Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности роста фолликулов и созревание ооцитов в яичниках коров при культивировании IN VITRO

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Закономерности роста фолликулов и созревание ооцитов в яичниках коров при культивировании IN VITRO"

всесоюзный научно-исследовательскии институт

разведения и генетики сельскохозяйственных животных

На правах рукописи

СВИРИДОВ Борис Евгеньевич

удк 636.2:591.405.1

ЗАКОНОМЕРНОСТИ РОСТА ФОЛЛИКУЛОВ И СОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ В ЯИЧНИКАХ КОРОВ И ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ IN VITRO

Специальность 03.00.15. — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения н генетики сельскохозяйственных животных.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор М. И. Прокофьев; доктор медицинских наук Э. Л1. Китаев; доктор биологических наук А. Ф. Смирнов.

Ведущее учреждение: Всесоюзный научно-исследовательский институт животноводства.

Защита состоится « 1992 года на за-

седании Специализированного совета Д 020.07.01 по защите диссертаций па соискаине ученой степени доктора наук при Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения и генетики сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Санкт-Петербург — Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « // » .^ 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор с.-х. наук, профессор

Ж. Г. Логинов

Г 'i

\ I. ВВЕДЕН И Ii

. - ,,.ЬЛ. Актуальность темы. У самок крупного рогатого скотд имеются'огромные потенциальные генетические возможности, однако в естественных условиях реализуется только незначительная часть. Одним из подходов к решению этой проблемы является обработка таких животных гонпдотропными гормонами, которая способствует некоторому увеличению числа созревших и способных к оплодотворению ооцитов. Трансплантация полученных из таких ооцитов эмбрионов дает возможность эффективнее использовать дополнительные резервы повышения продуктивности крупного рогатого скота и решить вопросы ускоренного воспроизводства высокопродуктивных коров.

Основным препятствием широкого распространения метода трансплантации является трудность получения необходимого для этих целей числа полноценных эмбрионов от доноров. Успестное культивирование вне организма ооштов, выделенных из антраль-ных фолликулов и последующее оплодотворение в какой-то степени способствует увеличению, числа эмбрионов, пригодных для трансплантации. В настоящее время разработан метод, при.помощи которого получают до 20 эмбрионов из яичников одного животного, что позволяет увеличить число стельностей до 130 на 100 животных (cross, I9Ö9). Однако, далеко не весь генетический потенциал при этом будет реализован, так как наши знания о росте и созревании ооцитов и фолликулов весьма ограничены.

Процессы роста ооцитов и фолликулов регулируются сложными взаимоотношениями между различными факторами, действующим как в самом фолликуле, так и между популяциями фолликулов. Остаются неизвестными механизмы, которые заставляют фолликулы поки-. нуть пул покоящихся'и начать свой рост. Происходящая атреэия покоящихся фоллнкулот значительно снижает генетический потенциал животных• На всех этапах созревания ооцитов и фолликулов происходит их атрезия. Атретические процессы достаточно сложны и мало изучены. Они зависят от возраста животного, гормонального статуса организма, от условий внешней среды и т.д. Все еще остаются неисследованными механизмы регуляции мейоза в оогене-зе крупного рогатого скота; механизмы блока мейоза и его снятие. Очень мало известно о процессе созревания ооцитов, регуляции сложных межклеточных взаимоотношений, когда ооцит и фолликулярные клетки составляют единую сопряженную систему,в результате чего в ооцит поступают сигналы, от которых зависит как блок

I

мейоза, так и инициация, созревания (Дибан, 1ШВ), В связи с этим возникает необходимость глубокого изучения видовой и возрастной специфики оогенеза и фолликулогенеза крупного рога« того скоти.

Решение этих проблем представляет не только большой теоретический ннтерес, но будет способствовать созданию новых путей эффективного управления оогенезом млекопитающих и поможет решить проблему более полного использования генетического потенциала яичников.

1.2. Цель и задачи исследований. Для того, чтобы решить проблему использования генетического потенциала яичников коров необходимы более глубокие знания биологии роста и созревания ооцитов и фолликулов. Основными вопросами исследований являются: инициация роста ооцитов и фолликулов и их атрезия, взаимоотношение фолликулярных клеток и ооцита, механизмы регуляции ыейоза и его блок в онтогенезе крупного рогатого скота, а также при культивировании ооцитов и фолликулов вне организма.

В задачу наших исследований входило;

- изучение динамики роста ооцитов в яичниках коров; • изучение характера атретических процессов у коров в онтогенезе;

- разработка количественных морфологических и функциональных критериев оценки степени атрезни антральных фолликулов;

- исследование созревания ооцитов при культивировании вне организма.

1.3, Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые изучен характер атретических процессов.в онтогенезе крупного рогатого скота. Показано, что уже в период образования ооцитов у эмбрионов начинается массовая гибель половых кле ток. Атрезия наблюдается как в период образования фолликулов, так и по мере его роста, причем характер атрезни изменяется. Наиболее подвержены атрезии • примордиальные фолликулы, растущие фолликулы - в меньшей степени. Характер атрезии интралышх фолликулов зависит от возраста животных и от стадии полового цикла,

- Ир&длонсМ способ количественной оценки степени атрезии. фолликулов. Имеется определенная взаимосвязь между атрезией фолликулярных клеток и дегенерацией хромосом ооцитов. Полярографический метод определения утилизации кислорода фолликулам! позволяет быстро оценивать степень атрезии фолликулов. Предло-

генные подходы в значительной степени способствуют унификация. фолликулов по степени их атрезии и могут быть использованы при отработке новых более совершенных методов вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота, а также при культивировании ооцитов вне организма.

Выявлена хронология появления огдитов на каждой стадии профазы I мейоза в яичниках плодов ■ крупного рогатого скота. Определено количественное соотношение состава популяции половых клеток в яичнике в течение всего периода развития эмбриона. Показаны преобразования хромосом в период формирования, созревания и атрезии ооцитов, тем самым созданы определенный предпосылки для дальнейших исследований генетического потенциала яичников.

Изучена динамика созревания ооцитов при культивировании их вне организма. Дифференцировка ооцитов по состоянию кумулюса с последующим отбором их для культивирования позволяет увеличить число созревших ооцитов до стадии метафазы II свыше 80/о, Культивирование ооцитов в присутствии стероидных и гонадотропных гормонов снижает число ооцитов с дегенерировантгли хромосомами. В результате оплодотворения ооцитов, созревших-вне организ- . ма, были получены эмбрионы на разных стадиях развития (от 2-х клеточной стадии до морулн)."

Разработанный метод индивидуального культивирования фолликулов позволяет довести созревание ооцитов до 83%, при этом наблюдается разрастание кумулюса и гранулезы, активизируются сте- ■ роидогенез. Разработанный метод позволяет изучать закономерности созревания фолликулов и дает возможность более эффективно использовать генетический потенциал яичников.

1.4. Апробация работы. Советско-французский симпозиум по животноводству (Москва, Дубровицы, ВИЙ," 197В), Всесоюзный съезд эмбриологов (Москва, МГУ, 1980), Всесоюзная конференция по проблеме клеточной репродукции (Ленинград, ЦИН АН СССР, 1981), Всесоюзное совещание по культивированию клеток (Пущино, ИБ£ АН СССР, 1982), Всесоюзное совещание по эмбриогенстике (Москва, ИМГ АН СССР, 1982), I Всзсоюзная конференция по цитогенетике сельскохозяйственных животных (Москва, ИЕР АН СССР, 1965), Международная конференция по физиологии сельскохозяйственных животных (ЧСФР, Либлицы, 1988), Всесоюзная конференция по мейозу (Новосибирск, Институт цитологии и генетики СО АН СССР, 1990).

1.5, Объем работы, Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований,- обсуждения, выводов и предложений. Диссертация изложена па 252 страницах машинописного текста, включая 22 рисунка и Ь.'3 таблицы. Список использованной литературы состоит из 253 источников, в том числе 211 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом наших исследований служили яичники плодов неполовозрелых и половозрелых животных крупного рогатого ско- ' та черно-пестрой породы. Возраст плода определяли по его размеру. Возраст животного после рождения устанавливали по документации.

Яичники доставляли в лабораторию с Ленмясокомбината не более чем через 2-3 ч после забоя животных. Патологические яичники (кистозные, с геморрогическими фолликулами, с резко ■ уменьшенным числом фолликулов на поверхности и с другими отклонениями) отбраковывали. Яичники от стельных коров также в экспериментах использованы не были, так как во время стельности активизируются атретические процессы. Транспортировку осуществляли в термосе со средой ТС-199 при температуре 15-20°С. После доставки в лабораторию яичники отмывали от крови стерильным физиологическим раствором.

Яичники фиксировали в растворе Буэна, обезвоживали возрастающей концентрацией этилового спирта, заливали в парафин. 'На микротоме приготовляли срезы толщиной 7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином по Эрлиху-Гейденгайну. Подсчет половых клеток на серийных срезах проводили по всей плоскости среза. С целью исключения возможности повторного подсчета одной и той.жеклет ки на следующем срезе соблюдали интервал между ними не менее 42-49 мкм, расстояния, равное диаметру первичного фолликула, т.е. анализировали каждый 6-7 срез. В каждом яичнике подсчитывали клетки, при этом выделяли каждую стадию профазы мейоэа. Определяли процентное соотношение половых клеток к общему числу всех подсчитанных клеток яичника; процентное отношение обго ний и ооцитов к общему числу подсчитанных клеток, соотношение разных стадий профазы мейоэа и доли дегенерирующих половых кле ток по отношению к общему числу половых клеток.

