Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитологический анализ влияния гонадотропинов на структуру и функцию ооцитов коров в культуре

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Цитологический анализ влияния гонадотропинов на структуру и функцию ооцитов коров в культуре"

РГб од

2 2 АВГ 1394

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

УДК 577.113. 04 + 576. 364 : 591 : 392 АБЛЯТИПОВА Гульнора Нузетовна

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ГОНАДОТРОПИНОВ НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИЮ ООЦИТОВ КОРОВ В КУЛЬТУРЕ

03.00.25 — клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1994

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии Института биохимии АН РУз.

Научные руководители: академик АН РУз

Д. X. Хамидов

кандидат биологических наук Т. Ю. Коваль

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Л. А. Муртазаева кандидат биологических наук Н. Н. Кузнецова

Ведущая организация: Институт животноводства АН РУз.

Защита диссертации состоится «_»_:_1994 г.

в «_» ч. на заседании специализированного совета

Д 015.16.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии Академии Наук Республики Узбекистан по адресу: 700143, Ташкент, ул. X. Абдуллаева, 56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУз.

Автореферат разослан «_»_1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

С. А. БУРХАНОВ

АКТУАЛЬНОСТЬ TEMU Ускоренно научно-технического прогресса способствуют разработка и освоение-э^ктпвнкх методов биотехнологии, -клеточной и генетической imrénepiui. Перспективным биотехнологическим методом является трансплантация эмбрионов, включающая выделение из яичников самки нужного генотипа большого числа яйцеклеток с целью их культивирования, оплодотворения и-получения эмбрионов для пересадки другим, генетически'менее ценным животным. Потенциальные возможности воспроизводства самок млекопитаюшик огромны. Однако лишь небольшая часть их яйцеклеток в процессе жизни реализуется в виде потомства. Эту проблему с различных методических позиций питаются решить многие ученые мира. Прежде всего, особую важность для данных исследований пресбретает оценка качественных параметров, используемых для экспериментов ооцитсв, так как отбор неполноценных клеток может значительно ухудшить получаемые результаты.

У коров рост ооцитов заканчивается на стадии ранних астральных фолликулов. Культивирование ооцитов, извлеченных из таких фолликулов, является первой ступенью в реализации эффективного метода получения ранних эмбрионов. Полноценное созревание ооцитов коров и их компетентность к оплодотворению зависят от того, насколько точно условия,-применяемые.в дискретном эксперименте, моделирует условия in-vivo. Подбор, оптимальных физико-химических параметров и сочетание в культуральной среде ряда биологически активных веществ, благоприятно елияюких на созревание ооцитов, может дать высокое обеспечение генетически полноценного материала.

ЦЕЛЬ И ЗАДА'И J'CO.IEaCBABíi'. Целью натах исследований явилось совершенствование сценки функционального состояния ооцитов крупного рогатого скота, позволяющие повысить эффективность их отбора для культивирования in vitro, а таги4« совершенствование методов культивирования ооиигое коров вне организма. В связи с этим были поставлены следугане задачи:

1. Современным цнтоморфологическим методом изучить морфо-функционалънке характеристики ооцитов коров,а таете их способность к развитию in vit.ro с помощи световой и электронной микроскопии. ,

2. Провести подбор оптимальных условий культивирования ооцитов коров, включающие температурный и временной режима

3. И;.учить влияние гонздотропних гормонов гипоФига в сис-

темах 1» situ и In vitro на решшциацию нейоэа ооцитов коров и приобретение ими способности к оплодотворению.

4. Определить воздействие фолликулярной жидкости после перфузии яичников коров трапными гормонами гипофиза на спонтаннее созревание ооцитов и приобретение ими способности к парте-ногенетичоскому развитию.

5. Наследовать эффект гонадотрошшов in situ на стеропдо-генез ь фолликулах ь зависимости от их диаметра.

6. Ьньить участие аденилатциклазной системы в передаче сигналов тройных гормонов гипофиза на ооцит крупного рогатого скота.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. РАБОТЫ. Впервые для партеиогеиетического созрььанил ооцитов коров был использован циклогексимид при температуре 3t5 С и культивировании 24 ч. Euna подобрана оптимальная концентрация хорпогоничеекого гормона для культивирования и спонтанного созревания ооцитов коров iп vitro. Впервые для получения большого количества созревших tr\ vit.ro ооцитов коров была использована перфузия in situ яичников гонадотропинами -сывороткой жеребых кобил и ХГ, а такте сочетанное воздействие XI1 в среде и перфузия яичников СКК. Выявлено достоверное сниже-пке уровня тестостерона, увеличение уровня'зстрадиола-13зпо мере увеличения диаметра фолликулов в фолликулярной жидкости при воздействии гонадотропинами, выявлено кластерное скопление зерен аденилатциклазы на ооло-мме ооцита после культивирования in vitro.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработанный подход прижизненной оценки функционального состояния ооцитов,' позволяющий более эффективно проводить отбор незрелых яйцеклеток коров, монет бить испольаован в биотехнологии экстракорпорального оплодотворения созревших in vlt.ro яйцеклеток. Результаты методических усовершествований в фиксации и окрашивании ооцитов, а также разработанное устройство для их электронной микроскопии открывают- возможность более тщательного анализа экспериментального материала. Данные по влиянию гонадотропинов на функциональный статус ооцитов могут быть использованы в научных лабораториях, занимающихся' разработкой и совершенствованием методов культивирования клеток.

.ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: По материалам диссертации

опубликовано 7 работ. Основные полоумия диссертации долокены на: VIII Всесоюзном совяиршш экбпкз.-Зтов (Москва, 1990), V Конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), 7 Интернационально! конференции "Клеточные программы роста, дифФ^еештровки и неоплазии" (Хельсинки, 1992).

СТРУКТУРА диссертации. Дгесзртациошгая работа ркличает следующие разделы: "Введение", "Обзор литературы" (4 главы). "Ш-териалы и методы исследований", "Результаты и обсуждение" (!) глав), "Заключение", "Выводи". Диссертация излотена на 125 страницах, иллюстрирована 9 таблицами и 16 рисунками. "Список литературы" содержит 134 наименований (20 отечественных, 114 иностранных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования слудали ооинтн, выделенные из антраль-ных фолликулов яичников убойных коров iE-10 яичников). Гремя от момента убоя до исследования яичников - 1,5-2 часа. Транспортировку яичников осуществляли при t'lO-15°C в среде 199 (Свердлов, НИИ вирусных препаратов). Яичники с признаками патологий не использовались. В целом било изучено 3623 ооцита.

Культивирование ссиятов коров in vitro. Соииты извлекали из шчников путем разрыва фслликулЬв тонкой иглой в среде Хенкса .'Свердлов. КИИ вирусных инфекций). Прижизненный отбор ооцитов проводили непосредственно после их выделения из фолликулов на основании визуальной оценки состояния ооплаэмы и кумулюса. Ра-тем переносили в среду вымывания, которая содержала соли Ррла ("Flow",Англия) с добавлением лактата !1а - 21,7 гсМ ("Flow",Англия) , пирувата Na - 0,33 пМ ( "31 gira",США), бычьего сывороточного альбумина (BSA) - 2 мг/мл ("Si«та", США), пенициллина - 100 ед/мл, етгептомицида - 50 ед/мл ("М;дПром", СССР), Нерез-буфера - 10 мМ ("Serva",<НТ). рН среды доводили до 7,2 1 H раствором NaOII ("Serva",ííT). После однократной промывки в вышеуказанной среде осииты пометали б среду культивирования, которая содержала соли Sp.-;a, .-актнт На - 21,7 пируват На - 0,33 тМ, BSA -_4 мг/мл, Hairo, - 20 !tl.í ( "Flow",Англия). Сухую среду зрла растворял:! декевизирс.Баипой водой (кн^одра омбрислэгии МГУ). р Сошны культиЕировчл;! в пластиковых чоиках Потри d-lO мм

I "Шдир.л.1", СССР) с точении 24 ч при t*"36'c, влажность 100?., в газовой о не с и - 5Х 5Х со,,орх И*. Контрольную группу составлял!! ооциты, выделенные из яичников коров без каких-либо дополнительна манипуляций. В исходную культуральную среду добавляли гормоны различных концентраций: хорногонический чоловечес-кии гонадотропил (XT') (Московский эндокринный завод, Министерство Ыед. промышленности СССР} в дозах 2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл и 0,0-1 икг/ыл; яичники коров из опытной группы иерфугироьадн средой ЮЗ содержащей XI' (5 МЕ/мл)(сиьороига жеребых кобплНЬ llE/мл) б течение 1 часа. Перфузии яичников сэров проводили в крупные сосуды путем однократной иагекции растворов гонадотро-пшюв d oOici,i:v 20 мл. Активировали ооциты цпклогексиындои (ЦГ) в дозе ?.5 мкг/мл в течение С ч. после культивирования.

Приготовление тотальных препаратов ооцптоь коров (модификация метода). Готовили фиксирующий раствор ив води: метанола: центрального формалина в соотношении 2:1:1. Клетки переносили в охлаэдешшй фиксатор. Время фиксации 2 ч. По истечению двух чг^оЕ клетки переносили в охлажденный 06% ьтиловии спирт. После фиксации ооцитов готовили тотальные препараты. Сюииги окрашивали 1 каплей 0.24?. раствором лакмоида и 1 каплей 0,002% раствора генцианового фиолетового, покрывали покровным стеклом и готовый препарат просматривали под фазовым контрастом аото-микроскопа ИЕИ-15. (Авторское свидетельство II 1763981, от 20 июля 1090 г.)

Полученные результаты подвергали статистической обработке по Иэицевичште-Эрингыне (1964); достоверность разницы средних значений определяли по критерию Стьюдента.

Световая и электронная микроскопия ооцитон коров. Ооцигы до и после культивирования фиксировали в предложенном нами устройстве для подготовки клеток к электронной микроскопии (.Авторское свидетельство N 1826736 от 28 февраля 19У0 г.) Ооциты переносили в устройство пастеровской пипеткой и фиксировали 2,ЬХ раствором глутаральдегида ("Merck") на 0,1 М фосфатном буфере (рн 7,4) с добавлением Сахаровы при комнатной температуре в течение 1 ч, постфпксировали 1>. раствором тетраокиси осмия CisO^Ha том ив буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. Обезволивали в спиртах восходящей концентрации и аиетоне, с дальней-

шей пропиткой смесью ацетона с заливочной средой. Запивали в смесь эпон-аралдит фирмы "Flul:a". КаьОулы ггалимернзовали 24 ч при 37 "С и 24 ч при 60" С.

Полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, изготовленные на ультрамикротоме LKB-8BOO (Швеция) , окрашивали метиленоЕой синью и фуксином по методу Humphrey (.1974). Препараты просматривали ва световом микроскопе.

Ультратонкие срезы помешали на медные сеточки и последовательно контрастировали 2,5?. раствором уксуснокислого уранчла по Watson (1958) и цитратом свинца по Reynolds (1981).Ультраст-ругауру социгов коров изучали под электронным микроскопом Hitachi H-600 ("Hitachi",Япония).

■Определение аденилатциклазы вооцитах коров. Ооциты коров фиксировали в 12 растворе глутаралъдегида в 0,005 M кокадилат-ном буфере (рН 7,2-7,4) в течение 1 часа при комнатной температуре или в холодильнике. После фиксации клетки промывали в том же буфере и оставляли на ночь при 4°С. Гистохимическую реакцию по выявлению аденилатциклазы проводили по методу Howell и Whitfield (1972). Ооциты инкубировали в инкубационной среде в течение 30-50 минут при 37°С. Состав инкубационной среды: 80 мМ трис-малеатный буфер (рН 7,4h 6Z глюкозы, 2 Ш М^С1Д, 2 тМ те-офиллин, 0,5 мМ АТФ, 4 мМ Pb( HOj )х. В отдельных случаях в качестве субстрата добавляли адениламидофосфат (AMP-PNP). Контролем служили образцы, обработанные в следующих инкубационных средах: с добавлением фтористого натрия или уайаила, без добавления ATS или ФМР-РНР. После этого ооциты промывали в 0,08 M трие-малеат-ном буфэре и фиксировали в IS OsO^на 0,05 M кокадилатном буфере (рН 7,4) в течение 1 ч при 4еС, пропивали в том те буфере, обезвоживали в спиртах, абсолютном ацетоне и заливали в смесъ эпон-аралдит. Срезы готовил!! на ультратомэ LKB-8800, неокрашен те препараты просматривали под электронным микроскопом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфолспш социтов корсв до и после воздействия in vitro гонздотропинов

С;оранныи на фолликулов комплексы ооциты-клиткн куыулюса ¿2-8 ым> юшсспфицированы на 4 типа. Методом световой микроско ыш (х-Ю) выявлено, что:

Тип 1 - компактный многослойный внеьний слои на клеток кумулю-са, галогенная соплаома, комплекс светлый, прозрачный. Тип 2 - компактный многослойный внешний слой из клеток кумулю-са, гомогенная ооплизма, обдай комплекс немного темнее к менее прозрачный. Тип 3 - utiif.fi компактный внешний слой клеток кум/лкх-а, неравномерных ооплазма с темными кластерами, общий комплекс Солее темный.

Тип i - отсутствие ilbstok куму.лмеа, ооплазма неравномерная с темный! кластерами.

Ультраструктурные исследования подтвердили данные световой микроскопии.

Клетки всех -1 типов последи пали на созревание in vitro. Для стимуляции созревания впервые для ооцнтов коров был исполь аован циклогексимид 125 мкг/мл) в течение о часов... Способность ооцитов коров к партеногенотичеокоиу развитию при добавлении циклогексимида применена в глч;с:тве критерия созревания ооцига ; различних вариантах культивирования. У 75 % ооцитов 1 и 2 типов снимался I блок i,¡с-поза и 10-iS t клоток достигали мета^-au II. В типах 3-4 заметного развития ни обнарумано или клетки деградировали. Поэтому в дальнейшей работе были использованы только ооциты первых двух типов.. Они показали одинаковую способность-к развитию в системах созревання in vit.ro (Таблица í).

В мировой практике при культивировании оощУгов и оплодотворения их in vitro получакц1 лишь ограниченное количество живых особей (Goto,1986; Fayrer-HosKen et al. ,1988; Brackett,1088). Для выяснения причин неудачных результатов чрезвычайно важно детальное изучение ооцитов, отбираемых для экспериментов in vitro. В этом аспекте приобретают особую важность настоящие результаты по классификации комплекса ооцнт-клетки кумулюса. *

• 2. Спонтанное согревание ооцитов коров с подбором оптимальных временных и температурных реллмов.

Таблица. 1

Способность к развитию в системе vitro осцитов крупного рогатого скота в зависимости от морфологических характеристик комплекса'ооцит-клетки кумулюса (в 7.).

' ! Зародыш. 1Конде.н.- ! I I

Типа . I пузырек I хромосом ! М. I I М. II ! Прснуклеус

1 (80) 26,0+12,0 28,0+13,3 35,3+34,2 9,6+5,9 1,2+2,3

2 (60) 24,0+11,0 26,3410,4 37,0+11,7 11,4+4,8 1,3+2,4

3 (50) 21,0+8,1 25,2+9,0 46,8+16,2 7,0+3,2 4(50) 49,5+17,9 30,7+13,4 19,8+8,5

( ) - количество клеток в 2 экспериментах

Таблица 2

Влияние различных сроков, культивирования на спонтанное созревание ооцитов коров при 1-33 С.

