в семеннике - сперматогониев, а в яичнике - оогониев. Биохимическими методами изучена сезонная активность простаглан-■дйн-синтетагы и установлена ее локализация в половых и вспомогательных клетках. Радиометрическим методом определено количественное содержание простзглэндинов на стадиях покоя и пролиферации. Установлено, что их содержание в органе находится в зависимости от активности перекисного окисления липидов и скорости использования антиоксидантов.

Теоретическое и практическое значение. Полученные результаты дополняют ранее исследованные механизмы регуляции гамэтогенеза у приморского гребешка и могут быть использованы при разработка способов контроля за его воспроизводством. Применение специфических блок&торов простатландии-синтетазы уменьшает продолжительность стадий половой инертности и пролиферация, увеличивает численность сперматогониев и оогониев, что повысит плодовитость моллюска, сократит длительность полозого цикла, снизит экономические затраты на воспроизводство животных в морских хозяйствах.

Апробация работы. Основное результаты работы были представ-, лены й рассмотрены на цитологических.семинарах' Института биологи», моря. Материалы диссертации' доложены'на Всесоюзной конференции' "Механизмы действия-.гормонов и-медиаторов" ''Суздаль, 1989), на Региснальной конференции "Биологические ресурсы шельфа и их рациональное использование" (Владивосток, 1989),-на конференции молодых ученых ЕГМИ к ДВО АН СССР (Владивосток; ■ 199и), на региональной конференции Международного общества нейрсбиологов б/п 'Минск, .1^91), на Советско-финском симпозиуме -по биологии развития "Сигнальные молекулы и клеточная дифференцировка" (Суздаль, 1991), на

конференции по электронной шкроскопии (.Москва, 1992), на ежегодных отчетных сессиях J2M (1992, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура И' c*i?w диссертации. Работа состоит иг введения, 3 глав, выводов; список литературы включает 210 источников, в том числе 165 иностранных. Диссертация изложена-на "132 стр и включает 1? таблиц, И рисунков (схемы, микрофотографии).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на ' половозрелых особях приморского гребешка • Mizuhopecten yessoensis (Jay),' с диаметром створок 100-120 т, собранных в районе о.Попова (вал. Петра Великого Японского моря) е период с сентября 1989 г. по сентябрь 1994 г. Животных доставали с помощью легководолаэной техники и помещали в аквариумг с аэрируемой проточной морской водой для адаптации.

Для гистологических исследований кусочки гонад размером 1x1x1 см фиксировали в жидкости Буэна и заключали в парафин по общепринятым методикам. Срезы толщиной 5-7 мкм, приготовленные на санном микротоме, депарафпнировали,. окрашивали гематоксилином Эр-лиха и эрэином.

Для электронно-микроскопического исследования кусочки гонады,' размером lxlxl мм, фиксировали 2,5 X раствором глутараль-дегида ('"Serva") на 0,-i М- и@кодилатном буфере в течение ча а при 4° С Затем материал .дофиксировали в 1% растворе OsG^ ("РЕАХИМ.") Jtf» ,0,í М растворе какодидаткого буфера при 4° С в течение часа;, ссштичность среды фиксаторов составляла 1200 mOsM. После дегидратации в .' спиртах возрастающей концентрации и ацетоне^матэриал

заключали в смесь эпон-зралдитз ("Fluka"). Срезы, приготовленные ка ультратоме "Ultracut Е" (Австрия), контрастировал« урзкидаце-татом и цитратом свинца и. изучали в электронном микроскопе JEM -• ioG- В (Япония).