Из антральных фолликулов путем надреза лезвием бритвы выделяли ооциты в среду ТС-199, содержащую 5 ед/мл гепарина. Оо-

циты помещали на 20 мин п 0,9% раствор цитрата натрия. Затем при помощи препаровальных игл ооцити отделял» от клеток куму-лгоса и переносили на предметное стекло, где и фиксировали раствором метанол-уксусной кислоты а соотношении 3:1 по. методу Тарковского (1966). Окраску препаратов производили раствором Гимза. Исследования препаратов хромосом ооцитов вели под микроскопом МБИ-15. При опенке стадий мейоза учитывали классификацию, предложенную МакГаухвей и Полжем (ficGaugwee, Polge, 1976), и модифицированную Эрнстом и др. (I9d0).

Одиночные ооцитьт и эмбрионы, полученные in vitro, фиксировали следующим образом: обезжиренное предметное стекло обрабатывали парафином, на которое наносили каплю свежего куриного белка. D каплю вносили 5-10 ооцитов или эмбрионов с минимальным количеством среды. Висячую каплю помещали в najaxa6~ солютного спирта на 5-10 мин, затем фиксировали метанол-уксусной кислотой в соотношении 3:1. Зафиксированные капли белка подвергались обычной гистологической обработке.

В опытах по культивированию изолированных ооцитов, клетки переносили в культуральную' среду (TC-I99 - 80сыворотки КРС - 20$, пенициллин - 100 ед/мл, стрептомицин - 50 млг/мл, содержащей различные препараты гонадотропных и стероидных гормонов). Культивирование осуществляли в полистеролових чашках Петри в каплях культуральной среды объемом 100 мкл под вазелиновда маслом. В каждую каплю помещали 5-G ооцитов. Газовая среда: 2.1% Og, Ъ% COg, 74$ N2 при 100% влажности. Температура культивирования - 38°С.

Антральные фолликулы выделяли из яичников по разработанной нами методике. Выделение фолликулов осуществляли в условиях бокса и стерильности. Яичники промывали физиологическим раствором, затем споласкивали средой TC-I99, содержащей 100 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. После промывания яичники помещали в стерильные чашки Петри с небольшим количеством среды TC-I99 с антибиотиками. Скальпелем производили надрез > яичника по наибольшей длине в месте вхождения сосудов в него. Хирургическими пинцетами разделяли яичник на две половины по линии надреза. Видимые на внутренней поверхности фолликулы с помощью глазных анатомических пинцетов отсепарировали от соединительной ткани с двух сторон, после чего фолликул выделялся свободно. Остатки соединительной ткани удаляли под бинокулярнш микроскопом МБС-9 с помощью препаровальных игл. Выделение фол-

ли кули помещали во влажные камеры.

Фолликулы культивировали в среде 199 с 20% гомологичной сыворотки при- рН 7,2-7,4 в присутствии антибиотиков (пенициллина - 200 ед/мл и стрептомицина - 50 мкг/мл с добавлением СЖК, ФСГ, ЛГ и инсулина в газовой среде: 55% 02, 5% С0?_, 40% Н2 . Температура - 38°С.

Качество фолликулов определяли визуально по степени развития кровеносной системы или по специально разработанной для этих целей методике. В опыт брага только фолликулы с развитой кровеносной системой. Фолликулы белесые, непрозрачные, со ела-' бым тургором в опытах неиспользовались.

Изолированные фолликулы культивировали в специально нами разработанной системе или в ро'ллерной установке. Культивирова-' нив в роллерной установка осуществляли групповым или индивидуальным способам. После окончания срока культивирования из одной части фолликулов извлекали ооциты и готовили препараты для исследования хромосом. Другую часть фолликулов фиксирова-1 ли в растворе Буэна, заливали в парафин и готовили гистологические препараты для исследования изменений морфологии фолликулов в процессе культивирования. Также были проведены исследования синтеза стероидов фолликулов после завершения культивирования.

Для определения интенсивности дыхания антралы'ше фолликулы, ввделенные из яичников коров,'очищали от соединительной ткани, взвешивали на весах ВЛР-200, помещали во флаконы с двумя мл среды TC-I99 (рН-7,4) и ставили на инкубацию в термостат при температуре 3tJ°C, Параллельно ставили, контроль; среда без фолликулов и среда с фолликулами, подвергнутыми температурному воздействию (60° в течение 30 мин). По истечению срока инкубации фолликулы извлекались из флаконов, а раствор колоримвТ; рировали на спектрофотометре Oí-16 при длине волны 550 нм. Полученный результат пересчитывали и выражали в единицах оптической плотности на 100 мг ткани в час. Затем фолликулы помещали на предметное стекло в 0,9% раствор цитрата натрия. Препара-вальными иглами разрывали фолликул и клетки гранулези пипетйро-■• вали в растворе цитрата натрия. После чего часть клеток грону-' лезы переносили на другое предметное стекло и делали мазок,который фиксировали метанол-уксусной смесью. Полученный препарат окрашивали раствором Гимза по Романовскому. Иод микроскопом определяли число пикнотических ядер в клетках гранулезы и соотно« сили его с общим числом подсчитанных клеток. Данные выражались ' • б ' .

в процентах, тем самым давалась характеристика, степени атрезии фолликула при сопоставлении изменения оптической плотности куль-уральной среды при инкубации фолликулов со степенью их атрозии.

При изучении утилизации кислорода онтрольными фолликулами был использовал полярографический метод определения концентрации кислорода,растворенного в жидкости. Для определения концен-, трации кислорода использовали клпрковский платиновый электрод фирлы "Radiometer " (Дания). Работа выполнена на микрогазоанализаторе ВМЕ, микро Аструп, фирмы "Radiometer " (Дания).

Электрод был откалиброван согласно инструкции по стандартным растворам, входящим в комплект поставки прибора. Выделенные фолликулы помещали в разовые пприцы объемом 2 мл. Затем в • шприц вводили I мл культуралыюй- среды TC-I99 и ставили на инкубации при 38°С, предварительно удалив воздух. Контролем служили пробы, не содержащие фолликулов. Исследование инкубационной среды проводили через I ч, для чего 0,2 мл среды через капиллярное отверстие помещали в измерительную камеру прибора, В течение I мин определяли концентрацию кислорода в пробе. Результаты измерения сопоставляли с контролем и пересчитывали на 100 мг клеточной массы фолликула-.

Определение циклических нуклеотидов проводили на фолликулах размером от 2 до 10 мм в диаметро. Выделенные фолликулы, диаметр которых был измерен под микроскопом МВС-9, разрывали препаравальными иглами, отсасывали пипеткой фолликулярную жидкость, ткань взвешивали на весах BJI-200. Далее тканк фолликулов переносили в стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком и гомогенезировали при 2000 об/мин 3 мин в растворе, содержащем 20 мМ Трис-hcl рН 7,4 и 5 мМ теофелина из расчета 1г ткани на 10 мл буфера. Депротеинизациюгомогената и фолликулярной жидкости осуществлялась 20% трихлоруксусной кислотой. Суспензию центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин. Полученную в результате центрифугирования надосадочную жидкость нейтрализовали IN КОН по бромтимоловому синему. цАМ5 и цГШ в надоса-дочной жидкости определяли набором "Cyolic amp assay kit " и . "Cyclic GMP assay Icit " фирмы Amersham . Счет радиоактивности осуществляли на,жидкостном сцилляционном спектрометре фирмы Nuclear Chicago . Содержание циклических нуклеотидов рассчитывали на 100,мг сырого веса ткани или на 0,1 мл фолликулярной жидкости.

Определённа концентрации' стероидных гормонов проводили в лаборатории генетики «елез внутренней секреции ВНИЛРГН по раз-

7

работанной в лаборатории методике (Дмитриев и др., 19о7).

Окрашенные срезы и препиратн хромосом были исследованы под микроскопом 1.Ш1—15. Результаты исследований документировали с помощью микрофотографий.

Статистическая обработка полученных данных проводилась методом наименьших квадратов.

з. результаты исслвдовапяи и их овсувдше "

3.1. Оогенез в яичниках эмбрионов коров

При исследовании процесса оогенеза были использованы яичники от 66 плодов в возрасти от 1,5 до 9 месяцев, получен- . ных при забое стельных короп. В зависимости от размеров эмбрионов яичники были подразделены на 7 поорастных групп. В каждой возрастной группе били проведены гистологические исследования и дана колнчестпоннал оценка состава полопых клеток яичников. Результаты представлены в таблице I.

В яичниках 1,5-2 месячных плодов половые клетки пред' ставлены главным образом оогониями. Они характеризуются крупными по сравнению с соматическими клетками размерами, сферическим, центрально расположенным ядром. В ин.терфазном ядре оого-ний выявляются окрашенное ядрышко, тонкая сеть хроматина.. Око-? ло одного пвоцента половых клеток находилось на стадии пролеп-тотены и лептотены. Процесс перехода последних генераций оого-ний в ооциты характеризуется спирализацией и образованием про-хромосом. Уже в яичниках этого возраста появляются дегенериро-вшшые половые клетки.

У плода на 2,5-3 месяце развития значительно увеличивается число ооцитов на стадиях пролептотены.'В ото же время появляются первые ооциты на стадиях зиготены и пахитены. Леп-тотеновые хромосомные нити располагаются параллельно дгтуг дру~. гу и происходит конъюгация гомологичных хромосом. После конъюгации хромосомы интенсивно спирализуются и. сходятся к одному полюсу, формируя плотный клубок. 11а стадии пахитены хромосомы имеют хорошо выраженную четкую структуру. В этом возрасте -плода' увеличивается число догенерированных половых клеток.