Время I Зародш. ! Конден. ! ! (Начало форм,

.культив. ! пузырек I хромосом! М. 1+Т. I I М. 11+Т.11! пронуклеуса

£4'ч (50) 30,6+11,3 30,0^9,5 17,5+7,0 19,4+6,9 2,5+1,9 ((5))

30 Ч (50) 27,6+7,1 22,5+4.8 26,5+1,2 21,1+3,3 ' 2,3+1,0 ((5))

40-42 4(35) 27,9+6,3 27,2+4,7 32,9+4,1 12,0+4,8 ((4))

( ) - количество клеток в эксперименте (( )) - количество экспериментов

Условия подготовки ооцитов к оплодотворению имеет большое вначени«, т.к. оптимально .подобранные сроки культивирования оч'ааииаются оф^ктииными для получения повышенного процента оплодотворения Клеток. Ранее; было показано, что перезревание также, как и пэдозревание ооцитов Бнсиштелыю уменыла«т их оплодотворяющую способность. Точное знание динамики созревания ооцитов в каждом вица жшотного позволяет избежать последствий перезревания яйцеклеток, особенно при применении гормонов и биологически активных веществ.

В таблице 2 представлена д.шаш-га согревания ооцитов крупного -рогатого скота. Культивирование било проведено без добавления биологически активных компонентов (сыворотки, гормонов). Шкас-аао, что при культивировании ооцитов в течение 24 ч около 0.0-70.:, клеток способны к реипициацли мейоза и 20-25% достигает ¡.L II делинил ыейоза. Аналогичные результаты получены при увели-ч:*шш сроков культивирования до 30 ч. Дальнейшее увеличение времени культивирования (40-42 ч) приводит к торможении мейоти-ческого созревания. Следовательно, для ооцитов коров наиболее оптимальным является 24-30 ч. культивирования.

Лгыее исследовано влияние температуры па спонтанное созреванье ооцитов крупного рогатого скота. Проанализированы ооциты после культивирования при температурах 37* 37,5'; 38е С. Было выявлено, что температурный реуу.м За30 являете,i наиболее оптимальным - до 20% ооцитов доегигам ы.' п а небольшая часть 2-2,5Х клеток способны к формировании ленского иропуклеуоа.

3. Боздейстьиз ХГ на реинициащга мейоса ооцитов коров в системах in. vitro и 111 Sit. 11.

В связи с тем, что работа с яичниками уоогпшх коров делает невозможным проведение экспериментов с гормональной обработкой животных, била предложена предварительная перфузия яичника гормоном. Контрольная группа - ооциты коров, выделенные из необработанных гормонами яичников через 1-1,5 час, после забоя животного, бпытная группа состояла из дьух подгрупп : а)ооциты выделенные из фолликулов после перфузии яичника XI1, б) контрольные ооциты, внесенные в культуральную среду с добавлением XI'.

Согласно данным таблицы 3 введение в культуральную среду И' в доге 0,4 мкг/мл индуцировало мейопЛеское деление у 757. клеток, причем около 15-20%. клеток приобретали способность к партеногенетическсй активации формирования женского ядра под влиянием ЦТ. Перфузия яичников убойных коров средой, содеряапрй ХГ в дозах 2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, в течение 1 ч приводило к снятию I блока' мейоза в обоих группах у 90Х клеток. Доза 2 мкг/мл оказалась более эффективной для способности к формированию ,тен-ского пронуклеуса (307,), по сравнению с дозой 0,4 мкг/мл (3£).

Полученные результаты свидетельствуют, что ХГ оказывает эффект на спонтанное созревание ооцитов крупного рогатого скота в системах in vitro и in situ. Однако, наибольший эффект воздействия ХГ на спонтанное созревание ооцитов коров получен в системе in situ - путем перфузии яичников гормоном в дезе 2 каст/мл, в системе in vitro оптимальная концентрация ХГ 0,4 мкг/мл. В связи с тем, что в нашх экспериментах в системе in vitro ооци-ты коров окружены клетками кумулюса, а в системе in situ присутствует весь комплекс фолликулярных клеток (клеток теки, кумулюса, гранулезы), то можно сделать предположение, что воздействие ХГ на ооцит осуществляется не прямо, а опосредовано через клетки округения, и пусковой сигнал ооцитами был воспринят и передан на определенные системы, запускающие возобновление мейоза, приведшие у части клеток к полноценному созреванию в культуре.

4. Эффект сыворотки жеребых кобыл (СЯК) и ХГ на спонтанное созревание ооцитов коров в системах in situ и in vitro.

В связи с тем, что тропные гормоны гипофиза составляют ЕЭ/Хную часть регуляторной системы созревания ооютов млекопитающих, нам представлялось интересным .изучить эффект СЖК, как источника 2СГ Ra приобретение ос-шяами коров способности к возобновлен««) мейсга ц партеногенетической активации формирования женского ядра. • .

соцпты изс'ЛИрСБаЛГ из 2-х групп яичнчков убойных коров: 1 - крнтрелг-нче, яичники не обработанные горыснаш;2 - опытные, яичники перфурлров'лныэ СЯК в '. дозе 5 ME /мл в течение 1 часа.