Радиоавтографическим методом исследовали активность синтеза ДНК на самцах приморского гребешка. Кусочки.гонад инкубировали в стерилизованной ультрафиолетом и пропущенной через мнллипоровскпй фильтр (0,22 мкм) морской воде сгёнтамицкном (20 ют/мл). После инкубаиии кусочкоЕ половой железы с исследуемыми веществами, в среду вносили 3Н - метил-тимидк« с объемной активностью 37 КВк/ыл. Через б ч материал извлекали из среды и фикокровали в 2,5 % растворе глутаральдегида на морской гаде в течение часа при 4РС. Постфиксацию проводили 1Z раствором O3Q4 ка морской водэ ь течение часа при той же температуре. Материал обезвоживали и заключали в смесь эпон-аралдита.. Полутонки? сре2ы, приготовленные на ■ "Ultracut Е" (А-встрстя), окрашивали раствором метиленового синего и покрывали эмульсией марки М ("Ниихимфотозроэкт"). Срезы экспонировались в течение 80 су? при С. Затем препараты проявляли и изучали при помощи световой микроскопии.

Цитохимическим методом определяли локализацию яростаглан-дин-Н-синтетазы в половой железе приморского гребешка. Для этого в качестве красителя применяли 3,3'-дпамннобевеидик (Роговик др.,' 1977). Для'инактивации истинных пероксидаз применяли перекись водорода (3%) и цианистый кадий (0,1 мМ), а ПГН-синтетазы -аспирин (0.75 мМ) и индометацин (20 мкМ). . '

Спектрофотсметрическим методом определяли активность простаг-■ ландин-синтетазы (Мевх и др., '. 1983; Miyamoto et ах., 1975,. Take-gushi, Sih, 1972).-В качестве донора электронов использовали ад-

реналйн, который преобразуясь в адренохром, имеет коэффициент молярного поглощения 4000 М-1, см"*1 при длине волны 480 нм. Активность простагландин-сцнтетазы выражали в мкМ адренохрома, окисленного из адреналина эа 10 мин в пересчете на грамм сырой ткани.

Цгрекчсное окисление дипидов (ПОЛ) в тканях гонады оценивали по уровню малонового диалъдегида (МДА), определяемого спектрофо-тометрическим методом (Владимиров, Арчаков, 1972). Исследование образцов велось при длине волны 535 нм. Концентрацию МДА выражали £ нг/г пырой ткани,. исходя из коэффициента молярного поглощения, равного для этого вещества - 156000 М-1 см-1.

Концентрацию а-токоферола определяли по методике, предложенной Буртоном и соавторами (Burton et al.,■ 1985). Исследование проводилось с помощью спектрофлуориметра MPF-4 ("Hitachi" Япония) при длине волны возбуждении 296 нм и флуоресценции 323 нм. Концентрацию токоферола выражали в мг\г сырой ткани.

Жирны® кислоты гонады приморского гребешка изучачи методом газохидкостной хроматографии. Метиловые эфяры получали по методу Carreau, Dabacq (1978). Анализ у очистку эфиров жирных кислот ли-пидов гонады выполняли на хроматографе "Shimadsu GC-5" (Япония) с плазменно-иониаационным детектором..

31ля определения концентрации простатдандина Fgct к Ег исполь-вовали диагностические наборы "t3H] Prostagladin Fact Radioiirmuno-assay KIT" ("Institute of. Isotopes of the Hungarian Academy of Sciences") if "[3H] Prostaglandin E Radioimmunoassay KIT" ("Trave-lon-G nentech Diagnostics, Cambridge"). Обработка и исследование проб велись по методике, указанной в инструкции радиоиммунологи-.ческого набора. Радиоактивность надссадочной жидкости, содержащей связанный антиген, измеряли в жидкостном сцинтиляционном счетчике

SL-4221. Концентрацию простагландинов F2« и Ег выражали в кг/г сырой ткани.

Концентрацию бедка в гонадах приморского гребешка измеряли по .' Mevofly Greenberg, Gaddock (1982). Образцы спектрофотометрирсвали при длине волны 610 нм.