В период от 3 до 4 месяцев развития плода происходит . 'значительное изменение соотношения между оогониями и ооцитами, • число последних составляет 45%. Далее наблюдается снижение числа ооцитов на стадиях пролептотены и значительное увеличение на стадии зиготены и пахитены. Число ооцитов на двух последних

Таблица I

Количественная характеристика состава половых клеток яичников плодов коров

на разных сроках развития

Возоаст \iu~nn плода: Число - 1 клеток

Число Оогонии Дегенера-эмб- % ции, % рио-нов

Доля ооцитов на разных стадиях профазы мейоза, % Пролептотена Лептотена Зиготена Пахитена Диплотена

1,5-2,0 1547 - 8 97*2,1 1,8*1,2 0,7*0,1 0,4*0,1 - -

2,5-3,0 ' 1596 10 75*3,5 7,8*1,1 4,7*0,2 7,0*0,5 2,2*0,1 3,1*0,2 -

3,5-4,0 ' 2942 9 ' 42*2,7 14,0*1,6 11,0*0,2 10,0*0,9 16,0*1,2 8,0*0,5 -

4,0-4,5 ■ 1977 12 33*3,1 12,1*1,1 4,0*0,3 7,0*0,6 . . 31,0*1,5 13,0*1,1 5,0*1,3

5,0-5,5 2294 9 1,8*0,3 14,4*1,2 3,7*0,2 3,0*0,5 '8,9*0,6 19,6*1,6 43,4*1,6

6,0-7,0 1322 II . - 11,4*0,8 0,7*0,2 0,5*0,1 2,3*0,5 25,5*1,2 63,5*1,4

8,0-9,0 ■ 864 8 - 8,1*0,5 0,1*0,1 0,2*0,1 1,4*0,5 12,8*1,2 71,8*1,6

.стадиях у эмбрионов на .4-4,5 месяц составляет 44%. В этот период развития появляются ооциты на стадии диплотены. Процент де-генс-рированных половых клеток не изменяется. Далее возрастает число ооцитов на стадии пахитены и диплотены. Число дегенери-рованных половых клеток остается большим.

Б период от 6 до 7 месяца пренатального развития животного в результате прекращения митозов осгоний число- ооцитов снижается. В период от В-У месяцев большинство ооцитов находится на стадии диплотены. Ооциты, находящиеся на этой стадии, заключены в фолликулы. Па всех стадиях мейоза наблюдается дегенерация.

Таким образом показано, что оогенеэ у коров происходит асинхронно. В разные периоды развития организма можно встретит! популяции оогоний н ооцитов на разных стадиях. Во все периоды развития плода наблюдается массовая гибель половых клеток.

Особы:1 интерес представляет исследование активности яд- ' ршковых организаторов хромосом крупного рогатого скота в профазе мейоза. Данные по активности ядрышек приведены в таблице 2. Показано, что ядра оогониев содержат от 4 до 5 ядрышек разнообразных по размеру и форме. На прелептотене имеется от 3 до 9 округлых, крупных и до II мелких. На стадии лептотены число, крупных ядрышек насчитывается от 2 до Б, а по мелким наблюдается сильная гетерогенность. В одних клетках было от 2 до 9, в других клетках они вообще не наблюдаются. На стадии зиготены имелось от 2 до 5 крупных ядрышек, мелкие ядршки отсутствуют. Большинство клеток на стадии пахитены содержится б крупных ядрышек. Ооциты на стадии диплотена.содержали от. I до б ядрышек. Таким образом, на протяжении профазы оогенеза у коров наблюдается высокая транскрипционная активность ядришкообразующих районов в ооцитах, синтезирующих РНК, которые используются в процессе его роста.

• Таблица 2

Распределение ядрышек в ооцитах на разных стадиях оогенез!

Стадии мейоза число клеток число ядрышек, шт.

богонии 76 4,5 ± 0,3 •

Пролептотена 32 5,8 ± 1,0

Лептотена 27 3,9 ± 0,4

Зиготена • '29 4,3 '± 0,5 .

Пахитена 25 6,0 $ 0,8

Диплотена 26 . 3,8 ± 1,1

кГ

3.2. Атрезия (ТоллпкуЛоп и ооцитов в яичниках коров

Интенсивная потерн полових клеток и яичник« крупного рогатого скота происходит в течение всего периода жизни ¡штатного,, йпимипация ооцитов из малых фолликулов происходит в основном лизисом или фагоцитозом пшшотических ооцитов. Фолликулярные хо клетки атротячоских пршосдлмышх н жзроччинх (Толлпкулов могут ; продолжать су (чествовать в яичниках, в то вр&.чл как их ооцитц до-генерированы и исчезают полностью ( Byskoy , 1979). Лтрезил растущих фолликулов характеризуется некрозом фолликулярных глоток. Рост такте как п птрозил, зависит о.т биохимических и физиологических взаимодействий ме-ду такой, гранулезоИ и ооцптом ( Ireland, Hoohe , 1983).

В литературе отсутствуют сведения, указывающие на непосредственную связь между степенью атрезип <Толликулов и состоянием хромосом ооцитов. В напшх исследованиях впервые установлена такал взаимосвязь. Наибольший процент ооцитов с неизмененными хромосомами бил обнаружен в фолликулах, имеющих единичные клетки гранулезы с тпспотичесгаши. ядрами. По мере роста фолликула, число дегенерированных ооцитов в фолликулах с малш числом пикноти-ческих ядер уменьшается ( т.е. изменяется взаимоотношение мезду ; фолликулярными клетками и ооцитом ). В течение онтогенеза также происходят изменения этих отношений (табл.3). У плода в преан-тральных (фолликулах, тлеющих малое число фолликулярных клеток с . • пикнотическими ядрами определяется около 27% дегенерпрованных • ооцитов. После роздения особи, число фолликулов с дёгенорирован-нши ооцитамл снижается до 2.', затем повышается и у взрослой особи составляет около 10%. В этот период увеличение числа фолликулярных глеток с пикнотическими ядрами существенно сказывается на состоянии ооцлта; В этом случае все ооциты обнаруживают приз-■ наки дегенерации, С увеличением возраста происходит некоторое снижение-этого влияния.

• Несколько иначе процесс атрезли протекает в антральшх фолликулах. Наиболее активные атретичестие процессы происходят в I месяц постнаталыюго развития, когда 80% полостних фолликулов становятся атретлчеекг/л. С увеличенном возраста число таких фолликулов снижается и составляет около 60%. При Ьгом соотношение . не:иу числом фолликулов с различным содержанием пикнотических клеток п числом ооцитов с признаками дегенерации меняется. Так, ■у плода и теленка I месяца жизни слабоатретическиб фолликулы содержат 15% дегенерпрованных ооцитов, в то время как у взрослой

Таблица 3

Дегенерапик хромосом оо'литов в фолликулах разной, степени атрезни в про- и постнатольнцй

период развития атрезик

Группы животных Число Число клеток гранулезк с пикнотически--ми ядрами, % Преантральнне фолликулы Актрал ьнке фолликулы

яичников,d3t. число фолликулов, шт. число' ооштов с дегенеривованны-ми хромосомами,% число фолликулов, эт. число ооцитов с дзгенерированкыми хромосомами, %

Плод . (Ь-У месяцев) 5 менее 10 10-50 более 50 ■ . 128 . 34 ' 44 27,3^5,6 73,6±3,4' • ' 100 ' 52 18 12 13,5-3,7 57,025,1 100

Теленок 1-2 месяца • 6. менее 10 . 10-50 более 50 109 24 . 43 1,8±0,6 100 100 61 25 • 20 15,0±4,9 92,0±2,3 95,(¿1,5

Теленок-3-4 месяца 4 . менее Ю 10-50 более 50 123 23 45 ' 5,8±0,4 87,4±3,6 100 . 65 31 15 9,0±2,5 64,(£4,5 "95,0±1,5 '

Корова 3-4 года (стадия сЬолли-кулярного роста) 4 менее 10 IÖ-50 более 50 .62 12 17. • 9,7±2,7 78,2±1,8 100 30 20 18 4,5^1,1 I0,0il,5 • 87,0±2,4

особи их число составляет около 5£(табл.З). Л сильно атлетических фолликулах в яичниках плодов позднего срока стельности всо 100$ ооцитов дегенерированы, л то время как в постнаталышй период в таких фолликулах момяо встретить нормалышо ооцнтм. Все это указывает на то, что характер атротическич процессов изменяется л течение онтогенеза.

Характер атрезии аитрплышх фолликулов изменяется d течение' пологого цикла (табл.4). При исследовании яичников па стадии фолликулярного роста било показано, что наибольшее число пеатротичес-ких фолликулов шоется в популяции мелглх полостных Фолликулоп ' (менее 3 ш), где это число составляет свыше 70,'.С увеличением размера число таких фолликулов снижается. На величину указанного показателя' большое влияние оказшюот наличие крупных полостных фолликулов в яичниках. При наличии последних происходит снижение числа неатретических фолликулов меньшего размера. По-видимому, крупные фолликулы способны подавлять рост мелких,вызывая irx атрезпга. В подавлении роста мелких крупными .Толликулами в процессе атрезип полостных Фолликулов большоо значений га.юют не только характер ги-поталаш-гипофязарко-яичгшковых взаимоотношений, но и межфолликулярные взаимодействия на уровне яичника.

При исследовании яичников с делтыми телами (табл.5) показано, что по мере развития желтого тела происходит усиление атретяческо-го процесса, который сменяется ростом мелких (Толликулоа при его деградации,

В процессе атрезия наблюдаются характерные изменения кумулю-са. Показано, что на всех стадиях, полового цикла в яичниках 'Преобладают ооцитн с плотным компактны.! кумулюсом. Наибольшее число таких .ооцитов .наблюдается в яичниках в первой половине стадии фолликулярного роста, lio море развития атре'тических процессов в яичниках во время полового цикла число таких ооцитов снижается.