Влияние различных доз XT m vitro к in situ на спонтанное созревание ооцитов rjyraraго рогатого сгота

Условия ■ ! Зародыш. ! Конден. t I Коклек. t ! эксперимента! пузырек ! хромое. ! И I+T. I ! хромое, t 1LII+T. II f Про кукле ус t_J_t 1_I I__

Контроль.(БО) 26,0+12,0 28,0+13,3 34,0+33,0 1,3+2,3 8,5+4,7 .1,2+2,0 ((6))

ХГ в среде 38,0+5,3 37,0+4,7 14,0+16,7 11,0+9,4 .

2мкг/мл(50) ' (СЗ))

'ХГ в среде ■ 25,0+14,7 ■ 4.1+3,1 '26,1+6,5 13,5+5,8 1в,0+4,4 13.3+3,25 0,4 мкг/мл( 80) ■

С(б)) ,

ХГ в среде 3,5+6,2 13,0+7,5' 53,2+15.2-13,4+14.0 13,8+4,1' 3,1+3,'б 0,04 мкг/мл( 50) ■ ' ((6))

ХГ перфузия 19,3+9,6 6,2+4,7 6,2+4,7. 10,2+4,6 . '25,4+5,3 32,7+5,3«

2 мкг/мл (50) , 4 ((5))

ХГ перфузия' 11,0+9,6 13,3+12,0 41,8+15,4-14,5+13.5 16,7+1,0 .2,7+2,7 0,4 ыкг/ыл(50) ((4))

* - Р < 0,05 достоверность медду контролем и опытным:: группами ( ) - толичество клеток в эксперименте; ( )) - кзл:г-:естш экихеримеитоЕ

Время культивирования - 24 ч, t«38°C (Таблица 4).

- Обработка яичников коров CIK привела к реинициацйи мейоза у 95% клеток, причем около 15-17% приобретали способность к формированию жбн?кого пронуклеуса под влиянием циклогексимида. Использование комплексного воздействия перфузии СЖК яичников коров и введенного в. среду культивирования ХГ в различной концентрации показало, что концентрация ХГ в дозе 0,4 мкг/мл вызывало сдвиг мейотического созревания (95%) в сторону повышения процента клеток способных формировать женское ядро (25%)под влиянием ДГ.

На основании полученных данных можно сделать предположение, что обработка яичников СЯК повышает чувствительность ооци-тов, окруженных, клетками кумулюеа к воздействию ХГ в культуре, что хорошо согласуется о представлениями о регуляции созревания ооцитов млекопитаютцх гонадотрепными гормонами гипофиза in vivo.

5. Изменение уровня половых стероидов в фолликулярной жидкости после обработки яичников коров тропными гормонами гипофиза.

Весьма актуальным является вопрос о роли стероидных гормонов в репродуктивной функции сельскохозяйственных животных, поэтому целесообразно более подробно остановиться на изучении уровня половых стероидов в ФЖ в зависимости от стадий фэллику-логенеза (таблица 5).

С помощью радиоиммунологического анализа было показано, что уровень прогестерона почти не изменялся ни от размера фолликула, ни от воздействия на яичник коров гонадотропинов. Однако после обработки яичника путем перфузии XI1 в дозе 0,4 мкг/мл уровень тестостерона резко снижался. Перфузия яичников коров СЖК в дозе 5 МЕ/мл приводила к еще большему падению уровня тестостерона. Перфузия яичников ХГ в дозе 0,4 мкг/мл и СЖК 5 ЫЕ/мл достоверно приводила к повышению содержания эстрадиола в . малом и среднем фолликулах. Однако не был обнаружи эф1»кт гонадотропинов на содержание зстрадиола в болышх фолликулах.-

Таким образом, полученные результаты хорошо .согласуются с

Влияние СЗЕ in situ и XT in vitro ка спонтанное созревание ооцитов крупного рогатого скота (Z).

■Условия ! Зародыш.! ! Конден. ! !

эксперимента! пузырек ! М. I+T. I ( ' хромое. ! M.II+T. II ! Пронуклеус

Контроль(50) 25,0+12,0 28,0+13,3 29,3+13,3 9,5+3,1 1,2+2,8 С (6))

СЭЙ-перфуз. 5,5+0,6* 24,3+10,0 27,1+14,4 26,4+2,2* 16,7+1,1*

2 мкг/ил(110.) •

.. cod •

С2Я-яерф73. 3,4+3,4 7.6+4,1 6.4+3,9 71,4+16,1* 11,2+0,4* . 2 мкг/мл' + ХГ в среде

0,04 мкг/мл (100) ((•«)

СЗК-ПерФуг. 5,2+5,2 15,0+0,3 19,3+14,1 33.7f6,2* 26,8+3,4* •2'мкг/мл + Л1 я спеце 0,4 мкг/мл (110) ((8))

* - Р < 0,05 достоверность между контролем и опытными группами. ( 1 - количество клеток в эксперименте; (( )) - количество-экспериментов

Влияние Фа» после перфузии яичников гонадотрогшши гормонами, ва спонтанно? созревание ооцитов крупного рогатого скота.