Экспериментальные методы. Влияние физиологически активных веществ на гаметогенез приморского гребешка изучали в экспериментах in v.vo. Для этого животных, собранных в море в различные сезоны, помещали в аквариумы с аэрируемой мирской волой и выдерживали в течение 3 - 7 сут с целью адаптации. Подопытным животным раз в сутки в аддукторную мышцу в течение двух недель вводили 100 мкл этанодьных рзстворов, содержащих следующие препараты: 100 ккг эрахидонсЕОК кислоты; 100 мкг индометацина ("Serva"); 10 мкг простатландина F2« ; 10 мкг простатландина Ег. Контрольным животным вводили по 100 мкл этанола (в предварительных экспериментах • было установлено, что уегазанная дога этанола не влияла ка гамето-генез у моллюсков). Арахвдонова». кислота, простагландины р£й и Ез были синтезированы в Ла&ратории сравнительной биохимии ИЕМ ДЗО РАН.. •

Исследовали' влияние веществ в конечной-концентрации: аядаэав* тацина (Ю-5 М), 'арахидонсвой кислоты (Ю-5 М), дибутярип-ц?^ ("Reanal") (10"6 М), диСутирил-цГЮ ('..езпа1") (10~6 М), г;ростаг-лак ,ика Fg« ('xú~9 М), тестостерон (10~б М) на зкио'.ение -'н-тши-дина в сперматогонии приморского гребешка радиоавтогра4т.ческим методом в условиях in vitro, поэволяюцш судить о скорости пролиферации клеток.

Полученные количественные- данные обрабатывали методой г,&рка-ционнсп статистики (Плохинский, 1980 >.'. Различия ме.еду средккы*'

величинами считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Наличие г.ростагданднноз в гонаде определялось двумя путями:

- косвенно, вводя специфические блокаторы синтеза простаг-данриноз и, наблюдая морфологические изменения в гонаде; на результатах этих исследований мы остановимся кие;

- путем прямого определения концентрации простагландинс Ег и в гонаде радиометрическим методом.

Наличие обоих простагландиков обнаружено и в семенниках- и в яичниках приморского гребекка .(табл.1), в несколько большей концентрации у самок, чем у самцов,, что соответствует литературным данным (Rag-peri, Thoroughgood 1985; Osada, Nomura, 1990). Довольно низкие концентрации ПГЕг и ПГГгес, выявленные нами в декабре, подтверждает ранее установленную закономерность о том, что развитие гамет у двустЕорок и, в частности, у гребешка происходит при минимальном содержании простагл.ачдинов (Osada et al., 1989, Ono <?t al., 1982). '■ .

Известно, что-источником образования ПГ является эйкозотетра-сновая (арзхидоновая), кислота (Piretty et al., 1987). Относительной содержание по"стадиям полового цикла этой кислоты снижается от 9 до 3 раз.к нересту, вероятно, за счет усиленного синтеза ПГ (Osada,-Nomura, 1990).' ' & •

Присутствие, простагландинов в гонаде приморского грёбещка еще ,не .доказывает их только эндогенного происхождения. .Спектрофото-^етрнческум ' методом с использованием в качестве доноров электронов адреналикз. нами установлено присутствие фермента просдагдан-

Таблица 1

Концентрация простагландинов в гонаде приморского гребешка Mizuhopeoten 'yessoensis. ?чслеримент in vitro.

1 препараты . концентрация простагландина, нг-'г сырой ткани 1 . самцы - самки 1

Простагландш Ег (июнь) 1

К 5,21+1,29 (3) 7,01+0,87 (3) !

1АСП, 20 3. £ 0,09+0,01 (3)-а ' 6,13+1,50 (3) i

Простагландш Ег (декабре • 1

К 0,42+0,С? (9) i

1КНД, 10 мкМ. 0,32+0,04 (9) i

Проотагландин Р°й (декабрь) 1

К 0,04+0,01 (6) 0.06+0,01 (6) 1

1ИНД, 10 мкМ 0,09+0,02 (6)* 0,09+0,02 (6)* 1

( ) - количество повторов * - достоверные различи^ Р. < 0,01 дин-сиигетааы на всех стадиях гонэдогенеза, .что говорит о синтезе простагландинов cíe лото в гонаде. Ее .наивысшая активность оказа-' лась в преднерествой гонаде (табл.2), что соответствует еысокому содержанию ПР в органе перед выметем (Osad?. Новдга, 1990).