3.3. Функциональная гетерогенность популяции антралышх фолликулов

Одним из фундаментальных проблем биологии репродукции является вопрос:почему одни фолликулы идут в развитие и овулируют,-в то время как другие подвергаются дегенерации и элиминируют.'В этот тип селекции вовлечены внутри- и.экстраличниковые факторы. В частности, способность развивающихся фолликулов реализовать высокую концептращш зртрлдаола, которая, стимулирует рост и клоточнуга диф-ференцировку, явллетс'я. одним из центральных моментов в селекционном процессе 'фолликулов для со'зревшпгя и овуляции. Уменьшение про-

Таблица 4

Распределение фолликулов по степени атрезии в яичниках разного типа на стадии фолликулярного роста

Процент

клеток

грану-

лезы с

пикно-

тичес-

кимн

ядрами

Число яичников

2В

меньше 20

21-40

более 40

Число фолликулов, % Размер фолликулов, им

3,0 3,1-4,0 4,1-5,0 5,1-6,0 6,ЫЗ'.0 В,0.

Яичник I типа

6?£з

23^4 10±2

70^5 76±6 17^3 ' 17*4 13±3 7±2

50^4 16±4

меньше 20 21-40 более 40

23 ' Яичник П типа

77±5 ЧЧ-Ч 5В-5 30±3

■ 12^3 "12±2 23±3 40±5

П±2 9*3 . 19±3 30*2

22*4 40*5 ЗВ*5

меньше 20 21-40 более 40

25 Яичник 11 типа

42*6 29*4 2Ь*4 16*4

42*4 24*4 30*5 2В±3

16*2 47*6 45*7 56*6

29*4 29*3 4В*5

2В*3 28*4 54±7

Таблпгч !)

Распределение фолликулов по степени FvnvDiiu в яични^нх с ^-'•лтги

Процент Число (í'fpiVíM'K-fM.'.'v ('••.•лл(!1'УЛ()п, %

клеток -----------—--------■--------------------'-------

тану- Число Размер фччли ¡гулов, мм

леям с яич- -----—-----—---------—'---------------

пикно- пиков

тичес-

кими

ядрами

В1М!1 3,0 3,1-1,0 4,1-5.0 5,I-G,0 G.I-xi.O Н,0

12 Яичник после ппуляции

менее 20 72¿b Ш±4 7ܱ6 £>3±4 4Z-& 26±6

21-10 ieÍ4 I9¿3 I2¿4 22¿o 24^3 32±5

более 40 I0¿3 I3±2 15^4 25¿5 3<)±4 42±6

9 Яичник со прелым желтым телом

менее 20 , 65¿6 55¿7 ÜÓÍ5 27¿3 I0¿2

21-40 25±4 26±3 33±4 43±6 50±5 45±4

более 40 . 10*2 19±3 31±3 30±6 <лМ 55±7

II Яичник с рассасывагацимся желтым телом

менее 20 7tí¿6 73±5 75¿V 63¿4 36±3 25¿3

21-40 I5±3 I6±2 I2±3 24±4 27±2 35±4

более 40 7±I 9±I I3±3 I3±2 37±4 40Í2

дукпии йотркдиолп на любом птшю приводит к атрезии фолликулов. Однако, ото не обьясняет атрезию первичных и вторичных фолликулов. Таьим образом необходимо знать, что инициирует первичные изменения в фолликулах, которые приводят к росту и раз- . витии или их дегенерации. ■

Основные биохимические и эндокринные аспекты фолликулярной атрезии все еще не известны, таме мало мы знаем о биохимической активности гонадотропных и стероидных гормонов в растущих фолликулах.

Есть основания предполагать, что факторы, вызывающие атрезию, по-видимому, различны и зависят от стадии фолликулярного роста. Однако ясно, что процесс атреэии регулируется взаимодействием гонадотропных и стероидных гормонов. Несовершенство , баланса или снижение уровня этих гормонов существенны для этих процессов.

Имеется две гипотезы механизм« атрезии. Во-первых, клетки гранулезы генетически запрограммированы на гибель. Во-вторых их и;бель вызвана химическими посредниками, которые могут существовать в сыворотке крови или в фолликулярной жидкости (Weathotí et ai., I9tí7)'.

Некоторые исследователи считают, что атреэия представляет • собой определенный процесс в фолликулах или ооцитах, который 1 направлен на удаление дефектных гамет до оплодотворения.. Другие считают, что атреэия происходит потому, что созревание гамет и овуляторный процесс асинхронны (Sohulti et al., I9Ü3),' Однако, ооциты, выделенные из атретических фолликулов, показывают нормальное созревание и способность к дальнейшему развитию (Hay et al., 1976; Moor, Traunson, 1977).-Есть основания предполагать, что факторы, вызывающие атрезию, по-видимому,различны и зависят от взаимодействия гонадотропных, стероидных гормонов и других ьеществ с фолликулярными клетками.

Циклические нуклеотиды игра»)? важную роль в. ре!уляторнис механизмах метаболизма клеток, основной функцией которых в фолликулярных клетках является роль посредника между гонадотропнц-ми гормонами и метаболизмом (Sato et al., 1990). В период'ро-1 ста и созревания фолликула изменяется активность нуклеотидцик-лазных систем, что указывает на уменьшение баэального уровня цАЫФ'в тканях фолликулов и увеличением цГЮ, при увеличении их размера.

. Особый интерес выбывают изменения аденилатциклазной и гуанилатциклазной систем в фолликулах при их атрезии. Установке . ' •

лено, что по мере развития отрезки происходит снижение количества цАМ'5 в тканях фолликулов. Если считать, что иМФ является внутриклеточным медиатором, то естественно предположить, что при атрезии происходит разрушение фолликулярных клеток и выход цА1ЛФ, что такте сказывается на повышении уровня нЛМФ и фолликулярной жидкости. Уровень цГО1> увеличивается по мере роста фолликула. При воздействии гонадотропних гормонов происходит увеличение количества цЛМ5 п тканях фолликулов разного размера в то время, как уровень ц1Ш снижаотся. Известно, что г«|фекты цГОФ и цАМЯ могут быть синергичнч или онтогонистичнм. В данном случае, вероятно, система аденилаттишазы будет антогонистшла гуанилатциклаоы. Однако роль гуанилатниклааной системы п рапон--тии актуальных фолликулов мало известка.

Концентрация половых стероидов в «фолликулярной «идкости изменяется по мере развития фолликулов. Мелкие фолликулы интенсивно синтезируют тестостерон и он нокаплньается в довольно высоких количествах. Синтез эстрадиола в таких фолликулах мал. По мере роста фолликула все больше активизируется проматазная активность, что выражается в увеличении концентрации острадио-ла в фолликулярной жидкости. Взаимосвязи между расиером фолликула и концентрацией прогестерона получено не было. С увеличением атретических процессов в фолликулах наблюдается снижение синтеза стероидов, причем наибольшие изменения наблюдаются для . эстрадиола, в то время как синтез прогестерона изменяется незначительно. Даже в сильноатретических фолликулах синтез про* гестероиа остается весьма существенным, так как тека является ' наиболее устойчивой структурой фолликула. Изменения функциональных свойств клеток гранулеэы при атрезии в значительной степени связаны с ароматазной активностью. Ого в свою очередь ' оказывает существенное влияние на протекшие атретических процессов.

• Известно, что при атрезии кроме изменений стероидогенеза в фолликулярных клетках наблюдаются другие дегенеративные изменения: морфологии митохондрий, образования миэлиноподобных структур, увеличение липидных включений и т.д., что в свою очередь должно сказаться на потреблении кислорода фолликулярными клетками. Полученная корреляция между потреблением кислорода и степенью атрезии позволила нам' разработать метод определения степени атрезии фолликулов.

Как мы уже отмечали ранее, в атретических фолликулах эндо-

' Г7

генный уровень цАМ5 зависит or степени атразии. Потребление кислорода коррелирует не только с числом интактнцх фолликулярных клеток, но татю с уровнем ондогешюго цАк'Ф. Нопиионие ■ уу.юшш HA'.'.t можно добиться добавлением к среди инкубации цАМФ, дибутирил цЛ!.К», а чъкжа тоофщуща . ЬсС ¡эти вещества вызывают усиленно потребления кислорода тканями фолликула. Гонодотроп-нио гормоны такие активизируют адеаилатциклазную систему .увеличивая количество цАМФ в тканях фолликула. При исследовании потребления кислорода тканями в среде, содержащей разные концентрации xopiv оничоского гонадотрошша, было показано, что повышение ХГ до I ед/мл имеет место пропорциональное увеличе-. нию утилизации кислорода. При дальнейшем увеличении концентрации гормона потребление кислорода фоллтеулаыи не изменяется.-Вероятно, действий хорпонического гонодотропнна обусловлено числом рецепторов на поверхности фолликулярных клеток.

3.4. Структура хромосом в ооцитах антрапьных фолликулов

При исследовании структуры хромосом в ооцитах антрьльных фолликулов показано, что хромосомы могут находиться как на стадии 'диплотены-диктиотенц, так'и на более продвинутых стадиях мейоза от дшошнеоа до стадии мьтафазы II. Сило отмечено, что число ооцитов на продвинутых стадиях связано с иозрастсм «и-- ' вотного, размером фолликула и самого ооцита. Несомненно, наличие продвинутых стадий мейоза в ооцитах таких фолликулов связано с атретическимн процессами, протекающими в яичникахi Считается, что у большинства видов млекопитающих блок нейоза происходит на диффузной стадии - диплотоне-диктиотпне (Дыбан, I9b9). Организация хроматина на стадии диктиотене у ряда млекопитающих моает бить различна. Так у грызунов он находится в диффузном состоянии, в то время как у кошек и собак, а также у приматов ооциты имеют различную степень конденсации хромосом (Baker, 1979). Наши исследования показали, что ооциты в ант-ральнмх фолликулах коров находятся в состоянии бивалентна,фиб-рилл'ярной или в диффузной форме, ¡Сели наличие продвинутых стадий оопитов актуальных фолликулов обусловлено атретическимн ч процессами, протекающими в них, то гетерогенность на стадии диплотенц не совсем понятна. 'Ото ' мокет с одной стороны бить результатом блока мойоэа ооцитов-на стадии диплотены, когда еще хромосомы не перешли в диффузное состояние и находятся, в ■ разной степени конденсации; с другой стороны, блок, как обычно происходит на диктиотене, а по мере развития атретичоского про-10 •

цесса в фолмшулнх, блок ослабевает, в результате чего происходит кондепсапил хромосом.