Н ! I I Коиден. ! ]

. ! 311 I Ii t I хромосом I М. II I Нронуклеус

Контроль 34,091-9,7 45.Ü+JÜ.8 13,5+2,1 8,2t-0,6

IOZ-'Л + - 26,0+10,0 13,0+2,2 41,0+9,4 10,0+0,3

перф. ХГ

5 ШУнл . '

202 ФК + 5.1Ю.З 11,3+2,5 10,0(3,2 33,2+3,9 40.1 + 1,9 иерф. ХГ 0,4ккг/мл '

20Z М» - 15,3+5,8 14, ИЗ,О 45,in-i,5 12,5+2,5

перф. сж 5 НЕ/МЛ

.Рыло проведано 4 оксперименга, виделено £00 асцитов

Таолпца п

Изменение уровня половых стероидов в зависимости от рмьнеров фолликул в iM из яичников коров,перфорированных in situ CIKK или >.]'.

Гормоны I ЛолиьЯ фолликул! Средний фолликул f Калий фон лику л кыоль/л I d-6-Ю мм I d-5-б мм ^I .1-2-3 мм

I---------------1------------------j------------------

I. I I II I III ! I ! II I III I I I II I III

Прогестерон 38.9 ä5,6 37,6 34.2 34,6 33,7 39,4 34,0 a;.,0 Тестостерон 19,3 3.7 0.6 21,4 4,8 0,? . 20,4 0,8

Г«Традиол 53,6 56.5 55,7 38,8 42,8 44,0 2 4,4 43.9 41.3

I - Контроль5 И - 'К ИВ фолликул ЯИЧНИКОВ, Пйрфу&ИГОВЫШНХ .У' в дозе 0,4 ыкг/мл в течение 1 часа;III - «ж из фолликул начникок, перфузированных СЯК в дозе 5 МЕ/мл в течений 1 часа. Было проведено 3 опыта на 100 ооцитах

предположениями о регудяторной роли гонадотропинов на биосинтез стероидных гормонов соматическими клетками фолликулов яичников. Воздействие на яичник ХГ и СЖК, ■ как основного носителя' <1СГ и • небольшого количества ХГ, вероятно, активируют систему транспорта .тестостерона в клетки гранулезы, где он превращается в эстрадиол, в результате происходит резкое снижение в <ГЖ уровня тестостерона и повышение уровня эстрадиола-!^. К воздействию гонадотропных гормонов гипофиза наиболее чувствительными оказались фолликулярные клетки малых и средних фолликулов, .которые находятся на не завершенной стадии фолликулогенеза.

Рядом работ было показано, что' цитодифференцировка меток гранулезы сопровождается синтезом белков-рецепторов к гонадот-ропинам, ферментов стероидогенеза и др. В сеязи с этим весьма'' интересным является влияние ФЖ на спонтанное созревание ленских половых клеток после воздействия на яичник гонздотропинами.

Обнаружено, что добавление в среду инкубации ФЖ в дозе 10%, 20% после воздействия XT in situ, приводит к реинициации мейоза у 95-1002 клеток (Таблица 6), причем доза ФЖ до 20% в среде вызывала около 40%. клеток способность к формированию женского пронуклеуса. Однако после обработки яичников коров СЖК, ФЖ. в дозе 20% процент клеток способных формировать пронуклеус ' снижался по сравнению с воздействием ХГ до 10-15%.

Полученные результаты указывают, что эффект ФЖ на спонтанное созревание • торов был более значительным после обработки яичников ХГ, чем СЖК. Вероятно, воздействие СЯК на мейотическое деление в системах.'in situ связано с присутствием в нем небольших количеств XL', а не влиянием ФОГ, так как именно XI' усиливает в фолликулярных клетках синтез зетрадиола, который-является, возможно, внутрияичниковым регулятором функпи.н клеток гранулезы (Tonatta et al. ,'№86).

6. Изменение содергашш аденилатцкклапы б ооцитах . крупного рогатого скота после вог^нйствия CMC iп situ и ХГ'-in vitro.

00Ш-1ГЫ крупного . рогатого скота пг*чц:тас*яст опродел^нкнй интерес для исследователей, так как имога 5олзе пролонгирован-

ный период созревания в культуре 24-40 ч, и процесс созревания улучшается при добавлении гонадстропшлс и других гормонов в культуральную среду (Strard, 1990). Эти исследования показали, что цАМФ'может играть роль в контролировании мейоза у этого вида, и что коровьи ссциты могут синтезировать цА№ (Bllodeau et al., 1993).

В наших исследованиях определл кса эффект стимуляции синтеза аденилатциклазы через воздействие вначале оак в дозе Ь Мё/мл на яичник в течение 1 ч, а затем внесением в культуральную среду ХГ в дозе 0,04 мкг/'мл с помощью злектронной микроскопии. Анализ электроннограмм еыявил в контрольной группе единичные верна аденилатциклазы на оолемме ооцита, иногда они встречались ЬеСольшими скоплениями. После воздействия гормонами на комплекс еоцит-клетки кумулюса были обнаружены кластерные скопления зерен аденилатциклазы на поверхности плазматической мембраны ооцита, шлемообразние выпячивания оолеммы в сторону зоны пеллю-ции, снижение межле точных контактов не аду ооиитои и ¡метками кумулюса.

Полученные результаты подтверждает предполоу-ение о том, что эффект гонадотроп.ных гормонов на созревание ооцитов млекопитающих опосредуется при участии цАШ>. Уровень аденилатциклазы при этом резко возрастает, не только за-счет снижения процессов деградации, по и за счет.активации процессов ero синтеза, что ооциты коров могут синтезировать тсские, количества iiAt.lI'.