Гистологически гонада представляет' собой довольно гетерогенный орган. Помимо половых и вспомогательных клег.ок ее стенка содержит соединительную, эпителиальную .ткани ч гонадную мышцу. Ответ на вопрос о локализации простагландинов в гонаде можно получить, только при исследовании фермента•йх синтеза цитохимическим

методом.

Энзимположителъными оказались 'половые и вспомогательные клетки гонады. Слабее скрашивались вспомогательные клетки, интенсивнее - гонии. Ввёдение в среду блокаторов КОМ и HsO-г позволило уотрашт элементы не специфической реакции и более точно выяеить локализацию простатландш-синтетазы, при эЛзм исчезал диффузно желто-коричневый цвет цитоплазмы и Солее ярко окрашивалась плазматическая мембрана. Этот результат находится в соответствии с ранее полученными данными на других объектах. Как известно, Ван Дорп и соавторы определили ПГН-синтетазу как интегральный белок плазмолеммы (V n Dorp ^t al., 1978). '

Таким'образом,, простагландины в гонаде приморского гребешка установлены нами на основании:

- наличия субстрата для их образования, которым служит сшкозогетраеновая (арахидоновая ) кислота;

- присутствия фермента специфической простагландинсинтета-?а а половых и вспомогательных клетках;

- радиометрическим ' методом установлено. количественное' - содержание простагландинов Ег и Fgct.

•. ■ Другая задача нашего исследования заключалась в том, чтобы выяснить-их влияние на гаметог>=нез на стадии пролиферации. Рост и длфференцировка, а также - созревание гамет dura исследованы нзми для сравнения и только на уровне морфологических изменений гонады. Инъекции индометацпка'. <Не изменяли на этих стадиях ни коли- . ч<?саво гамет, . ни гонадный индекс, ни объемы ацинусов. .Эффекты простагландинов видимо могли проявипкя в других более тонких показателях .

Союзные результаты гистологического исследования полученные

Таблица 2

Сезонная F-тивность ПГН-синтетазы в гонаде приморского гребешка

мкМ адренохргма/миь г сырой ткачи

1 Стадии ! вещества 1 1 i

I развития i К •| ИНД i АСП I

I ! гонады I месяцы ■ 1 .1 1 1 1 1

1 дифферен- 1 январь 135+40 i 10?+1б 1 55+9 1

1 цировки 1 февраль "184-43 1 157+11 1 63+4 '

1 нерестовая 1 апрель 240+18 1 130+23 1 7t)+17 1

* инертности! август 60+3 ' 60+7 1 54+11 1

i лролифе- 1 сентябрь 40+10 J 35+5 '' 30+3 1

i i рации . 1 ноябрь 100+15 1 95+10 i 1 I 68+9 i 1

при анализе экспериментальных исследований приведены на рис.. 1.

На стадии покоя вместе с процессами посленереотовой резорбции уже наблюдается появление новых гоний. йндометацин, блокируя цик-лооксигеназу н,'тем самым, синтез простатландинее, включает физиологические механизмы', усиливающие пролиферацию сперматогониев и огониев. Тог же самый эффект при воздействии индслетацина происходит и в период'размножения гоний - в начале и середине стадии пролиферации.

Простагландин Fgct на стадии покоя не изменяет состояние гонады, а Ео на стадии пролиферации тормозит гонадогенез. Происходит 'задержка в развитии половой .железы и зсэ морфологические локаза-тели-снижаются но сравнению о контролем. .Такой же эффект получен и от использования арачидоновой кислоты (рт»с.1).'

F'ue.l. Изменение количества' сперматогониев" в ацинусах семен-.шка приморского грббеача' после инкубации с исследуемыми веществами. Эксперимент in vivo. 1. Контроль; 2. 'Лндсметацин; 3. Простагландин F^ct; 4. Арзхидоновая .кислота; 5.- Арахйдоновая - кислота совместно с индоме-тадщом; о. Простагландин Es. Время проведения опытов : А - сентябрь; Б - начал о октября; В .- середина ок--тнбря; Г - конец октября. По вертикали - количество гениев на плоцадп 0,01 мм2-, птн. ед. * - Р < 0,05.