В настоящее время механизм блока нейоза па стадии дни логины остается неизвестным. П^дполагпют, »¡то в фолликулярной кил-Hocrir имеется пептид, который удерживает сонат на стадии д.тль-тены (ciarke et al., 1ШЗ). По мере ослабления ингибируычего действия в результате предовуляторного подъема гонадотропинов или в случае нтрезии фолликулов, а также при культипировапии социтов in vitro в ядрах происходят структурные изменения,связанные с конденсацией хромосом (Hammond, JO'JI; Sato et nl., 1990). ' "

3.Sj. Изменения структуры хромосом ооцитоо при культивировании

Уст.'ловлена дип-л.ика созревании о они г о в при культивировании in vitro . показана хронология появхения согитоп на всех продвинутых стадиях м.еЛоза. Созревшие ооцитов происходит асинхронно, что, по-ипдимому, связано с тем, что и сама популяция ссштов в яичнике гетерогенна по структуре хромосом на стадии .диплотена-днктнотена (табл.6).

Предварительный отбор ооцитов по состоянии кумулюса позволяет довольно точно иропзиестн дифферент/ipoimy социтов, что позволяет получать высокий процент-клеток,созревших до метафа-зы II при культивировании in vitro. Наилучшие результаты гю выходу метафазы II были получены и том случае, когда использовали ооциты с плотным, компактным кумулюсэм. Наиболее пригодными оказались именно такие ооциты, выделенные из яичников на ста- . дии фолликулярного роста. В результате культивирования таких социтов выход метафазы II составлял tfO%.

. iJpii 1лтогенатичсском анализе культивируемы-: ооштон ниьи были отмечены ряд нарушений: блок анафазы первого деления созревания, наличие мостов и фрагментов хромосом, образована уни-. вьлентов, конденсация и слипание хромосом (табл.7). Известно, что для полного созревания ооцитов большое змичоние имеет соотношение стероидных гормонов. Добавление в культуральную среду стероидов помогло снизить число оопитоп с дегенерированными хрсмосомаш. Добавление к. среде культиниропанин гонадотропных гормонов также способствоьало увеличении стерсидогенеза фолли-. ¡сулярных клеток, что приводило к увеличению числа ооцитов, созревших до метафазы II и снижению клеток с дегенерированными хромосомами (табл. 7). Показано, что уменьшение стероидов в тече-

19

ние последних стадий созревания увеличивает число хромосомных нарушений на.метафазе I и П.

Таблица 6

Распределение ооцитов по стадиям мейоза в зависимости от времени культивирования

Время куль-тиви-рова-ния,ч Число ооцитов Стадия мейоза, % диплотена диакинез метафаза I анафаза I метафа:

"о 252 95 I I , — ; 3

4 21 90 - ' -

6 237 83 I - -

8 III . 60 , 36 II- 3 -

14 44 . 20 . . 47 33 -

17 45 II 28 40 2 8

20 87 ' 12 23 44 3 18 .

24 . 253 14 8 36 4 • 38 '■

30 75 11 ; 6 18 - 63

36 51 8 6 II 3 72

•40 за 5 3 10 5 76

43 41 5 3 10 3 76

50 47 2 - 53х

60 50 "2 _ _ 12х

Примечание. х - в остальных клетках наблодали интенсивную дегенерацию хромосом

• Особый интерес вызывает культивирование ооцитов внутри фолликулов. Использование этого метода позволяет сохранить естественные соотношения между ооцитом и соматическими элементами фолликула. В свою очередь этот метод позволяет в какой-то степени моделировать процесс фолликулогенеэа, изучать гормональную регуляцию роста и созревания фолликула, синтез половых стероидов, процесс атреэии, созревания ооцитов и т.д.

Важнш элементом в сложной цепи механизмов регуляции роста и созревания ооцита являются гонадотропные гормоны. При ис-. следовании созревания ооцитов внутри фолликулов при культивиро^. вакии вне организма было показано, что без гонадотропных гормо-

Таблица 7

Дегенерация хромосом и нарушение мейоза при культивировании изолированных ооштов в различных средах

(время культивирования ч)

Культуральная среда

Число Число ооцитов, %

ЙГ Задержка Нарушение

развития мейоза

ТС-199

ТС-199 + 2 икг/мл ФСГ

ТС-199 + 2 мкг/мл ФСГ+

1 мкг 3

' ТС-1991-

2 мкг/мл ФСГ+

1 мкг И

ТС-199 +

2 мкг/мл ФСГ+ . I мкг Т

Хэм Ф-10

Хэм Ф-10 + 2 мкг/мл ФСГ

Хэм 4~][0 + 2 мкг/мл 4СГ+

1 мкг. Э

Хэм Ф-10 +

2 ед/мл ХГ

Хэм ¡6-12

Хэм Ф-12 + 2 ыкг/мл ФСГ

136 102

117

112

96 119

.112

127

115 135

105

диплоте- диагашез . ■ .

на -ыетофа- Я й |о!?р,

за I

О« Ио СЧ ищи

о« ш.ч а) «о

чэз сс! ж« р.кя

Дегене-— рация хромосом на мета— фазе (1

6

7 6

II

а

7

6

1В

16

25

27 23

17

23

21 21

19

3 I 2 -

I I

- I

3 I I I

1 -

2' I

2 I

3 -

2 I

• I

40 14

18

25

32

36

25

23

¡28 за'

32

нов ооцйти не могут завершить мейоз, в то время, как в присутствии ФСГ, ЛГ или СШ половые клетки достигают метафазы П. Од- . нако при добавлении в среду культивирования ФСГ или ЛГ эиачи-

• ' 21

4

I

4

а

5

тельчо большое число ооцитов достигало этой стадии, чем при СНК. Вероятно, эти различия обуслоплены р/зной природой гормонов.

Так как большинство фолликулов п популяции подвергнуты атрезии п той или иноП степени, то определенный интерес представляет поведение таких фолликулов при культивировании (табл. 0). Приведенные дпнние показали, что ооциты в неатретических фолликулах, т.е. имеющих менее 10/5 клеток гралулезн с гшкно-тическими ядрами, в болыпшетве своем созревали до мотафазы II. При культивировании фолликулов, содержащих от 10 до 4С$ клеток гралулезн с пикнотическими ядрами около ооцитов созрели до м'етофязн И. В то время как в сильноатретических фолликулах созревание наблюдалось только у Ь% ооцитов. Порченные данные свидетельствуют с> том, что в фолликулах, подвергнута* атрезии в слабой степени, ооциты способны к созреванию до ме-тафазы II. 1

Таблица В

Культивирование ооцитов внутри фолликулов разной степени атрезии

Процент ц,.„пп Стадии мейоза, % пикноти- -------------------------------------------

^Гв ДИПЛ0ТШ1а ДИаКИНе3 фаза"! ^Гп ^Г™

клетках

грануле-

зы

менео 10 121 5 — 8 73 14

10-20 132 6 I 12 49 32

20-40 60 4 - 5 45 56

более 40 4? 2 — _ В 90

Большое значение имеет динамика созревания ооцитов в фолликулах. Было показано, что при культивировании изолированных ооцитов происходит асинхронное их созрепшше. Аналогичные данные были получены и при культивировании ооцитов внутри фолликулов, как реннициация, так и последующее развитие происходит с запаздыванием приблизительно на 6 ч в сравнении с динрликой ерзревшшя изолированных ооцитов. Задержка созревания, в основном, обусловлена задержкой рекнициацип мейоза. По-видимому,для того, чтобы вызвать роинициацию мейоза и снять блок, необходим . мо время, которое требуется не только для того, чтобы запустите реакцию, но и чтобы приизошел синтез вещества в достаточном ко-.

личестве, необходимом для запуска мейоза.

Как было показано ранее, при созревании изолированных: оопитов часть клеток блокируется на более ранних стадиях или достигнув стадии метафазы ¡1 имеет дегенерированиые хромосомы.При индивидуальном культивировании фолликулов 70,3% оопитов созрели до метафазы Г1 и только 4,5% имели дегенерлрованные хромосомы. При культивировании групповым способом созревание до метафазы II наблюдалось у ошштов, Причем большинство из них имели дегенерироьанные хромосомы. При индивидуальном способе культивирования, как и при культивировании групповым способом, наблюдались различные нарушения мейоза приблизительно в 3% , случаев. Количество и характер этих нарушений мало зависели от способа культиьирования (табл.9).