выводи

1. .По морфологическим критериям оценки выявлены 4 типа ооцитов коров. Показано, что ооциты 1 и 2 типа, характеризу-ювдеся компактным многослойным слоем клеток кумулюса, гомогенной ооплазмой, способны к спонтанному созреванию и достижении стадии ыетафазы II деления, и в дальнейшем использовались' в экспериментах. Ооциты 3 и 4 типа, обладавшее неравномерной ооплазмой с темными кластерами, менее компактным слоем клеток кумулюса или их отсутствием, выявляли сниженную способность к развитию или тормо.чсение на стадии зародышевого пузырька.

2. Впервые в качестве критерия созревания оошпов in vit.ro

использовали способность ооцитов коров к партеногенетической активации иод действием циклогексимида (25 мкг/мл) в течение 6 часов. На основе этого критерия сравнивали различные условия созревания ооцитов в культуре.

3. Установлено, что оптимальными условиями для культивирования ооцитов крупного рогатого скота является температурный режим - 38"С, продолжительность культивирования - 24-30 часов, что позволяет реиницировать мейоз у 70% ооцитов, около 25% клеток способны достигать метафазы II деления.

4. Показано положительное влияние хориогонического гормона (0,4 мкг/мл) внесенного в культуральную среду не только на возобновление мейоза, но и на оплодотворяющую способность ооцитов. Выход ооцитов способных к партеногенетическому формированию женского пронуклеуса (15%), был значительно выше, чем в контроле (1-3%).

б. Впервые предложен оригинальный способ воздействия го-надотропинов на мейоз путем перфузии яичников убойных коров с последующим выделением ооцитов в культуру. Обнаружено, что обработка яичников коров хориогоническим гормоном (5 МЕ/мл) приводила к снятию II блока мейоза у 30% ооцитов, что было в 2 раза выше, чем после перфузии яичников сывороткой жеребых кобыл (5 ЫЕ/мл).

6. Установлено, что совместное воздействие сыворотки жеребых кобыл (5 МЕ/мл) путем перфузии яичника и хориогонического гормона (0,4 мет/мл) в среде культивирования оказало стимулиру-'шиий эффект на ре инициацию мейоза (05-100%) .и на оплодотворяющую способность ооцитов (25%).

7. Использование при созревании ооиптов коров в среде 20% фолликулярной 1ощкостн, выделенного из фолликулов яичников обработанных гонаЯотропинами, позвслило повысить выход клеток, способных к оплодотворению (до 40%), по сравнению с контролем (1-3%).

3. Стимулирующий эффект го.чадотрэипнх гормонов на мейоз, вероятно, определяется их опосредованным .влиянием на эстрадиол-сннтетическук. функцию фолликулярных клеток. Установлено, что после обметки гскадотрошгаами «ичшнки» в « средних и малых фолликул)в я г>раза уь^личигаетой уг:'. п эетраднолэ.-["fi,

резко падает содержание тестостерона- в 6-20 раз.

9. Установлено активирующее воздействие гонадотропиков на биосинтез аденилатциклазы, увеличение зерен этого фермента на плазматической мембране ооцитов коров, что предполагает участие цАМФ в пусковых механизмах возобновления мейоза.

Описок раоот, опубликованных по теме диссертации.

1. Хамидов Д. X , Кобэль Т. Ю. , Аблятипова Г. IL Влияние гонадот-poruiux гормонов на созревание ооцитов коров in vitro// Тезисы VIII Всесоюзного совешанмя эмбриологов. - Москва, МГУ. -1990. - 0. 31.

й. апняние тронных гормонов гипофиза па уровень половых стероидов в фолликулярной жидкости и на приобретение компетенции к спонтанному созреванию ооцитов коров/ Т. Ю. Коваль, Г. II. Аблятипова, А. Е Федорущенко, Д. X. амидов// Тезисы докладов У Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана на.-Ташкент, 12-15 ноября 1Q91 г. ДАН. - 1991. -С. Кб. 3. Коваль Т. й , Аблятипова Г. Н., Хамидов Д. X. Влияние сыворотки >:еребых кобыл и хорпогоничэского гормона на способность оо-• цимв коров, созревших ш vitro, к партеногенетической активации ЦИКЛ0Гысеш,«1д0м//Онтогенез. -1991. -Т. 22. -t) б.-С. 652-657 -1. Influence of pregnant пиите serum and cnoriogonic hoi пюп-з on the capability of i.uturcd in vitro cow oocytes to partenog-enetio action iriducdty cycloheximido /Т. Yu. Koval, G. Ablayt ipova, E. (ioncharova, D. Kh. Khamidov// The 7-th International Com'c-i «псе of the Internet, ior.al society c.i Dif fereni i ct ion "Cellular programmes for growth, difrerentiation and neoplasia", 1992. -Helsinki, Finland. -1992.- P. 118.