Следовательно, по данным наших исследований, арахидоновая кислота и простагландины тормозят размножение гоняй.

В связи с возможностью практического использования индэмета-'цина для стимуляции гонадогенеза гребешка встает вопрос о его побочных действиях. Изучение морфологии гонады на световом уровне не выявило каких-либо отклонений в ее гистологической организации. Электронномикроскопическое исследование при действии индоме-тацина показало некоторые прогрессивные, морфологические признаки функциональней активности гений:-более развитый шероховатый рети-кулум с явлениями секреторной активности, более раннее, чем в контроле, формирование проакросомного аппарата. Арахидоновая кислота угнетала цитогенез, но патологических эффектов ни в соматических, ни пеловых клетках гонады' она не вызывала.

Оценку механизма угнетазошего • действия простагландинов на пролиферацию гониапьных клеток мы пытались производить методом авторадйографических исследований. После инкубах?«! ткани с индо-метацином число радиоактивных треков нзд. гониями увеличивалос! почти в Б раз по сравнению с контролем. Происходила активизация синтеза ДНК, метились все клетки, т.е. гонии находились в фазе 3 клеточного н^кла. Введение в среду арахидоноЕой кислоты, цАМВ и простагландина достоверно угнетало синтез ДНК, з ЦГМФ и сочетание арахидоновой кислоты с индсметацином не вызывало отклонений от контрольных'показателей. Индометацин совместно с цГМ1 и тестостерон . усиливали синтез ДНК, ко не столь ярко кзк в опытах с

индометгцином (рис.2).. о

Ез этих наблюдений можно заключить, что простатландины то: -,мозят пролиферация, угнетая синтетическую стадию клеточного цикла, йозможно «¿ерез накопление цА№:: введение которого подавляет

Рис.2. Включение -ri-тимидина в сперматогонии приморскои

гребешка. Эксперимент in vitro. 1 - контроль; 2 - индометацин; 3 - арахидоновая кислота; 4 - арахидоновая кислота и индометацин; 5 - цАШ; 6 - цГМФ; 7 - простагландин Fa«; 8 - индометацин и ЦГШ>; 9 - тестостерон.. Гхо вертикали г относительные единицы, число зерен серебра на площади 0,01мм2 занимаемой спер-матогониями. * - Р < 0,05

образование ДНК. Вероятным стимулятором размножения сперматогоний на стадии пролиферации является гестостерон. Активация синтеза ДНК от введения в среду мужского полового гормона в наших опытах не зависела от наличия в ней индометацина.

К. условиям, определяющим уровень синтеза простагландинов и их количественного содержания относят наличие в среде перекисей и оксидантов. Их участие рассматривают в механизмах, контролирующих пролиферацию клеток (Mlirisaki et а1., 1984; Wickremasinghe, 1988; Dennis, 1989; Круглякова, Шишкина, 1392).

К настоящему времени - установлен, что процесс лерекисного окисления липидов является нормальным физиологическим процессом. Интенсивность лерекисного окисления сСычно устанавливают по одному. из конечных продуктов - малоновому диальдегиду. Его содержание оказывалось наиболее высоким на стадии покоя и снижалось не ме-• нее, чем в полтора раза на стадии пролиферации (табл.3).

Таблица 3

Влияние индометацина,•аспирина и ШТгй на интенсивность

ПОЛ в гонаде гребешка на стадии покоя и пролиферации.

нг МДА/г сырой ткани

К , КНД . 1 АСП nfFs«

июль -481+21 483+17 382+78 399+73

октябрь 262+13 222+18 183+17 351+36

ноябрь

247+10

235+9

134+8

200+13

известно, что концентрация малонового днальдеглда обратно

пропорциональна митотической активности тканей. Каши данные, свидетельствуют, что ПГРг« на стадт. пролиферации увеличивал концентрацию альдегида, а аспирин снижал перекисное окисление липидов, те.' активность синтеза ПГ сопровождалась усилением пере-кисного окисленнл липидов.