Как мы уже указывали ранее, реинициация ыеИоэа при культивировании фолликулов происходит через 6-В ч поело .добавления в среду гонадотропных гор/сноп, В ото время происходит ряд важных событий, которые И определяют судьбу ооцита. Вызывает определенный интерес последовательное культипирование оопитов сначала в фолликуле, а затем изолированно в каплях среды. Ци- ' .тогенетический анализ показал, что большинство оонитоа созревало до метафазы II. Следует отметить, что при последовательной культивировании число оопитов с дегенерировантми хромосомами не намного выше по сравнению с индивидуальным культивированием фолликулов. Если культивирование в фолликулах производилось В н 15 ч, то нарушение мейоза также было незначительное и сопоставимо с другими способами культивирования. Однако, если культивирование происходило 21 ч в фолликулах, то резко возрастает число ооцитов с (5локом анафазы I. По-видимому, эти нарушения мейоза обусловлены тем, что в период изоляции ооцитов из фолликулов большое число меток находится на стадии анафазы I, и небольшое колебание температуры или других культуральних условий приводит к этим измененном.,

Очевидно, такой смешанный способ культивирования может быть весьма перспективен, так как считается, что в настоящее время довольно сложно создать полноценные условия для культивирования фолликулов в теченио длительного периода времени,по- ■ ■этому использование последовательного культивирования является полезным, а именно тот факт, что в первые часы культивирования создаются условия в достаточной степени подобные тем, которые происходят в организме.

to ■fe

Таблица 9

Нарушение мейоза и дегенерация хромосом при культивировании оогатов внутри фолликулов

(время культивирования 36 ч)

Од ' Число ооцитов, %

вания ооцитов внут- ^щтов 'Задержка развития - Нарушение мейоза Дегенерация

1ТОТТЛПТ„НЯ диакинез- ■ • блок полиплои- неправиль- метафазе П* ыетафаза I анафазы дия. ное расхождение хро-' мосом

Индивидуальное

культивирование IS8 4

фолликулов

Групповое культивирование 206 7. фолликулов

16 20

2,3 1,2 .1,9 170

1.7 "2,0

4,5 38

Время культивирования в час

фоллику- изолированное ных ооцитов

Последовательное культивирование ооцитов в фолликулах и изолированных ооцитов

8 ■ 23 107 8 23 2,1 1.2 .1,6 9,0

15 21 98 6 31 4,2 1,5 1.9 16,Q

21 15 92 5 - 15 20,1. 1,9 1,3 .. 27,0

Прц изучении ВЛИЯНИЯ ГОНа.ЦОТрОШШХ. ГОр-ЮИОВ lía морфологические характеристики Фолликулов в процессе ах кельтии пропаши било показано, что при этом происходят изменения всех структурных элементов фолликулов.

Существенные изменения морфологии паблвдаю-гсл и фолликулах, в которйх ооцнтц созрели до метафазы И и имели хромосомы баз ви~ дш.шх признаков дегенерации. В тех ;;<е фолликулах, в ооцитах которых Наблюдалась рсшг.щшщия меПоиа, но созревание остановилось намета.Тазе - анафазе I и хромосомы июли признаки дегенерации, морфологические особенности культивируемых фолликулов виравались, в- основном, е прогрессивном увеличения числа клеток с пикиотичасг.ими ядрами. По-видимому, состояние хромосомного комплвкиа ооцита сопряжено с функциональным состоянием Фолликулярных структур. Очевидно, что атретичоские изменения, которые происходят в фолликулах, сказываются на состоянии ооцита, но не исключена и обратная связь: дегенеративные изменения ооцита могут предшествовать необратцмам изменения!.! самого Флллицула.

Необходимо отметить, что в процессе культивирования в средах, содержащих СШС и ЛГ, набладаотоя низкая аитотическая ап-■ тиеность фолликулярных клеток. Од!шко она увеличивается в фолликулярных клетках в культуральных средах, содержащих ЮГ. В фолликулах, в которых ооцатц находились на стадии метафазы II без признаков дегенерашш, число клеток с'шшютлческимн ядрами было 18,6,2. Наименее существенные изменения морфологии■ происходят, 'в клетках теки. Клетки кумулиеа занимают в этом отношении промежуточное положение. Увеличение объема кумулюса и гранулезы, по-видимому, ц^исходит за счет увеличения моНллеточпоги пространства, размера самих клеток и ил. ядер. Увеличение размера ядер указывает на активацию сгнтетпческой и секреторной активности фолликулярных .клеток. Не исключено, что увеличение цеаъадерного .расстояния moíot происходить из-за гибели (лизиса) клеток с пнкнотичесшыи ядрами.

'Показано, что наиболее значительные изменении морфологии фолликулов происходят при наличии в культуралыюй среде фолликул ос тпму лиру юще го гормона. ■ Гранулеза является, наиболее лабильной структурой, .поскольку она в большей степени подпряжена ат- -резни и активно реагирует' на воздействия гонадотрошшх гормонов.

В .присутствии гонадотрошшх гормонов происходит значительное увеличение синтеза половых стероидом фолликулами. Причем ЛГ' и СЯК вызывают более интенсивные увеличения синтеза лрогеотеро-. ' 25

Таблица 10

Никиотические ядоа в фолликулярных клетках до и после • культивирования

Состоите Процент гшкнотических ядер в -клетках

ооцита°М кумулюсо. токи • гронулезы слоор гРа!Улсзи ^

плотного рыхлого

До культивирования Диплотена 0,3*0,1. 2,6*0,2 3,4*0,3

После 20 часов культивирования

Диплотена 0,6*0,2 • 0,7*0,1 11,0*0,8 8,2*0,4 13,8*1,2

Метафаза I 0,5*0,1 . 1,8*0,3 6,7*0,5 4,1*0,4 9,3*0,3

Метафаза I . ■ '

Лег. 0,7*0,3 3,5*0,4 8,9*0,6 4,4*0,3 13,3*0,9

После 40 часов культивирования

Диплотена 13,0*1,7 10,0*0,8 50,1*1,3 30,0il,4 ' 70,2*1,9

'Метафаза I 5,4*0,5 9,3*1,1 27,9*2,3 17,8*0,7 38,0*1,4 '

Метафаза I . ^ ,

дег. 7,5*0,3 7,1*0,4 42,2*1,7 28,3*0,9 56,1*2,3

Анафаза I 5,9*0,8 3,7*0,5 19,0*1,4 13,5*1,1 24,5*1,5

Анафаза I , , , . ..

дег! 9,3*1,2 6,2*0,3 32,8*2,1 27,4*1,7 . 38,2*1,8

Мет.афаза Л 6,8*0,7 7,1*1,5 18,6*0,9 15,8*0,7 21,4*0,7

на, чем ФСГ. Однако в отличие рт.ЛГ, в присутствии ФСГ происходит даже некоторое снижение синтеза прогестерона мелкими фолликулами. Интенсивность синтеза эстрадиола малыми фолликулами зависит от типа гонадотропньк гормонов£ повышением размера фолликулов интенсивность синтеза этого стероида увеличивается. Наиболее активным гонодотропным гормоном в этом случае является ФСГ (табл.11).

В клетках теки осуществляется синтез прогестерона. Клетки гранулезы, имеющие высокую ароматазную активность, .синтезируют -острадиол, используя в качестве субстрата андрогены, синтезируемые в теке и гранулезе. Этому способствует наличие большого числа специализированных межклеточных контактов между фолликулярными клетками, которые имеют повшенную проницаемость для ионов и малых молекул и определяют взаимосвязь между различным элементами фолликула* Для полного завершения биосинтеза стероидов не-' ■ обходимо одновременное участие тери и гранулезы. Морфологичес-

кие исследования показали, что в процессе культивирования сохраняются нормальные отношения менду клетками теки и грануле-зы, что выражается в довольно интенсивной синтезе эстра-

'диола фолликулами. В результате культивирования происходит увеличение соотношения эстрадиол-прогестерсн в несколько раз. Ве-

Таблица II

Синтез прогестерона и эстрндиола фолликулами в процессе культивирования (ФСГ 2 мкг/мл)

Диаметр Число фолли- фолликулов , кулоь,. мм шт.

Синтез стероидов мкг/100 иг сырой массы ткани фолликулов, ч

прогестерон

эстрадиол

начало культивирования

конец культивирования

начало культивирования

конец культивирования

2,0 135 6,12-1,3 50*12,4 1,57*0,7 7,3*1,2

2,5 118 3,75*0,9. 46,8*11,9 1,35*0,6 1,7*0,3

3,0 102 3,43*1,03 12,9*4,1 0,63*0,5 2,0*0,3

3,5 136 3,08*1,1 12,1*3,6 0,6(1*0,3 7,2*1,3

4,0 147 2,64+1,02 12,4*3,6 0,62*0,3 '7,3*1,6

4,5 176 1,71*0,6 14,8*2,9 0,60*0,3 8,4*1,9

5,0 153 1,37*0,56 14,0*3,0 0,49*0,1 10,8*2,4

5,5 150 2,20*0,83 в',5*2,4 0,32*0,1 13,9*2,7

6,0 130 3,56*1,1 9,1*2,1 0,33*0,1 14,4*3,6

6,5 94 5,11*1,4 • 10,0*2,2 0,30*0,1 17,8*4,1

роятно, значительная часть прогестерона, синтезированного в те-ке, превращается в клетках гранулезн в-эстрадиол. При этом происходит увеличение ароматазной активности. Гонадотрспные гормоны оказывают влияние практически на все звенья стероидогенеза. Взаимодействие клеток теки и гранулезы играет особую роль в процессе роста и созревания фолликулов. В зависимости от условий, происходит нормальное созревание ооцита или атрезия фолликула и гибель ооцита. Если происходят изменения в синтезе какого-либо стероида любой из этих тканей, то зто обязательно скажется на судьбе как самого фолликула, так и роцита. Секреторная активность как клеток теки, так и меток гранулезы, сбалансированы на каждой стадии фолликулярного роста подобно тому, как и их ответ на действие гонадотропшсс гормонов, что в большей степени и обуславливает нормальное созревание оонита. Ыетод куль-

тшитроряшш дает возможность для изучения конкретпих механизмов роста и созреванья Фолликула и ооцита.