5. A. c. 1763981 СССР, l.iKf 6 01 N 33/48, £2. 05. 92г. Способ подготовки ооцитов крупного рогатого скота для анализа /Хамидов Д. X , Коваль Т. Ю. , Аблятипова Г. К /

6. А. с. СССР, мки G 01 М 33/48, 13. 10. 92г. Устройство для лабораторных исследовшшй/1!оваль Т. №. , Лим А. В. , Аблятипова Г. Н. /

7. Коваль Т. Ю., Аблятипова Г. Н. , Хамидов Д. X. 0-{фь-кт гонадотро-пинов на стимуляцию возобновления мейоза и содержание адени-латциклазы в ооцитах коров in vitго//Мгаду»йродиая конфереь-

цта "Механизмы развития( онтогенез н аспекты эволюции) ",Мэск-га, ¡34-29 августа, 1994 г.

"Гонадотрошшларшшг (ррамол ооцитдярн тузилиши ва функциясига та'ьопршшнг ш!Тологик тац^н^и" мавзусидаги диссертация нешшшг i^iicija мазмуни

ЬЬрфологш: бахрлашга асосланган хрлда [;орамол ооцитлари 4 туршшнг маплудлнгн ани^лашш. Ооиитларнинг цитологии тадциф! шуни курсатдики, улзрнинг бпринчи ва иккннчи туригииа in vitro иароитларида усиш ва тула шакллании хусуспятига згадир. Кррамол оонитларпнн з^ароратнинг 33° С дарачада булиши ва устириш даври-нинг 24-30 соатга тенглигиии талаб этшаи анш$ланди. Илк маротаба, корамол ооцитларини партеногенетик устириш макрадларида цигло-гекснмндяан фойдаланилдикн, бу модда ёрдамида сунтий устириш шроитида тула шаклланган з^ужайраларни айиан таплзб олиш г.лпео-ниятлари яратилади.

Оаииттрнч супъчй Устириш шароигида гояадэхрошшларшшг ролини анш$лша ма^садида хсриогоннк гормошшнг (ХГ) устирия му-з$игнда ¡¿улланиладиган дозасинннг 0,4 мкг/мл га тенглиги аннг,-ланди. In vit.ro шароитида тула шаклланган у^угайралар сонини оширип мзкеадида (ррамол тухумдонлари ХГ ва бия tip ни зардоби (ЕЮ) in situ перфузияланди. ХГ таъсир мехшшзимини тукунткриш хамда пронуилеусларни куп мгарордэ олиш ма^еадларида ооиитларнинг сунъий ^сишига ХГ ва БКЗшшг биргалпкдаги таъсири Зфганил-

ди.

Ушбу таъсирга ж.авобан фолликуляр сую^ликда тестестерон ш^доришшг кескин камайипп, фолликулалзр днаметршшнг fcrniai аоноида эстрадиод-17 концентраииясишшг камайигаи ани^ланди. Ушбу шаооиглаида прсгестепоншшг кснц--гитрацчяси узгармаолигитд нрлзли. j

Оналгк ялросш:;: накллаптирпгпга нрдир ху^тоаларнинг onv куп мт;лэр» I.ДОХ), суиьий устирия му>-птагп 20.S фолликуляр сум; лик ^твяшачдз га тухумдонлэр хориогскт: гзрмов Силан т-гФувкл-лангш.ча хос;:;'. буляши мумки;ш;ги аникрандя.

Эяскттен м;!кроско;ц«к уоул ёглашяд. тухукиинга ыз töichd -jT'jiipns I a o.-;;i)!!'i устнриа му^ктяга >3' ¡^гомгак/га с.-оц'.тт ш'Лраняп^г-'-'-Л'-! вг,'«шатю«та докйчаглритгсг кгогегсгсся тул-длш<ги y.:vy далкл гонгчеггогки горузняаы» сух '.¡г«-

syB<iHJiap oomiT.napiira TaiciipHHHHr nAl.№ iimrapoKiina OopniiMUiiHr nc-OoTiiaHp.

"Cytologycal analysis of gonadotropin effect on the

structure and function of bovine oocytes in culture. " Summery

According t.o the morphological criteria four types of bovine oocytes have been discovered. Analysis has shown that only oocytes of the 1st and the 2nd types are capable of further development and maturation in vitro. 38*0 and 24-30 hours have been established optimal for cultivation of bovine oocytes. For parthogenetlc development of bovine oocytes iycloheximlde was used for the first tune as an indicator of ■full-maturated cell selection in culture.

To demonstrate the significance of gonadotropins In oocyte maturation the choriogenlc hormone (Chli) optimal dose of 0,4 g/ml has been selected. To increase the percentage of cells maturated in vitro cow ovary perfusion in situ by ChH and pregnant mare serum (P!.G) has been used. To explain the mechanism of action of ChH and to obtain the larger nutriber of pronuclei the combined effect of ChH and PM3 on oocytes has been rendered.

The confident decrease in the level of testosterone, estradiol-r^, conoo;.';ation increase wit(r the follicle diameter increase and no change in the concentration cf progesterone have been discovered in the course of elucidating the significance of sexual steroids in follicular fluid.

The highest percentage of cells able to form the rennle nucleus was established in cultural medium containing 20i follicular fluid and upon ovary perfusion by Chi I.

By means of electronic microscopy the clustor aggregations of adenylate cyclase grains cn the plasma menbrane of oocytes have been discovered after ovary treatment with Fi>G and introduction of ChH into cultural medium, to confirm the hopothesis that gonadotropic hormone effect on oocytes of mammals is madiated with the participation of cAMP.

Соискатель