Протекание многих патологических состояний - сопровождается изменением интенсивности процессов перекионого окисления липидов. Для нормализации гомеостаза окислительных реакций в организме существует система защиты - ингибиторы свободкорадикальных процессов или антиоксиданты. Одним ив таких веществ является токоферол. Содержание витамина Е по данным наших исследований снижалось на стадии пролиферации по сравнению со стадией покоя (табл.4).

Таблица 4

Влияние индомегацина, аспирина и ШТ^а на концентрацию влтамина Е в гонаде гребешка на стациях покоя и пролиферации.

а-токоферол мкг/г сырой ткани

июль октябрь ноябрь

К 30+5 ■ 21+1 25+1

ИНД 34+3 22+1 24+1

ДСП 23+1 28+1 24+Э

11ГГ2а 33+5 '17+1 28+1

Введение в среду ШТго. уменьшало концентрацию токоферола, а аспирина - увеличивало её содержание нз стадии пролиферации. -Относительно низкое содержание, витамина'Е в- период митотического деления гамет отражает высокую скорость использования его как ан-

тиоксиданта, который препятствует развитию перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот и инактясирует свободные радикалы, предупреждая.тем самым нарушения в развитии галет, особенно хромосомные, абберации (Теппермен Дж., Теппермен X., 1989; Баз, 1991; 1)уаио\', 1992).

Обобщат выше изложенный материал, можно сказать, что стадия пролиферации протекает при сниженном уровне шрекисного окисления, нюкой. активности простагландиксиятетаэы и минимальном уровне простагландпнов 'Ег и Г га. Механизм действия простатландинов связан, по данным наших' исследований и литературным сведениям, с угнетением синтеза ДНК, опосредовано через накопление в клетке цАШ. (Ак1:ог1ез еЬ а!. , 1983; Ивашкин и др. ,1987; Епифанова и др., }9В8; Круглякова, Шишкина, 1992; Еш^а е1 а1., .1993).

Ыы не считаем, что всю регуляцию пролиферации гониев можно свести лишь к биологическш свойствам простат ландинов. Они являются частью системы, управляющей воспроизводством полоеых клеток и окончательную роль их можно оценить лишь- изучив взаимодействие с другими регуляторными Механизмами (рис.3).

Если биологические эффекты прсстагландинов в органах ливот-ных, в большей степени млекопитающие, установлены, то механизмы их действия и особенно, взаимосвязь с другими регулирующими системами остаются до сих пор малоизвестными.

Один и тот' же простагландин в одном и том же органе может участвовать, в регуляции разных функций и вызывать противоположные реакции. Это создает значительные.трудности для интеграции ПГ в системе регуляции и установления ж взаимодействий.

Показано, что митагенные пептиды подавляют пролиферацию, действуя опосредовано через ПГ. При этом наиболее выраженным ин-

Ф АКТОРЫ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

цнс

АцХ НП

ВЩ I

V

ГОНАДА

ИНДСИЕТДЦИН, АСПИРИН

NN

¡ВитамшГ г;'

ПОЛОВАЯ

ХЛЕТКгГ "

митотичеслая алтнвность

Рис. ■ 3. Схема регуляции яролифернции -ггслег приморского грейетиа с участием эикоганскдов. ■ АцХ - зцегнлхолкн;'НП - нейро-яептлды; ЕМА - биогенные моноамины; ИФз - иногмтол -3-' фосфат; ДГ - диацилглицерол; ПОЯ - лерекисное окисление.', лютидоз. ■

гквкруюцм эффектом обладает ПГЕг (Shapiro et al., 1993). Другой гормон - пептид-тый морфоген, активируя 5а - редуктазу, повышает синтез ' стероидных гормонов и стимулирует пролиферации гений (Баранова,. 1994). Согласно исследованиям провезенным нз млекопатаю- • цих, эффекты сотрогенсв реализуются на фоне высокой концентрации простациклкна (Terragno, Terragno, 1979).