В связи с теп, что метаболиты перенес', тэте я из одной клетки в другую но пе^клоточшгм контактам, специфическая гормональная стимуляция одтшх типов глоток пршюдит i: из;■.онсниям активности других типов клеток. Вероятно, это происходит посредством цЛМ5. Метаболит» глоток гранулезы через блестящую оболочку попадают в ' ооилазму и оказывают стимулирующее влияние на развптло ооцата ( Dome et al. , 1989).

При культивировании изолированных роцлтов происходит ряд последовательных событий, Пси.этом псе клетки дтМеренцируют'ся или трансформируются таким образом, что измоняотся их структура, причем эти изыснония хотя и схонш с теми, ко торне осуществляются в организме, по происходят ошг .без нормальных Физиологических. Факторов, контролирующих эта процессы! в организме. Однако, при культивировании in vitro клеточная дкфТеренцлровка молот осуществляться так' ;.о, как это шеет место в цолостиом организме,: Показа- . но, что при культивировании фолликулов наблюдается решшциация мой-оза и его заверлеШге'п'ооцитах, секреция половых стероидов, муцифи-к.чцпя и экспансия клеток куадулюса и т.д. ( Bp'plg . , 1981).

4. 3 А К Л Ю Ч Е I! И Е

Приведенные в диссертации собственные , а такие литературные дашшо о характере развития ооцитов и их атрезщ! в онтогенезе крупного рогатого скота позволяют высказать мнение о том, что в яичниках животного постоянно происходит селекция ооцитов и фолликулов.

Созревание ооцитов тесним образом связано с атрезией. Атрезия является физиологическим' процессом и выступает как рогуляторный фактор, определяющий число фолллкулоЕ па разных стадиях- развития. ЕолБшое количество фолликулов дегенерирует в первые мосяци после роздешш особи. По мере- развития тавотного процессы атрезли отно-ситольно стабилизируются и у половозрелых носят волнообразный характер, отражая циклическую активность яичника. Наибольшая частота атрезии антралышх фолликулов наблюдается после овуляции п во время беременности. Показано, что атрезия мо.тет наступать на.любой стадии развития фолликулов.

• Установлена определенная взаимосвязь мезду структурными элементами фолликула и ооцитом, которая изменяется .по

: мере развития фолликула и зависит от гормонального статуса животного. Наибольший процент ооцитов, хромосомы которых не имели признаков дегенерации, был обнаружен в фолликулах, клетки 'гранулезы которых содержали единичные клетки с пикнотическими ядрами. По мере развития атротических явлений в гранулезе наблюдается дегенерация ооцитов.

Показано, что характер и интенсивность атретических явлений в яичниках изменяется в процессе онтогенеза. Ейть основания считать, что факторы, вызывающие атрезию, различны и действуют на всех стадиях развития фолликулов. Процесс птреэни регулируется взаимодействием гонвдотроп'ннх и стероидных гормонов. . Несовершенство баланса или снижение уровня этих гормонов вызывает атрезию фолликулов. Фолликулы, развитие которых совпадает ' с периодом максимальной реализации фолликулсуимулирующего гормона, развиваются нормально и овулируют, в то время .как другие становятся атретическими. Ответ фолликулов на гипофизарные гормоны зависит от количоства рецепторов к этим гормонам в клетках гранулезы. Фолликулстимулирующий гормон действут синергично с острадиолом, инициируя образование рецепторов к лютеинизирующе-. му гормону. Эстраднол оказывает стимулирующее влияние-на фолликулярный рост.

Важную роль при созревании ооцитов играют циклические нук-леотиды, выполняющие функцию посредника между гонадотрспными и ' стероидными гормонами. Особое ¡значение в процессах развития оо*. ' цитов и фолликулов имеет еденилатциклазная система. Соотношение андрогенов и эстрогенов в фолликулах является также критичным для судьбы фолликула. Преобладание андрогенов прекращает рост ' фолликулов и приводит к их атрезии, преобладание же эстрогенов приводит к дальнейшему росту фолликулов. Установлено, что в яичниках существует определенная иерархия фолликулов. Более крупные фолликулы доминируют над другими фолликулами, угнетал их рост. При наличии в яичниках крупных фолликулов увеличивает-• ся число малых атретических. В фолликулярной жидкости крупных фолликулов обнаружен ингибитор, который угнетает фолликулогенеэ и реакцию фолликулов на экзогенные гонадотропины (*вагЪоГ* вt а1., 1989). Обработка животных гонадотропными гормонами визы- ■ вает активацию ароматазной системы и увеличение рецепторов 5СГ и ЛГ, тем самым увеличивая число овуляторнмх фолликулов. Разработанные в настоящее время методы вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота позволяют получать в среднем лишь 3-6

вибрионов от одного тавотного. Однако основное количество ооии-тов в яичниках подвергается дегенерации.

Культивирование изолированных ооцитов позволяет исследовать закономерности развития женских половых гамет и получать зрелые оошты, при оплодотворении которых образуются эмбрионы, пригодные для трансплантации. Установлено, что в антральных фолликулах популяция ооцитов гетерогенна по степени кондонса-. ции хромосом, что и определяет асинхронность созревания ооцитов при культивировании. Показано, что часть ооцитов при созревании подвергается дегенерации. Предварительный отбор ооцитов по состоянию куыулюса позволяет получать высокий процент ооцитов, созревших до матефазы П. Добавление в среду культивирования гонадотропных и стероидных гормонов способствует снижению числа клеток с дегенерированными хромосомами. Совместное культивирование ооцитов с клетками гранулезы увеличивает число ооцитов, при оплодотворении которых образуются эмбрионы. Современные методы культивирования и оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота вне организма позволяют получать до 10 эмбрионов из одного яичника (Сгоав, 1989). Однако огромный генетический потенциал яичников остается нереализованным.

Культивирование онтральных фолликулов позволяет в какой-то степени моделировать процесс фолликулогенеза, изучать гормональную, регуляцию роста и созревания фолликулов, синтез половых гормонов, атрезию ооцитов и т.д. Разработанные нами методы индивид дуального культивирования и определения степени атрезии фолликулов позволили повысить выход ооцитов на стадии метафазы П у 8Э& клеток.

Одним из перспективных подходов, позволяющих значительно повысить реализацию генетического потенциала яичников, является метод культивирования примордиальных и преантральных фрлли-кулов. Однако эти эксперименту связаны с определенными трудностями, такими, как малоизученностью механизмов регуляции их роста и длитсльнш сроком их культивирования (Boj, Greenwald, 1989; Quiet «t el.; 1990).

Решение этих проблем будет способствовать созданию новых путей эффективного управления оогенезом и фолликулогенезом крупного рогатого скота, что позволит более эффективно использовать генетический потенциал яичников. Учитывая то обстоятельство, чтч эти подходы в настоящее время интенсивно разрабатываются, можно надеяться, что это позволит существенно продвинуться в практиче-cKoi! решении сложных проблем. ■

30 - • •-

. 5. В U В О Д U

1. Изучен характер атретических процессов в ялчипках крупного рогатого скота как в период образования уолликулов, так н во время его роста. Показано, что характер атрээпл изменяется по мерз развития организма.

2. При исследовании яичников плодов коров показана динамика развития и атрезии популяции половых меток в точение всего периода роста плода, установлено, что ыейоз в яични:са:с коров протекает асинхронно. Па всех стадиях мейоза отмечена высокая трапскрипцион- . нал активность-ядршшовых организаторов.

3. В качестве объективной характеристики степени птрезии предложен пикнотический индекс, вира-генный в процентом отношении числа клеток а пшено тичесюгля ядрами к общему количеству исп.ю-дуемых фолликулярных клеток. Наиболее лабильной при атрезии структурой фолликула является гранулеза, в то время как тока и ооцит наиболее устойчивы.

4. Продемонстрировано, что наименее подвержена атрезии ант-ралыша фолликулы диаметром до 3 мм. По мере их роста увеличивается число атретических фолликулов. Наличие в яичниках крупных фолликулов способствует, атрезии более мелких. При разьитпи желтого, тела наблюдается значительное увеличение числа атретических фолликулов.

. . 5. Показано, что атрезия характеризуется закономерными изменениями ооцит-кумулюсного комплекса,сопсово:вдзе::!:сся гибелью час-' ти клеток, потерей ингибирующей мейоз функциаЛ ггянулезп, реини-циаДией мейоза и появлением в таких (фолликулах ооцитов вплоть до стадия метафазы II.Предложен способ классификации ооцитов по состоянию. ооцит-кумулюсного комплекса.'

6« Биохимический анализ выявил изменения уровней цАМФ ц цШ5' в тканях фолликула при атрезии. Предполагается, что первый из циклических мононуклеотидов способствует развития фолликула, а второй является его антогонистогл.

7. Обнаружена обратная зависимость меэду степенью атрозии и уровнем утилизации' кислорода изолированными аитралындга фол. ликулами. Описанная взаимосвязь позволяет количественно характеризовать стёпвнь их атрезии.

8. Предложенные подходы унификации фолликулов по степени их атрезии били использованы при культивировании ооцитов внутри антралышх фолликулов. Показано, что ооцита атретических фоллн-

кулов. Показано, что ооцпты.атретических фолликулов могут при культивировании созревать до стадии метафазы II.

9. Показана гетерогенность хромосом ооцитов антральных фолликулов по степени их конденсации на стадии диплотены. Определена динамика созревания ооцитов, выделенных из антральных долли-кулов, при культивировании. Созревание ооцитов в условиях in vitro происходит асинхронно, что связано с гетерогенностью ооцитов по. структуро хромосом на стадии диплотенц.

10. Цитогенетичеслшй анализ культивированных ооцитов выявил ряд нарушений мейоза, a Taicr.e • наличие хромосом с признаками дегенерации. Показано, что добавление в среду культивирования фол-ликулостимулирувдего гормона и эстрадиола способствовало снижении числа ооцитов на стадии метаФазы II, имеющих хромосомы с

I

признаками дегенерации. .

11. Установлено, что атрезгЬ является физиологическим процессом и выступает как регуляторнйй фактор..Созревание ооцитов связано с функциональным состоянием фолликулярных клеток. При куль-

'тивированин фолликулстимулирующнй -гормон и эстрадиол препятствуют развитию атрезии'фолликулов, при этом пикнотический индекс фолликулярных клеток остается низким, синтез эстрадиола увеличивается. ■ ' i

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПВЕДЯ01ТЕНИЯ

1. Для установления степени атрезии фолликулов следует ис- . пользовать пикнотический индекс фолликулярных клеток.

2. Для определения функционального состояния антральных фолликулов мо;шо использовать зависимость скорости утилизации кислорода фолликулами от степени их атрезии.

3. Предложен способ индивидуального культивирования антральных фолликулов для изучения атретическпх процессов.

4. Рекомендуется Включить в учебный курс цитогенетики данные о преобразовании хромосом в период образования, созревания и атрезии ооцитов коров.

ШССК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ÍIO ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ "

1. Эрнст Л.К., Янушка А.Л., Свиридов Б.Е. и др. Культиви-, рование фолликулярных ооцитов коров //Докл.ВАСХНИЛ. - 1979. -

- » 4. - С.27-28.

2. Эрнст Л.К., Свиридов Б.Е. и др. Состояние хроматина в ооцитах коров // Докл.ВАСХНИЛ. - 1979. - № 7. - С.20-23.

3. Эрнст Л.К., Свиридов Б.Е. и др. К вопросу р культивировании ооцитов млекопитающих с целью трансплантации эмбрионов

// Сельхоз.биология. - 1979. - Х1У, № б. - С.716-720.

4. Эрнст Л.К., Свиридов Б.Е. и др. Нарушение мейоза при культивировании ооцитов коров // Цитология. - 1980. - № 4. -

- С.475-479. .

5. Эрнст Л.К., Мамлеев P.C., Свиридов Б.Е. и др. Динамика созревания ооцитов коров // Докл.ВАСХНИЛ. - 1980. - № 6. -

- С.22-23.

6. Эрнст Л.К., Бехтина В.Г., Свиридов Б.Е. и др. Рост и развитие ооцитов и фолликулов // Вестник с.-х. науки. - 1980.- №6. - С. 103-108.

7. Эрнст Л.К., Свиридов Б.Е. и др. Культивирование ооци-гов 'коров внутри фолликулов-// Докл.ВАСХНИЛ. - I9cj0. - № Ü. - С.22-

-23.' . •

8. Свиридов Б.Е., Галиева Л.Д. .Яцушка А.Л. Культивирование . фолликулярные ооцитов // Биолог.основы совершенствования селекционно-генетических методов в животноводстве, - 1980. - 30.-

г C.I0I-I03. . '

9. Свиридов Б.Е., Галиева Л.Д. Хромосомы ооцитов антраль-ных фолликулов // Тез.УП Всесоюзного совещания эмбриологов. -

- 198Ii - С.35. • ' -

10. Свиридов Б.Е. Созревание ооцитов коров II Тез,У1 Всес. совещания эмбриологов. - I9BI.' - С. 163.

11. Степанов Г,С., Ептеева H.H., Свиридс Мамлеев Р.С, Стероидные гормоны в фолликулярной жидкости керов // Тез.У1 Всес, совещания эмбриологов. - 1981. - С.177.

12. Степанов Г.С., Кудрявцева И.В., Евтеева И.Н., Свиридов Б.Е. Циклические нуклеотиды в фолликулах коров // Тез.У1 Всес. совещания омбриологор. - Ift.il. - С. 177.

13. Перебора A.B., Голубев-А.К., Свиридов Б.Е. Перфузия яичников крупного рогатого скота // Болл.ВИИИРГЙ. - 1980. - JM8.

- C.7-Ü.

14. Свиридов Б.Е..,-Бехтина В.Г., Галиева Л.Д., Голубаа А.К.

О возможности использования убойного материала в экспериментах по культивированию ооцитов. Повышение эффективности селекционно-племенной работы в'животноводстве. - 1980. - № 29. - С.190--195. .

15. Евтеева И.Н., Степанов Г.С., Свиридов Б.Е., Кудрявцева Н.В. Гормонсинтезиругацая функция фолликулов яичников коров на разных стадиях развития // Еюлл.ВНИИРПК. - 19 . - № 51.

- С.26-29.

16. Эрнст Л.К., Голубев А.К., Мамлеев P.C., Свиридов Б.Е., Галиева J1.Д. Устройство для-культивирования фолликулов. - Авторское свидетельство. - 1981. - № 836691.

1?.'Балтян. Р.И:, Галиева Л.Д., Свиридов Б.Е. Культивирование ооцитов из фолликулов разного диаметра // Тезисы докл. "Проблемы генетики и селекции с.-х. животных". - I9ÜI. - С.85.

IB. Свиридов Б.Е. и др. .Структура хромосом в ооцитах ант-ральных фолликулов коров разного возраста // Цитология. - 1981,-Т.ХХШ, № 10. - C.II9Ö.

19. Перебора A.B., Свиридов Б.Е. и др. Вцделение антраль-ных фолликулов'из яичников крупного рогатого скота // Еюлл. ВИНИТИ. - 1982. - » 56. - С.16-17.

20. Дмитриев Н.Г., Свиридов Б.Е. и др. Способ определения функционального состояния фолликулов млекопитающих. - Авторское свидетельство. - 1983. - * I0I0870.

21. Эрнст Л.К., Свиридов Б.Е. и др. Атрезия фолликулов и ооцитов в яичниках коров // Докл.ВАСХНИЛ. - I9Ö3. - № 5. -

- С.26-28. -

22. Перебора A.B., Голубев А.К., Свиридов Б.Е . К вопросу о переживаемости яичников крупного рогатого скота при различных температурах хранения // Криоконсервирование гамет, эмбрионов с.-х. животных. - 1983. - С.84-В9.

.23. Балтян Р.И;, Свиридов Б.Е. и др. Культивирование ооцитов крупного рогатого скота в зависимости от состояния куму клеток // С.-х. биология. - 1984. - * 6, - С.25-26.

24. Свиридов Б.Е. и др. Способ определения биологической активности гонадотропных гормонов, г Авторское свидетельство.-

- 1985. - » II534I4.

25. Свиридов Б.Е., Галиева Л.Д. Изменение хромосом мейоти-ческой профазы в ооцитах коров // I Всес.конф.по цитогенетике . с.-х. животных." - 1965. - C.I0-II.

26.. Галиева Л.Д., Свиридов Б.*Е. и др. Реинициация мейоза

: в ооцитах крупного рогатого скота /! 1.Всес.конф. по цитогене-тике с.-х. животных. - 1985. - С.12-13.

27. Козакова Л.В., Галиева Л.Д., Свиридов Б.Е. Синтез РШ 4в ооцитах алтральных фолликулов коров // I Всес.конференция

по цитогенетике с.-х. животных. - 1905. - С.49-50.

28. Ковалев П.Ф., Свиридов Б.Е. и др. Структура хромосом в ооцитах, культивируемых внутри фолликулов // I Всес.конф.

по цитогенетике с.-х. животных. - 1985. - С.50-51. •

29; Ковалев П.Ф., Свиридов Б.Е. и др. Нарушение ыейоза при культивировании ооцитов внутри фолликулов // Еюлл.научн.работ ВНИИРГЖ. - 1986. - Вып.85. - С.29-31.

30. Ковалев Л.Ф., Голубев А.К., Свиридов Б.Е. Поочередное культивирование ооцитов внутри фолликулов Л Воспроизводство с.-х. животных и криоконсервация гамет и эмбрионов. - Сб.науч. трудов ВНИИРГЖ. - 1986. - С.84-Й6.

31. Ковалев П.Ф., Свиридов Б.Е. и др. Культивирование ооцитов в присутствии гонадотропных гормонов. Воспроизводство с.-х. животных и криоконсервация гамет и эмбрионов J J Со'.науч. трудов ВНИИРГЖ. - 1986. - С.86-88.

32. Ковалев П.Ф., Свиридов Б.Е. и др. Культ,1внрозанпе ооцитов внутри фолликулов в присутствии СЛК // йзлл.ВНРЫРГМ,-

- 1987. - № 94. - С,18-21.

33. Sviridov В.В. et al. 6 plbdnenie oocytov hovadzieho do-

bytka in vitro po hormonalney atimulaoii vayechnikov//Ca.Fyaiolo-gio.-„1989. - V.38. - C.374.

Sviridov B.B. et al. Ultraetrukturai in vitro oplonanyol

follikulamych oocytov jalovie ziakanych aapiraoion // Ca.Fyaio-

logio. - 1989. - C.38. - 0.371.

35. Голубев А.К., Свиридов Б.Е; и-др. Методические рекомендации по культивированию ооцитов и.фолликулов П ВНИИ разведения и генетики с.-х. животных. - I9H9.. - С.1-34.

36. Стефанова В.Н., Галиева Л.Д., Свиридов Б.Е. Ядршжо-образующие районы хромосом в профазе мейоза у коров // Известия сибирского отделения Aft СССР, серия биологические науки.-

- 1990. - Вып.2. - С.21.

37. Каганская В.В., Свиридов Б.Е. Культивирование ооцитов коров с.'фолликулярными клетками // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве. В1М, 1990. - СЛ4.

38. Свиридов Б.Е., Каганская В.В. Количественное изучение-развития преантральных фолликулоп крупного рогатого скота при культивировании вне организма // Вестник с.-х.науки.-Г991 -C.II2-II7. ' ' ' „„