Известно участие простагландинов в нересте, котосый у двустворчатых моллюсков запускается гонадотропньвл регуляторным пептидам через секрецию -серотоннна, при участии ШТг«» ускоряющего эм-мискю половы;-: клеток. (Еараксин, 1994). Этот простагландин снижает действие хелинергг.ческой- системы и повышает констрикторные функции моноаминергических нейронов нз гладкую мышечную ткань (Теп-пермек Дж., Тэппермен X., 198Э), 'в сом числе, возможно, усиливает степень сократительных возможностей аддукторной мышцы двустворчатых моллюсков. ■

Анализ литературных данных показывает, что пептидергическая и монсамикергкческал системы начинают ■формироваться на ранних стадиях- развития половой клетки. Метзнкефалин,' нейропептид, холе-цистокиник, полевав стероздные гормоны и'ферменты 'их обмена, а также прсстагландины выявляются в гониях и ь ходе гаметогенеза их содержание и активность увеличиваются (Вараксин, "1994). Сходным образом в гаметах формируются биогенные моноамины, энзимы их синтеза и внутриклеточные мессендуеры коноаминергической системы (Мотавкин и др., 1990; Хотимчерко и др., 1993). Сформировавшаяся половая ' клетка в полной мере обладает основными регуляторными системами (Бузниксв, 1987: spiterisrech, Nieschla?, 1993;.

Однайо, пептидергическая.,.мснозминергическая и етерсидерги-ческая регуляция характеризуется на стадии пролиферации • низкой

Функциональной активностью (Мотавкин и др., 1890). Одну иэ.-причин, вызывающих угнетение регуляторшх механизмов, можно объяснить 1.М, что размножение гоний идет практически при отрицательных температурах воду.

В современной . литературе ' рассматриваются две нейроэтологи-ческие гипотезы о роли, которую играет температура внешней среды в ;оловом поведении пойкилотёрмных морских организмов (Хотимченко и др., 1993). А) по "инструктивнсй" теории нервные центры связаны строго определенно и не могут функционировать, пока внешний сигнал не запустит программу - врожденный поведенческий механизм. Б) по■"селективной" теории - нервная система состоит из клеточных ансамблей, каждый из которых специфически реагирует на внешние сигналы. Последние -.лужат лишь для отбора клеточных групп, необходимых для реакции, предопределяет более.широкие возможности для адаптации полового поведения морских организмов.

У двустворчатых моллюсков преобладают стереотипные врожденные инстинкты, которые контролируют цикличность гаметогенеза. Поэтому, температура внешней среды выступает у приморского гребешка и как сигнал .полового поведения, и как инициатор половой активности. включающий механизмы регуляции гаметогенеза. Повышение температуры, в пределах адаптации вида сокращает, а понижение ее удлиняет время полового цикла (Мо1а-/к1пе, УагаякШе, 1989).

Изменение температурного режима, так называемая температурная стимуляция, как метод, предлагаемый для воспроизводства гребешка, сокращает стадию пролиферации и время всего гаметогенеза. Однако примерно на 1/3 снижает плодовитость моллюска (Викто-ровская, 1889) . Восполнить эту, потерю -помогут более полные знания, об эндогенных механизмах, в том числе и дальнейшее исследование'

рспи простггландинов, которую они играют в гаметсгенезе и в нересте приморского гребешка.

Выгоды

1. 3 гонадах самцов и самок приморского гребешка установлено наличие простагланднноз Еа и Гг« с колебаниями концентраций в сторону уменьшения от стадии покоя ч стадии пролиферации.

2. Активность ' простагландкн-скнтетагк колеблется по стадиям полового цикла, м&чимальный синтез прсстагландинов соответствует стадии пролиферации. Фермент локализован в мембранных структурах половых клеток.

3. Содержание прсстагландинов и интенсивность их синтеза опосредовано зависят от наличия в клеточной среде перекисей (малоново го диальдэгида) и антиоксндантсз («-токоферола).

4. Индсметацин на стадиях покоя и пролиферации стимулирует развитие гонады: повышает число оогониев и сперматогонпев, увеличивает значения гонадного индекса, не вызывая патоло1 .¡ческих иэ-■мек?ний в клетках,

5. Простатландикы Е? и Ггя и арахидонозая кислота тормозят развитие гонады: снижают содержание оогониев и сперматогониев и значения гонадного индекса по сравнению с контролем, не нарушая структуру клеток.

5. В опытах о индсметацином, который блокирует образование простатландинов, и половым стероидным гормоном - тестостероном, усиливается синтез ДНК, а с ддщ, цГМФ, простаглзндинсм Гс« и арахидсновсп кислотой встуглэниэ гений в фаеу 5 клеточного цикла тормозится.

7. Простатландины задерживают пролиферацию оогониеЕ и спер-матогониев, блокируя синтез ДНК, вероятно, через интерцеллюлярные мессенджеры цАЬй и ЦГШ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ№ . ДИССЕРТАЦИИ

i. Мотавкин П.А., Вараксин А.А., Низяева Е.П.., Реурова О.А. Типы нейронов центральной нервной системы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay). // Архив анатомии, .истол. и эмб-риол. 1988. Т.95. N 12. С.14-20.

г. Реунова 0. В. Влияние индсыетацша. на пролиферацию сперма-то гоний приморского гребешка. //' Тез. докд, 4 регион, конф. мол. уч. и спец. ДВ. Биол. ресурсы шельфа, их рациональное использование и охрана. Владивосток. 19S9. С. 72.

3. Вараксин А.А., Еараксика Г.С., Латышев Н.А.. РеуноЕа О.В. Действие простатландина Fgcc на эмбриональное и личиночное развитие морского ежа St 'ongylocentrotus intermedias. // Механизмы действия медиаторов и гормонов на э^фекторные клетки: Тез. докл. Суздаль. 1989. С.33.' . ' '

4. Реунова О.В. Действие индометацнна и арахидоновой кислоты на пролиферацию сперматогониев приморского гребешка. // Мат. науч. конф. мол. уч. ВГШ и JF0 АН СССР. Владивосток. -99О. С. 57. ■

5. Vsraksin А.А., Latyshev N.A., Varaksina G.S., Karaaeva Е.М., Reunova О.У., Khotí :henko íu.S. Involvement of arachidonic acid and its metabolites in regulation of germ cells'of marine bivalve molluscs and echinoderrns. // Онтогенез. 1991. 1.2Í. M 4. C.428-429. (Abst. Soviet-Finnish • Syrnp. •"Signal.Molleoules and'

Différenciation". Suzdal. 1991.

6. Varaksln A.A., Varaksina Q.3., ReuncvaO.V., Latyshev N.A. Significance of serotonin and fatty acids for stimulation of spawning and meicsis reinitiation In oocytes of bivalve molluscs. // Reg:. Meet. Inter. Sco. Invert. Neurobiology. Minso. 1991. F.103.

7. Реунова O.B. Ультраструктура сперматогониев гребешка при-'мсрскего -при воздействии арахидоновой кислоты и индометацина. // Тез. докл. XIV конф. по электр.' микроскоп:-! (биол., медицина). Москва. 1992. С.159.

8. Varaksin А.А., Varaksina В. 5., Reunova O.V., Latyshev N.A. Effect of serovonin, some fatty a-ids and their metabolites on reinitiation of meiotic maturation in oocytes of ' bivalve Spisula sachalinensis (Schrenk). // Сотр. Biochem. and Physiol. .1992. V.101 C.N 3. P.627-630.

9. Вараксин А.А., Реунова O.B. Влияние индометацина, арахи-доновой кислоты и некоторых ее метаболитов на пролиферацию спер-матогониев у приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis. // Ж. эвол. биохим. и.физиол. 199:3. Т.29. N 3. С.330-334.

10. Deridovich I.I., Reunova 0.V. Prostaglandins: reproduction control in bivalve molluscs. /. Сотр. Biochem. Phy iol. 1993. V.104 A. N 1. P/23-27.

Отп.ПОП Приморскгидромета Закал JP 33 Тираж ГО0